製備聚乙二醇化鹼性成纖維細胞生長因子的方法
2024-01-28 10:10:15
專利名稱：製備聚乙二醇化鹼性成纖維細胞生長因子的方法
技術領域：
本發明屬於蛋白質修飾製備領域，具體而言，本發明涉及完全在色譜柱上製備鹼性成纖維細胞生長因子的方法。
背景技術：
鹼性成纖維細胞生長因子(basicfibroblast growth factor, bFGF)是FGF家族的一個成員，是一種來源於中胚層及神經外胚層的細胞因子，在人體組織包括皮膚、血管、 神經纖維、骨組織和軟骨組織等細胞上含有豐富的受體，具有廣泛的促進生長等方面的活性，它可以促進血管內皮細胞、表皮細胞、軟骨細胞和神經纖維等細胞的生長，在臨床上具有巨大的應用價值。但大量研究和臨床實踐表明，bFGF在體內作用的發揮需持續長時間與靶細胞受體結合，但bFGF存在穩定性差、體內半衰期短以及存在免疫原性等缺陷日益成為制約bFGF藥物廣泛應用的工程化瓶頸問題。因此可以通過聚乙二醇(PEG)化來提高bFGF穩定性、延長其體內半衰期。常規的聚乙二醇化bFGF是在液相環境中使得PEG與bFGF綴合，然後通過諸如色譜柱等純化。在綴合過程中，液相條件不太穩定，容易在修飾過程中使蛋白失去活性， 形成二聚體等，而且PEG-bFGF本身的層析峰較品平緩而且保留時間較短，這些多聚化的 PEG-bFGF也會存在於這些峰中從而影響均一性；修飾位點不好控制，容易形成隨機、多位點修飾，結果導致產物不均一性能不穩定；分離純化比較困難往往需要多個步驟才能將單位點修飾產物和多位點修飾的產物分離開。為此，本發明人經過大量研究，從眾多的修飾和純化的步驟和材料中選擇並組合出了完全在色譜柱上修飾鹼性成纖維細胞生長因子並純化的方法，可以節約液相綴合步驟，而且所有步驟和材料均與該方法相適應，從而使得該方法能夠得以實現。該bFGF經固相PEG修飾後得到的產物均一性好、分離純化工藝簡單，且修飾產物不但保留了很好的生物學活性，同時其熱穩定性和抗酶解能力顯著提高、體內半衰期顯著延長、免疫原性低顯著降低，從而可以推廣產業化。
發明內容
本發明要解決的技術問題在於提供完全在色譜柱上修飾鹼性成纖維細胞生長因子並純化的方法。具體而言，本發明提供了在色譜柱上製備聚乙二醇化鹼性成纖維細胞生長因子(PEG-bFGF)的方法，其包括，
(1)將bFGF溶液上樣於肝素-S印harose親和層析柱；
(2)用mPEG-丁醛溶液在避光狀態下衝洗肝素-Si^pharose親和層析柱；
(3)用低鹽緩衝液洗去肝素-Si5Pharose親和層析柱中的雜質；
(4)用高鹽緩衝液對肝素-Si5Pharose親和層析柱洗脫，收集含PEG-bFGF的流出液；(5)將步驟(4)獲得的流出液上樣於分子篩層析柱，並用低鹽緩衝液洗脫，收集含 PEG-bFGF的流出液；和
(6)將步驟(5)獲得的流出液上樣於陽離子交換層析柱，收集用含NaCl的緩衝液洗脫的流出液。優選本發明的方法，其中步驟(5)中的分子篩層析柱是S印hadex G_25層析柱。優選本發明的方法，其中步驟(6)中的陽離子交換層析柱是SP-Sepharose陽離子交換層析柱。優選本發明的方法，其中低鹽緩衝液是l(T30mM磷酸緩衝液，優選是20mM磷酸緩衝液。進一步優選本發明的方法，其中高鹽緩衝液是含1. 5^2. 5M NaCl的l(T30mM磷酸緩衝液，優選是含2M NaCl的20mM磷酸緩衝液。進一步優選本發明的方法，其中含NaCl的緩衝液中NaCl含量是20(T500mM，優選是 350mM。進一步優選本發明的方法，其中bFGF和mPEG-丁醛的摩爾比範圍介於1 :1. 25-1 30，如 1 2. 5、1:5、1:10、或 1:20，優選是 1 :10。進一步優選本發明的方法，其中步驟(2)中衝洗的時間為10(Γ600分鐘，優選為 200^400分鐘。同時優選步驟(2 )的ρΗ介於4. 5-8. 5，如5、6、6. 5、7、或8，最優選是6.0-6.5。進一步優選本發明的方法，其中步驟(2)中衝洗的溫度為廣35°C，優選是4 25°C。進一步優選本發明的方法，其中mPEG的分子量為l(T80kDa，優選是20kDa。本發明的有益效果包括，獲得一種高效的蛋白定點修飾方法和便捷的修飾產物分離純化工藝，蛋白的修飾產率超過60%，純化工藝不超過三步且純度超過90% ；修飾產物相比修飾前蛋白其生物學活性保存率不低於80%，修飾產物穩定性顯著改善、體內半衰期顯著延長、免疫原性顯著降低等。
圖1表示本發明的固相PEG化反應方法得到的產物；
圖2表示用現有技術在液相條件下進行PEG化反應後得到的產物的SDS-PAGE電泳分析圖。圖3顯示了檢測實施例1的各個SP-Sepharose陽離子交換層析柱洗脫峰的之外檢測圖譜。圖4為實施例1-5最終收集到的產物的SDS-PAGE電泳分析圖。圖5顯示了實施例1中製備得到的聚乙二醇化bFGF (PEG_bFGF，三角)和收集的未修飾的bFGF (bFGF,方塊)與市售的bFGF標準品(bFGF標準品，圓)對3T3細胞的促增值作用的結果圖。圖6顯示了本發明的PEG-bFGF在大鼠血清中熱穩定性能夠顯著提高。圖7顯示了本發明的PEG-bFGF的抗胰蛋白酶解能力顯著提高。
具體實施例方式
以下將以實施例以人bFGF和20kDa mPEG- 丁醛來舉例說明，如有未盡之處，可以參考 《色譜分析概論》(化學工業出版社，2005)等手冊或教科書。實施例1製備聚乙二醇化bFGF的過程將IOmg的bFGF以20mM磷酸緩衝液(pH 6. 5)溶解製成蛋白濃度為lmg/ml的溶液，然後將該溶液上樣於柱體積為2ml的肝素-S印harose親和層析柱(可購自GE Healthcare公司)，控制流速為0. 5ml/min。上樣完後，以20mM磷酸緩衝液(pH 6. 5)配製mPEG- 丁醛溶液，mPEG- 丁醛的濃度為10mg/ml，將該mPEG- 丁醛溶液作為流動相，以0. Olml/min的流速衝洗肝素-S印harose 親和柱，柱溫維持為室溫，同時將肝素-Sepharose親和柱用錫箔紙包裹以避光，持續衝洗 200分鐘。之後，將流動相換成20mM磷酸緩衝液(pH 6. 5)繼續衝洗肝素柱，以lml/min的流速衝洗20分鐘。然後，用含2M NaCl的20mM磷酸緩衝液(pH 6. 5)以lml/min的流速洗脫肝素-Sepharose親和層析柱，收集聚乙二醇化bFGF所對應的洗脫峰(可以在對照組中將聚乙二醇化bFGF直接上樣洗脫以顯示洗脫峰的位置)的流出液。再將上述流出液上樣於柱體積為100ml的S印hadex G-25層析柱(可購自GE Healthcare公司)，然後用20mM磷酸緩衝液(pH 6. 5)以lml/min的流速洗脫除鹽，收集聚乙二醇化bFGF所對應的洗脫峰(可以在對照組中將聚乙二醇化bFGF直接上樣洗脫以顯示洗脫峰的位置)的流出液。然後，將上述流出液上樣於柱體積為Iml的SP-S^harose陽離子交換層析柱(可購自GE Healthcare公司)，用含0_2mM NaCl的20mM磷酸緩衝液(pH 6. 5)以lml/min的流速梯度洗脫陽離子交換柱，收集其中以含350mM NaCl的20mM磷酸緩衝(pH 6. 5)洗脫的峰，即得到聚乙二醇化bFGF。實施例2以低PEG濃度製備聚乙二醇化bFGF的過程
將IOmg的bFGF以20mM磷酸緩衝液(pH 6. 5)溶解製成蛋白濃度為lmg/ml的溶液，然後將該溶液上樣於柱體積為2ml的肝素-S印harose親和層析柱(可購自GE Healthcare公司)，控制流速為0. 5ml/min。上樣完後，以20mM磷酸緩衝液(pH 6. 5)配製mPEG- 丁醛溶液，mPEG- 丁醛的濃度為5mg/ml，將該mPEG-丁醛溶液作為流動相，以0. Olml/min的流速衝洗肝素-S印harose親和層析柱，柱溫維持為室溫，同時將肝素-Sepharose親和層析柱用錫箔紙包裹以避光，持續衝洗200分鐘。之後，將流動相換成20mM磷酸緩衝液(pH 6. 5)繼續衝洗肝素-S印harose親和層析柱，以lml/min的流速衝洗20分鐘。然後，用含2M NaCl的20mM磷酸緩衝液(pH 6. 5)以lml/min的流速洗脫肝素-Sepharose親和層析柱，收集聚乙二醇化bFGF所對應的洗脫峰(可以在對照組中將聚乙二醇化bFGF直接上樣洗脫以顯示洗脫峰的位置)的流出液。再將上述流出液上樣於柱體積為100ml的S印hadex G-25層析柱(可購自GE Healthcare公司)，然後用20mM磷酸緩衝液(pH 6. 5)以lml/min的流速洗脫除鹽，收集聚乙二醇化bFGF所對應的洗脫峰(可以在對照組中將聚乙二醇化bFGF直接上樣洗脫以顯示洗脫峰的位置)的流出液。然後，將上述流出液上樣於柱體積為Iml的SP-S^harose陽離子交換層析柱(可購自GE Healthcare公司)，用含0_2mM NaCl的20mM磷酸緩衝液(pH 6. 5)以lml/min的流速梯度洗脫陽離子交換柱，收集其中以含350mM NaCl的20mM磷酸緩衝(pH 6. 5)洗脫的峰，即得到聚乙二醇化bFGF。實施例3以流加PEG的低速度製備聚乙二醇化bFGF的過程
將IOmg的bFGF以20mM磷酸緩衝液(pH 6. 5)溶解製成蛋白濃度為lmg/ml的溶液，然後將該溶液上樣於柱體積為2ml的肝素-S印harose親和層析柱(可購自GE Healthcare公司)，控制流速為0. 5ml/min。上樣完後，以20mM磷酸緩衝液(pH 6. 5)配製mPEG- 丁醛溶液，mPEG- 丁醛的濃度為10mg/ml，將該mPEG- 丁醛溶液作為流動相，以0. 005ml/min的流速衝洗肝素-S印harose 親和層析柱，柱溫維持為室溫，同時將肝素-Si5Pharose親和層析柱用錫箔紙包裹以避光， 持續衝洗400分鐘。之後，將流動相換成20mM磷酸緩衝液(pH 6. 5)繼續衝洗肝素-S印harose親和層析柱，以lml/min的流速衝洗20分鐘。然後，用含2M NaCl的20mM磷酸緩衝液(pH 6. 5)以lml/min的流速洗脫肝素-Si^pharose親和層析柱，收集聚乙二醇化bFGF所對應的洗脫峰(可以在對照組中將聚乙二醇化bFGF直接上樣洗脫以顯示洗脫峰的位置)的流出液。 再將上述流出液上樣於柱體積為IOOml的S印hadex G-25層析柱(可購自GE Healthcare公司)，然後用20mM磷酸緩衝液(pH 6. 5)以lml/min的流速洗脫除鹽，收集聚乙二醇化bFGF所對應的洗脫峰(可以在對照組中將聚乙二醇化bFGF直接上樣洗脫以顯示洗脫峰的位置)的流出液。然後，將上述流出液上樣於柱體積為Iml的SP-S^harose陽離子交換層析柱(可購自GE Healthcare公司)，用含0_2mM NaCl的20mM磷酸緩衝液(pH 6. 5)以lml/min的流速梯度洗脫陽離子交換柱，收集其中以含350mM NaCl的20mM磷酸緩衝(pH 6. 5)洗脫的峰，即得到聚乙二醇化bFGF。實施例4以流加低濃度PEG的低速度製備聚乙二醇化bFGF的過程
將IOmg的bFGF以20mM磷酸緩衝液(pH 6. 0)溶解製成蛋白濃度為lmg/ml的溶液，然後將該溶液上樣於柱體積為2ml的肝素-S印harose親和層析柱(可購自GE Healthcare公司)，控制流速為0. 5ml/min。上樣完後，以20mM磷酸緩衝液(pH 6. 0)配製mPEG- 丁醛溶液，mPEG- 丁醛的濃度為5mg/ml，將該mPEG- 丁醛溶液作為流動相，以0. 005ml/min的流速衝洗肝素-S印harose 親和層析柱，柱溫維持為室溫，同時將肝素-Si5Pharose親和層析柱用錫箔紙包裹以避光， 持續衝洗400分鐘。之後，將流動相換成20mM磷酸緩衝液(pH 6. 0)繼續衝洗肝素-S印harose親和層析柱，以lml/min的流速衝洗20分鐘。然後，用含2M NaCl的20mM磷酸緩衝液(pH 6. 0)以lml/min的流速洗脫肝素-Si^pharose親和層析柱，收集聚乙二醇化bFGF所對應的洗脫峰(可以在對照組中將聚乙二醇化bFGF直接上樣洗脫以顯示洗脫峰的位置)的流出液。再將上述流出液上樣於柱體積為100ml的S印hadex G-25層析柱(可購自GE Healthcare公司)，然後用20mM磷酸緩衝液(pH 6. 0)以0. 5ml/min的流速洗脫除鹽，收集聚乙二醇化bFGF所對應的洗脫峰(可以在對照組中將聚乙二醇化bFGF直接上樣洗脫以顯示洗脫峰的位置)的流出液。然後，將上述流出液上樣於柱體積為Iml的SP-S^harose陽離子交換層析柱(可購自GE Healthcare公司)，用含0_2mM NaCl的20mM磷酸緩衝液(pH 6. 0)以lml/min的流速梯度洗脫陽離子交換柱，收集其中以含350mM NaCl的20mM磷酸緩衝(pH 6. 0)洗脫的峰，即得到聚乙二醇化bFGF。實施例5以低溫製備聚乙二醇化bFGF的過程
將IOmg的bFGF以20mM磷酸緩衝液(pH 6. 0)溶解製成蛋白濃度為lmg/ml的溶液，然後將該溶液上樣於柱體積為2ml的肝素-S印harose親和層析柱(可購自GE Healthcare公司)，控制流速為0. 5ml/min。上樣完後，以20mM磷酸緩衝液(pH 6. 0)配製mPEG- 丁醛溶液，mPEG- 丁醛的濃度為10mg/ml，將該mPEG- 丁醛溶液作為流動相，以0. Olml/min的流速衝洗肝素-S印harose 親和層析柱，柱溫維持為4°C，同時將肝素-Si5Pharose親和層析柱用錫箔紙包裹以避光，持續衝洗200分鐘。之後，將流動相換成20mM磷酸緩衝液(pH 6. 0)繼續衝洗肝素-S印harose親和層析柱，以lml/min的流速衝洗20分鐘。然後，用含2M NaCl的20mM磷酸緩衝液(pH 6. 0)以lml/min的流速洗脫肝素-Si^pharose親和層析柱，收集聚乙二醇化bFGF所對應的洗脫峰(可以在對照組中將聚乙二醇化bFGF直接上樣洗脫以顯示洗脫峰的位置)的流出液。再將上述流出液上樣於柱體積為100ml的S印hadex G-25層析柱(可購自GE Healthcare公司)，然後用20mM磷酸緩衝液(pH 6. 0)以0. 5ml/min的流速洗脫除鹽，收集聚乙二醇化bFGF所對應的洗脫峰(可以在對照組中將聚乙二醇化bFGF直接上樣洗脫以顯示洗脫峰的位置)的流出液。然後，將上述流出液上樣於柱體積為Iml的SP-S^harose陽離子交換層析柱(可購自GE Healthcare公司)，用含0_2mM NaCl的20mM磷酸緩衝液(pH 6. 0)以lml/min的流速梯度洗脫陽離子交換柱，收集其中以含350mM NaCl的20mM磷酸緩衝(pH 6. 0)洗脫的峰，即得到聚乙二醇化bFGF。實施例6聚乙二醇化bFGF的純度鑑定
用本發明的固相PEG化反應方法(S卩，本發明實施例1中自起始步驟至洗脫肝素-Sepharose親和層析柱並收集聚乙二醇化bFGF所對應的洗脫峰的步驟)得到的產物與用現有技術在液相條件下進行PEG化反應後得到的產物進行SDS-PAGE電泳(分離膠12%， 濃縮膠5% )，採用卡馬斯亮藍法染色，觀察純度。結果如圖1所示，其中圖1在液相條件下進行PEG化反應後得到的反應液的圖譜，其中M泳道為分子量標記，a泳道為修飾前的野生型bFGF, b e泳道依次為PEG與bFGF以摩爾比為10 :1、ρΗ6· 5條件下室溫反應lh、2h、4h、 8h的反應液，明顯可以看出有多聚化的副反應產物產生；圖2為本發明的固相PEG化反應方法得到的流出液的圖譜，其中M泳道為分子量標記，f泳道為修飾前野生型bFGF，g泳道為肝素柱洗脫流出液。從圖1和圖2比較，可以發現液相修飾修飾率相對降低，如果通過延長時間來提高修飾產率則修飾條帶出現多條，為非單一性修飾的副反應產物；而在色譜柱固相修飾不僅修飾產率高而且為單一修飾。檢測實施例1的各個SP-Sepharose陽離子交換層析柱洗脫峰並將上述實施例1_5最終收集到的產物進行SDS-PAGE電泳分析(分離膠12%，濃縮膠5%，採用卡馬斯亮藍法染色)。結果如圖2所示，其中圖3顯示了實施例1中不同鹽離子濃度下洗脫SP-Sepharose 陽離子交換層析柱所對應的洗脫峰，峰1為含0. 35M NaCl的洗脫液的洗脫峰(PEG化的 bFGF)，峰2為含1. OM NaCl洗脫液的洗脫峰(未修飾的bFGF)，表明通過本發明的方法可以有效分離PEG化的bFGF和未修飾的bFGF，而且兩者都可方便地收集(前者作為最終產品， 後者可以循環參與反應);圖4為實施例1-5收集的最終產物的SDS-PAGE電泳分析圖a泳道為未修飾的bFGF，M泳道為分子量標記，b-f泳道依次為實施例1-5收集的最終流出液， g泳道為實施例1的未修飾的bFGF所對應的洗脫峰的濃縮液，表明本發明的方法可以在多種濃度、速度和溫度的條件下進行而無顯著區別，另外未修飾的bFGF所對應的洗脫峰含有的未修飾的bFGF純度很高，因而無需純化就可循環利用。實施例7聚乙二醇化bFGF的促細胞增殖活性分析
活性測定採用常規的MTT法。簡而言之，將3T3細胞轉接於含10%小牛血清的1640培養液置於二氧化碳培養箱，37°C培養5d，用0. 25%的胰酶消化培養瓶中的3T3細胞，再用含 10%小牛血清的1640培養液稀釋至細胞濃度為107 108個/ml，加入96孔細胞培養板中(100 μ 1/孔)，37°C培養24h。換含0. 4%小牛血清的1640培養液(100 μ 1/孔)，37°C繼續培養24h，去板中培養液，依次加入150 μ 1待測樣品(用含0. 4%小牛血清的1640培養液稀釋，按第1孔濃度為lOOng/ml，以下各孔依次4倍稀釋)，37 V培養24h，每孔各加入 MTT(5mg/mL)20l·! 1，繼續培養4h，去培養液，每孔加入二甲基亞碸100 μ 1，室溫放置30min， MK-3酶標儀雙波長(570、630nm)檢測各孔樣品的OD值，分別與陰性對照(含0.4%小牛血清的1640培養液)比較，計算半數增長率(ED50)，再根據下列公式算出各樣品的活性 樣品效價=(樣品ED50/標準品ED50) X標準品效價X樣品稀釋倍數結果表明，bFGF經PEG 修飾後，實施例1-5收集到的聚乙二醇化bFGF的生物活性保存率均達到90%以上，其中實施例1製備的聚乙二醇化bFGF的生物活性與修飾前的野生型bFGF基本相似(見圖3)。實施例8聚乙二醇化bFGF的熱穩定性研究
取大鼠血液，4°C、8000 r/min離心，取上清製得大鼠血清，分別取含等物質量FGF-2 和PEG-FGF-2各0. 6 ml，與大鼠血清2.4 ml混勻，37°C保溫；分別於2、4、8、24和48 h取樣，-20°C保存，以空白大鼠血清作為對照，採用上述實施例7描述的方法測定實施例1-5 的PEG-bFGF生物活性，並以修飾前蛋白(bFGF)為對照，計算活性保存率。以實施例1獲得的PEG-bFGF為例，結果如圖4所示，可以顯著提升活性保存率。另取實施例1-5的PEG-bFGF以及bFGF在37°C保溫96小時後，與未經過保溫的 bFGF比較，計算活性保存率。以實施例3製備的PEG-bFGF為例，活性保存率為61. 7% ；而未修飾的bFGF的活性保存率僅為23. 4%。以上結果充分說明bFGF經過色譜柱固相化學修飾並純化後在大鼠血清中熱穩定性明顯提高。 實施例9聚乙二醇化bFGF的抗酶解能力檢測
分別取含等物質量的bFGF和實施例1製備的PEG-bFGF各0. 5ml，與2 mmol/L胰蛋白酶溶液0.5ml混勻，最終蛋白與胰蛋白酶的物質量比為100 1，37°C保溫，於0、1、5、10、 15,20,40和60 min取混合樣0. 1 ml，立即與無血清RPMI 1640培養基混勻(樣品體積培養基體積=1 10)，以終止胰蛋白酶的作用。
將處理後的各樣品進行SDS-PAGE電泳分析，並將獲得的凝膠採用凝膠掃描分析，觀察蛋白質被胰蛋白酶的降解情況。結果如圖5所示，表明保溫20min後，修飾產物 PEG-FGF-21的含量與酶解前相比仍然存留31. 3%，而未修飾產物基本被完全降解，由此可見，bFGF經過色譜柱固相化學修飾並純化後抗胰蛋白酶水解能力明顯增加。
權利要求
1.製備聚乙二醇化鹼性成纖維細胞生長因子的方法，其包括，(1)將bFGF溶液上樣於肝素-S印harose親和層析柱；(2)用mPEG-丁醛溶液在避光狀態下衝洗肝素-Si^pharose親和層析柱；(3)用低鹽緩衝液洗去肝素-Si5Pharose親和層析柱中的雜質；(4)用高鹽緩衝液對肝素-Si5Pharose親和層析柱洗脫，收集含PEG-bFGF的流出液；(5)將步驟(4)獲得的流出液上樣於分子篩層析柱，並用低鹽緩衝液洗脫，收集含 PEG-bFGF的流出液；和(6)將步驟(5)獲得的流出液上樣於陽離子交換層析柱，收集用含NaCl的緩衝液洗脫的流出液。
2.根據權利要求1所述的製備聚乙二醇化鹼性成纖維細胞生長因子的方法，其中步驟(5)中的分子篩層析柱是S印hadexG-25層析柱。
3.根據權利要求1所述的製備聚乙二醇化鹼性成纖維細胞生長因子的方法，其中步驟(6)中的陽離子交換層析柱是SP-S^harose陽離子交換層析柱。
4.權利要求1-3之任一所述的製備聚乙二醇化鹼性成纖維細胞生長因子的方法，其中低鹽緩衝液是l(T30mM磷酸緩衝液，優選是20mM磷酸緩衝液。
5.根據權利要求1-3之任一項所述的製備聚乙二醇化鹼性成纖維細胞生長因子的方法，其中高鹽緩衝液是含1. 5 2. 5M NaCl的l(T30mM磷酸緩衝液，優選是含2M NaCl的20mM 磷酸緩衝液。
6.根據權利要求1-3之任一項所述的製備聚乙二醇化鹼性成纖維細胞生長因子的方法，其中含NaCl的緩衝液中NaCl含量是20(T500mM，優選是350mM。
7.根據權利要求1-3之任一項所述的製備聚乙二醇化鹼性成纖維細胞生長因子的方法，其中bFGF和mPEG-丁醛的摩爾比範圍介於1 1.25-1 :30，優選是1 :10。
8.根據權利要求1-3之任一項所述的製備聚乙二醇化鹼性成纖維細胞生長因子的方法，其中步驟(2)中衝洗的時間為10(Γ600分鐘，優選為20(Γ400分鐘。
9.權利要求1-3之任一所述的方法，其中步驟(2)中衝洗的溫度為廣35°C，優選是 r250C O
10.根據權利要求1-3之任一項所述的製備聚乙二醇化鹼性成纖維細胞生長因子的方法，其中mPEG的分子量為l(T80kDa，優選是20kDa。
全文摘要
本發明屬於蛋白質修飾領域，具體而言，本發明提供了在色譜柱上製備聚乙二醇化鹼性成纖維細胞生長因子(PEG-bFGF)的方法，其包括，將bFGF溶液上樣於肝素-Sepharose親和層析柱；用mPEG-丁醛溶液在避光狀態下衝洗；用低鹽緩衝液洗去雜質；用高鹽緩衝液洗脫，收集含PEG-bFGF的流出液；將獲得的流出液上樣於分子篩層析柱，並用低鹽緩衝液洗脫，收集含PEG-bFGF的流出液；和將獲得的流出液上樣於陽離子交換層析柱，收集用含NaCl的緩衝液洗脫的流出液。
文檔編號C07K17/08GK102329395SQ20111026140
公開日2012年1月25日 申請日期2011年9月6日 優先權日2011年5月16日
發明者葉朝輝, 唐璐, 張翼, 李校堃, 王曉傑, 黃志鋒 申請人:溫州醫學院, 黃志鋒