一種可以用於上皮種植的新型納米支架及其製備方法
2023-12-07 05:07:46 1
專利名稱：一種可以用於上皮種植的新型納米支架及其製備方法
技術領域：
本發明涉及納米支架，尤其涉及一種可以用於上皮種植的新型納米支架及其製備方法。
背景技術：
目前，機體在因炎症、外傷、腫瘤或其他病變導致氣管大範圍受損、切除較長段氣管的情況下，需要修復缺損氣管。長期以來，氣管軟骨缺損的修復問題，一直困擾著臨床醫生。一期端端吻合技術僅適合局部缺損的修復，當缺損長度超過6. Ocm時，由於吻合口張力高而易產生吻合口漏等嚴重為、併發症。組織工程技術研究的突飛猛進給氣管重建帶來了新的希望，但自1994年初嘗試後再無突破性進展，仍處於實驗和探索階段，仍有問題有待解決。許多學者嘗試應用同種異體移植、自體組織移植以及人工材料替代物等方法，效果均不夠理想。人工氣管完善應用更關鍵的是如何在人工氣管內腔表面引入具有調節氣管黏膜 細胞生長代謝作用的材料，促進黏膜上皮爬行再生。在眾多的生物材料中，膠原被認為是較理想的選擇。然而，膠原屬於異體動物組織提取物，存在傳染病毒等疾病的潛在可能性，且製作過程複雜，而絲素蛋白屬於天然蛋白，來源豐富，價格適宜。國外學者研究了不同的人體細胞株在絲素蛋白膜上的生長情況，結果表明，絲素蛋白和膠原蛋白一樣，可以促進細胞的生長。絲素蛋白是一種天然結構性蛋白，主要有三種簡單的胺基酸甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸組成，它們約佔絲素蛋白總量的85%，所以絲素蛋白表面含有相當比例的OH、C00H、NH2等極性基團，這對成纖維細胞的粘附和增殖具有重要作用，而且絲素蛋白表面還含有一定比例的帶正電荷的胺基酸殘基，這也為成纖維細胞的粘附和增殖創造了良好條件。聚乳酸乙醇酸共聚物(poly (lactic-co-glycolic acid), PLGA)由兩種單體-
乳酸和羥基乙酸聚合而成，是一種可降解的功能高分子有機化合物，PLGA的降解產物是乳酸和羥基乙酸，是人代謝途徑的副產物，所當它應用在醫藥和生物材料中時不會有毒副作用。由於其具有良好的生物相容性、無毒、良好的成囊和成膜的性能，PLGA被廣泛應用於製藥、醫用工程材料和現代化工業領域。但是迄今為止，國內外尚無絲素蛋白與PLGA結合應用於氣管缺損重建方面的報導。
發明內容
本發明的目的在於提供一種含有絲素蛋白與PLGA的可以用於上皮種植的新型納米支架。本發明所述的一種可以用於上皮種植的新型納米支架，其中，組成材料包括乳酸乙醇酸共聚物和絲素蛋白，乳酸乙醇酸共聚物與絲素蛋白的質量比為1-3: 7-9。優選地，所述乳酸乙醇酸共聚物與絲素蛋白的質量比為2:8。所述乳酸乙醇酸共聚物中單體乳酸和乙醇酸的摩爾比為40-60%: 40-60%，優選為50%:50%ο所述可以用於上皮種植的新型納米支架可以經高壓靜電紡絲技術製成。電紡工藝參數條件為高壓靜電紡的電壓為15-25kv，接受臺離噴射孔的板距為10-20cm。進一步地，高壓靜電紡時的環境空氣溼度〈20%，經過甲醇蒸汽交聯8-16小時。所述絲素蛋白的製作方法為採用桑蠶蠶繭在MHCO3水溶液中脫膠，將脫膠蠶絲溶於AlX3或鈣鹽溶液，得絲素蛋白鹽溶液，去離子透析除去溶液中的無機鹽，透析，壓力過濾，將濾液冷凍乾燥，即可得到純化的絲素蛋白，其中，M為鹼金屬，如Li、Na、K或Cs等，優選為Na、K，更優選為Na ;X為滷素，如F、Cl、Br或I等，優選為Br或I，更優選為Br等。所述鈣鹽可以為氟化鈣、氯化鈣、溴化鈣、磷酸鈣或磷酸氫鈣等可溶解的鈣鹽，更優選為氯化鈣等。·
優選地，所述絲素蛋白的製作方法中，桑蠶蠶繭脫膠過程為，幹的桑蠶蠶繭25-35克加入含10-20g NaHCO3的3升沸水，煮20-40分鐘，可根據需要反覆脫膠數次。優選地，所述絲素蛋白的製作方法中，製備絲素蛋白鹽溶液，可採用經脫膠處理後的幹蠶繭8-12克放入溴化鋁溶液(70-90克溴化鋁加水配成IOOml溶液)，或者將上述烘乾的蠶繭45-55克放入氯化鈣溶液(150-170g氯化鈣加水208ml和165. 7g乙醇的混合溶液)，加熱溶解，加熱溫度為55-75°C。本發明所述的可以用於上皮種植的新型納米支架可以為圓形，橢圓形、三角形、四邊形、多邊形等任意平面幾何圖形。一種製備上述可以用於上皮種植的新型納米支架的方法包括以下步驟
I)製備絲素蛋白，所述絲素蛋白的製作方法如下
採用桑蠶蠶繭在MHCOyK溶液中脫膠，將脫膠蠶絲溶於AlX3或鈣鹽溶液，得絲素蛋白鹽溶液，去離子，透析除去溶液中的無機鹽，透析，壓力過濾，將濾液冷凍乾燥，即可得到純化的絲素蛋白，其中，M為鹼金屬，如Li、Na、K或Cs等，優選為Na等；X為滷素，如F、Cl、Br或I等，優選為Cl等。2)製備納米支架，原料包括乳酸乙醇酸共聚物和所述絲素蛋白，乳酸乙醇酸共聚物與絲素蛋白混合後製成納米級網狀纖維平面支架。步驟2)中所述乳酸乙醇酸共聚物和所述絲素蛋白的質量比為1-3: 7-9。優選地，所述絲素蛋白的製作方法中，製備絲素蛋白鹽溶液，可採用經脫膠處理後的幹蠶繭8-12克放入溴化鋁溶液(70-90克溴化鋁加水配成IOOml溶液)，或者將上述烘乾的蠶繭45-55克放入氯化鈣溶液(150-170g氯化鈣加水208ml和165. 7g乙醇的混合溶液)，加熱溶解，加熱溫度為55-75°C。優選地，步驟2)中所述乳酸乙醇酸共聚物與絲素蛋白的質量比為2:8。優選地，步驟2)中乳酸乙醇酸共聚物與絲素蛋白混合後經高壓靜電紡絲的技術製成納米級網狀纖維平面支架。
本發明所述的可以用於上皮種植的新型納米支架，利於細胞的黏附和增殖，可以用作氣管上皮、消化道上皮、消化腺腺泡和導管等的修復，尤其可用作氣管缺損修補，對促進氣管黏膜修復及臨床重建氣管缺損、減少重建氣管術後併發症提供了有意義的參考。下面結合附圖和具體實施例對本發明進行詳細的介紹和描述，以更好的理解本發明，在下文中可以用於上皮種植的新型納米支架表示為PLGA/SF。
圖I為本發明實施例PLGA/SF的超微結構電子顯微鏡照片；
圖2為本發明實施例PLGA/SF纖維直徑測量結果；
圖3為大鼠氣管上皮細胞在PLGA/SF上的黏附攀爬能力實驗結果；
圖4為大鼠氣管上皮細胞在PLGA/SF上的黏附實驗電鏡超微結構 圖5為大鼠氣管上皮細胞在PLGA/SF增殖能力實驗結果；
圖6為大鼠氣管上皮細胞在PLGA/SF上的HE染色以及螢光蛋白表達染色照片。
具體實施方式
下面參照附圖，通過具體實施例對本發明所述的一種可以用於上皮種植的新型納米支架進行詳細的介紹和描述，以更好的理解本發明，但是應當理解的是，下述實施例並不限制本發明範圍。一、製備絲素蛋白 按照下述步驟製備絲素蛋白
1)15gNaHC03加入到3升水煮沸後，加入幹的桑蠶蠶繭30克，煮30分鐘後，取出蠶繭，重新加上述NaHCO3水溶液，繼續煮，重複3次；
2)用去離子水漂洗煮過的蠶繭5-6次後，將蠶繭放入45度烘箱，烘乾(儘量將蠶繭剪碎後分散擺放，使之乾燥徹底)；
3)將上述烘乾的蠶繭10克放入溴化鋁溶液(78.165克溴化鋁加水配成IOOml溶液)，或者將上述烘乾的蠶繭50克放入氯化鈣溶液(160g氯化鈣加水208ml和165. 7g乙醇的混合溶液)，置於65度水浴鍋，定時攪拌混勻，直至完全溶解，然後室溫下冷卻至常溫；
4)用去離子水衝洗透析袋，將蠶繭溶解液灌入透析袋(1/3至1/2袋)，然後封扎兩端，置於去離子水中透析3天(每4-5小時換水)；
5)將透析液進行壓力過濾，將濾液轉移至大口培養皿中(高度一半為宜)置於-80度預凍1-2天，凍存乾燥2-3天，即可得到純化的絲素。二、PLGA與絲素蛋白經高壓靜電紡絲技術製成納米支架
PLGA與絲素蛋白按質量比為2:8的比例混合，PLGA與絲素蛋白混合物按質量體積比12%充分溶解在分析純的六氟異丙醇溶液中，然後經高壓靜電紡絲機製成納米支架。電紡工藝參數條件為高壓靜電紡的電壓為20kV，接受臺離噴射孔的板距為15cm。電紡時的環境空氣溼度〈20%，經過甲醇蒸汽交聯12小時。超微結構電子顯微鏡觀察效果，如圖I所示，纖維直徑均一，表面光滑沒有斷裂，孔隙率均一，孔隙直徑約為30-40 μ m。測量納米支架纖維直徑，結果如圖2所示，其中，6. 5%的纖維直徑為240-360nm，12%的纖維直徑為361_480nm，直徑為481_600nm佔15%，直徑為601-720nm的佔17. 8%,直徑為721_840nm的佔16%，直徑為841_840nm的佔16. 2%,直徑為841-960nm和直徑為961_1080nm的分別佔9. 8%，直徑為1081_1200nm的佔6. 4%，平均直徑為650nm，標準差210nm，整體纖維的直徑變異範圍符合正態分布。測試大鼠氣管上皮細胞在不同材料上的黏附攀爬能力，實驗結果如圖3和圖4所示圖3中，在接種細胞最初30分鐘內，PLGA/SF (PLGA)就顯示出較玻璃板(Glass)和塑料板(TCP)顯著優越的利於細胞黏附能力(*表示統計學P〈0. 01，**表示統計學P〈0. 001)，在接種後24小時這種差異變小，可能是細胞在材料上的增殖影響的原因。圖4中顯示，隨著時間的推移，上皮細胞在PLGA/SF上的數量逐漸增多，並且細胞膜上的突起逐漸形成，攀沿著纖維支架，並且細胞之間開始連接成片。測試大鼠氣管上皮細胞在PLGA/SF上的增殖能力，實驗結果如圖5和圖6所示圖5中，在接種細胞在24小時以後，在PLGA/SF上的增殖顯著快於另外兩種材料。在種植後的第3至第7天，這種增殖的速率達到最大值，隨後至第14天增殖速率趨於相對平穩，且PLGA/SF材料上的細胞絕對數始終顯著大於對照的兩種材料(TCP :塑料培養板，Bo :玻璃板，Mo :PLGA/SF)。圖6中，螢光染色是活體細胞經由慢病毒轉染表達螢光蛋白，只有活體細胞才可以表達螢光，可以清晰地看到隨著時間的推移，上皮細胞在PLGA/SF上的數量逐漸增多連成片狀，並且細胞活性良好。本發明的可以用於上皮種植的新型納米支架纖維直徑均一，表面光滑沒有斷裂，孔隙率均一，細胞在其上具有良好的黏附攀爬能力和增殖能力，這可用於氣管缺損修補，對 促進氣管黏膜修復及臨床重建氣管缺損、減少重建氣管術後併發症提供了有意義的參考。以上對本發明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為範例，本發明並不限制於以上描述的具體實施例。對於本領域技術人員而言，任何對本發明進行的等同修改和替代也都在本發明的範疇之中。因此，在不脫離本發明的精神和範圍下所作的均等變換和修改，都應涵蓋在本發明的範圍內。
權利要求
1.一種可以用於上皮種植的新型納米支架，其特徵在於，組成材料包括乳酸乙醇酸共聚物和絲素蛋白，乳酸乙醇酸共聚物與絲素蛋白的質量比為1-3: 7-9。
2.根據權利要求I所述的一種可以用於上皮種植的新型納米支架，其特徵在於，所述乳酸乙醇酸共聚物與絲素蛋白的質量比為2:8。
3.根據權利要求I所述的一種可以用於上皮種植的新型納米支架，其特徵在於，所述乳酸乙醇酸共聚物中單體乳酸和乙醇酸的摩爾比為40-60%:40-60%。
4.根據權利要求I所述的一種可以用於上皮種植的新型納米支架，其特徵在於，所述乳酸乙醇酸共聚物中單體乳酸和乙醇酸的摩爾比為50%:50%。
5.根據權利要求I所述的一種可以用於上皮種植的新型納米支架，其特徵在於，乳酸乙醇酸共聚物與絲素蛋白經高壓靜電紡絲的技術製成納米級網狀纖維平面支架。
6.根據權利要求I所述的一種可以用於上皮種植的新型納米支架，其特徵在於，所述絲素蛋白的製作方法如下 採用桑蠶蠶繭在MHCOyK溶液中脫膠，將脫膠蠶絲溶於AlX3或鈣鹽溶液，得絲素蛋白鹽溶液，去離子透析除去溶液中的無機鹽，透析，壓力過濾，將濾液冷凍乾燥，即可得到純化的絲素蛋白，其中，M為鹼金屬，X為滷素。
7.一種製備如權利要求I所述的可以用於上皮種植的新型納米支架的方法，其特徵在於，包括以下步驟 1)製備絲素蛋白，所述絲素蛋白的製作方法如下 採用桑蠶蠶繭在MHCOyK溶液中脫膠，將脫膠蠶絲溶於AlX3或鈣鹽溶液，得絲素蛋白鹽溶液，去離子透析除去溶液中的無機鹽，透析，壓力過濾，將濾液冷凍乾燥，即可得到純化的絲素蛋白，其中，M為Li、Na、K或Cs，X為F、Cl、Br或I ； 2)製備納米支架，原料包括乳酸乙醇酸共聚物和所述絲素蛋白，乳酸乙醇酸共聚物與絲素蛋白混合後製成納米級網狀纖維平面支架。
8.根據權利要求7所述的製備方法，其特徵在於，步驟2)中所述乳酸乙醇酸共聚物和所述絲素蛋白的質量比為1-3: 7-9。
9.根據權利要求8所述的製備方法，其特徵在於，步驟2)中所述乳酸乙醇酸共聚物和所述絲素蛋白的質量比為2: 8。
10.根據權利要求7所述的製備方法，其特徵在於，步驟2)中乳酸乙醇酸共聚物與絲素蛋白混合後經高壓靜電紡絲的技術製成納米級網狀纖維平面支架。
全文摘要
本發明所述的一種可以用於大鼠氣管上皮種植的新型電紡納米支架及其製備方法，其中，組成材料包括乳酸乙醇酸共聚物和絲素蛋白，乳酸乙醇酸共聚物與絲素蛋白的質量比為1-3:7-9，混合後的乳酸乙醇酸共聚物與絲素蛋白製成納米級網狀纖維平面支架。本發明所述的可以用於上皮種植的新型納米支架，利於細胞的黏附和增殖，可以用作氣管上皮、消化道上皮、消化腺腺泡和導管等的修復，尤其可用作氣管缺損修補，對促進氣管黏膜修復及臨床重建氣管缺損、減少重建氣管術後併發症提供了有意義的參考。
文檔編號A61L27/26GK102895701SQ20121041873
公開日2013年1月30日 申請日期2012年10月29日 優先權日2012年10月29日
發明者鄭卉, 陳昶, 高文 申請人:上海市肺科醫院