釀酒酵母從頭合成柚皮素工程菌株及其構建方法與應用

2024-04-16 05:15:05

釀酒酵母從頭合成柚皮素工程菌株及其構建方法與應用
(一)技術領域
1.本發明涉及一種採用增強酪氨酸代謝通量和基因組delta多拷貝位點整合促進異源基因高效表達的組合策略，尤其涉及一種生產柚皮素的釀酒酵母工程菌及其構建方法和應用。
(二)

背景技術：

2.柚皮素是黃酮類化合物的核心骨架結構，作為平臺化合物可衍生大量黃酮類物質，具有抗病毒、抗菌、抗高血壓和抗氧化等多種生理活性，廣泛應用於食品、化工、醫藥等行業。鑑於植物提取和化學合成的局限性，柚皮素的生物合成已成為研究熱點。以植物代謝途徑為參照，目前已報導的異源合成柚皮素有2條代謝通路：以酪氨酸為底物，在酪氨酸解氨酶(tal)催化下生成對香豆酸，隨後在4-香豆酸:輔酶a連接酶(4cl)催化下合成對香豆醯-coa，再經由查爾酮合酶(chs)和查爾酮異構酶(chi)催化下分別合成柚皮素查爾酮和柚皮素；由酪氨酸合成柚皮素的途徑是目前研究的熱門方案。在另一條途徑中，由苯丙氨酸通過5步酶催化反應合成柚皮素，分別為：苯丙氨酸解氨酶(pal)、肉桂酸-4-羥化酶(c4h)、4cl、chs和chi。苯丙氨酸合成方案涉及了c4h，該酶屬於p450酶，需要由p450還原酶將其轉化為氧化還原形態，並且需要錨定在內質網上完成催化反應，限制了該通路在原核表達系統中的應用。
3.通過微生物發酵法來合成柚皮素是降低黃酮類化合物成本的理想來源，同時也滿足綠色、資源環保理念。釀酒酵母作為gras(generally regarded as safe)生物，具有良好的遺傳背景、優異的抗逆性、優異的發酵特性、穩定的生產性能和較高的安全性，已成為生產柚皮素的一種有吸引力的微生物宿主。
(三)

技術實現要素：

4.本發明的第一個目的是提供一種生產酪氨酸的釀酒酵母工程菌，所述的工程菌以s.cerevisiae cen.pk2-1c為底盤菌，通過代謝改造，得到高產l-酪氨酸的釀酒酵母t01菌株。
5.本發明的第二個目的是提供一種實現並強化柚皮素從頭合成的釀酒酵母工程菌。所述工程菌是以高產酪氨酸t01菌株為宿主，以高拷貝2μ質粒過表達rgtal和sc4cl，實現柚皮素從頭合成菌株(n01)的構建；隨後，通過將sc4cl和hachs表達盒整合至delta位點(該菌株命名為n02)，顯著促進了柚皮素的合成並對生物量無明顯影響。
6.為實現上述目的，本發明採用如下技術方案：
7.第一方面，本發明提供一種重組表達質粒，所述重組表達質粒含有酪氨酸解氨酶基因(tal)和4-香豆酸:輔酶a連接酶基因(4cl)。
8.在本發明的一個實施例中，所述重組表達質粒的載體為pesc-his，所述酪氨酸解氨酶基因連接有tef啟動子控制表達。另外，為進行質粒篩選，所述tef啟動子還可攜帶篩選基因，如潮黴素抗性基因。
9.在本發明的一個實施例中，所述酪氨酸解氨酶基因編碼如seq id no:6所示胺基酸序列，來源於rhodotorula glutinis；所述4-香豆酸:輔酶a連接酶基因編碼如seq id no:7所示胺基酸序列，來源於streptomyces coelicolor。上述基因在插入宿主菌時需要相應做密碼子優化為本領域的公知常識。
10.在本發明的一個實施例中，所述重組表達質粒被命名為pesc-tal-4cl-hygr質粒。
11.第二方面，本發明提供一種含上述重組表達質粒的基因工程菌，所述基因工程菌的宿主菌是s.cerevisiae cen.pk2-1c菌株經如下改造獲得的：將gal80基因替換為查爾酮合酶基因的表達盒a，將aro10基因替換為查爾酮異構酶基因的表達盒，敲除pdc5基因和gal2基因，將pha2基因替換為aro7
g141s
基因的表達盒，trp2替換為aro4
k229l
基因的表達盒，得到所述宿主菌。
12.所述aro7
g141s
基因的表達盒編碼的胺基酸序列是將aro7基因編碼的胺基酸序列的141位甘氨酸突變為絲氨酸，所述aro7
g141s
基因的表達盒編碼的胺基酸序列如seq id no:10所示；所述aro7
g141s
基因的表達盒的啟動子和終止子分別是pgk1啟動子和hxt7終止子。所述aro4
k229l
基因的表達盒編碼的胺基酸序列是將aro4基因的表達盒編碼的胺基酸序列的229位賴氨酸突變為亮氨酸，所述aro4
k229l
基因的表達盒編碼的胺基酸序列如seq id no:11所示，所述aro4
k229l
基因的表達盒的啟動子和終止子分別是tef1啟動子和cyc1終止子。
13.在本發明的一個實施例中，所述查爾酮合酶(chs)基因的表達盒a的啟動子和終止子分別是gal7啟動子和cyc1終止子，所述查爾酮合酶(chs)基因的表達盒a編輯的胺基酸序列如seq id no:8所示；所述查爾酮異構酶(chi)基因的表達盒的啟動子和終止子分別是gal1啟動子和adh1終止子，所述查爾酮異構酶(chi)基因的表達盒編輯的胺基酸序列如seq id no:9所示。
14.優選地，所述基因工程菌進一步進行如下改造：將查爾酮合酶基因的表達盒b和4-香豆酸:輔酶a連接酶基因的表達盒一同整合至所述基因工程菌的delta位點，得到高產柚皮素的基因工程菌。
15.進一步，上述改造都採用crispr-cas9單質粒基因編輯系統完成。在本發明的一個實施例中，改造前先將cas9表達盒(p
tef-spcas9-t
adh2
)整合至s.cerevisiae cen.pk2-1c菌株的基因組的ix-1位點，以優化crispr-cas9雙質粒基因編輯系統。採取di-crispr/cas9(delta-integration)技術，設計grna靶向酵母基因組上delta序列，在雙鏈斷裂處(dsb,double stranded breaks)實現柚皮素合成途徑中sc4cl和hachs donor dna的簡單高效性整合。但本領域人員應當知曉，採用其它基因編輯方法進行的相同或類似改造也在本發明的保護範圍內。
16.在本發明的一個實施例中，所述查爾酮合酶基因的表達盒b的啟動子和終止子分別是erg20啟動子和cyc1終止子；4-香豆酸:輔酶a連接酶基因的表達盒的啟動子和終止子分別是sed1啟動子和cyc1終止子。
17.在本發明的實施例中，所述查爾酮合酶基因的表達盒a、b所編輯的胺基酸序列相同，區別僅僅在於啟動子不同。
18.在本發明的一個實施例中所述查爾酮合酶基因的表達盒編輯的胺基酸序列如seq id no:8所示；所述4-香豆酸:輔酶a連接酶基因的表達盒編輯的胺基酸序列如seq id no:7所示。
19.第三方面，本發明還提供上述基因工程菌在在發酵生產柚皮素中的應用。
20.具體地，在本發明的一個實施例中所述應用為：將所述基因工程菌接種於ypd液體培養基，30℃、180rpm培養15h得到種子液；將所述種子液以2％的體積接種量轉接至新鮮ypd液體培養基，30℃、180～220rpm發酵48-96h，獲得含柚皮素的發酵液。
21.具體地，所述宿主菌的構建方法，包括如下步驟：
22.(1)s.cerevisiae cen.pk2-1c基因組作為模板用來擴增內源性啟動子、終止子、上下遊同源臂和內源基因；大腸桿菌e.coli dh5α用於質粒擴增和保存等。
23.(2)為了便於基因操作，以基因組為模板，擴增靶位點ix1基因座上下遊各約500bp同源臂；從p42h-spcas9質粒中擴增出一個cas9表達盒，通過over-lap pcr獲得完整的cas9表達盒donor dna片段。liac/peg化轉法轉化上述donor dna和grna-ix1質粒，菌落pcr驗證cas9表達盒整合至ix1位點後用無抗ypd傳代培養丟grna-ix1質粒，得到的菌株c00(cen.pk2-1c,ix1::p
tef-spcas9-t
adh2
)用作後續dna整合和生物合成途徑的宿主。
24.(3)以c00為底盤菌，首先，敲除gal80可以解除gal啟動子半乳糖依賴性表達，同時在該位點整合hachs表達盒(所述查爾酮合酶chs來源於漿果金絲桃的(hypericμm androsaemμm)；敲除aro10並整和mschi表達盒實現chi的過表達(查爾酮異構酶chi來源於紫花苜蓿(medicago sativa)；敲除pdc5減少競爭代謝支路對4-hpp的消耗；隨後，敲除gal2；接著，敲除pha2並過表達aro7
g141s
和敲除trp2並過表達aro4
k229l
避免碳通量趨向合成苯丙氨酸和色氨酸，可以增加進入莽草酸和分支酸代謝碳通量並解除酪氨酸的反饋抑制。t01菌株在發酵96h時酪氨酸產量最高，為840mg/l，相較於出發菌株提升約494％。
25.具體地，在本發明的實施例中所述基因工程菌和高產柚皮素的基因工程菌按照如下方法構建：
26.1)本發明所述酪氨酸解氨酶tal來源於粘紅酵母(rhodotorμla glμtinis)，4-香豆酸:輔酶a連接酶4cl來源於天藍色鏈黴菌(streptomyces coelicolor)。首先，將基因rgtal和sc4cl經密碼子優化後克隆至pesc-his載體；隨後，將his營養缺陷型篩選標記替換為潮黴素(hygromycin)抗性標籤後，獲得pesc-tal-4cl-hygr質粒。
27.2)pesc-tal-4cl-hygr表達質粒在高產酪氨酸t01菌株中過表達時，獲得菌株n01，其酪氨酸產量為403mg/l，對香豆酸產量為40.99mg/l，柚皮素的產量為81.45mg/l。
28.3)本發明所述delta位點整合sc4cl和hachs表達盒方法為：以s.cerevisiae cen.pk2-1c基因組為模板，分別擴增delta位點上遊同源臂，約160bp、sed1啟動子、erg20啟動子、delta位點下遊同源臂，約250bp。以pesc-tal-4cl-his、pesc-chs-chi-his質粒為模板，分別擴增4cl及其adh1終止子和chs及其cyc1終止子。上述pcr產物經純化或膠回收得到6個dna片段。多次兩片段融合得delta整合donor dna，通過liac/peg化轉法整合至n01菌株基因組上得到delta整合型菌株，命名為n02。n02酪氨酸的產量為344.19mg/l，對香豆酸的產量為67.96mg/l，柚皮素的產量為157.68mg/l。
29.本領域人員知曉，先完成基因組改造，再導入重組質粒，也應在本發明的保護範圍內。
30.與現有技術相比，本發明有益效果主要體現在：本發明將cas9基因表達盒整合至酵母基因組中，優化crispr/cas9雙質粒基因編輯系統，可以縮短酵母基因編輯周期。di-crispr/cas9(delta-integration)平臺可作為有效的方式顯著的提高目標代謝物的合成。
本發明構建的釀酒酵母工程菌能夠以葡萄糖為底物實現微生物法從頭合成柚皮素，n02菌株搖瓶發酵的產量為157.68mg/l。
(四)附圖說明
31.圖1柚皮素化學結構式
32.圖2釀酒酵母中柚皮素合成代謝途徑改造示意圖
33.圖3釀酒酵母工程菌株生物量示意圖
34.圖4釀酒酵母工程菌株酪氨酸產量示意圖
35.圖5釀酒酵母工程菌株柚皮素產量示意圖
36.圖6sc4cl和hachs表達盒整合至delta位點示意圖
(五)具體實施方式
37.為使本發明實施例的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將對本發明實施例的技術方案進行完整的描述。但是，所描述的是本發明的一部分實施例，而不是全部的實施例。基於所描述的本發明的實施例，本領域普通技術人員在無需創造性勞動的前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明的保護範圍。
38.本發明所述實例中涉及的培養基如下：
39.lb培養基：0.5％酵母粉、1％蛋白腖、1％氯化鈉，溶劑為水，ph自然；
40.ypd培養基：1％酵母粉、2％蛋白腖、2％葡萄糖，溶劑為水，ph自然；
41.固體培養基則加入1.5％的瓊脂粉。
42.酪氨酸及柚皮素採取高效液相色譜(hplc)法檢測。
43.酪氨酸hplc檢測具體條件為：使用welchrom c18色譜柱(250mm
×
4.6mm,5μm)，流動相為0.1mol/l乙酸鈉溶液(ph＝4.0):甲醇＝90:10(v/v)，流速為1ml/min，紫外檢測器的檢測波長為280nm，進樣量為10μl，柱溫為30℃。
44.柚皮素hplc檢測具體條件為：使用welchrom c18色譜柱(250mm
×
4.6mm,5μm)，流動相a為純甲醇(含0.2％乙酸)，流動相b為含0.2％乙酸水溶液，流速為1ml/min，流動相梯度洗脫見下表，對香豆酸紫外檢測器的檢測波長為308nm，柚皮素檢測波長為288nm，進樣量為10μl，柱溫為30℃。
[0045][0046]
實施例1
[0047]
1.產酪氨酸釀酒酵母工程菌t01的構建
[0048]
首先，將cas9表達盒(p
tef-spcas9-t
adh2
)整合至s.cerevisiae cen.pk2-1c基因組ix-1位點，以優化crispr-cas9雙質粒基因編輯系統；隨後，gal80替換為p
gal7-chs-t
cyc1
，解
除gal型啟動子的半乳糖依賴性表達並過表達chs；接著，aro10替換為p
gal1-chi-t
adh1
；隨後，依次敲除pdc5、gal2，最後，pha2替換為p
pgk1-aro7
g141s-t
hxt7
，trp2替換為p
tef1-aro4
k229l-t
cyc1
以實現酪氨酸抗反饋抑制基因的過表達並減弱苯丙氨酸和色氨酸競爭支路的代謝通量，得到t01菌株。
[0049]
2.整合cas9表達盒至s.cerevisiae cen.pk2-1c基因組
[0050]
構建grna-ix1質粒(後續基因編輯所需grna質粒以此為例構建)。
[0051]
首先以質粒pkan100-leu2-grna(cn112322512a)為模板反向擴增(引物為：grna-f和grna-r)，經dpn i單酶切消化2.5h，化轉至e.coli dh5α；amp平板過夜培養後，挑取單菌落，接入含amp(本文所述氨苄青黴素溶液的工作濃度均為100mg/ml)的lb中培養12-15h，提質粒，以載體通用引物m13r進行測序驗證leu2標籤是否已經敲除，敲除成功即得pkan100質粒。之後以pkan100質粒為模板，通過設計ix1靶位點pam位點前20bp的引物(grna-ix1-f和grna-ix1-r)進行反向擴增得pkan100-ix1 dna片段，其餘步驟參考pkan100質粒構建，提取質粒後以載體通用引物m13r進行測序驗證ix1靶位點前20bp(即，n20)是否突變成功；n20突變成功即得grna-ix1質粒。
[0052]
以質粒ph-spcas9(cn112322512a)為模板擴增spcas9(引物為：spcas9-p42h-f和spcas9-p42h-r)，並以質粒prs42h-icas9(cn112322512a)為模板反向擴增(引物為：p42h-spcas9-f和p42h-spcas9-r)，並通過over-lap pcr獲得完整的重組線性化質粒片段(引物為：spcas9-p42h-f和p42h-spcas9-r；兩個dna片段使用量為摩爾比1:3)，連接完成進行轉化並菌落pcr驗證(引物為：spcas9-check-f1和spcas9-check-r1)，篩選陽性轉化子並提取質粒測序驗證其序列正確性，測序正確即得p42h-spcas9質粒。之後以s.cerevisiae cen.pk2-1c基因組為模板，擴增靶位點ix1基因座上下遊各約500bp同源臂(引物為：up ix1-f、up ix1-r、down ix1-f和down ix1-r)；從p42h-spcas9質粒中擴增cas9表達盒(引物為：spcas9-f和spcas9-r)，通過over-lap pcr獲得完整的donor dna片段(引物為：up ix1-f和down ix1-r；三個dna片段使用量為摩爾比1:3:1)。首先，將p42h-spcas9質粒化轉至s.cerevisiae cen.pk2-1c中；隨後，將有cas9表達盒的donor dna和grna-ix1質粒共轉化至s.cerevisiae cen.pk2-1c。通過菌落pcr(引物為：ix1-check-f1和ix1-check-r1)及測序驗證正確後得到菌株c00(cen.pk2-1c,ix1::p
tef-spcas9-t
adh2
)，被用作後續dna整合和生物合成途徑的宿主。
[0053]
3.crispr/cas9基因替換的操作，以gal80δ::pgal7-chs-tcyc1為例
[0054]
1)構建grna-gal80質粒，操作同grna-ix1質粒的構建，區別僅在於目靶基因gal80的pam位點前20bp序列不同，即構建擴增引物為：grna-gal80-f和grna-gal80-r。
[0055]
2)donor dna的製備
[0056]
擴增上下遊同源臂(50μl體系)：以1μl的s.cerevisiae cen.pk2-1c基因組為模板(本文中基因組使用濃度為100ng/μl)，2
×
phanta max master mix(vazyme，南京)高保真dna聚合酶25μl，引物up gal80-f和up gal80-r(上遊同源臂引物)或downgal80-f和downgal80-r(下遊同源臂引物)各1μl，ddh2o補足至50μl。pcr反應條件為：預變性98℃，8min，然後進入溫度循環98℃，10sec；58℃，15sec；72℃，30sec；共35個循環，終止溫度為16℃。pcr擴增完成後，經1％瓊脂糖凝膠電泳驗證正確的pcr產物，利用pcr purification kit(transgen，北京)純化獲得上遊或下遊同源臂片段。
[0057]
擴增chs表達盒(pgal7-chs-tcyc1)：以1μl，濃度為100ng/μl的pesc-chs+chi-his質粒(由杭州tsingke生物有限公司合成，合成所得質粒的核苷酸序列如seq id no:1)為模板，2
×
phanta max master mix(vazyme，南京)高保真dna聚合酶25μl，引物pgal7-chs-t-f和pgal7-chs-t-r各1μl，ddh2o補足至50μl。pcr反應條件為：預變性98℃，5min，然後進入溫度循環98℃，10sec；58℃，15sec；72℃，1min；共35個循環，終止溫度為16℃。擴增完成後，經1％瓊脂糖凝膠電泳驗證正確的pcr產物，利用pcr purification kit純化獲得chs表達盒。
[0058]
用overlap pcr，獲得donor dna。以gal80上遊同源臂、chs表達盒和gal80下遊同源臂dna片段為模板(根據各片段回收濃度以片段摩爾濃度比為1：3：1添加)，2
×
phanta max master mix(vazyme，南京)高保真dna聚合酶25μl，引物up gal80-f和downgal80-r各1μl，ddh2o補足至50μl。pcr反應條件為：預變性98℃，5min，然後進入溫度循環98℃，10sec；58℃，15sec；72℃，1min；共35個循環，終止溫度為16℃。擴增完成後，純化或膠回收得到的pcr產物測序正確後即得donor dna。
[0059]
3)s.cerevisiae c00化轉感受態製備(後續基因編輯所需的釀酒酵母感受態製備以此為例)
[0060]
(1)取出保藏菌種c00，劃線於ypd固體平板，30℃恆溫培養箱中培養2-3天。
[0061]
(2)挑取新鮮單菌落接種於5ml ypd液體培養基中，30℃，200rpm振蕩培養15-20h。
[0062]
(3)取上述菌液以2％接種量接入新鮮20ml ypd培養基中，30℃，200rpm振蕩培養至od600＝0.5-0.7。
[0063]
(4)將20ml菌液轉移至50ml滅菌離心管中，4000rpm，4℃，離心5min，收集細胞。
[0064]
(5)用移液槍取900μl預冷無菌水、100μl 10
×
liac溶液加入至上述50ml離心管中，輕柔重懸細胞，菌液轉移至2ml滅菌ep管中，4000rpm，4℃，離心1min，收集細胞。
[0065]
(6)再次使用900μl預冷無菌水、100μl 10
×
liac溶液重懸菌體、離心。重複上述步驟三次。
[0066]
(7)最後向ep管中加入900μl預冷無菌水、100μl 10
×
liac溶液重懸菌體，靜置5min，4000rpm，4℃，離心1min，棄除900μl上清液，剩餘上清液重懸細胞，得c00感受態。
[0067]
4)peg/liac釀酒酵母化轉(後續基因編輯時轉化以此為例)
[0068]
(1)滅菌ep管中加入轉化體系。轉化體系見下表：
[0069][0070]
(2)向上述轉化體系中加入25μl製備好的感受態細胞，使用渦旋震蕩儀混勻10s。將該ep管放置於30℃恆溫培養箱中30min。
[0071]
(3)加入36μl二甲基亞碸，渦旋震蕩儀混勻10s。42℃水浴中熱激15min。
[0072]
(4)4000rpm，4℃，離心1min，收集細胞。棄上清液，加入400μl 5mm cacl2溶液重懸細胞，靜置15min。
[0073]
(5)離心收集細胞。棄上清液，加入1ml滅菌ypd培養基，輕柔重懸菌體，30℃，200rpm振蕩培養1h。
[0074]
(6)離心收集細胞。棄上清液，加入1ml滅菌水清洗菌體，同上離心。
[0075]
(7)棄700-800μl ypd培養基，用剩餘培養基輕柔重懸菌體後塗布於ypd+g418(本文中g418使用終濃度為200mg/l)固體平板。30℃恆溫培養箱中培養2-3天。
[0076]
5)釀酒酵母轉化子鑑定(後續基因編輯時菌落pcr以此為例)
[0077]
mightyprep reagent for dna(takara，大連)用於釀酒酵母的細胞裂解獲得菌落pcr用模板。以1μl的上清細胞裂解液為模板，green taq mix(vazyme，南京)25μl，引物gal80-check-f1和gal80-check-r1各1μl，ddh2o補足至50μl。pcr反應條件為：預變性98℃，8min，然後進入溫度循環98℃，15sec；58℃，15sec；72℃，30sec；共35個循環，終止溫度為16℃。該pcr產物經測序正確後，即完成基因編輯。
[0078]
6)grna-gal80質粒消除(後續基因編輯時grna質粒消除以此為例)
[0079]
(1)將有正確基因型的轉化子接入3ml ypd培養12h；(2)取100μl轉接新的3ml ypd，連續傳代3次；(3)吸取5μl劃線於ypd固體平板，培養2-3天；(4)挑取同一單菌落於無抗ypd固體平板和ypd+g418抗性平板；若無抗ypd固體平板上能長單菌落，g418平板不能長出單菌落，即得grna-gal80質粒已丟失的工程菌。
[0080]
7)後續基因編輯若為基因組替換則參考gal80δ::pgal7-chs-tcyc1操作流程。
[0081]
4.crispr/cas9基因敲除的操作，以pdc5基因為例
[0082]
基因敲除相較於替換區別在於，只需在構建donor dna步驟中，直接融合上下遊同源臂片段。
[0083]
擴增上下遊同源臂：以1μl濃度為100ng/μl釀酒酵母cen.pk2-1c基因組為模板，2
×
phanta max master mix高保真dna聚合酶25μl，引物uppdc5-f和uppdc5-r或downpdc5-f和downpdc5-r各1μl，ddh2o補足至50μl。pcr反應條件為：預變性98℃，8min，然後進入溫度循環98℃，10sec；58℃，15sec；72℃，15sec；共35個循環，終止溫度為16℃。pcr擴增完成後，經1％瓊脂糖凝膠電泳驗證正確的pcr產物，利用pcr purification kit純化獲得上遊或下遊同源臂片段。
[0084]
overlap pcr，獲得donor dna。以pdc5上遊同源臂和pdc5下遊同源臂回收片段為模板(片段摩爾濃度比為1：1)，2
×
phanta max master mix高保真dna聚合酶25μl，引物uppdc5-f和downpdc5-r各1μl，ddh2o補足至50μl。擴增完成後，純化或膠回收得到的pcr產物測序正確後即得donor dna。
[0085]
其餘步驟參考gal80δ::pgal7-chs-tcyc1基因替換。
[0086]
5.crispr/cas9抗反饋抑制點突變的操作，以pha2δ::p
pgk1-aro7
g141s-t
hxt7
為例
[0087]
aro7抗反饋抑制的解除及其過表達屬於基因替換，相較於本發明前文所述的替換，區別之處在於需要對aro7基因關鍵位點進行點突變實現抗反饋抑制目的。
[0088]
將aro7編碼蛋白的第141位甘氨酸突變為絲氨酸。首先，aro7
g141s
表達盒以全質粒擴增的方式構建，即引物p
pgk1-aro7
m-t
hxt7-f和p
pgk1-aro7
m-t
hxt7-r以p-aro7m質粒(實驗室保存，所述質粒的核苷酸序列如seq id no:2)為模板反向擴增得到p
pgk1-aro7
m-t
hxt7
片段；其
次，上下遊同源臂同前述方法擴增(擴增上遊同源臂引物為：up pha2-f、up pha2-r；擴增下遊同源臂引物為：down pha2-f、down pha2-r)；最後，用引物up pha2-f和down pha2-r通過overlap pcr融合上述三個片段得到donor dna。
[0089]
其餘步驟參考gal80δ::pgal7-chs-tcyc1操作流程。trp2δ::p
tef1-aro4
k229l-t
cyc1
參考pha2δ::p
pgk1-aro7
g141s-t
hxt7
。其中p-aro4m質粒由實驗室保存，所述質粒的核苷酸序列如seq id no:3)
[0090]
6.重組質粒pesc-tal-4cl-hygr的構建
[0091]
rgtal和sc4cl基因由杭州tsingke生物有限公司經過釀酒酵母密碼子優化、多克隆位點為：sac i\xho i，合成於pesc-his載體上，所得pesc-tal-4cl-his質粒的核苷酸序列如seq id no:4。
[0092]
以pesc-tal-4cl-his質粒為模板，反向擴增得pesc-tal-4cl(去除his3表達框)載體骨架；以p-grna-delta質粒(由浙工大胡忠策老師實驗室惠贈，所述質粒的核苷酸序列如seq id no:5)為模板，引物hygr-f、hygr-r擴增得到潮黴素抗性基因的表達框(p
tef-hygr)。pesc-tal+4cl與hygr表達框用clonexpressⅱone step cloning kit試劑盒一步克隆後化轉至e.coli dh5α。菌落pcr(引物為+hygr-check-f1和+hygr-check-r1)和測序結果表明pesc-tal-4cl-hygr質粒構建成功。
[0093]
7.釀酒酵母n01的構建
[0094]
首先，製備t01感受態；其次，將pesc-tal-4cl-hygr質粒用liac/peg化轉導入t01感受態細胞中，塗布於ypd+hyg(hyg工作濃度為200mg/l)平板，30℃培養2-3天至長出轉化子。最後，用引物+hygr-check-f1和+hygr-check-r1進行菌落pcr驗證，驗證正確的菌株進行甘油管保藏，得到釀酒酵母工程菌n01。
[0095]
8.釀酒酵母n02的構建
[0096]
donor dna的構建：以s.cerevisiae cen.pk2-1c基因組為模板，up-delta-f和up-delta-r引物擴增delta位點上遊同源臂，約160bp；psed1-f1和psed1-r1引物擴增sed1啟動子；perg20-f1和perg20-r1引物擴增erg20啟動子；down-delta-f和down-delta-r引物擴增delta位點下遊同源臂，約250bp。以pesc-tal-4cl-his、pesc-chs-chi-his質粒為模板(由杭州tsingke生物有限公司合成，所述質粒的核苷酸序列分別見seq id no:1和seq idno:4)，4cl-f和4cl-r、chs-f和chs-r引物分別擴增4cl及其adh1終止子和chs及其cyc1終止子。上述pcr產物經純化或膠回收得到6個dna片段。overlap pcr得delta整合donor dna。sc4cl和hachs表達盒整合至delta位點示意圖見圖6。
[0097]
製備釀酒酵母n01感受態，其餘步驟參考gal80δ::pgal7-chs-tcyc1操作流程。驗證正確的菌株進行甘油管保藏，得到釀酒酵母工程菌n02。
[0098]
實施例2：搖瓶發酵生產酪氨酸及柚皮素
[0099]
(1)將實施例1中得到的釀酒酵母工程菌t01、n01和n02接種於20ml ypd液體培養基，30℃、180rpm培養15h得到種子液。
[0100]
(2)將步驟(1)得到的種子液以2％接種量轉接至30ml ypd液體培養基，30℃、180rpm發酵至96h。
[0101]
(3)48h、72h和96h取樣檢測各工程菌生物量、l-酪氨酸及柚皮素產量，結果如下圖3、4和5所示。胞外柚皮素產量的檢測樣品按如下方法製備：取800μl發酵液加入等體積的乙
酸乙酯渦旋震蕩30min，吸取上清至ep管中，再次加入400μl乙酸乙酯同上渦旋震蕩30min，收集兩次上清，使用真空濃縮儀在50℃溫度下離心濃縮樣品40min，加入等體積色譜級甲醇溶解濃縮後的乾燥沉澱，用0.2μm有機系濾膜過濾得待測發酵樣品。
[0102]
表1本發明所涉及菌株及質粒
[0103]
[0104][0105]
表2本發明所使用到的引物
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[0109]