與血液凝固相關的疾病的預防和治療的製作方法

2023-12-11 23:54:02

專利名稱：與血液凝固相關的疾病的預防和治療的製作方法
技術領域：
本發明涉及產生一種具有持久性凝固性過高狀態的動物模型的方法，用於具有持久性凝固性過高狀態的疾病的預防或治療劑，用於感染導致的凝固性過高狀態的預防或治療劑，用於靜脈或動脈血栓形成的預防或治療劑，和由於血管中層(vascular media)肥大導致的疾病的預防或治療物質。
背景技術：
血液凝固是一種反應，其中絲氨酸蛋白酶母體持續被激活形式的蛋白酶激活，其最終產生凝血酶，從而導致纖維蛋白形成。血栓形成作為過渡增加的血液凝固反應的結果而產生，所述過渡增加的血液凝固反應由於血漿凝固和纖維蛋白溶解系統中、血小板功能中、與各種疾病狀態的發展相關的白細胞和血管內皮細胞的變化而引起。血液凝固反應的起始因素是組織因子。在急性冠狀血管症候群例如急性心肌梗塞和不穩定咽峽炎中，當動脈粥樣硬化發生之後形成的斑塊中大量存在的組織因子暴露於血時，由於斑塊破裂而觸發血液凝固反應。
在與膿毒症和惡性腫瘤相關的擴散性血管內凝固綜合症中，激活的單細胞和巨噬細胞表達組織因子或者腫瘤細胞表達組織因子，從而引發增加的血液凝固。一旦組織因子與血液接觸，則在非常短的時間內發生血液凝固反應並且導致血液凝塊的形成。因此，為了防止血栓形成，需要阻斷可能在任何時間觸發的或者可能持久性發生的血液凝固反應。因此，表現出持久性基礎上的凝固性過高狀態的實驗模型對於開發有效抗凝劑來說是必需的。在任何常規已知的血栓形成模型中，都是在短時間內誘發血栓形成。
因此，根據本發明的一個方面，提供了一種實驗模型，其中通過在持久基礎上使人組織因子接觸血液以使凝固性過高狀態持久。
血液凝固是一種反應，其中絲氨酸蛋白酶母體持續被激活形式的蛋白酶激活，其最終產生凝血酶，從而導致纖維蛋白形成。血栓形成作為過渡增加的血液凝固反應的結果而產生，所述過渡增加的血液凝固反應由於血漿凝固和纖維蛋白溶解系統中、血小板功能中、與各種疾病狀態的發展相關的白細胞和血管內皮細胞的變化而引起。血液凝固反應的起始因素是組織因子(TF)。
在急性冠狀血管症候群例如急性心肌梗塞和不穩定咽峽炎中，當動脈粥樣硬化發生之後形成的斑塊中大量存在的組織因子暴露於血時，由於斑塊破裂而觸發血液凝固反應。在與膿毒症和惡性腫瘤相關的擴散性血管內凝固綜合症中，激活的單細胞和巨噬細胞表達TF或者腫瘤細胞表達TF，從而引發增加的血液凝固，並且這種狀態是持久的。一旦TF接觸血液，則在非常短的時間內發生血液凝固反應並且導致血液凝塊的形成。因此，為了防止血栓形成，需要阻斷可能在任何時間觸發的或者可能持久性發生的血液凝固反應。因此，需要能阻斷在持久性基礎上發生的凝固性過高狀態的持久性的藥物作為有效抗血栓形成劑。
因此，根據本發明的第二方面，提供了用於具有持久性凝固性過高狀態疾病的新穎的預防或治療物質。
嚴重的感染經常與異常凝固有關，異常凝固誘發疾病狀態，例如多器官衰竭和擴散性血管內凝固綜合症，並且代表加重患者預後的因素。因此考慮使用的指徵是重要的。在嚴重感染中，其中全身性感染，例如膿毒症，血管內皮細胞的損傷已經暗示器官失調的啟動機理。在膿毒症中，特別是在革蘭氏陰性細菌引起的膿毒症中，細胞成分脂多糖(LPS)起著重要作用。
釋放到血液中的LPS不僅激活單細胞並從而產生導致凝固性過高狀態的組織因子(TF)，而且產生並釋放細胞因子，例如TNF，IL-1β和IL-8，並從而激活嗜中性粒細胞和血管內皮細胞。被激活的嗜中性粒細胞粘附細胞內皮細胞以釋放細胞毒性物質例如活性酶和彈性蛋白酶，其損傷血管內皮細胞。在由細胞因子激活的或者嗜中性粒細胞損傷的血管內皮細胞中，TF的產生增強，其進一步加重了凝固性過高狀態。結果，發生全身性微血栓，這引發導致多器官衰竭的器官中的循環衰竭。
因此，非常需要開發用於感染引起的血液可凝狀態的預防或治療劑。
因此，根據本發明的第三方面，提供了用於感染引起的血液可凝狀態的新穎的預防或治療劑。
作為導致靜脈血栓形成啟動的機理，認為靜脈鬱積、對靜脈壁的損傷以及凝固性過高起著重要作用。特別地，侵襲作用例如手術、嬰兒出生和外傷誘發對血管壁的物理損傷以及凝固作用及纖維蛋白溶解系統異常，並且手術後的褥瘡誘發靜脈鬱積。不只是靜脈內生成的血液凝塊誘導肢體的循環衰竭，而且凝塊本身進入循環並且流入肺動脈導致致命的肺栓塞。因此，考慮預防靜脈血栓形成本身是重要的。因此，需要開發能有效防止或治療靜脈血栓形成的製劑。
因此，根據本發明的第四方面，提供了治療靜脈血栓形成的新穎的預防或治療劑。
在動脈血栓形成中，具有晚期硬化血管中發生血液凝塊，並且在大多數情況下，重要器官例如大腦和心臟中發生疾病是致命的。特別是，相信急性冠狀綜合症例如不穩定咽峽炎和急性心肌梗塞是容易引起突然死亡的危險疾病狀態。最近證明動脈粥樣硬化斑塊破裂並且接著發生血栓是疾病發生機理中的重要因素。
還已經證明血栓形成的起始因子組織因子(TF)在斑塊的細胞表面上和胞外間隙過量表達，因此，相信由斑塊破裂導致的組織因子(TF)暴露於血液中是血栓形成的主要因素。
因此，非常需要開發預防或治療動脈血栓形成的新穎的藥物。
因此，根據本發明的第五方面，提供了用於動脈血栓形成的新穎的預防或治療劑。
在治療冠狀心臟病中，經皮經腔冠狀血管成形術(PTCA)佔據重要位置。但是手術後幾個月發生的再狹窄防礙了該治療方法的效果，因此造成問題。作為再狹窄的原因，變得越來越清楚，對內皮細胞的損傷導致的急性期和亞急性期間形成的血栓形成是重要的。損傷的內皮細胞表達的組織因子(TF)的血液與平滑肌和亞內皮組織中的成纖維細胞的接觸對於血栓形成是重要的。血管壁中的細胞生長以使覆蓋生成的血栓從而使血管腔區域變窄。血管組織本身的生長和血管直徑的限制也是造成血管腔區域變窄的原因，並且它們是再狹窄的直接因素。因此，非常需要預防或治療再狹窄的新穎的藥物。
因此，根據本發明的第六方面，提供了用於血管中層的肥大導致的疾病的新穎的預防或治療物質。
本發明的公開為了解決上述問題進行了集中而廣泛研究之後，本發明人發現，通過向實驗動物植入(implanted)通過在其中引入人組織因子(TF)基因而能持久性表達人組織因子的動物細胞從而提高動物中人組織因子的濃度，能夠將所述動物的凝固性過高狀態長時間保持，從而完成本發明。
因此，根據本發明的第一方面，本發明提供了植入了其中插入了編碼人組織因子(TF)的基因或者其部分並且能表達所述基因的動物細胞的實驗動物，所述動物具有長時間持續凝固性過高狀態的非人動物。
所述人組織因子的部分是例如缺少胞內區的人組織因子。所述動物細胞優選是哺乳動物細胞。所述哺乳動物細胞優選是人骨髓瘤細胞。所述動物優選是小鼠。至少一種下面的現象指徵所述凝固性過高狀態，包括人組織因子血漿濃度的提高，血小板減少，纖維蛋白原減少，可溶性纖維蛋白單體複合物濃度提高，和凝血酶-抗凝血酶III複合物的濃度提高。
本發明還提供了產生上述動物的方法，其中向非人動物植入了編碼人組織因子(TF)的基因或者其部分並且能表達所述基因的動物細胞，然後篩選具有持久凝固性過高狀態的動物。
本發明還提供了篩選抗血栓形成劑的方法，該方法包括使用上述動物。
為了解決上述第二個問題進行了集中而廣泛研究之後，本發明人發現，抗人組織因子的抗體(抗-人TF抗體，或者有時稱之為抗-TF抗體)能防止凝固性過高狀態的持久性。
因此，根據本發明的第二方面，本發明提供了用於具有持久性凝固性過高狀態的疾病的預防或治療劑，所述製劑包括抗人組織因子(人TF)的抗體。
上述抗體是例如多克隆抗體。上述抗體優選是單克隆抗體。上述抗體優選是重組抗體。上述抗體優選是改變的抗體。上述改變的抗體優選是嵌合抗體或人源化抗體。上述人源化抗體優選是b-b，i-b或i-b2型人源化抗體。上述抗體例如是抗體修飾物。上述抗體修飾物是例如抗體片段Fab，F(ab』)2或Fv，或者單鏈Fv(scFv)。
為了解決上述第三個問題進行了集中而廣泛研究之後，本發明人發現，抗人組織因子的抗體(抗-人TF抗體，或者有時稱之為抗-TF抗體)能防止或治療感染導致的凝固性過高狀態。
因此，根據本發明的第三方面，本發明提供了用於感染導致的凝固性過高狀態的預防或治療劑，所述製劑包括抗人組織因子(人TF)的抗體。
上述抗體是例如多克隆抗體。上述抗體優選是單克隆抗體。上述抗體優選是重組抗體。上述抗體優選是改變的抗體。上述改變的抗體優選是嵌合抗體或人源化抗體。上述人源化抗體優選是b-b，i-b或i-b2型人源化抗體。上述抗體例如是抗體修飾物。上述抗體修飾物是例如抗體片段Fab，F(ab』)2或Fv，或者單鏈Fv(scFv)。
為了解決上述第四個問題進行了集中而廣泛研究之後，本發明人發現，抗人組織因子的抗體(抗-人TF抗體，或者有時稱之為抗-TF抗體)能防止或治療靜脈血栓形成。
因此，根據本發明的第四方面，本發明提供了用於靜脈血栓形成的預防或治療劑，所述製劑包括抗人組織因子(人TF)的抗體。
上述抗體是例如多克隆抗體。上述抗體優選是單克隆抗體。上述抗體優選是重組抗體。上述抗體優選是改變的抗體。上述改變的抗體優選是嵌合抗體或人源化抗體。上述人源化抗體優選是b-b，i-b或i-b2型人源化抗體。上述抗體例如是抗體修飾物。上述抗體修飾物是例如抗體片段Fab，F(ab』)2或Fv，或者單鏈Fv(scFv)。
為了解決上述第五個問題進行了集中而廣泛研究之後，本發明人發現，抗人組織因子的抗體(抗-人TF抗體，或者有時稱之為抗-TF抗體)能防止或治療動脈血栓形成。
因此，根據本發明的第五方面，本發明提供了用於動脈血栓形成的預防或治療劑，所述製劑包括抗人組織因子(人TF)的抗體。
上述抗體是例如多克隆抗體。上述抗體優選是單克隆抗體。上述抗體優選是重組抗體。上述抗體優選是改變的抗體。上述改變的抗體優選是嵌合抗體或人源化抗體。上述人源化抗體優選是b-b，i-b或i-b2型人源化抗體。上述抗體例如是抗體修飾物。上述抗體修飾物是例如抗體片段Fab，F(ab』)2或Fv，或者單鏈Fv(scFv)。
為了解決上述第六個問題進行了集中而廣泛研究之後，本發明人發現，抗人組織因子的抗體(抗-人TF抗體，或者有時稱之為抗-TF抗體)能防止或治療血管中層肥大引起的疾病。
因此，根據本發明的第六方面，本發明提供了用於血管中層肥大引起的疾病的預防或治療劑，所述製劑包括抗人組織因子(人TF)的抗體。
上述抗體是例如多克隆抗體。上述抗體優選是單克隆抗體。上述抗體優選是重組抗體。上述抗體優選是改變的抗體。上述改變的抗體優選是嵌合抗體或人源化抗體。上述人源化抗體優選是b-b，i-b或i-b2型人源化抗體。上述抗體例如是抗體修飾物。上述抗體修飾物是例如抗體片段Fab，F(ab』)2或Fv，或者單鏈Fv(scFv)。
附圖的簡要說明

圖1是H鏈嵌合/L鏈嵌合抗體，H鏈人源化b型/L鏈人源化b型抗體，H鏈人源化i型/L鏈人源化b型抗體，和H鏈人源化i型/L鏈人源化b2型抗體的抗原結合活性之比較圖。
圖2是H鏈嵌合/L鏈嵌合抗體，H鏈人源化b型/L鏈人源化b型抗體，H鏈人源化i型/L鏈人源化b型抗體，和H鏈人源化i型/L鏈人源化b2型抗體的中和人TF的活性(抑制Xa因子產生的TF活性)之比較圖。
圖3是顯示H鏈嵌合/L鏈嵌合抗體，H鏈人源化b型/L鏈人源化b型抗體，H鏈人源化i型/L鏈人源化b型抗體，和H鏈人源化i型/L鏈人源化b2型抗體的中和人TF的活性(抑制X因子產生的TF活性)之比較圖。
圖4顯示是H鏈嵌合/L鏈嵌合抗體，H鏈人源化b型/L鏈人源化b型抗體，H鏈人源化i型/L鏈人源化b型抗體，和H鏈人源化i型/L鏈人源化b2型抗體的中和人TF的活性(抑制血漿凝固的TF活性)之比較圖。
圖5是顯示在植入了已經引入人組織因子基因的細胞的小鼠中植入腫瘤細胞後(虛線)和在植入了沒有引入所述基因的細胞的小鼠中植入腫瘤細胞之後(實線)腫瘤體積隨著時間的變化圖。
圖6是顯示在植入了已經引入人組織因子基因的細胞的小鼠中植入腫瘤細胞後(虛線)和在植入了沒有引入所述基因的細胞的小鼠中植入腫瘤細胞之後(實線)人組織因子的血漿濃度隨著時間的變化圖。
圖7是顯示在植入了已經引入人組織因子基因的細胞的小鼠中植入腫瘤細胞後(虛線)和植入了沒有引入所述基因的細胞的小鼠中植入腫瘤細胞之後(實線)血小板計數隨著時間的變化圖。
圖8是顯示在植入了已經引入人組織因子基因的細胞的小鼠中植入腫瘤細胞後(虛線)和在植入了沒有引入所述基因的細胞的小鼠中植入腫瘤細胞之後(實線)纖維蛋白原的血漿濃度隨著時間的變化圖。圖中的點指示相對值，其中以沒有植入腫瘤細胞的對照小鼠(正常)的纖維蛋白原的濃度作為100％。
圖9是顯示在植入了已經引入人組織因子基因的細胞的小鼠中植入腫瘤細胞後(虛線)和在植入了沒有引入所述基因的細胞的小鼠中植入腫瘤細胞之後(實線)可溶性纖維蛋白單體複合物(sFMC)的血漿濃度隨著時間的變化圖。
圖10是顯示在植入了已經引入人組織因子基因的細胞的小鼠中植入腫瘤細胞後(虛線)和在植入了沒有引入所述基因的細胞的小鼠中植入腫瘤細胞之後(實線)凝血酶-抗凝血酶III複合物(TAT)的血漿濃度隨著時間的變化圖。
圖11顯示是小鼠體內血小板計數隨時間的變化圖，所述小鼠在植入已經引入了人組織因子基因的腫瘤細胞後45天開始，每周施用1毫克/千克抗-人TF抗體、共施用三周。
圖12是顯示最後施用抗人組織因子抗體後第6天小鼠體內可溶性纖維蛋白單體複合物(sFMC)的血漿濃度圖，所述小鼠在植入已經引入了人組織因子基因的腫瘤細胞後45天開始，每周施用1毫克/千克所述抗體、共施用三周。
圖13是顯示最後施用抗人組織因子抗體後第6天小鼠體內凝血酶-抗凝血酶III複合物(TAT)的血漿濃度圖，所述小鼠在植入已經引入了人體組織因子基因的腫瘤細胞後45天開始，每周施用1毫克/千克所述抗體、共施用三周。
圖14是顯示使用滲透泵，在植入了其中已經引入了人TF基因的腫瘤細胞49天後一次施用1毫克/千克抗-人TF抗體或者以601.5IU/千克、1900.3IU/千克或6487.3IU/千克持續24-小時施用低分子量肝素的小鼠體內的血小板計數隨著時間的變化圖。
實施本發明的最佳方式已經克隆了編碼用於本發明的第一方面的人組織因子(TF)的基因，其鹼基序列和由其編碼的胺基酸序列也是已知的(H.Morrissey等，細胞(Cell)，Vol.50，p.129-135(1987))。SEQ ID NO103-104中給出了編碼全長人組織因子和相應的胺基酸序列的鹼基序列。根據本發明，可以使用其中去除了胞內區的編碼TF的基因或者編碼保留引發血液凝固系統活性的部分的基因。
作為將該基因引入動物細胞並且表達其的載體，可以使用任何在動物細胞中有功能的表達載體，包括，例如，pCOS1，pSV2-neo，pMAM-neo，和pSG5。根據本發明，通常使用有用的啟動子，人組織因子基因和位於其3』-末端下遊polyA信號可以功能性地連接並且能夠被表達。作為啟動子/增強子，可以提到人巨細胞病毒立即早期啟動子/增強子，病毒啟動子例如逆轉錄病毒、多瘤病毒、腺病毒和猿猴腎病毒40(SV40)的啟動子，從哺乳動物細胞例如人延伸因子1α(HEF1α)衍生的啟動子/增強子。對於表達載體，作為複製因子，可以使用來自SV40、多瘤病毒、腺病毒等的那些。此外，對於表達載體可以含有作為可選擇性標記物的磷酸轉移酶APH(3』)II或I(neo)基因，胸苷激酶(TK)基因，二氫葉酸還原酶(dhfr)基因等。
作為將基因引入細胞的方法，可以使用電穿孔方法，磷酸鈣方法，脂轉染方法等。作為其中引入表達載體的細胞，可以使用任何細胞，只要其能植入給動物細胞。為了該目的，可以使用各種培養細胞，包括例如哺乳動物細胞例如來自人、小鼠、大鼠、倉鼠和猴的培養細胞，腫瘤細胞是最優選的。作為細胞的具體例子，可以使用人骨髓瘤細胞系例如KPMM2和ARH-77，小鼠白血病細胞系例如P815，P388，和L1210。
本發明中使用的實驗動物是除人之外的哺乳動物，優選小的實驗動物，例如小鼠，大鼠和倉鼠，小鼠是最優選的。
根據本發明的第二方面，凝固性過高狀態指人TF誘導的身體狀況，並給出血小板計數減少和纖維蛋白原濃度降低，可溶性纖維蛋白單體複合物(sFMC)濃度提高以及凝血酶-抗凝血酶III複合物(TAT)提高的病徵。
儘管本發明中使用的抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體，倘若其對於由於TF的凝固性過高狀態的持久性具有預防或治療作用，單克隆抗體是優選的。另外也可以使用嵌合抗體，人源化抗體或以單克隆抗體為基礎的單鏈Fv等。人源化抗體是特別優選的。
儘管在本發明第三方面中使用的抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體，倘若其對於由於TF的凝固性過高狀態的持久性具有預防或治療作用，單克隆抗體是優選的。另外也可以使用嵌合抗體，人源化抗體，以單克隆抗體為基礎的單鏈Fv等。人源化抗體是特別優選的。
儘管本發明第四方面中使用的抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體，倘若其對於由於TF的凝固性過高狀態的持久性具有預防或治療作用，單克隆抗體是優選的。另外也可以使用嵌合抗體，人源化抗體，以單克隆抗體為基礎的單鏈Fv等。人源化抗體是特別優選的。
儘管本發明第五方面中使用的抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體，倘若其對於由於TF的凝固性過高狀態的持久性具有預防或治療作用，單克隆抗體是優選的。另外也可以使用嵌合抗體，人源化抗體，以單克隆抗體為基礎的單鏈Fv等。人源化抗體是特別優選的。
儘管本發明第六方面中使用的抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體，倘若其對於由於TF的凝固性過高狀態的持久性具有預防或治療作用，單克隆抗體是優選的。另外也可以使用嵌合抗體，人源化抗體，以單克隆抗體為基礎的單鏈Fv等。人源化抗體是特別優選的。
1.抗-人TF抗體本發明中使用的抗-人TF抗體可以是任何來源，任何類型(單克隆，多克隆)和任何形狀，倘若它們具有預防或治療病毒性出血熱的作用。
使用公知方法能夠獲得作為多克隆抗體或單克隆抗體的本發明中使用的抗-人TF抗體。哺乳動物源的單克隆抗體特別優選作為本發明中使用的抗-人TF抗體。哺乳動物源的單克隆抗體包括雜交瘤產生的那些和通過基因工程技術在用包含抗體基因的表達載體轉化的宿主中產生的那些。這些抗體通過與人TF結合藉助人TF來抑制血栓的形成。
2.產生抗體的雜交瘤使用公知方法基礎性產生生產單克隆抗體的雜交瘤。也就是使用人TF或者其部分(片段)作為敏化抗原，並且用常規免疫方法對其進行免疫。用常規細胞融合方法使這樣獲得的免疫細胞與已知的親本細胞融合，然後通過常規篩選方法篩選生產單克隆抗體的那些細胞而製備單克隆抗體。
具體地說，可以用下面的方法獲得單克隆抗體。
首先，通過表達J.H.Morrissey等，細胞(Cell)，Vol.50，p.129-135(1987)中公開的TF基因/胺基酸序列能夠獲得用作抗體的敏化抗原的人TF。即將編碼人TF的基因序列插入已知的表達載體以轉化合適的宿主細胞，之後，用已經方知純化存在於宿主細胞或者其培養上清液中的靶人TF蛋白質。本說明書參考實施例1中描述了該方法。此外，可以根據參考實施例2描述的方法，從含有TF的生物樣品例如人胎盤通過提取和純化使用作為抗原的人TF。
然後，將純化的人TF蛋白質用作敏化抗原。或者通過例如基因重組可以產生其中人TF的C-末端的膜滲透區已經被去除的可溶性TF，並且其可以用作敏化抗原。
儘管對於要用敏化抗原免疫的哺乳動物沒有特別限定，但是優選考慮它們與細胞融合中使用的親本細胞相容性來選擇。它們典型的實例包括嚙齒類動物例如小鼠、大鼠和倉鼠或者兔、猴等。
使用公知方法進行用敏化抗原對動物的免疫。例如，作為典型的免疫方法，通過將敏化抗原注射到哺乳動物腹腔或皮下來進行免疫。
具體地說，用磷酸緩衝鹽水(PBS)或生理鹽水將敏化抗原稀釋到合適的體積，根據需要將生成的懸浮液與合適量的一般佐劑例如弗氏完全佐劑混合。乳化之後，以多劑量對哺乳動物每4-21天施用。此外在用敏化抗原免疫時可以使用合適的載體。
在用這種方式免疫動物並且證實血清中期望的抗體水平提高之後，從該哺乳動物取免疫細胞並且進行細胞融合。然而脾細胞是特別優選的免疫細胞實例。
哺乳動物骨髓瘤細胞可用作與上述免疫細胞進行細胞融合的其它親本細胞。各種已知的細胞系可用作這些骨髓瘤細胞，優選包括P3(P3×63Ag8.653)(Kearney，J.F.et al.，J. Immunol. (1979)123，1548-1550)，P3×63Ag8U.1(Yelton，D.E.et al.，Current Topicsin Microbiology and Immunology(1978)81，1-7)，NS-1(Kohler，G.and Milstein，C.，Eur.J.Immunol.(1976)6，511-519)，MPC-11(Margulies，D.H.et al.，Cell(1976)8，405-415)，SP2/0(Shulman，M.et al.，Nature(1978)276，269-270)，F0(de St.Groth，S.F.and Scheidegger，D.J.，J.Immunol.Methods(1980)35，1-21)，S194(Trowbridge，I.S.，J.Exp.Med.(1978)148，313-323)andR210(Galfre，G.et al.，Nature(1979)277，131-133).
基本上根據已知方法例如Milstein等(Kohler，G.和Milstein，C.，酶學方法(Method Enzymol)(1981)733-46)描述的方法，可以進行上述免疫細胞和骨髓瘤細胞之間的細胞融合。
更具體地說，在例如細胞融合促進劑存在下，在常規營養肉湯中進行上述細胞融合。所使用的細胞融合促進劑的實例包括聚乙二醇(PEG)，仙臺病毒(HVJ)等，另外，根據需要，可以加入佐劑例如二甲亞碸等以進一步增強融合效果。
免疫細胞和骨髓瘤細胞的使用比例可以任意設定，例如優選的比例是免疫細胞的數目是骨髓瘤細胞數目的1-10倍。用於上述細胞融合要使用的培養基的例子包括RPMI1640培養基、MEM培養基和其它常用於該細胞培養類型的適合上述骨髓瘤細胞系生長的常規培養基。而且可以與上述介質聯合使用血清補充物例如胎牛血清(FCS)。
如下進行細胞融合將在上述培養介質中的預定量的上述免疫細胞和骨髓瘤細胞充分混合，通常以30-60％(w/v)的濃度向其中加入預先加熱至大約37℃的PEG(例如具有大約1000-6000的分子量)溶液，並且混合，形成靶融合細胞(雜交瘤)。然後通過連續加入合適量的培養介質，並且通過離心反覆去除上清液從而去除雜交瘤生長不期望的細胞融合試劑等。
通過在常規選擇的培養基例如HAT培養基(培養基含有次黃嘌呤，氨基蝶呤和胸苷)中培養來篩選如此獲得的雜交瘤。一般將在所述HAT培養基中的培養持續足以有效殺死除靶雜交瘤之外的細胞(非融合細胞)的一段時間，一般是幾天至幾周。然後進行常規臨界稀釋，篩選其中生產靶抗體的雜交瘤並且進行單克隆。
另外，除了通過用抗原免疫除人之外的動物獲得上述雜交瘤之外，也可通過體外敏化人淋巴細胞至人TF，並且將得到的敏化的淋巴細胞與人骨髓瘤細胞例如具有永久有絲分裂能力的骨髓瘤細胞系U266融合，來獲得具有人TF結合活性的期望的人抗體(參見日本審查後專利公布No.1(1989)-59878)。此外，將用作抗原的人TF給予具有人抗體基因所有組成成分的全部或部分的轉基因動物，獲得抗-人TF的抗體產生細胞，並衰減那些細胞從衰減的細胞可以獲得對於抗-人TF的人抗體(參見國際未審專利申請WO94/25585，WO93/12227，WO92/03918，WO94/02602，WO96/34096和WO96/33735)。
可以在常規的培養基中傳代培養以這種方式得到的產生單克隆抗體的雜交瘤，並且可以在液氮中儲存延長的時間。
為了從所述雜交瘤獲得單克隆抗體，用常規方法培養所述雜交瘤，獲得培養上清液，或給相容的哺乳動物施用雜交瘤使之在該哺乳動物中增殖，以腹水形式獲得抗體。前一方法適合獲得高純度抗體，而後一方法適合大量生產抗體。
參考實施例2中具體描述了單克隆抗體製備的例子。在該實施例中獲得了六種單克隆抗體(稱為ATR-2，3，4，5，7和8)。儘管這些都可以在本發明中使用，但是ATR-5是最優選的。
3.重組抗體本發明中可以使用重組抗體作為單克隆抗體，所述重組抗體是通過重組基因技術製備的，其中從雜交瘤克隆抗體基因並且摻入到合適的載體中，然後將其引入宿主(參見，例如，Vandamme，A.M.等，歐洲生物化學雜誌(Eur.J.Biochem.)(1990)192，767-775)。
更具體地，從生產抗-人TF抗體的雜交瘤中分離編碼抗-人TF抗體的可變區(V)的mRNA。利用例如公知方法例如胍超離心方法(Chirgwin，J.M.等，生物化學(Biochemistry)(1979)18，5294-5299)或AGPC方法(Chomczynski，P.和Sacchi，N.，Anal.Biochem.(1987)162，156-159)分離mRNA來製備總RNA，然後利用mRNA純化試劑盒(Pharmacia製造)製備靶mRNA。另外，也可使用QuickPrep mRNA純化試劑盒(Pharmacia製造)直接製備mRNA。
使用逆轉錄酶可以從生成的mRNA合成抗體的V區的cDNA。使用AMV逆轉錄酶第一鏈cDNA合成試劑盒(Seikagaku Kogyo製造)可以合成cDNA。另外，可以使用PCR，利用5』-Ampli FINDER RACE試劑盒(Clontech製造)和5』-RACE方法，進行cDNA的合成和擴增(Frohman，M.A.等，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)(1988)85，8998-9002；Belyavsky，A.等，核酸研究(Nucleic Acides Res.)(1989)17，2919-2932)。
從生成的PCR產物純化靶DNA片段並且可以與載體DNA連接。此外，從中構建重組載體然後引入大腸埃希氏桿菌等，從中篩選菌落來製備期望的重組載體。通過已知方法例如二脫氧基核苷酸鏈中止方法可以證實靶DNA的鹼基序列。
獲得編碼期望的抗-人TF抗體的V區的DNA之後，將其滲入包含編碼期望的抗體的恆定區(C區)的DNA的表達載體中。
為了製備本發明使用的抗-人TF抗體，在表達調控區例如增強子和/或啟動子的控制下，將該抗體基因摻入到表達載體中。接著，通過將此表達載體轉化宿主細胞表達抗體。
為了表達抗體基因，可以分別將編碼抗體的重鏈(H鏈)或輕鏈(L鏈)的DNA摻入到表達載體中，並且同時轉化宿主細胞，或者可以將編碼H鏈和L鏈的DNA摻入到單一表達載體中並且轉化宿主(參見國際專利申請公布WO94-11523)。
此外，除了上述宿主細胞之外，可以使用轉基因動物來產生重組抗體。例如，將抗體基因插入編碼一種蛋白質的基因的中間可以融合基因的形式製備重組抗體，所述蛋白質特徵性地產生於乳房奶中。向山羊胚胎注射包含已經向其中插入了抗體基因的融合基團的DNA片段，並且將該胚胎引入雌性山羊體內。從接受所述胚胎的山羊或者其後代生出的轉基因山羊生產的母奶中獲得期望的抗體。另外，為了提高轉基因山羊生產的含有期望的抗體的乳房奶的量，可以給予該轉基因山羊合適的激素(Ebert，K.M.等，生物/技術(Bio/Technology)(1994)12，699-702)。
參考實施例3具體描述了製備重組抗體的方法的實施例。
4.改變的抗體在本發明中，除了上述提到的抗體之外，還可以使用以用於降低抗人的異源抗原性為目的的人工改變的重組抗體，例如嵌合抗體和人源化抗體。可以使用已知的方法製備改變的抗體。
通過將按上述方式的編碼抗體V區的DNA與編碼人抗體C區的DNA連接能夠獲得嵌合抗體，然後將其摻入到表達載體中並且引入宿主產生抗體。使用該已知方法，能夠獲得用於本發明的嵌合抗體。
人源化抗體也稱之為重構人抗體，這是通過將除人以外的哺乳動物的抗體例如小鼠抗體的互補性決定區(CDR)植入到人抗體的互補性決定區的結果。用於此目的的典型重組DNA技術是已知的(參見歐洲未審專利申請公布EP125023和WO96-02576)。
更具體地，通過PCR方法，使用多種寡核苷酸作為引物合成設計用來連接的小鼠抗體CDR和人抗體的構架區(FR)的DNA序列，所述的寡核苷酸是這樣製備的，以使在CDR和FR的末端區具有相互重疊的部分(參見國際專利公布WO98/13388中描述的方法)。
對於通過CDR連接的人抗體的構架區，選擇其中的互補決定區形成滿意的抗原結合位點的區。當期望時，可以取代抗體可變區的構架區中的胺基酸，以使重構的人抗體的互補性決定區可以形成合適的抗原結合位點(Sato，K.等，癌症研究(Cancer Res.)(1993)53，851-856)。
人抗體的C區可以用於嵌合抗體或人源化抗體的C區。例如，在H鏈中可以使用Cγ1，Cγ2，Cγ3和Cγ4，在L鏈中可以使用Cκ和Cλ。另外，可以修飾人抗體的C區以改善抗體的穩定性或者它的生產。
由來自人以外的哺乳動物的抗體的可變區和來自人抗體的恆定區組成嵌合抗體。另一方面，由來自人以外的哺乳動物的抗體的互補性決定區和來自人抗體的構架區和C區組成人源化抗體。由於人源化抗體降低了在人體中的抗原性，使得它們作為本發明中使用的治療劑的活性成分是有用的。
參考實施例4中具體描述了構建嵌合抗體的方法。
參考實施例5中具體描述了構建人源化抗體的方法。在該參考實施例中，使用具有表1和表2中給出的胺基酸序列的a，b，c，d，e，f，g，h，i，j，b1，d1，b3和d3型作為人源化重鏈(H鏈)可變區(V區)。
表1H鏈V區的胺基酸序列FR1 CDR1 FR2CDR21 2 3 4 5 6123456789012345678901234567890 12345 67890123456789 012A3456789012345L39130(a) QVQLLESGAVLARPGTSVKISCKASGFNIK DYYMH WVKQRPGQGLEWIG GNDPANGHSMYDPKFQGZ34963(b) ------------------------------ ----- -------------- -----------------M30885(c) ------------------------------ ----- -------------- -----------------M62723(d) ------------------------------ ----- -------------- -----------------Z80844(e) ------------------------------ ----- -------------- -----------------L04345(f) ------------------------------ ----- -------------- -----------------S78322(g) ------------------------------ ----- -------------- -----------------Z26827(h) ------------------------------ ----- -------------- -----------------U95239(i) ------------------------------ ----- -------------- -----------------L03147(j) ------------------------------ ----- -------------- -----------------P01742(b1) ------------------------------ ----- --R-A-------M- -----------------P01742(d1) ------------------------------ ----- --R-A-------M- -----------------Z80844(b3) ------------------------------ ----- --R-A--------- -----------------Z80844(d3) ------------------------------ ----- --R-A--------- -----------------表2H鏈V區的胺基酸序列(續表1)FR3 CDR3 FR47 89 10 1167890123456789012ABC345678901234 56789012 34567890123L39130(a) RAKLTAATSASIAYLEFSSLTNEDSAVYYCAR DSGYAMDY WGQGTLVTVSS234963(b) -VTI--D--TNT--M-L---RS--T-I----- -------- -----------M30885(c) -VTMLVD--KNQRS-RL--V-AA-T------- -------- -----------M62723(d) -VTI--DE-T-T--M-L---RS------F--- -------- -----------Z80844(e) -VSI--DE-TK---M-LN--RS--T---F--- -------- -----------L04345(f) -VTI--DT-T-T--M-LR--RSD-T------- -------- -----------S78322(g) K-T---DE-S-T--MQL---RS------S--- -------- -----------Z26827(h) -VTMS-DK-S-A---QWT--KAS-T-I-F--- -------- -----------U95239(i) -VTI--D--T-TVFM-L---RS--T------- -------- -----------L03147(j) -VTF--D---NT--M-LR--RSA-T------- -------- -----------P01742(b1) -VTI--D--TNT--M-L---RS--T-I----- -------- -----------P01742(d1) -VTI--DE-T-T--M-L---RS------F--- -------- -----------Z80844(b3) -VTI--D--TNT--M-L---RS--T-I----- -------- -----------Z80844(d3) -VTI--DE-T-T--M-L---RS------F--- -------- -----------
還有，使用具有表3中給出的胺基酸序列的a，b，c，b1和b2型作為人源化輕鏈(L鏈)V區。
表3L鏈V區的胺基酸序列FRI CDRI FR2 CDR21 2 3 4 512345678901234567890123 45678901234 567890123456789 0123456Z37332(a) DIQMTQSPSSLSASYGDRVTITC KASQDIKSFLS WYQQKPGKAPKLLIY YATSLADS68699(b) ----------------------- ----------- --------------- -------P01607(c) ----------------------- ----------- --------------- -------S65921(b1) ----------------------- ----------- -F------S--T--- -------X93625(b2) ----------------------- ----------- ------E----S--- -------FR3 CDR3FR46 7 8 9 1078901234567890123456789012345678 901234567 8901234567Z37332(a) GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC LQHGESPYT FGGGTKVEIKS68699(b) --------------Y----------------- --------- ----------P01607(c) --------------Y-----------I----- --------- ----------S65921(b1) --------------Y----------------- --------- ----------X93625(b2) --------------Y----------------- --------- ----------如參考實施例6和參考實施例7所示，作為結合了上述H鏈V區的不同型和L鏈V區的不同型的抗原結合能力和TF-中和活性的評價結果，當指示為「H鏈V區型」-「 L鏈V區型」時，「b-b」、i-b」和「i-b2」結合表現出特別高的活性。圖1給出了這些人源化抗體的抗原結合能力，圖2給出了人TF的中和活性(TF因子Xa產生抑制活性)，圖3給出了人TF的中和活性(因子X結合抑制活性)，圖4給出了人TF的中和活性(TF血漿凝固抑制活性)。
5.修飾的抗體物質本發明中使用的抗體可以其抗體片段或修飾抗體物質存在，倘若它們結合人TF並且抑制人TF的活性。例如，抗體片段的實例包括單鏈Fv(scFv)，其中Fab，F(ab』)2Fv，或者H鏈或L鏈的Fv與合適的連接體連接。
更具體地，用酶例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶處理抗體，產生抗體片段，或者構建編碼這些抗體片段的基因，然後插入表達載體，其在合適的宿主細胞中表達(參見，例如，Co，M.S.等，免疫學雜誌(J.Immunol.)(1994)152，2968-2976；Better，M.和Horwitz，A.H.，酶學方法(Methods in Enzymology)(1989)178，476-496；Plucktrun，A.和Skerra，A.，酶學方法(Methods inEnzymology)(1989)178，497-515；Lamoyi，E.，酶學方法(Methods inEnzymology)(1986)121，652-663；Rousseaux，J.等，酶學方法(Methods in Enzymology)(1986)121，663-669；Bird，R.E.等，TIBTECH(1991)9，132-137)。
通過將抗體的H鏈的V區和L鏈的V區連接能夠獲得scFv。在此此scFv中，H鏈的V區和L鏈的V區通過連接體、優選肽連接體連接(Huston，J.S.等，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)(1988)85，5879-5883)。scFv中的H鏈的V區和L鏈的V區可以從本發明說明書中作為抗體所述的任何來源產生。可以使用包括例如12-19個胺基酸殘基的任意單鏈肽作為連接V區的肽連接體。
使用編碼上述抗體的H鏈或H鏈V區的DNA和編碼上述抗體的L鏈或L鏈V區的DNA的部分(所述部分是編碼那些序列的全部或所需要的胺基酸序列的)作為模板，通過PCR技術，使用確定其兩端的引物對進行擴增，並且合併和擴增編碼肽連接體部分和確定以使其兩端要分別與H鏈和L鏈連接的引物對的DNA，能夠獲得編碼scFv的DNA。
另外，一旦構建了編碼scFv的DNA，就能夠通過常規方法獲得包含它們的表達載體和用所述表達載體進行轉化的宿主，並且通過常規方法使用得到的宿主能夠獲得scFv。
通過用上述相同的方法獲得其基因並且使其在宿主中表達能夠製備這些抗體片段。這裡使用的「抗體」包括這些抗體片段。
可以使用與各種分子例如聚乙二醇(PEG)偶聯的抗-人TF抗體作為抗體修飾物。這裡使用的「抗體」包括這些抗體修飾物。通過將這樣獲得的抗體進行化學修飾能夠獲得這些抗體修飾物。本領域已經建立了這些方法。
6.重組抗體或改變的抗體的表達和製備利用公知方法能夠表達和獲得如上所述構建的抗體基因。在哺乳動物細胞的情況下，通過功能性偶聯通常使用的有用的啟動子、要表達的抗體基因以及其3』-末端下遊的聚A信號，可以表達抗體基團。作為啟動子/增強子的例子是人巨細胞病毒立即早期啟動子/增強子。
另外，可以用於本發明中使用的抗體的表達的其它啟動子/增強子包括病毒啟動子/增強子，例如逆轉錄病毒、多瘤病毒、腺病毒和猿猴腎病毒40(SV40)以及來源於哺乳動物細胞例如人延伸因子1α(HEF1α)的啟動子/增強子。
使用SV40啟動子/增強子時，通過Mulligan等的方法(自然(Nature)(1979)277，108-114)的方法可以容易地完成基因表達，在使用HEF1α啟動子/增強子時，通過Mizushima等的方法(核酸研究(Nucleic Acids Res.)(1990)18，5322)的方法可以容易地完成基因表達。
在大腸埃希氏桿菌情況下，通過功能性地偶聯通常使用的有用啟動子、抗體分泌的信號序列以及要表達的抗體基因，可以表達所述基因。啟動子的實例包括lacz啟動子和araB啟動子。當使用lacz啟動子時，可以使用Ward等的方法(自然(Nature)(1098)341，544-546；Ward，E.S.等，FASEB J.(1992)6，2422-2427)，或當使用arab啟動子時，可以使用Better等的方法(科學(Science)(1988)240，1041-1043)進行基因表達。
當在大腸埃希氏桿菌周質中生產時，應該使用pelB信號序列作為抗體分泌的信號序列(Lei，S.P.等，細菌學雜誌(J.Bacteriol)(1987)169，4379-4383)。分離周質中產生的抗體之後，在使用之前適當地重摺疊抗體的結構。
可以使用來自SV40、多瘤病毒、腺病毒或牛乳頭瘤病毒(BPV)等的複製起點作為複製起點。此外，為了擴增宿主細胞系統中基因拷貝數，表達載體可以包括作為可篩選標記的氨基糖苷磷酸轉移酶(APH)基因，胸苷激酶(TK)基因，大腸埃希氏桿菌黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(Ecogpt)基因，二氫葉酸還原酶(dhfr)基因等。
可以使用任意表達系統，例如真核細胞和原核細胞系統來製備本發明中使用的抗體。真核細胞包括，例如，哺乳動物細胞系統，昆蟲細胞系統，真菌細胞系統，例如絲狀真菌細胞和酵母細胞，原核細胞的實例可以包括，例如，細菌細胞，例如大腸埃希氏桿菌細胞。
優選地，用於本發明的抗體可以在哺乳動物細胞例如CHO細胞，COS細胞，骨髓瘤細胞，BHK，Vero和Hela細胞中表達。
下一步，通過體內或體外培養轉化的宿主細胞，能夠獲得靶抗體。通過公知方法培養宿主細胞。例如，可以使用DMEM，MEM，RPMI1640和IMDM作為培養基，上述介質還可以結合使用血清補充物例如胎牛血清(FCS)。
7.抗體的分離和純化可以從細胞或宿主分離如上所述產生並且表達的抗體，並純化至同質性。可以通過親和柱完成本發明使用的抗體的分離和純化。作為使用蛋白質A柱的柱子，包括Hyper D，POROS，SepharoseF.F.(Pharmacia製造)等。另外，應該使用用於蛋白質的常規分離和純化的方法。並且對這些方法沒有限制。例如，通過合適地選擇和組合除了上述親和色譜外的色譜、過濾、超濾、鹽析或透析等，可以分離和純化抗體(抗體實驗手冊(AntibodiesA Laboratory Manual)，Harlow和David Lane編著，冷泉港實驗室，1988)。
8-1.防止凝固性過高狀態持久性的活性的測定為了研究本發明預防和治療具有持久性凝固性過高狀態疾病的效力，需要一種新的動物模型，本申請的相同申請人的標題是「持久性凝固性過高狀態的動物模型及其產生方法」的專利申請說明書中描述了該評價方法細節。在本說明書實施例1中描述了該評價方法的具體實施例。
實施例2和圖11-13給出了使用上述人源化抗-人TF抗體「i-b2」型的實驗結果。根據該實驗，在實施例1中給出的動物模型系統中，在植入有包含人TF基因的腫瘤細胞的小鼠的血小板數降低到大約沒有植入所述腫瘤細胞的小鼠的血小板計數的一半後(植入後5-6周)，反覆靜脈內給予1毫克/千克/周人源化抗-人TF抗體「i-b2」型，結果使血小板計數保持在與沒有植入所述腫瘤細胞的小鼠相等的水平上，直到實驗結束，即開始施藥之後三星期。
施用本發明的人源化抗-人TF抗體抑制可溶性纖維蛋白單體複合物(sFMC)和凝血酶-抗凝血酶III複合物(TAT)濃度的提高。結果證明施用本發明的抗-人TF抗體可以防止凝固性過高狀態的持久性並且保持正常狀態。
8-2.對感染產生的凝固性過高狀態的治療效果的證實凝血酶原時間的延長、纖維蛋白原血漿濃度的降低、纖維蛋白降解產物的血清濃度的提高等可以歸因於凝固性過高狀態。給予本發明抗人-TF抗體可以抑制連續輸注LPS誘導的凝血酶原時間的延長、纖維蛋白原血漿濃度的降低、纖維蛋白降解產物的血清濃度的提高，結果證明本發明的抗-人TF抗體對於感染產生的凝固性過高狀態的預防和/或治療是有效的。
實施例3中具體描述了該效果。
8-3.靜脈血栓形成的預防和/或治療效果的證實實施例4具體描述了本發明的抗-人TF抗體對靜脈血栓形成具有預防和/或治療效果。
8-4.動脈血栓形成的預防和/或治療效果的證實實施例5具體描述了本發明的抗-人TF抗體對動脈血栓形成具有預防和/或治療效果。
8-5.對因血管中層增厚產生的疾病的預防和/或治療效果的證實實施例6具體描述了本發明的抗-人TF抗體對因血管中層增厚產生的疾病具有預防和/或治療效果。
9.給藥和配製藥物的方法本發明的治療劑用於預防、治療或改善具有持久性凝固性過高狀態，感染、靜脈血栓形成、動脈血栓形成導致的凝固性過高狀態的疾病和因血管中層肥大產生的疾病的目的。
每次給藥的有效劑量選自0.001毫克至1000毫克/千克體重的範圍。或者，可以選擇0.01-100毫克/千克，優選0.1-10毫克/千克的劑量。但是，含有本發明的抗-人TF抗體的治療劑不局限於這些劑量。
優選的給藥方法是但不局限於靜脈內注射、靜脈內滴注等。
可以使用標準方法(Remington製藥科學(Remington’sPharmaceutical Science)，最新版本，Mark PublishingCompany，Easton.USA)配製含有抗-人TF抗體作為活性成分的本發明的治療劑，並且其中可以含有藥學可接受載體和/或添加劑。
這樣的載體或添加劑的例子包括水，藥學可接受有機溶劑，膠原，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，羧乙烯基聚合物，羧甲基纖維素鈉，聚丙烯酸鈉，藻酸鈉，水溶性葡聚糖，羧甲基澱粉鈉，果膠，甲基纖維素，乙基纖維素，黃原酸膠，阿拉伯膠，酪蛋白，瓊脂，聚乙二醇，雙甘油，甘油，丙二醇，凡士林，石蠟，十八烷基醇，硬脂酸，人血清白蛋白(HSA)，甘露糖醇，山梨糖醇，乳糖，藥學可接受表面活性劑等。
使用的添加劑選自但是不局限於上述物質及其組合，如果需要，取決於本發明的劑型。例如，當用作注射液時，可以將純化的抗-人TF抗體溶解於一種溶劑例如生理鹽水、緩衝液和葡萄糖溶液中，其中可以加入抗-吸附劑，例如Tween80、Tween20、明膠和人血清白蛋白。或者，可以將它們凍幹並在使用之前溶解並且重新配製成劑型。作為用於凍幹的賦形劑，可以使用糖醇和糖例如甘露糖醇和葡萄糖。
實施例將參照實施例更具體地解釋本發明。
實施例1.實驗小鼠的產生將其中編碼人組織因子基因(SEQ ID NO103)已經插入到動物表達載體pCOS1中的載體(hTF-pCOS1)用限制酶PruI消化並且線性化，其然後通過電穿孔引入人骨髓瘤細胞系KPMM2(FERM BP-7419)。
通過用EcoRI和SamI消化從HEF-PMh-gγ1(WO92/19759)去除抗體基因，然後通過連接EcoRI-NotI-BamHI接合體(Takara Shuzo)構建pCOS1。在含有1毫克/毫升G418的RPMI1640培養基(含有20％FCShIL-64ng/ml)中培養之。通過流式細胞儀證實生長的細胞是使用抗-人組織因子抗體(American Diganostica)人組織因子的表達。這給出其中已經引入人組織因子基因的細胞系KPMM2/TF226。
在含有4ng/ml人IL-6和20％胎牛血清的RPMI-1640培養基中培養引入上述人組織因子基因之前的親本細胞株(KPMM2/親本)和基因引入株KPMM2/TF226。以1×107細胞分別將這樣培養的KPMM2/TF226細胞和親本KPMM2/親本細胞皮下植入到SCID小鼠(從日本CLEA獲得，雄性，7周齡，平均體重大約22克)的脅腹中，並且研究腫瘤體積、血液中血小板數以及人組織因子、纖維蛋白原、可溶性纖維蛋白單體複合物(sFMC)和凝血酶-抗凝血酶III複合物(TAT)的血漿濃度隨著時間的變化。
結果如圖5所示，所有小鼠的腫瘤體積隨著時間而增大。但是如圖6所示，其中植入了其中引入了人組織因子基因的細胞的小鼠人組織因子的血漿濃度隨著時間增加，但是植入了其中沒有引入人組織因子基因的動物細胞的小鼠一點沒有增加。如圖7和圖8所示，在植入了其中引入了人組織因子基因的動物細胞的小鼠中，血小板和纖維蛋白原各自隨著時間減少，其表明這些血液中的凝固成分被消耗。相反，植入了其中沒有引入人組織因子基因的動物細胞的小鼠中，沒有發現血液中這些凝固成分的減少。
如圖9和圖10所示，在植入了其中引入了人組織因子基因的動物細胞的小鼠中，可溶性纖維蛋白單體複合物(sFMC)和凝血酶-抗凝血酶III複合物(TAT)各自的血漿濃度隨著時間而增大，其表明凝固性過高狀態是持久性的。相反，植入了其中沒有引入人組織因子基因的動物細胞的小鼠中，沒有發現血液中上述凝固成分的減少。
由上述結果證明，在植入了其中引入了人組織因子基因的動物細胞的小鼠中，凝固性過高狀態是持久性的，證明本發明的動物作為持久性凝固性過高狀態的模型是有用的。
實施例2在實施例1描述的模型中研究了人源化抗-人TF抗體「i-b2」型的作用。對SCID小鼠(日本CLEA，雄性，7周齡，平均體重大約22克)植入KPMM2/TF226之後5-6周，當血小板數減少到沒有植入腫瘤組的一半時，證明凝固性過高狀態的持久性，因此，自植入之後第45天開始，每周一次靜脈內施用1毫克/千克人源化抗-人TF抗體「i-b2」型。結果，在施用人源化抗-人TF抗體「i-b2」型之後第三天，血小板數恢復至高於沒有植入腫瘤組的水平，從實驗開始到實驗結束的第三周，血小板計數保持在和沒有植入腫瘤組相等的水平上。
在第三次施用人源化抗-人TF抗體「i-b2」型之後第六天，測定可溶性纖維蛋白單體複合物(sFMC)的和凝血酶-抗凝血酶III複合物(TAT)的血漿濃度，發現施用該抗體抑制它們的增加(圖12和圖13)。這些結果表明人源化抗-人TF抗體「i-b2」型通過一周一次施用於其中長時間保持凝固性過高狀態的模型而具有穩定保持正常水平凝固的作用。
實施例3在異氟烷麻醉下，以1mg/kg/hr(2ml/kg/hr)劑量以連續方式對食蟹猴(從中國南寧Chuang靈長類實驗動物研究中心進口，雄性和雌性數目相等，估計年齡5-7歲，體重2.99-5.81千克)靜脈內注射溶解於生理鹽水中的LPS6小時。在開始連續注射LPS之前10分鐘，分別對施用人源化抗-人TF抗體組的猴子靜脈內施用0.3毫克/千克(1毫升/千克)的人源化抗-人TF抗體「i-b2型」，對對照組的猴子靜脈內施用溶劑(20mM乙酸鈉/150mM氯化鈉，pH6.0)。
在連續注射LPS結束時，通過插入股動脈的導管抽取檸檬酸化血液和正常血液，測定凝血酶原時間、纖維蛋白原的血漿濃度和纖維蛋白降解產物的血清濃度。結果如表4所示，LPS注射導致凝血酶原時間延長，纖維蛋白原的血漿濃度的降低和纖維蛋白降解產物的血清濃度的提高，即凝固性過高狀態，但是在接受人源化抗-人TF抗體「i-b2型」的猴子中，這些變化被強有力地抑制。這些結果表明人源化抗-人TF抗體「i-b2型」能夠抑制感染導致的凝固性過高狀態。
表4通過LPS注射人源化抗-人TF抗體對凝固性過高的作用
*平均值±標準偏差實施例4在通過靜脈鬱滯和對靜脈壁的損傷誘導的靜脈血栓形成模型中，評價人源化抗-人TF抗體對靜脈血栓形成的作用。通過結紮血管產生靜脈鬱滯。使用「聚多卡醇(Polidocanol)(一種用於食管靜脈曲張的治療藥，Kreussler)」誘導對靜脈壁的損傷。
在靜脈血栓模型中使用估計年齡3-4歲，體重2.97-3.99千克的食蟹猴(從中國Chuang靈長類實驗動物研究中心獲得)。用異氟烷和一氧化二氮的混合物麻醉猴於以暴露兩側頸靜脈。通過縫合圍繞接近心臟的部位，完全結紮暴露的頸靜脈的節段，並通過縫合圍繞接近頭部的部位，可逆地結紮，以便以後鬆開。將導管以指向頭部的方向從靠近心臟的部位插入暴露的頸靜脈兩端結紮之間的節段中。通過導管除去暴露的頸靜脈兩端結紮之間的節段中的血液，內部用生理鹽水洗滌。通過導管向暴露的血管結紮之間的節段中注射0.5％的聚多卡醇，移去導管，同時在緊靠導管插入點的上端處可逆性地結紮血管節段。
五分鐘之後，鬆開心臟側可逆性結紮點排出聚多卡醇。鬆開頭側的可逆性結紮點排出少量血，然後暴露的血管的節段完全位於緊靠導管插入點的上端。向節段中填充血液後，在接近頭部的部分完全結紮暴露的頸靜脈。調節兩端完全接扎之間的節段為1.5cm長。30分鐘之後，測定形成的凝塊的溼重。為了評價，使用兩側頸靜脈中凝塊溼重的加和。在靜脈血栓形成開始之前2小時，以0.3毫克/千克和1.5毫克/千克的劑量靜脈內施用人源化抗-人TF抗體「i-b2型」。
表5給出了結果。施用人源化抗-人TF抗體導致形成的血塊的重量的減小。因此證明人源化抗-人TF抗體在此模型中具有預防靜脈內凝塊形成的作用。
表5食蟹猴靜脈血栓形成中人源化抗-人TF抗體的作用
實施例5在使用通過血管狹窄和對動脈壁的損傷誘導的動脈血栓形成模型中，評價人源化抗-人TF抗體對動脈血栓形成的作用。通過用圓形針尖擰緊的20G針頭緊緊結紮血管然後移去針產生血管狹窄和對動脈壁的損傷。這是模擬由於動脈粥樣硬化的血管狹窄和由於斑塊破裂的對動脈壁損傷的模型。
使用估計年齡3-5歲，體重3.55-3.99千克的食蟹猴(從中國Chuang靈長類實驗動物研究中心獲得)。用氯胺酮(肌內施用)和butofanol(肌內施用)麻醉猴子暴露右側主頸動脈。暴露的血管周圍插入都卜勒流量計的探頭，並且監測血流量大約5分鐘。證實血流流量恆定之後，在探頭頭側的鄰近部位周圍誘導血管狹窄和對動脈壁的損傷。
接下來的15分鐘觀測血流量，並且測定由於血栓形成的血管梗阻時間。鬆開右主頸動脈處的結紮之後，對施用抗體組的猴子施用人源化抗-人TF抗體。在左主頸動脈處也測定由於血栓形成的血管梗阻時間。在左主頸動脈血栓形成開始之前1小時以0.3毫克/千克和1.5毫克/千克的劑量靜脈內施用人源化抗-人TF抗體「i-b2型」。
表6給出了結果。施用人源化抗-人TF抗體導致血管梗阻時間的縮短。因此證明人源化抗-人TF抗體在此模型中具有預防動脈內血栓形成的作用。
表6食蟹猴動脈血栓形成中人源化抗-人TF抗體的作用
*都是各組的平均值實施例6肌內用5-10毫克/千克Ketalar，和靜脈內用15-20毫克/千克戊巴比妥麻醉食蟹猴(從KEARI Inc.購得，Vietnam產猴，估計年齡4-5歲)，並且切割頸部暴露頸動脈。通過外頸動脈，插入Fogarty導管(3-5F)，並且將囊充氣刮掉血管內膜5分鐘。刮掉後抽出導管並且縫合傷口。一個月之後，殺死動物，並且取出頸動脈。此時，以相同方式取出沒有充氣損傷的另一側的頸動脈。
在血管損傷之前10分鐘，以0.3毫克/千克的劑量靜脈內施用人源化抗-人TF抗體「i-b2型」1分鐘。將取出的動脈固定在福馬林中，製備組織切片，用HE染料和Elastica van Gieson染料染色，接著成像分析來測定內膜區。結果如圖7所示，人源化抗-人TF抗體「i-b2型」強烈抑制內膜的肥大。這表明人源化抗-人TF抗體「i-b2型」通過抑制血管組織本身的生長在短時間內抑制腔區的變窄，其提示這能夠有效地防止再狹窄。
表7動物序號未損傷的血療損傷的血療中層面積(mm2) 中層面積(mm2)對照組 1 1.062.15(203％)2 0.741.45(196％)3 0.821.78(217％)抗-人TF抗體4 0.751.15(153％)5 0.780.96(123％)6 0.860.98(114％)(相對於非損傷側的百分比)實施例7在實施例1描述的模型中研究人源化抗-人TF抗體「i-b2型」和低分子量肝素的作用。對SCID小鼠(CLEA日本，雄性，7周齡，平均體重大約24克)植入KPMM2/TF226之後6-7周，血小板計數減少至沒有植入腫瘤組的大約一半，證實凝固性過高狀態的持久性。因此，在植入之後49天開始靜脈內施用1毫克/千克人源化抗-人TF抗體「i-b2型」或者通過皮下包埋允許24小時持續釋放的滲透泵以601.5IU/千克，1900.3IU/千克，和6487.3IU/千克連續施用低分子量肝素。結果，施用人源化抗-人TF抗體「i-b2」型之後第一天，血小板計數恢復，第三天血小板計數超過沒有植入腫瘤組，並且即使7天之後還保持第三天的效果。相反，在施用6487.3IU/千克低分子量肝素組，在連續給藥之後第一天和第二天觀察到血小板計數稍微恢復，但是在第三天該效果消失，儘管血小板數還稍微有所恢復(圖14)。
參照實施例1.製備可溶性人TF的方法用下面的方法製備可溶性人TF(shTF)。
向哺乳動物細胞表達載體(包含新黴素抗性基因和DHFR基因)插入編碼隨後被FLAG肽M2置換的人TF穿入區(220位胺基酸)的基因，並且引入CHO細胞。關於人TF的cDNA序列參見James H.Morrissey等的文章(細胞(Cell)(1987)50129-135)。SEQ ID NO101和102給出了該可溶性人TF的基因序列和胺基酸序列。用G418篩選藥物之後，篩選表達細胞，然後用氨甲喋呤使其進行表達擴增，並且構建表達shTF的細胞。
在沒有血清的培養基CHO-S-SFMII(GIBCO)中培養細胞以獲得含有shTF的培養上清液。用等體積的40mM Tris-HCl緩衝液(pH8.5)將其稀釋2倍，加到用20mM Tris-HCl緩衝液(pH8.5)平衡過的Q-Sepharose高流速柱(100毫升，Pharmacia Biotech)。用含有0.1M氯化鈉的相同緩衝液洗滌之後，氯化鈉的濃度變為0.3M，從柱中洗脫出shTF。為了獲得shTF級分，加入硫酸銨至2.5M終濃度，離心(10000rpm，20分鐘)沉澱出汙染蛋白質。將上清液加給Butyl TOYOPEARL(30毫升，TOSOH)，然後用含有2.5M硫酸銨的50mM Tris-HCl緩衝液(pH6.8)洗滌。
在50mM Tris-HCl緩衝液(pH6.8)中，硫酸銨的濃度從2.5M至0M線性地降低使得洗脫shTF。通過Centri-Prep10(Amicon)濃縮含有shTF的峰級分。對用含有150mM氯化鈉的20mM Tris-HCl緩衝液(pH7.0)平衡過的TSK凝膠G3000SWG柱(21.5×600mm，TOSOH)加入濃縮物，收集shTF的峰級分。用0.22μm膜過濾器無菌過濾並且證明產物是可溶性人TF(shTF)。假定樣品的摩爾消光係數ε＝40130並且分子量＝43210，計算樣品濃度。
參考實施例2抗-TF單克隆抗體的製備1.人TF的純化根據Ito的方法(Ito，T.等，生物化學雜誌(J.Biol.Chem.)114691-696，1993)對來自人胎盤的TF進行純化。因此，在含有1.0mM苄脒鹽酸鹽，1mM苯基甲基磺醯氟，1mM二異丙基氟磷酸酯和0.02％疊氮化鈉的Tris緩衝鹽水(TBS，pH7.5)中將人胎盤勻漿，然後用冷丙酮將沉澱脫脂。將獲得的脫脂粉末懸浮於含有2％TritonX-100的上述緩衝液中溶解TF。
使用伴刀豆球蛋白A-瓊脂糖4B柱(Pharmacia)和抗-TF抗體-結合瓊脂糖4B柱(Pharmacia)將上清液進行親和色譜以獲得純化的TF。用超濾膜(PM-10，Amicon)濃縮並且作為純化樣品在4℃下儲存。
通過結合了市售抗-TF單克隆抗體(American Diagnostica)和多克隆抗體(American Diagnostica)的夾心ELISA，用重組TF為標準物對純化的樣品中的TF含量進行定量。
通過使樣品進行SDS-PAGE，使用4-20％密度梯度聚丙烯醯胺凝膠，並且將產物銀染色，證實純化樣品的純度。
2.免疫和雜交瘤製備將純化的人TF(大約70微克/毫升)與等體積的弗氏完全佐劑(Difco)混合之後，以10微克TF/小鼠皮下接種到5周齡Balb/c雄性小鼠(Nippon Charles River)的腹部。第12，18，和25天，用與弗氏不完全佐劑混合的TF以5微克/小鼠TF皮下加強免疫，在第32天以5微克/小鼠腹膜內給予用PBS稀釋的TF溶液作為最後免疫。
最後免疫之後三天，從四隻小鼠製備脾細胞，並且通過聚乙二醇方法以大約其1/5細胞數與小鼠骨髓瘤細胞系P3U1融合。將融合細胞懸浮於含有10％胎牛血清的RPMI-1640培養基(下文稱之為RPMI-培養基)(Lifetech Oriental)，每隻小鼠接種到96孔板的400個孔中(大約400細胞/孔)。融合之後第1，2，3和5天，用含有HAT(DainipponSeiyaku)和調製的H1(Boehringer Mannheim GmbH)的RPMI-培養基(下文稱之為HAT-培養基)置換一半體積的原培養基來進行雜交瘤的HAT篩選。
通過進行有限稀釋兩倍克隆通過下述篩選方法篩選的雜交瘤。
對於有限稀釋，在兩個96-孔板中每孔接種平均0.8個細胞。通過顯微鏡檢查證實單一菌落的孔，通過下面對TF-結合活性和TF-中和活性的測定來篩選克隆。得到的克隆的條件從HAT-培養基變為RPMI-培養基。證實由於適應導致的抗體產生能力降低不存在之後，再次進行有限稀釋進行完全克隆。通過上述方法，獲得產生六種強烈抑制TF/因子VIIa複合體和X因子結合的抗體(ATR-2，3，4，5，7和8)的雜交瘤。
3.腹水形成和抗體的純化根據標準方法進行創建的雜交瘤的腹水形成。因此，將體外傳代培養的106雜交瘤腹膜內植入給事先已經接受兩次靜脈內施用的礦物油的BALB/c雄性小鼠。從植入之後1-2周出現腹部膨脹的小鼠收集腹水。
使用裝有蛋白質A柱(Nippon Gaishi)的ConSepLC100系統(Millipore)從腹水純化抗體。
4.細胞-ELISA從ATCC獲得已知高水平表達TF的人膀胱癌細胞J82(Fair D.S.等，生物化學雜誌(J.Biol.Chem.)26211692-11698，1987)，並且在37℃，5％CO2和100％溼度條件下在RPMI-培養基中傳代和保持。
通過以105細胞/孔用J82細胞接種96-孔板，在上述條件下培養一天，去除培養基後用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌兩次，加入4％低聚甲醛溶液(PFA)，並且使之在冰上靜置10分鐘以固定來製備細胞-ELISA板。去除PFA之後，用PBS洗滌平板，向其中加入含有1％BSA和0.02％疊氮化鈉的Tris緩衝液(封閉溶液)，使用之前在4℃下儲存平板。
用下面的方法進行細胞-ELISA。因此，從如上製備的平板去除封閉緩衝液，向其中加入抗-TF抗體溶液或雜交瘤培養上清液並且在室溫下反應1.5小時。用含有0.05％Tween20的PBS洗滌之後，鹼性磷酸酶偶聯的山羊抗-小鼠IgG(H+L)(Zymed)反應1小時。洗滌之後，加入1毫克/毫升對硝基苯磷酸二鈉(Sigma)，1小時之後測定405nm處的吸光度來確定與J82細胞結合的抗-TF抗體的量。
5.以Xa因子活性為指數的針對TF的中和活性的測試系統向含有5mM氯化鈣和0.1％牛血清白蛋白的50微升Tris緩衝鹽水(TBSpH7.6)中加入10微升從人胎盤得到的凝血因子III(thromboplastin)溶液(5毫克/毫升)(Thromborel S)(Boehring)和10微升VIIa因子溶液(82.5ng/ml)(American Diagnostics)，室溫下反應1小時，使生成TF/VIIa因子複合物。加入10微升預定濃度的稀釋的抗-TF抗體溶液或雜交瘤培養上清液以及10微升X因子溶液(3.245微克/毫升)(Celsus Laboratories)，並且反應45分鐘之後，加入10微升0.5M EDTA中止反應。向其中加入50微升2mM S-2222溶液(Daiichi Kagaku Yakuhin)，測定在30分鐘內的405/655nm處吸光度的變化並且設定為TF的X-因子-產生活性。在該方法中，能夠測定抑制TF/VIIa因子複合物和X因子結合的抗體的活性。
6.針對血漿凝固抑制活性的測試系統50微升適當稀釋的抗-TF抗體溶液與100微升購得的正常人血漿(Kojin Bio)混合併且在37℃下反應3分鐘。然後向其中加入50微升從人胎盤得到的凝血因子III溶液(1.25毫克/毫升)，利用血漿凝固測定儀(CR-AAmelung)測定血漿凝固時間。
7.抗體同型的測定對於雜交瘤的培養上清液和純化的抗體，使用小鼠單克隆抗體同型測定試劑盒(Amersham製造)來證實抗體的同型。結果如下。
表5抗-TF單克隆抗體的免疫球蛋白同型ATR-2 IgG1，κATR-3 IgG1，κATR-4 IgG1，κ
ATR-5 IgG1， κATR-7 IgG2a，κATR-8 IgG2a，κ參照實施例3.編碼抗人TF的小鼠單克隆抗體的V區的DNA的克隆(1)mRNA的製備使用QuickPrep mRNA純化試劑盒(Pharmacia Biotech)從參照實施例2獲得的雜交瘤ATR-5(IgG1κ)製備mRNA。根據試劑盒所附的說明書，在提取緩衝液中將各雜交瘤細胞完全勻漿，然後，通過寡(dT)-纖維素離心柱之後，通過乙醇沉澱來純化mRNA。將mRNA沉澱溶解於洗脫緩衝液。
(2)編碼小鼠抗體V區的基因的cDNA的製備和擴增(i)H鏈V區cDNA的克隆使用5』-RACE方法(Frohman，M.A.等，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)858998-9002，1988；Belyavsky，A.等，核酸研究(Nucleic Acids Res.)172919-2932.1989)進行抗人TF的小鼠單克隆抗體的H鏈V區的編碼基因的克隆。關於5』-RACE方法，使用Marathon cDNA擴增試劑盒(CLONTECH)並且根據試劑盒所附的說明書進行操作。
使用大約1微克如上製備的mRNA為模板，加入試劑盒所附的cDNA合成引物，其在42℃下與逆轉錄酶反應60分鐘進行對cDNA的逆轉錄。其與DNA聚合酶I，DNA連接酶和RNase H在16℃下反應1.5小時，並且和T4 DNA聚合酶在16℃下反應45分鐘，從而合成雙鏈cDNA。用苯酚和氯仿提取該雙鏈cDNA，通過乙醇沉澱回收。
通過在16℃下與T4 DNA連接酶反應過夜，cDNA連接物連接該雙鏈cDNA的兩個末端。用含有0.1mM EDTA的10mM Tricine-KOH(pH8.5)和將反應混合物稀釋50倍。使用該產物為模板，通過PCR擴增編碼H鏈V區的基因。對於5』-端引物使用試劑盒所附的連接物引物1，對於3』-端引物使用MHC-G1引物(SEQ ID NO1)(S.T.Jones，等，生物技術(Biotechnology)，988-89，1991)。
100微升用於ATR-5抗體H鏈V區的PCR溶液中含有120mMTris-HCl(pH8.0)，10mM KCl，6mM(HN4)2SO4，0.1％Triton X-100，0.001％BSA，0.2mM dNTPs(dATP，dGTP，dCTP，dTTP)，1mM MgCl2，2.5單位的KODDNA聚合酶(Toyo Boseki)，30-50pmole連接物引物1，以及MHC-Gl引物，和1-5微升其上已經連接了cDNA連接物的cDNA的反應混合物。
使用DNA熱循環儀480(Perkin-Elmer)進行所有的PCR，並且以94℃30秒，55℃30秒和74℃1分鐘的溫度循環將PCR進行30次循環。
(ii)L鏈V區cDNA的克隆使用5』-RACE方法(Frohman，M.A.等，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)858998-9002，1988；Belyavsky，A.等，核酸研究(Nucleic Acids Res.)172919-2932.1989)進行抗人TF的小鼠單克隆抗體的L鏈V區的編碼基因的克隆。關於5』-RACE方法，使用Marathon cDNA擴增試劑盒(CLONTECH)，並且根據試劑盒所附的說明書進行操作。使用大約1微克如上製備的mRNA為模板，加入cDNA合成引物，其在42℃下與逆轉錄酶反應60分鐘進行對cDNA的逆轉錄。
其與DNA聚合酶I，DNA連接酶和RNase H在16℃下反應1.5小時，並且和T4 DNA聚合酶在16℃下反應45分鐘，從而合成雙鏈cDNA。用苯酚和氯仿提取該雙鏈cDNA，通過乙醇沉澱回收。通過在16℃下與T4DNA連接酶反應過夜，cDNA連接物連接該雙鏈cDNA的兩個末端。用含有0.1mM EDTA的10mM Tricine-KOH(pH8.5)將反應混合物稀釋50倍。使用該產物為模板，通過PCR擴增編碼L鏈V區的基因。對於5』-端引物使用連接物引物1，對於3』-端引物使用MKC引物(SEQ IDNO2)(S.T.Jones，等，生物技術(Biotechnology)，988-89，1991)。
100微升PCR溶液中含有120mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM KCl，6mM(HN4)2SO4，0.1％Triton X-100，0.001％BSA，0.2mMdNTPs(dATP，dGTP，dCTP，dTTP)，1mM MgCl2，2.5單位的KOD DNA聚合酶(Toyo Boseki)，30-50pmole連接物引物1，以及MKC引物，和1微升其上已經連接了cDNA連接物的cDNA的反應混合物。
使用DNA熱循環儀480(Perkin-Elmer)進行所有的PCR，開且以94℃30秒，55℃30秒和74℃1分鐘的溫度循環將PCR進行30次循環。
(3)PCR產物的純化和片段化用苯酚和氯仿提取上述PCR反應混合物，並且通過乙醇沉澱回收擴增的DNA片段。37℃下用限制酶XmaI(New English Biolabs)消化DNA片段1小時。通過使用2％-3％NuSieve GTG瓊脂糖(FMC BioProducts)進行瓊脂糖凝膠電泳來分離XmaI消化混合物，切下含有大約500bp長DNA片段作為H鏈V區和大約500bp長DNA片段作為L鏈V區的瓊脂糖條。用苯酚和氯仿提取瓊脂糖條，並且用乙醇沉澱DNA片段，然後將其溶解於10微升含有lmM EDTA的10mM Tris-HCl(pH8.0)和(下文稱之為TE)。
使用DNA連接酶試劑盒2型(Takara Shuzo)，根據試劑盒所附說明書，在16℃下反應1小時，使如上製備的含有編碼小鼠H鏈V區和L鏈V區的基因的XmaI消化的DNA片段和用XmaI消化製備的pUC19質粒載體連接。
將連接混合物加入100微升大腸埃希氏桿菌JM109感受態細胞(Nippongene)並且在冰上溫育30分鐘並且在42℃下溫育1分鐘。
然後，向其中加入300微升Hi-感受態肉湯(Nippongene)並且在37℃下溫育1小時。然後將大腸埃希氏桿菌平鋪在含有100微克/毫升氨苄青黴素的LB瓊脂培養基(分子克隆實驗指南(Molecular ClongALaboratory Manual)，Sambrook等，冷泉港實驗出版社，1989)(下文中稱為LBA瓊脂培養基)上，並且在37℃下溫育過夜獲得大腸埃希氏桿菌轉化體。
該轉化體在37℃下在3毫升或4毫升含有50微克/毫升氨苄青黴素的LB培養基(下文稱之為LBA培養基)培養過夜，使用QIAprep Spin質粒試劑盒(QIAGEN)從細胞級分製備質粒DNA，然後測定核苷酸序列。
(2)編碼小鼠抗體V區的基因的核苷酸序列的測定使用染料中止子循環測序FS即用反應試劑盒(Perkin-Elmer)，通過DNA測序儀373A(Perkin-Elmer)測定質粒中cDNA編碼區的核苷酸序列。作為測序引物，使用M13引物M4(Takara Shuzo)(SEQ ID NO3)和M13引物RV(Takara Shuzo)(SEQ ID NO4)，通過在兩個方向證實核苷酸序列來確定序列。
這樣獲得的包含來自雜交瘤ATR-5的編碼小鼠H鏈V區的基因的質粒記為ATR-5Hv/pUC19，包含來自雜交瘤ATR-5編碼小鼠L鏈V區的基因的質粒記為ATR-5Lv/pUC19。SEQ ID NO5和99分別給出了質粒ATR-5Hv/pUC19中包含的各小鼠抗體的H鏈V區的編碼基因的核苷酸序列(包括相應的胺基酸序列)，SEQ ID NO6和100分別給出了質粒ATR-5Lv/pUC19中包含的各小鼠抗體的L鏈V區的編碼基因的核苷酸序列(包括相應的胺基酸序列)。
參者實施例4.嵌合抗體的構建製備嵌合ATR-5抗體，其中小鼠ATR-5抗體V區連接人抗體C區。通過將編碼ATR-5抗體V區的基因與編碼人抗體C區的表達載體連接構建嵌合抗體表達載體。
(1)嵌合抗體H鏈V區的構建為了使其與編碼人抗體H鏈C區的表達載體連接，通過PCR方法修飾ATR-5抗體H鏈V區。設計5』-端引物ch5HS(SEQ ID NO7)使其與編碼V區的DNA的5』-端雜交並且具有Kozak共有序列(Kozak，M.等，分子生物學雜誌(J.Mol.Biol.)196947-950，1987)和限制酶SalI的識別序列。設計3』-端引物ch5HA(SEQ ID NO8)使其與編碼J區的DNA的3』-端雜交並且具有限制酶NheI的識別序列。
100微升PCR溶液中含有120mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM KCl，6mM(HN4)2SO4，0.1％Triton X-100，0.001％BSA，0.2mMdNTPs(dATP，dGTP，dCTP，dTTP)，1mM MgCl2，2.5單位的KOD DNA聚合酶(Toyo Boseki)，50pmole ch5HS引物和ch5HA引物，以及1微升質粒ATR5Hv/pUC19作為模板DNA。對於PCR，使用DNA熱循環儀480(Perkin-Elmer)，並且以94℃30秒，55℃30秒和74℃1分鐘的溫度循環將PCR進行30次循環。
用苯酚和氯仿提取上述PCR反應混合物，並且通過乙醇沉澱回收擴增的DNA片段。在37℃下用限制酶NheI(Takara Shuzo)消化DNA片段1小時，然後37℃下用限制酶SalI(Takara Shuzo)消化1小時。通過使用3％NuSieve GTG瓊脂糖(FMC BioProducts)進行瓊脂糖凝膠電泳來分離消化混合物，切下含有大約450bp長DNA片段的瓊脂糖條。用苯酚和氯仿提取瓊脂糖條，並且用乙醇沉澱DNA片段，然後將其溶解於20微升TE中。
作為克隆載體，使用其中引入限制酶NheI，SalI，和SplI，BglII的識別序列的改變的啟動子載體(下文稱之為CVIDEC)。使用DNA連接試劑盒2型(Takara Shuzo)根據試劑盒所附說明書在16℃下反應1小時，使如上製備的編碼小鼠H鏈V區的基因片斷和用NheI和SalI消化製備的CVIDEC載體連接。
將連接混合物加入100微升大腸埃希氏桿菌JM109感受態細胞(Nippongene)，並且在冰上溫育30分鐘並且在42℃下溫育1分鐘。然後，向其中加入300微升Hi-感受態肉湯(Nippongene)並且在37℃下溫育1小時，然後將大腸埃希氏桿菌平鋪在LBA瓊脂培養基上，並且在37℃下溫育過夜獲得大腸埃希氏桿菌轉化體。該轉化體在37℃下在3毫升LBA培養基中培養過夜，使用QIAprep Spin質粒試劑盒(QIAGEN)從細胞級分製備質粒DNA。
使用染料中止子循環測序FS即用反應試劑盒(Perkin-Elmer)通過DNA測序儀373A(Perkin-Elmer)測定質粒中cDNA編碼區的核苷酸序列。作為測序引物，使用M13引物M4(Takara Shuzo)(SEQ ID NO3)和M13引物RV(Takara Shuzo)(SEQ ID NO4)，通過在兩個方向證實核苷酸序列來測定序列。包含5』-端編碼ATR-5抗體H鏈V區的基因，SalI識別序列和Kozak共有序列，和3』-端NheI識別序列的質粒記為chATR5Hv/CVIDEC。
(2)嵌合抗體L鏈V區的構建為了使其與編碼人抗體L鏈C區的表達載體連接，通過PCR方法修飾ATR-5抗體L鏈V區。設計5』-端引物ch5LS(SEQ ID NO9)使其與編碼V區的DNA的5』-端雜交並且具有Kozak共有序列(Kozak，M.等，分子生物學雜誌(J.Mol.Biol.)196947-950，1987)和限制酶BglII的識別序列。設計3』-端引物ch5LA(SEQ ID NO10)使其與編碼J區的DNA的3』-端雜交並且具有限制酶SplI的識別序列。
100微升PCR溶液中含有120mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM KCl，6mM(HN4)2SO4，0.1％Triton X-100，0.001％BSA，0.2mMdNTPs(dATP，dGTP，dCTP，dTTP)，1mM MgCl2，2.5單位的KOD DNA聚合酶(Toyo Boseki)，50pmole ch5LS引物和ch5LA引物，以及1微升質粒ATR5Lv/pUC19作為模板DNA。對於PCR，使用DNA熱循環儀480(Perkin-Elmer)，並且以94℃30秒，55℃30秒和74℃1分鐘的溫度循環將PCR進行30次循環。
用苯酚和氯仿提取上述PCR反應混合物，並且通過乙醇沉澱回收擴增的DNA片段。在37℃下用限制酶SplI(Takara Shuzo)消化DNA片段1小時，然後37℃下用限制酶BglII(Takara Shuzo)消化1小時。通過使用3％NuSieve GTG瓊脂糖(FMC BioProducts)進行瓊脂糖凝膠電泳來分離消化混合物，切下含有大約400bp長DNA片段的瓊脂糖條。用苯酚和氯仿提取瓊脂糖條，並且用乙醇沉澱DNA片段，然後將其溶解於20微升TE中。
使用DNA連接酶試劑盒2型(Takara Shuzo)根據試劑盒所附說明書在16℃下反應1小時，使如上製備的編碼小鼠L鏈V區的基因和用SplI和BglII消化製備的CVIDEC載體連接。
將連接混合物加入100微升大腸埃希氏桿菌JM109感受態細胞(Nippongene)並且在冰上溫育30分鐘並且在42℃下溫育1分鐘。然後，向其中加入300微升Hi-感受態肉湯(Nippongene)並且在37℃下溫育1小時，然後將大腸埃希氏桿菌平鋪在LBA瓊脂培養基上，並且在37℃下溫育過夜獲得大腸埃希氏桿菌轉化體。該轉化體在37℃下在3毫升LBA培養基中培養過夜，使用QIAprep Spin質粒試劑盒(QIAGEN)從細胞級分製備質粒DNA。
使用染料中止子循環測序FS即用反應試劑盒(Perkin-Elmer)通過DNA測序儀373A(Perkin-Elmer)測定質粒中cDNA編碼區的核苷酸序列。作為測序引物，使用M13引物M4(Takara Shuzo)和M13引物RV(Takara Shuzo)，通過在兩個方向證實核苷酸序列來測定序列。包含5』-端編碼ATR-5抗體L鏈V區的基因和具有BglII識別序列和Kozak共有序列以及3』-端具有SplI識別序列的質粒記為chATR5Lv/CVIDEC。
(3)嵌合抗體表達載體的構建使用從IDEC引入的抗體表達載體構建嵌合抗體表達載體。作為載體，使用IgG1-型抗體表達載體H5KG1(V)和IgG4-型抗體表達載體N5KG4P。通過使ATR-5的H鏈C區的編碼基因與緊位於表達載體H5KG1(V)或N5KG4P的人抗體H鏈C區之前的SalI-NheI位點連接並使ATR-5的L鏈C區的編碼基因與緊位於表達載體H5KG1(V)或N5KG4P的人抗體L鏈C區之前的BglII-SplI位點連接，產生嵌合ATR-5抗體表達載體。
(i)H鏈V區的引入在37℃下用限制酶NheI(Takara Shuzo)消化質粒chATR5Hv/CVIDEC3小時，37℃下用限制酶SalI(Takara Shuzo)消化3小時。通過使用1.5％NuSieve GTG瓊脂糖(FMC BioProducts)進行瓊脂糖凝膠電泳來分離消化混合物，切下含有大約450bp長DNA片段的瓊脂糖條。用苯酚和氯仿提取瓊脂糖條，並且用乙醇沉澱DNA片段，然後將其溶解於20微升TE中。
在37℃下用限制酶NheI(Takara Shuzo)消化表達載體N5KG1(V)和N5KG4P3小時，37℃下用限制酶SalI(Takara Shuzo)消化3小時。通過使用1.5％NuSieve GTG瓊脂糖(FMC BioProducts)進行瓊脂糖凝膠電泳來分離消化混合物，切下含有大約9000bp長DNA片段的瓊脂糖條。用苯酚和氯仿提取瓊脂糖條，並且用乙醇沉澱DNA片段，然後將其溶解於20微升TE中。
使用DNA連接試劑盒2型(Takara Shuzo)根據試劑盒所附說明書在16℃下反應1小時，使如上製備的包含編碼H鏈V區的基因和用SalI和NheI消化的N5KG1(V)和N5KG4P連接。
將連接混合物加入100微升大腸埃希氏桿菌JM109感受態細胞(Nippongene)並且在冰上溫育30分鐘並且在42℃下溫育1分鐘。然後，向其中加入300微升Hi-感受態肉湯(Nippongene)並且在37℃下溫育1小時，然後將大腸埃希氏桿菌平鋪在100微克/毫升LBA瓊脂培養基上，並且在37℃下溫育過夜獲得大腸埃希氏桿菌轉化體。該轉化體在37℃下在3毫升LBA培養基中培養過夜，使用QIAprep Spin質粒試劑盒(QIAGEN)從細胞級分製備質粒DNA。包含編碼嵌合ATR-5抗體H鏈基因的這些質粒分別定為chATR5Hv/N5KG1(V)和chATR5Hv/N5KG4P。
(ii)L鏈V區的引入在37℃下用限制酶BglII(Takara Shuzo)和SplI(Takara Shuzo)消化質粒chATR5Lv/CVIDEC1.5小時。通過使用1.5％NuSieve GTG瓊脂糖(FMC BioProducts)進行瓊脂糖凝膠電泳來分離消化混合物，切下含有大約400bp長DNA片段的瓊脂糖條。用苯酚和氯仿提取瓊脂糖條，並且用乙醇沉澱DNA片段，然後將其溶解於20微升TE中。
在37℃下用限制酶BglII(Takara Shuzo)和SplI(Takara Shuzo)消化質粒chATR5Hv/N5KG1(V)和chATR5Hv/N5KG4P1.5小時。通過使用1.5％NuSieve GTG瓊脂糖(FMC BioProducts)進行瓊脂糖凝膠電泳來分離消化混合物，切下含有大約9400bp長DNA片段的瓊脂糖條。用苯酚和氯仿提取瓊脂糖條，並且用乙醇沉澱DNA片段，然後將其溶解於20微升TE中。
使用DNA連接試劑盒2型(Takara Shuzo)根據試劑盒所附說明書在16℃下反應1小時，使如上製備的包含編碼L鏈V區的基因和用SplI和BglII消化的chATR5Hv/N5KG1(V)或chATR5Hv/N5KG4P連接。
將連接混合物加入100微升大腸埃希氏桿菌JM109感受態細胞(Nippongene)並且在冰上溫育30分鐘並且在42℃下溫育1分鐘。然後，向其中加入300微升Hi-感受態肉湯(Nippongene)並且在37℃下溫育1小時，然後將大腸埃希氏桿菌平鋪在100微克/毫升LBA瓊脂培養基上，並且在37℃下溫育過夜獲得大腸埃希氏桿菌轉化體。該轉化體在37℃下在1升含有50微克/毫升氨苄青黴素的2xYT培養基中培養過夜，使用質粒Maxi試劑盒(QIAGEN)從細胞級分製備質粒DNA。包含編碼嵌合ATR-5抗體基因的這些質粒分別定為chATR5/N5KG1(V)和chATR5/N5KG4P。
(4)轉染到COS-7細胞中為了評價嵌合抗體的抗原結合活性和中和活性，將上述表達質粒轉染到COS-7細胞中並且瞬時表達抗體。
通過使用基因脈衝發生儀(Bio Rad)進行電穿孔將質粒chATR5/N5KG1(V)或chATR5/N5KG4P轉導到COS-7細胞中。以1×107細胞/毫升的細胞濃度向懸浮於Dulbecco PBS(-)(下文稱之為PBS)的0.78毫升的COS-7細胞中加入50微克所述質粒，使接受1500V和25μF電容的脈衝。
經室溫下10分鐘回收期之後，將經電穿孔的細胞懸浮於含有5％Ultra低IgG胎牛血清(GIBCO)的DMEM培養基中，並且在5％CO2培養箱中用10釐米培養皿培養。培養24小時之後，吸出培養上清液，然後加入無血清HBCHO(Irvine Scientific)。進一步培養72小時之後，收集培養上清液並且離心去除細胞碎片。
(5)抗體的純化如下使用rProtein A Sepharose Fast Flow(Pharmacia Biotech)，從COS-7細胞的培養上清液純化嵌合抗體。
將1毫升rProtein A Sepharose Fast Flow裝入柱子，並且通過10倍體積的TBS將柱子平衡。將COS-7細胞的培養上清液加到平衡過的柱子上，然後用10體積的TBS衝洗。
然後通過用13.5毫升的2.5mM HCl(pH3.0)洗脫吸附的抗體級分，並且通過加入1.5毫升的1M Tris-HCl(pH8.0)立即中和洗脫物。
通過使用Centriprep100(Amicon)對純化的抗體級分進行兩次超濾，將溶劑換為含有150mM NaCl的50mM Tris-HCl(pH7.6)(下文稱之為TBS)，並且最後濃縮至大約1.5毫升。
(6)穩定生產的CHO細胞系的建立為了建立穩定產生嵌合抗體的細胞系，將上述表達質粒引入適應CHO-S-SFMII無血清培養基(GIBCO)的CHO細胞(DG44)中。
用限制酶SspI(Takara Shuzo)酶切質粒chATR5/N5KG1(V)或chATR5/N5KG4P，使DNA線性化，並且在用苯酚和氯仿提取之後，通過乙醇沉澱作用回收DNA。通過使用基因脈衝發生儀(Bio Rad)進行電穿孔將線性化質粒轉導到DG44細胞中中。以1×107細胞/毫升的細胞濃度向懸浮於PBS的0.78毫升的DG44細胞加入10微克所述質粒，使接受1500V和25μF電容的脈衝。
室溫下10分鐘回收期之後，將電穿孔過的細胞懸浮於含有次黃嘌呤/胸苷(GIBCO)的CHO-S-SFMII培養基(GIBCO)中，並且在CO2培養箱中用兩個96-孔板(Falcon)培養。開始培養之後第一天，將培養基換為含有次黃嘌呤/胸苷(GIBCO)和500微克/毫升GENETICIN(G418Sulfate，GIBCO)的CHO-S-SFMII培養基(GIBCO)的篩選培養基來篩選其中引入了抗體基因的細胞。更換篩選培養基之後，大約2周之後用顯微鏡檢查細胞。觀察到有益細胞生長之後，通過下面對於測定抗體濃度描述的ELISA測定產生的抗體的量，並且篩選具有高抗體產率的細胞。
參照實施例5.人源化抗體的構建(1)人源化抗體H鏈的構建(i)人源化H鏈「a」型的構建通過PCR方法利用CDR-嫁接產生人源化ATR-5抗體H鏈。為了產生具有來自人抗體L39130的RF(DDBJ，Gao L.等，未公開，1995)的人源化H鏈「a」型，使用七種PCR引物。CDR-嫁接引物hR5Hv1S(SEQ IDNO11)，hR5Hv2S(SEQ ID NO12)，和hR5Hv4S(SEQ ID NO13)具有有義DNA序列，CDR-嫁接引物hR5Hv3A(SEQ ID NO14)和hR5Hv5A(SEQ IDNO15)具有反義DNA序列，各引物在其兩個末端具有18-35bp互補序列。
對hR5Hv1S設計使其具有Kozak共有序列(Kozak，M.等，分子生物學雜誌(J.Mol.Biol.)196947-950，1987)和SalI識別位點，設計hR5Hv5A使其具有NheI識別位點。外源引物hR5HvPrS(SEQ ID NO16)與CDR-嫁接引物hR5Hv1S具有同源性，hR5HvPrA(SEQ ID NO17)與CDR-嫁接引物hR5Hv5A具有同源性。
通過Pharmacia Biotech合成和純化CDR-嫁接引物hR5Hv1S，hR5Hv2S，hR5Hv3A，hR5Hv4S和hR5Hv5A，和外源引物hR5HvPrS和hR5HvPrA。
使用KOD DNA聚合酶(Toyo Boseki)並且使用附屬緩衝液，在98微升中含有120mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM KCl，6mM(HN4)2SO4，0.1％Triton X-100，0.001％BSA，0.2mM dNTPs(dATP，dGTP，dCTP，dTTP)，1mM MgCl2，2.5單位的KOD DNA聚合酶(Toyo Boseki)，和50pmole的各種CDR-嫁接引物hR5Hv1S，hR5Hv2S，hR5Hv3A，hR5Hv4S和hR5Hv5A的條件下，以94℃30秒，50℃1分鐘和72℃1分鐘的溫度循環將PCR進行5次循環。進一步加入100pmole的外源引物hR5HvPrS和hR5HvPrA之後，以相同的溫度循環在100微升系統中將PCR進行25次循環。通過使用2％NuSieve GTG瓊脂糖(FMC BioProducts)進行瓊脂糖凝膠電泳來分離通過PCR方法擴增的DNA片段。
切下含有大約430bp長DNA片段的瓊脂糖條。向其中加入3倍體積(ml/g)的TE，然後用苯酚，苯酚/氯仿，和氯仿提取來純化DNA片段。用乙醇沉澱純化的DNA，並且將其三分之一體積溶解於17微升水。用NheI和SalI消化得到的PCR反應混合物，並且使用DNA連接試劑盒2型(Takara Shuzo)根據試劑盒所附說明書，使之和用NheI和SalI消化製備的質粒載體CVIDEC連接。
將連接混合物加入100微升大腸埃希氏桿菌JM109感受態細胞(Nippongene)並且在冰上溫育30分鐘並且在42℃下溫育1分鐘。然後，向其中加入300微升Hi-感受態肉湯(Nippongene)並且在37℃下溫育1小時，然後將大腸埃希氏桿菌平鋪在100微克/毫升LBA瓊脂培養基上，並且在37℃下溫育過夜獲得大腸埃希氏桿菌轉化體。該轉化體在37℃下在3毫升LBA培養基中培養過夜，使用QIAprep Spin質粒試劑盒(QIAGEN)從細胞級分製備質粒DNA。
使用染料中止子循環測序FS即用反應試劑盒(Perkin-Elmer)通過DNA測序儀373A(Perkin-Elmer)測定質粒中cDNA編碼區的鹼基序列。作為測序引物，使用M13引物M4(Takara Shuzo)和M13引物RV(TakaraShuzo)，通過在兩個方向證實核苷酸序列來測定序列。
因為在EcoT221識別位點之前或之後發現突變和/或缺失，因此連接具有正確序列的各片段，然後再次亞克隆到CVIDEC來確定核苷酸序列。具有正確序列的質粒記為hATR5Hva/CVIDEC。質粒hATR5Hva/CVIDEC中包含的人源化H鏈「a」型的核苷酸序列及其相應的胺基酸序列在SEQ ID NO18中給出。SEQ ID NO19中也給出了「a」型的胺基酸序列。
(ii)人源化H鏈「b」和「c」型的構建通過利用FR-改組方法用來自另一種人抗體的FR3置換「a」型的FR3產生「b」和「c」型。為了用來自人抗體Z34963(DDBJ，BorretzenM.等，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)9112917-12921，1994)的FR3置換「b」型中的FR3，產生了4種編碼FR3的DNA引物。FR-改組引物F3RFFS(SEQID NO20)和F3RFBS(SEQ ID NO21)具有有義DNA序列，F3RFFA(SEQID NO22)和F3RFBA(SEQ ID NO23)具有反義DNA序列。
F3RFFS和F3RFFA彼此具有序列互補性，並且在兩個末端上具有BalI和XhoI識別序列。為了用來自人抗體P01825(SWISS-PROT，PoljakRJ.等，生物化學(Biochemistry)，163412-3420，1977)置換「c」型中的FR3，產生了4種編碼FR3的DNA引物。FR-改組引物F3NMFS(SEQ IDNO24)和F3NMBS(SEQ ID NO25)具有有義DNA序列，F3NMFA(SEQ IDNO26)和F3NMBA(SEQ ID NO27)具有反義DNA序列。F3NMBS和F3NMBA彼此具有序列互補性，並且在兩個末端上具有XhoI和NcoI識別序列。
通過Pharmacia Biotech合成F3RFFS，F3RFBS，F3RFFA，F3RFBA，F3NMFS，F3NMBS，F3NMFA和F3NMBA。將F3RFFS和F3RFFA，和F3RFBS和F3RFBA退火，並且分別用BalI和XhoI，以及NcoI和XhoI消化。將它們引入通過用BalI和NcoI消化製備的質粒hATR5Hva/CVIDEC(BalI/NcoI)，並且測定核苷酸序列。具有正確序列的質粒記為hATR5Hvb/CVIDEC。質粒hATR5Hvb/CVIDEC中包含的人源化H鏈「b」型的核苷酸序列及其相應的胺基酸序列在SEQ ID NO28中給出。SEQ ID NO29中也給出了「b」型的胺基酸序列。
將F3NMFS和F3NMFA，和F3NMBS和F3NMBA退火，並且分別用BalI和XhoI，以及NcoI和XhoI消化。將它們引入通過用BalI和NcoI消化製備的質粒hATR5Hva/CVIDEC(BalI/NcoI)，並且測定核苷酸序列。具有正確序列的質粒記為hATR5Hvc/CVIDEC。質粒hATR5Hvc/CVIDEC中包含的人源化H鏈「c」型核苷酸序列及其相應的胺基酸序列在SEQID NO30中給出。SEQ ID NO31中也給出了「c」型的胺基酸序列。
(iii)人源化H鏈「d」和「e」型的構建通過利用FR-改組方法，用來自另一種人抗體的FR3置換「a」型的FR3產生「d」和「e」型。為了用來自人抗體M62723(DDBJ，PascualV.等，臨床研究雜誌(J.Clin.Invest.)861320-1328，1990)的FR3置換「d」型中的FR3，產生4種編碼FR3的DNA引物。FR-改組引物F3EPS(SEQ ID NO32)具有有義DNA序列，F3EPA(SEQ ID NO33)具有反義DNA序列，引物的3』-端具有18bp互補序列。
外源引物F3PrS(SEQ ID NO34)和F3PrA(SEQ ID NO35)與FR-改組引物F3EPS和F3EPA具有同源性，並且也可以用於其它FR3的FR改組。為了用來自人抗體Z80844(DDBJ，Thomsett AR.等，未公開)的FR3置換「e」型中的FR3，產生2種編碼FR3的DNA引物。FR-改組引物F3VHS(SEQ ID NO36)具有有義DNA序列，F3VHA(SEQ ID NO37)具有反義DNA序列，引物的3』-端具有18bp互補序列。通過Pharmacia Biotech合成F3EPS，F3EPA，F3PrS，F3PrA，F3VHS和F3VHA。
使用KOD DNA聚合酶(Toyo Boseki)並且使用附屬緩衝液，在100微升反應混合物中含有1μM FR-改組引物F3EPS和F3EPA，或者F3VHS和F3VHA，0.2mM dNTPs，1.0mM MgCl2各5微升和2.5單位的KOD DNA聚合酶的條件下，以94℃30秒，50℃1分鐘和74℃1分鐘的溫度循環將PCR進行5次循環。進一步加入100pmol的外源引物F3PrS和F3PrA之後，以相同的溫度循環將PCR進行25次循環。
通過使用2％NuSieve GTG瓊脂糖(FMC BioProducts)進行瓊脂糖凝膠電泳來分離通過PCR方法擴增的DNA片段。切下含有大約424bp長DNA片段的瓊脂糖條，向其中加入3倍體積(ml/g)的TE，然後用苯酚，苯酚/氯仿，和氯仿提取來純化DNA片段。用乙醇沉澱純化的DNA之後，將其三分之一體積溶解於14微升水。用BalI和NcoI消化得到的PCR反應混合物，並且引入用BalI和NcoI消化製備的質粒hATR5Hva/CVIDEC(BalI/NcoI)，並且測定核苷酸序列。
具有正確序列的質粒記為hATR5Hvd/CVIDEC。質粒hATR5Hvd/CVIDEC中包含的人源化H鏈「d」型的核苷酸序列及其相應的胺基酸序列在SEQ ID NO38中給出。SEQ ID NO39中也給出了「d」型的胺基酸序列。質粒hATR5Hve/CVIDEC中包含的人源化H鏈「e」型的核苷酸序列及其相應的胺基酸序列在SEQ ID NO40中給出。SEQ IDNO41中也給出了「e」型的胺基酸序列。
(iv)人源化H鏈「f」和「g」型的構建通過利用FR-改組方法，用來自另一種人抗體的FR3置換「a」型的FR3產生「f」和「g」型。為了用來自人抗體L04345(DDBJ，HillsonJL等，實驗藥物雜誌(J.Exp.Med.)178331-336，1993)的FR3置換「f」型中的FR3，以及為了用來自人抗體S78322(DDBJ，Bejcek BE等，癌症研究(Cancer RES.)552346-2351，1995)的FR3置換「g」型中的FR3，合成2種分別編碼FR3的DNA引物。「f」型的FR-改組引物F3SSS(SEQID NO42)具有有義DNA序列，F3SSA(SEQ ID NO43)具有反義DNA序列，引物的3』-端具有18bp互補序列。
「g」型的F3CDS(SEQ ID NO44)具有有義DNA序列，F3CDA(SEQID NO45)具有反義DNA序列，引物的3』-端具有18bp互補序列。通過Pharmacia Biotech合成和純化F3SSS，F3SSA，F3CDS和F3CDA。使用KOD DNA聚合酶(Toyo Boseki)並且使用附屬緩衝液，在100微升反應混合物中含有1μM FR-改組引物F3SSS和F3SSA，或者F3CDS和F3CDA，0.2mM dNTPs，1.0mM MgCl2各5微升和2.5單位的KOD DNA聚合酶的條件下，以94℃30秒，50℃1分鐘和74℃1分鐘的溫度循環將PCR進行5次循環。進一步加入100pmole的外源引物F3PrS和F3PrA之後，以相同的溫度循環將PCR進行25次循環。
通過使用2％NuSieve GTG瓊脂糖(FMC BioProducts)進行瓊脂糖凝膠電泳來分離通過PCR方法擴增的DNA片段。切下含有大約424bp長DNA片段的瓊脂糖條，向其中加入3倍體積(ml/g)的TE，然後用苯酚，苯酚/氯仿，和氯仿提取來純化DNA片段。用乙醇沉澱純化的DNA之後，將其三分之一體積溶解於14微升水。用BalI和NcoI消化得到的PCR反應混合物，並且引入用BalI和NcoI消化製備的質粒hATR5Hva/CVIDEC(BalI/NcoI)，並且測定核苷酸序列。
具有正確序列的質粒記為hATR5Hvf/CVIDEC和hATR5Hvg/CVIDEC。該質粒hATR5Hvf/CVIDEC中包含的人源化H鏈「f」型的核苷酸序列及其相應的胺基酸序列，以及「f」型的胺基酸序列在SEQ ID NO46和SEQ ID NO47中給出。該質粒hATR5Hvg/CVIDEC中包含的人源化H鏈「g」型的核苷酸序列及其相應的胺基酸序列，以及「g」型的胺基酸序列在SEQ ID NO48和SEQ ID NO49中給出。
(v)人源化H鏈「h」型的構建通過利用FR-改組方法，用來自另一種人抗體的FR3置換「a」型的FR3產生「h」型。為了用來自人抗體Z26827(DDBJ，van Der Stoep等，實驗藥物雜誌(J.Exp.Med.)17799-107，1993)的FR3置換「h」型中的FR3，合成2種分別編碼FR3的引物。「h」型的FR-改組引物F3ADS(SEQ ID NO50)具有有義DNA序列，F3ADA(SEQ ID NO51)具有反義DNA序列，引物的3』-端具有18bp互補序列。
通過Pharmacia Biotech合成和純化F3ADS，F3ADA。使用KOD DNA聚合酶(Toyo Boseki)並且使用附屬緩衝液，在100微升反應混合物中含有1μM FR-改組引物F3ADS和F3ADA，0.2mM dNTPs，1.0mM MgCl2各5微升和2.5單位的KOD DNA聚合酶的條件下，以94℃30秒，50℃1分鐘和74℃1分鐘的溫度循環將PCR進行5次循環。進一步加入100pmole的外源引物F3PrS和F3PrA之後，以相同的溫度循環將PCR進行25次循環。通過使用2％NuSieve GTG瓊脂糖(FMC BioProducts)進行瓊脂糖凝膠電泳來分離通過PCR方法擴增的DNA片段。
切下含有大約424bp長DNA片段的瓊脂糖條，向其中加入3倍體積(ml/g)的TE，然後用苯酚，苯酚/氯仿，和氯仿提取來純化DNA片段。用乙醇沉澱純化的DNA之後，將其三分之一體積溶解於14微升水中。用BalI和NcoI消化得到的PCR反應混合物，並且引入用BalI和NcoI消化製備的質粒hATR5Hva/CVIDEC(BalI/NcoI)，並且測定核苷酸序列。具有正確序列的質粒記為hATR5Hvh/CVIDEC。質粒hATR5Hvh/CVIDEC中包含的人源化H鏈「h」型的核苷酸序列及其相應的胺基酸序列以及「h」型胺基酸序列在SEQ ID NO52中給出。SEQ IDNO53中給出了「h」型的胺基酸序列。
(vi)人源化H鏈「i」和「j」型的構建通過利用FR-改組方法，用來自另一種人抗體的FR3置換「a」型的FR3產生「i」和「j」型。為了用來自人抗體U95239(DDBJ，Manheimer-Lory AJ.等，未公開)的FR3置換「i」型中的FR3，以及為了用來自人抗體L03147(DDBJ，Collect TA.等，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)8910026-10030，1992)的FR3置換「j」型中的FR3，合成2種分別編碼FR3的引物。「i」型的FR-改組引物F3MMS(SEQ ID NO54)具有有義DNA序列，F3MMA(SEQ ID NO55)具有反義DNA序列，引物的3』-端具有18bp互補序列。
「j」型的F3BMS(SEQ ID NO56)具有有義DNA序列，F3BMA(SEQID NO57)具有反義DNA序列，引物的3』-端具有18bp互補序列。通過Pharmacia Biotech合成和純化F3MMS，F3MMA，F3BMS和F3BMA。使用Ampli Taq Gold(Perkin-Elmer)並且使用附屬緩衝液，在100微升反應混合物中含有1μM FR-改組引物F3MMS和F3MMA，或者F3BMS和F3BMA，0.2mM dNTPs，1.0mM MgCl2各5微升和2.5單位的Ampli TaqGold的條件下，以94℃30秒，50℃1分鐘和74℃1分鐘的溫度循環將PCR進行5次循環。進一步加入100pmole的外源引物F3PrS和F3PrA之後，以相同的溫度循環將PCR進行25次循環。
通過使用2％NuSieve GTG瓊脂糖(FMC BioProducts)進行瓊脂糖凝膠電泳來分離通過PCR方法擴增的DNA片段。切下含有大約424bp長DNA片段的瓊脂糖條，向其中加入3倍體積(ml/g)的TE，然後用苯酚，苯酚/氯仿，和氯仿提取來純化DNA片段。用乙醇沉澱純化的DNA之後，將其三分之一體積溶解於14微升水。用BalI和NcoI消化得到的PCR反應混合物，並且引入用BalI和NcoI消化製備的質粒hATR5Hva/CVIDEC(BalI/NcoI)，並且測定核苷酸序列。
具有正確序列的質粒記為hATR5Hvi/CVIDEC和hATR5Hvj/CVIDEC。質粒hATR5Hvi/CVIDEC中包含的人源化H鏈「i」型的核苷酸序列及其相應的胺基酸序列，和「i」型的胺基酸序列在SEQ ID NO58和SEQ IDNO59中給出。質粒hATR5Hvj/CVIDEC中包含的人源化H鏈「j」型的核苷酸序列及其相應的胺基酸序列，和「j」型的胺基酸序列在SEQ IDNO60和SEQ ID NO61中給出。
(vii)人源化H鏈「b1」和「d1」型的構建通過利用FR-改組方法，用來自另一種人抗體的FR2置換「b」和「d」型的FR2，產生「b1」和「d1」型。為了用來自人抗體P01742(SWISS-PROT，Cunningham BA.等，生物化學(Biochemistry)93161-3170，1970)的FR2置換FR2，合成2種分別編碼FR2的DNA引物。FR-改組載體F2MPS(SEQ ID NO62)具有有義DNA序列，F2MPA(SEQ ID NO63)具有反義DNA序列。它們具有彼此互補的序列，並且在其兩端具有EcoT22I和BalI的識別序列。
通過Pharmacia Biotech合成和純化F2MPS和F2MPA。將F2MPS和F2MPA退火，並且用EcoT22I和BalI消化。將它們引入用EcoT22I和BalI消化製備的質粒hATR5Hvb/CVIDEC(EcoT22I/BalI)和hATR5Hvd/CVIDEC(EcoT22I/BalI)，並且測定核苷酸序列。具有正確序列的質粒記為hATR5Hvb1/CVIDEC和hATR5Hvd1/CVIDEC。質粒hATR5Hvb1/CVIDEC中包含的人源化H鏈「b1」型的核苷酸序列及其相應的胺基酸序列，和「b1」型的胺基酸序列在SEQ ID NO64和SEQ IDNO65中給出。質粒hATR5Hvd1/CVIDEC中包含的人源化H鏈「d1」型的核苷酸序列及其相應的胺基酸序列，和「d1」型的胺基酸序列在SEQID NO66和SEQ ID NO67中給出。
(Viii)人源化H鏈「b3」和「d3」型的構建通過利用FR-改組方法，用來自另一種人抗體的FR2置換「b」和「d」型的FR2，產生「b3」和「d3」型。為了用來自人抗體Z80844(DDDJ，Thomsett AR.等，未公開)的FR2置換FR2，合成2種分別編碼FR2的DNA引物。FR-改組載體F2VHS(SEQ ID NO68)具有有義DNA序列，F2VHA(SEQ ID NO69)具有反義DNA序列。它們具有彼此互補的序列，並且在其兩端具有EcoT22I和BalI的識別序列。通過Pharmacia Biotech合成和純化F2VHS和F2VHA。
將F2VHS和F2VHA退火，並且用EcoT22I和BalI消化。將它們引入用EcoT22I和BalI消化製備的質粒hATR5Hvb/CVIDEC(EcoT22I/BalI)和hATR5Hvd/CVIDEC(EcoT22I/BalI)，並且測定核苷酸序列。具有正確序列的質粒記為hATR5Hvb3/CVIDEC和hATR5Hvd3/CVIDEC。質粒hATR5HVb3/CVIDEC中包含的人源化H鏈「b3」型的核苷酸序列及其相應的胺基酸序列，和「b3」型的胺基酸序列在SEQ ID NO70和SEQ IDNO71中給出。質粒hATR5Hvd3/CVIDEC中包含的人源化H鏈「d3」型的核苷酸序列及其相應的胺基酸序列，和「d3」型的胺基酸序列在SEQID NO72和SEQ ID NO73中給出。
(2)人源化抗體L鏈V區的構建(i)「a」型通過使用PCR方法進行CDR-嫁接產生人源化ATR-5抗體L-鏈V區。對於產生具有從人抗體Z37332(DDBJ，Welschof M.等，免疫學方法(J.Immunol.Methods)179203-214，1995)衍生的構架區的人源化抗體L鏈(「a」型)，使用七種PCR引物。
CDR-嫁接引物h5Lv1S(SEQ ID NO74)和h5Lv4S(SEQ ID NO75)具有有義DNA序列，CDR-嫁接引物h5Lv2A(SEQ ID NO76)，h5Lv3A(SEQID NO77)，和h5Lv5A(SEQ ID NO78)具有反義DNA序列，各引物在其兩個末端具有20bp互補序列。外源引物h5LvS(SEQ ID NO79)與h5LvA(SEQ ID NO80)與CDR-嫁接引物h5Lv1S和h5Lv5A具有同源性。通過Pharmacia Biotech合成和純化CDR-嫁接引物h5Lv1S，h5Lv4S，h5Lv2A，h5Lv3A，，h5Lv5A，h5LvS和h5LvA。
100微升PCR溶液中含有120mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM KCl，6mM(HN4)2SO4，0.1％Triton X-100，0.001％BSA，0.2mM dNTPs(dATP，dGTP，dCTP，dTTP)，1mM MgCl2，2.5單位的KOD DNA聚合酶(Toyo Boseki)，50pmoleCDR-嫁接引物h5Lv1S，h5Lv2A，h5Lv3A，h5Lv4S，h5Lv5A。
使用DNA熱循環儀480(Perkin-Elmer)以94℃30秒，50℃1分鐘和72℃1分鐘的溫度循環將PCR進行5次循環，來組裝5個CDR-嫁接引物。向反應混合物進一步加入100pmole的外源引物h5LvS和h5LvA之後，以94℃30秒，52℃1分鐘和72℃1分鐘的溫度循環將PCR進行30次循環擴增裝配的DNA片段。
通過使用3％NuSieve GTG瓊脂糖(FMC BioProducts)進行瓊脂糖凝膠電泳來分離PCR反應混合物。切下含有大約400bp長DNA片段的瓊脂糖條。用苯酚和氯仿提取該瓊脂糖條，通過乙醇沉澱回收DNA片段。用限制酶SplI(Takara Shuzo)和BglII(Takara Shuzo)在37℃下消化回收的DNA片段4小時。用苯酚和氯仿提取消化混合物，並且乙醇沉澱該DNA片段之後，將其溶解於10微升TE中。使用DNA連接試劑盒2型(Takara Shuzo)根據試劑盒所附說明書在16℃下反應1小時，連接如上製備的編碼人源化L鏈V區的SplI-BglII DNA片段和用SplI和BglII消化製備的CVIDEC載體。
將連接混合物加入100微升大腸埃希氏桿菌JM109感受態細胞(Nippongene)，並且在冰上溫育30分鐘並且在42℃下溫育1分鐘。然後，向其中加入300微升Hi-感受態肉湯(Nippongene)並且在37℃下溫育1小時，然後將大腸埃希氏桿菌平鋪在LBA瓊脂培養基上，並且在37℃下溫育過夜獲得大腸埃希氏桿菌轉化體。該轉化體在37℃下在3毫升LBA培養基中培養過夜，使用QIAprep Spin質粒試劑盒(QIAGEN)從細胞級分製備質粒DNA。
使用染料中止子循環測序FS即用反應試劑盒(Perkin-Elmer)，通過DNA測序儀373A(Perkin-Elmer)測定質粒中cDNA編碼區的核苷酸序列。作為測序引物，使用M13引物M4(Takara Shuzo)和M13引物RV(Takara Shuzo)，通過在兩個方向證實核苷酸序列來測定序列。
包含編碼人源化抗體L鏈V區的基因並且在5』-端具有BglII識別序列和Kozak序列並且在3』-端具有SplI識別序列的質粒指定為hATR5Lva/CVIDEC。SEQ ID NO81中給出該人源化L鏈「a」型的核苷酸序列(包括其相應的胺基酸序列)。SEQ ID NO82中也給出了「a」型的胺基酸序列。
(ii)「b」和「c」型通過置換「a」型的FR3(FR-改組)產生「b」和「c」型。對於「b」型，使用來自人抗體S68699(DDBJ，Hougs L等，臨床免疫原實驗(Exp.Clin.Immunogen et.)10141-151，1993)的FR3，以及對於「c」型，使用來自人抗體P01607(SWISS-PROT，Epp O等，生物化學(Biochemistry)144943-4952，1975)的FR3。
編碼「b」型的FR3的引物F3SS(SEQ ID NO83)和F3SA(SEQ IDNO84)，或者編碼「c」型的FR3的引物F3RS(SEQ ID NO85)和F3RA(SEQID NO86)彼此具有序列互補性，並且在其兩個末端具有限制酶KpnI和PstI識別序列。通過Pharmacia Biotech合成和純化F3SS，F3SA，F3RS和F3RA。通過在96℃下處理2分鐘並且在50℃下處理2分鐘將F3SS，F3SA，F3RS和F3RA各100pmole退火，並且產生雙鏈DNA片段。
37℃下用限制酶KpnI(Takara Shuzo)將這些雙鏈DNA片段消化1小時，然後37℃下用限制酶PstI(Takara Shuzo)消化1小時。用苯酚和氯仿提取消化混合物，用乙醇將其沉澱之後，將其溶解於TE中。
37℃下用限制酶KpnI(Takara Shuzo)將質粒hATR5Lva/CVIDEC消化1小時，然後37℃下用限制酶PstI(Takara Shuzo)消化1小時。通過使用1.5％NuSieve GTG瓊脂糖(FMC BioProducts)進行瓊脂糖凝膠電泳來分離消化混合物，切下含有大約3000bp長DNA片段的瓊脂糖條。用苯酚和氯仿提取該瓊脂糖條，通過乙醇沉澱DNA片段之後，將其溶解於TE中。
使用DNA連接試劑盒2型(Takara Shuzo)根據試劑盒所附說明書在16℃下反應1小時，連接如上製備的編碼「b」或「c」型的FR3的KpnI-PstI DNA片段和用KpnI和PstI消化去除FR3的hATR5Lva/CVIDEC載體。
將連接混合物加入100微升大腸埃希氏桿菌JM109感受態細胞(Nippongene)並且在冰上溫育30分鐘並且在42℃下溫育1分鐘。然後，向其中加入300微升Hi-感受態肉湯(Nippongene)並且在37℃下溫育1小時，然後將大腸埃希氏桿菌平鋪在LBA瓊脂培養基上，並且在37℃下溫育過夜，獲得大腸埃希氏桿菌轉化體。該轉化體在37℃下在3毫升LBA培養基中培養過夜，使用QIAprep Spin質粒試劑盒(QIAGEN)從細胞級分製備質粒DNA。
使用染料中止子循環測序FS即用反應試劑盒(Perkin-Elmer)，通過DNA測序儀373A(Perkin-Elmer)測定質粒中cDNA編碼區的核苷酸序列。作為測序引物，使用M13引物M4(Takara Shuzo)和M13引物RV(Takara Shuzo)，通過在兩個方向證實核苷酸序列來測定序列。
其中人源化抗體L鏈「a」型的FR3被置換的包含編碼「b」或「c」型的基因的質粒分別指定為hATR5Lvb/CVIDEC或hATR5Lvc/CVIDEC。SEQ ID NO87和88中給出質粒hATR5Lvb/CVIDEC中包含的人源化L鏈「b」型的核苷酸序列和相應的胺基酸序列以及「b」型的胺基酸序列。SEQ ID NO89和90中給出質粒hATR5Lvc/CVIDEC中包含的人源化L鏈「c」型的核苷酸序列和相應的胺基酸序列以及「c」型的胺基酸序列。
(iii)「b1」和「b2」型通過置換「b」型的FR2產生「b1」和「b2」型。對於「b1」型，使用來自人抗體S65921(DDBJ，Tonge DW等，免疫年(YearImmunol.)756-62，1993)的FR2，對於「b2」型，使用來自人抗體X93625(DDBJ，Cox JP等，歐洲免疫學雜誌(Eur.J.Immunol.)24827-836，1994)的FR2。
編碼「b1」型的FR2的引物F2SS(SEQ ID NO91)和F2SA(SEQ IDNO92)，或者編碼「b2」型的FR2的引物F2XS(SEQ ID NO93)和F2XA(SEQ ID NO94)彼此具有序列互補性，並且在其兩個末端具有限制酶AflII和SpeI識別序列。通過Pharmacia Biotech合成F2SS，F2SA，F2XS和F2XA。通過在96℃下處理2分鐘並且在50℃下處理2分鐘將F2SS和F2SA，或者F2XS和F2XA各100pmole退火，並且產生雙鏈DNA片段。
37℃下用限制酶AflII(Takara Shuzo)和SpeI(Takara Shuzo)將這些雙鏈DNA片段消化1小時。用苯酚和氯仿提取消化混合物，在用乙醇將其沉澱之後，將其溶解於TE中。
37℃下用限制酶AflII(Takara Shuzo)和SpeI(Takara Shuzo)將質粒hATR5Lvb/CVIDEC消化1小時。通過使用1.5％NuSieve GTG瓊脂糖(FMC BioProducts)進行瓊脂糖凝膠電泳來分離消化混合物，切下含有大約3000bp長DNA片段的瓊脂糖條。用苯酚和氯仿提取該瓊脂糖條，用乙醇沉澱DNA片段之後，將其溶解於TE中。
使用DNA連接試劑盒2型(Takara Shuzo)根據試劑盒所附說明書在16℃下反應1小時，連接如上製備的編碼「b1」或「b2」型的FR2的AflII-SpeI DNA片段和其中用AflII和SpeI消化去除FR2的hATR5Lvb/CVIDEC。
將連接混合物加入100微升大腸埃希氏桿菌JM109感受態細胞(Nippongene)並且在冰上溫育30分鐘並且在42℃下溫育1分鐘。然後，向其中加入300微升Hi-感受態肉湯(Nippongene)，並且在37℃下溫育1小時，然後將大腸埃希氏桿菌平鋪在LBA瓊脂培養基上，並且在37℃下溫育過夜獲得大腸埃希氏桿菌轉化體。該轉化體在37℃下在4毫升LBA培養基中培養過夜，使用QIAprep Spin質粒試劑盒(QIAGEN)從細胞級分製備質粒DNA。
使用染料中止子循環測序FS即用反應試劑盒(Perkin-Elmer)，通過DNA測序儀373A(Perkin-Elmer)測定質粒中cDNA編碼區的核苷酸序列。作為測序引物，使用M13引物M4(Takara Shuzo)和M13引物RV(Takara Shuzo)，通過在兩個方向證實核苷酸序列來測定序列。
其中人源化抗體L鏈「b」型的FR2被置換的包含編碼「b1」或「b2」型的基因的質粒分別指定為hATR5Lvb1/CVIDEC或hATR5Lvb2/CVIDEC。SEQ ID NO95和96中給出質粒hATR5Lvb1/CVIDEC中包含的人源化L鏈「b1」型的核苷酸序列和相應的胺基酸序列以及「b1」型的胺基酸序列。SEQ ID NO97和98中給出質粒hATR5Lvb2/CVIDEC中包含的人源化L鏈「b2」型的核苷酸序列和相應的胺基酸序列以及「b2」型的胺基酸序列。
(3)人源化抗體的表達載體的構建(i)人源化H鏈和嵌合L鏈的結合用NheI和SalI消化包含H鏈V區的質粒hATR5Hva/CVIDEC，回收人源化H鏈V區的cDNA片段並且引入通過用NheI和SalI消化chATR5/N5KG4P、chATR-5抗體表達質粒載體製備的chATR5/N5KG4P(SalI/NheI)。將這樣產生的質粒指定為hHva-chLv/N5KG4P。
用NheI和SalI消化包含H鏈V區的質粒hATR5Hvb/CVIDEC，回收人源化H鏈V區的cDNA片段並且引入通過用NheI和SalI消化chATR5/N5KG4P、一種chATR-5抗體表達質粒載體製備的chATR5/N5KG4P(SalI/NheI)。將這樣產生的質粒指定為hHvb-chLv/N5KG4P。
用NheI和SalI消化包含H鏈V區的質粒hATR5Hvc/CVIDEC，hATR5Hvd/CVIDEC，和hATR5Hve/CVIDEC，回收人源化H鏈V區的cDNA片段並且引入通過用NheI和SalI消化chATR5/N5KG4P、一種chATR-5抗體表達質粒載體製備的chATR5/N5KG4P(SalI/NheI)。將這樣產生的質粒指定為hHVc-chLv/N5KG4P，hHvd-chLv/N5KG4P和hHve-chLv/N5KG4P。
用NheI和SalI消化包含H鏈V區的質粒hATR5Hvf/CVIDEC和hATR5Hvh/CVIDEC，回收人源化H鏈V區的cDNA片段並且引入通過用NheI和SalI消化chATR5/N5KG4P、一種chATR-5抗體表達質粒載體製備的chATR5/N5KG4P(SalI/NheI)。將這樣產生的質粒指定為hHvf-chLv/N5KG4P和hHvh-chLv/N5KG4P。
用NheI和SalI消化包含H鏈V區的質粒hATR5Hvi/CVIDEC和hATR5Hvj/CVIDEC，回收人源化H鏈V區的cDNA片段並且引入通過用NheI和SalI消化chATR5/N5KG4P、一種chATR-5抗體表達質粒載體製備的chATR5/N5KG4P(SalI/NheI)。將這樣產生的質粒指定為hHvi-chLv/N5KG4P和hHvj-chLv/N5KG4P。
用NheI和SalI消化包含H鏈V區的質粒hATR5Hvb1/CVIDEC，hATR5Hvd1/CVIDEC，回收人源化H鏈V區的cDNA片段並且引入通過用NheI和SalI消化chATR5/N5KG4P、一種chATR-5抗體表達質粒載體製備的chATR5/N5KG4P(SalI/NheI)。將這樣產生的質粒指定為hHvb1-chLv/N5KG4P和hHvd1-chLv/N5KG4P。
(ii)人源化L鏈和嵌合H鏈的結合使用抗體表達載體N5KG4P，將其與嵌合H鏈結合併且表達，並且評價人源化L鏈。
37℃下用限制酶BglII(Takara Shuzo)和SplI(Takara Shuzo)將質粒hATR5Lva/CVIDEC，hATR5Lvb/CVIDEC，hATR5Lvc/CVIDEC，hATR5Lvb1/CVIDEC，和hATR5Lvb2/CVIDEC消化2-3小時。通過使用1.5％或2％NuSieve GTG瓊脂糖(FMC BioProducts)進行瓊脂糖凝膠電泳來分離消化混合物，切下含有大約400bp長DNA片段的瓊脂糖條。用苯酚和氯仿提取該瓊脂糖條，用乙醇沉澱DNA片段之後，將其溶解於TE中。
使用DNA連接試劑盒2型(Takara Shuzo)根據試劑盒所附說明書在16℃下反應1小時，連接包含分別編碼這些型的人源化L鏈V區的SplI-BglII DNA片段和用SplI和BglII消化的/hATR5Hv/N5KG4P。
將連接混合物加入100微升大腸埃希氏桿菌JM109感受態細胞(Nippongene)，並且在冰上溫育30分鐘並且在42℃下溫育1分鐘。然後，向其中加入300微升Hi-感受態肉湯(Nippongene)並且在37℃下溫育1小時，然後將大腸埃希氏桿菌平鋪在LBA瓊脂培養基上，並且在37℃下溫育過夜獲得大腸埃希氏桿菌轉化體。
該轉化體在37℃下在250毫升或500毫升LBA培養基中培養過夜，使用質粒Maxi試劑盒(QIAGEN)從細胞級分製備質粒DNA。其中引入編碼嵌合H鏈和人源化L鏈的基因的質粒分別指定為chHv-hLva/N5KG4P，chHv-hLvb/N5KG4P，chHv-hLvc/N5KG4P，chHv-hLvb1/N5KG4P和chHv-hLvb2/N5KG4P。
(iii)人源化H鏈和人源化L鏈的結合用NheI和SalI消化包含H鏈V區的質粒hATR5Hva/CVIDEC，回收人源化H鏈V區的cDNA片段，並且引入通過用NheI和SalI消化包含人源化ATR-5抗體L鏈「a」型的cDNA序列的質粒chHv-hLva/N5KG4P製備的hLva/N5KG4P(SalI/NheI)。將這樣產生的質粒指定為hHva-hLva/N5KG4P。
用NheI和SalI消化包含H鏈V區的質粒hATR5Hvb/CVIDEC和hATR5Hvc/CVIDEC，回收人源化H鏈V區的cDNA片段，並且引入通過用NheI和SalI消化包含人源化ATR-5抗體L鏈「a」型的cDNA序列的質粒chHv-hLva/N5KG4P製備的hLva/N5KG4P(SalI/NheI)。將這樣產生的質粒指定為hHvb-hLva/N5KG4P和hHvc-hLva/N5KG4P。
用NheI和SalI消化包含H鏈V區的質粒hATR5Hvb/CVIDEC，hATR5Hvd/CVIDEC和hATR5Hve/CVIDEC，回收人源化H鏈V區的cDNA片段，並且引入通過用NheI和SalI消化包含人源化ATR-5抗體L鏈「b」型的cDNA序列的質粒chHv-hLvb/N5KG4P製備的hLvb/N5KG4P(SalI/NheI)。將這樣產生的質粒指定為hHvb-hLvb/N5KG4P，hHvd-hLvb/N5KG4P如hHve-hLvb/N5KG4P。
用NheI和SalI消化包含H鏈V區的質粒hATR5Hvf/CVIDEC，hATR5Hvg/CVIDEC和hATR5Hvh/CVIDEC，回收人源化H鏈V區的cDNA片段，並且引入通過用NheI和SalI消化包含人源化ATR-5抗體L鏈「b」型的cDNA序列的質粒chHv-hLvb/N5KG4P製備的hLvb/N5KG4P(SalI/NheI)。將這樣產生的質粒指定為hHvf-hLvb/N5KG4P，hHvg-hLvb/N5KG4P和hHvh-hLvb/N5KG4P。
用NheI和SalI消化包含H鏈V區的質粒hATR5Hvi/CVIDEC和hATR5Hvj/CVIDEC，回收人源化H鏈V區的cDNA片段，並且引入通過用NheI和SalI消化包含人源化ATR-5抗體L鏈「b」型的cDNA序列的質粒chHv-hLvb/N5KG4P製備的hLvb/N5KG4P(SalI/NheI)。將這樣產生的質粒指定為hHvi-hLvb/N5KG4P和hHvj-hLvb/N5KG4P。
用NheI和SalI消化包含H鏈V區的質粒hATR5Hvb1/CVIDEC和hATR5Hvd1/CVIDEC，回收人源化H鏈V區的cDNA片段，並且引入通過用NheI和SalI消化包含人源化ATR-5抗體L鏈「b」型的cDNA序列的質粒chHv-hLvb/N5KG4P製備的hLvb/N5KG4P(SalI/NheI)。將這樣產生的質粒指定為hHvb1-hLvb/N5KG4P和hHvd1-hLvb/N5KG4P。
用NheI和SalI消化包含H鏈V區的質粒hATR5Hvb3/CVIDEC和hATR5Hvd3/CVIDEC，回收人源化H鏈V區的cDNA片段，並且引入通過用NheI和SalI消化包含人源化ATR-5抗體L鏈「b」型的cDNA序列的質粒chHv-hLvb/N5KG4P製備的hLvb/N5KG4P(SalI/NheI)。將這樣產生的質粒指定為hHvb3-hLvb/N5KG4P和hHvd3-hLvb/N5KG4P。
用NheI和SalI消化包含H鏈V區的質粒hATR5Hvb/CVIDEC，回收人源化H鏈V區的cDNA片段，並且引入通過用NheI和SalI消化包含人源化ATR-5抗體L鏈「b1」和「b2」型的cDNA序列的質粒chHv-hLvb1/N5KG4P和chHv-hLvb2/N5KG4P製備的hLvb1/N5KG4P(SalI/NheI)和hLvb2/N5KG4P(SalI/NheI)。將這樣產生的質粒指定為hHvb-hLvb1/N5KG4P和hHvb-hLvb2/N5KG4P。
用NheI和SalI消化包含H鏈V區的質粒hATR5Hvi/CVIDEC，回收人源化H鏈V區的cDNA片段並且引入通過用NheI和SalI消化包含人源化ATR-5抗體L鏈「b1」和「b2」型的cDNA序列的質粒chHv-hLvb1/N5KG4P和chHv-hLvb2/N5KG4P製備的hLvb1/N5KG4P(SalI/NheI)和hLvb2/N5KG4P(SalI/NheI)。將這樣產生的質粒指定為hHvi-hLvb1/N5KG4P和hHvi-hLvb2/N5KG4P。
(4)轉染到COS-7細胞中為了評價人源化抗體的抗原結合活性和中和活性，在COS-7細胞中瞬時表達上述抗體。
通過使用基因脈衝發生儀(Bio Rad)進行電穿孔將構建的表達質粒載體轉導到COS-7細胞中。以1×107細胞/毫升的細胞濃度向懸浮於PBS的0.78毫升的COS-7細胞中加入50微克或20微克所述質粒，使其接受1500V和25μF電容的脈衝。
經室溫下10分鐘恢復期之後，將經電穿孔的細胞懸浮於含有5％Ultra低IgG胎牛血清(GIBCO)的DMEM培養基中，並且在5％CO2培養箱中用10釐米或15釐米培養皿培養。培養24小時之後，吸出培養上清液，然後加入無血清培養基HBCHO(Irvine Scientific)。進一步培養72小時或96小時之後，收集培養上清液並且離心去除細胞碎片。
(5)抗體的純化使用AffiGel Protein A MAPSII試劑盒(Bio Rad)或者rProteinA Sepharose Fast Flow(Pharmacia Biotech)，從COS-7細胞的培養上清液純化嵌合抗體。按照試驗盒所附的說明進行採用AffiGelProtein A MAPSII試劑盒的純化。如下進行使用rProtein A SepharoseFast Flow的純化將1毫升rProtein A Sepharose Fast Flow裝入柱子，並且通過10倍體積的TBS將柱子平衡。將COS-7細胞的培養上清液加到平衡過的柱子上，然後用10倍體積的TBS衝洗。通過用13.5毫升的2.5mMHCl(pH3.0)洗脫吸附的抗體級分，並且通過加入1.5毫升的1MTris-HCl(pH8.0)中和洗脫物。
通過使用Centriprep30或100(Amicon)對純化的抗體級分進行兩次或三次超濾，將溶劑換為TBS，並且最後濃縮至大約1.5毫升。
參者實施例6.抗體定量測定和活性評價(1)通過用於測定抗體的ELISA平板通過ELISA測定抗體濃度如下製備測定抗體濃度的ELISA平板用100微升山羊抗-人IgGγ抗體(BIO SOURCE)固定96-孔ELISA平板(Maxisorp，NUNC)的每個孔，山羊抗-人IgGγ抗體製備成在固定緩衝液(0.1M碳酸氫鈉，0.02％NaN3，pH9.6)(下文稱之為CB)中、濃度為1微克/毫升。用200微升稀釋緩衝液(50mM Tris-HCl，1mM MgCl2，0.1M NaCl，0.05％Tween 20，0.02％NaN3，1％牛血清白蛋白(BSA)，pH8.1)(下文稱之為DB)封閉之後，用DB系列稀釋其中表達抗體的COS-7細胞的培養上清液或者純化的抗體，然後加入到各孔中。
室溫下溫育1小時之後，用含有0.05％Tween20的Dulbecco PBS(下文稱之為RB)洗滌，加入用DB稀釋1000倍的100微升鹼性磷酸酶-偶聯的山羊抗-人IgGγ抗體(Biosource)。室溫下溫育1小時之後，用RB洗滌，加入在底物緩衝液(50mM碳酸氫鈉，10mM氯化鎂，pH9.8)中溶解至1毫克/毫升的Sigma104(對硝基苯基磷酸酯，SIGMA)，然後使用Microplate Reader(Bio Rad)測定405/655nm處的吸光度。作為測定濃度的標準，使用IgG4κ(結合位點)。
(2)結合抗原活性的測定如下製備測定抗原結合的細胞ELISA平板。使用的細胞是人膀胱癌細胞J82(ATCC HTB-1)。對96-孔細胞培養板中的60個孔接種1×105J82細胞。在CO2培養箱中培養(含有10％胎牛血清(GIBCO)的RPMI1640培養基)一天使得細胞生長匯合。棄除培養物液體之後，用300微升PBS將每個孔洗滌兩次。向每個孔加入100微升含有4％低聚甲醛的PBS(下文稱之為PFA/PBS)，並且置於冰上10分鐘固定細胞。
棄除PFA/PBS，用300微升PBS將每個孔洗滌兩次，然後用250微升DB封閉。用DB系列稀釋培養上清液或純化的抗體，將其100微升加給每個孔。室溫下溫育2小時之後用RB洗滌，加入用DB稀釋1000倍的100微升鹼性磷酸酶-偶聯的山羊抗-人IgGγ抗體(BioSource)。室溫下溫育1小時之後用RB洗滌，加入底物溶液，然後使用MicroplateReader(Bio Rad)測定405/655nm處的吸光度。
(3)中和活性的測定通過人胎盤產生的凝血因子III，Thromborel S(Boehringer AG)用針對因子Xa-產生活性的抑制活性作為指數，測定小鼠抗體、嵌合抗體和人源化抗體的中和活性。因此，向10微升1.25毫克/毫升Thromborel S和10微升適當稀釋的抗體中加入60微升緩衝液(含有5mM氯化鈣和0.1％BSA的BSA)，然後將其在室溫下在96-孔板中溫育1小時。向其中分別加入10微升的3.245微克/毫升人因子X(CelsusLaboratories)和82.5ng/ml人因子VIIa(Enzyme Research)，然後在室溫下溫育1小時。
加入10微升0.5M EDTA中止反應，向其中加入50微升顯色底物溶液，並且使用Microplate Reader(Bio Rad)測定405/655nm處的吸光度。室溫下反應1小時之後，再次測定405/655nm處的吸光度。以沒有抗體加入時每小時吸光度的變化為100％活性，通過從吸光度的每一次變化計算殘留活性(％)可以測定中和活性。通過根據所附說明書的說明，溶解Testzyme顯色底物S-2222(Chromogenix)，用純化水稀釋2倍，並且以1∶1的比例與1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物溶液(0.6毫克/毫升六二亞甲基溴化物，SIGMA)混合。
(4)活性的評價(i)人源化H鏈「a」型和嵌合L鏈的結合產生人源化H鏈「a」型和嵌合L鏈結合的抗體(a-ch)，並且通過細胞ELISA測定對抗原的結合活性。發現在高濃度下與抗原結合的量降低。與陽性對照嵌合抗體(ch-ch)的相比，FXa產生-抑制作用針對抗原的中和活性弱。因此，決定通過FR-改組進行人源化H鏈的翻譯程序(version-up)。其中使用的嵌合抗體是在COS-7細胞中表達的抗體，純化，並且評價。
(ii)人源化L鏈「a」型和嵌合H鏈的結合產生人源化L鏈「a」型和嵌合H鏈結合的抗體(ch-a)，並且通過細胞ELISA測定對抗原的結合活性。發現具有等於或高於嵌合抗體的結合活性。另一方面，與陽性對照嵌合抗體相比，針對抗原的中和活性弱。因此，決定通過FR-改組進行人源化L鏈的翻譯程序。其中使用的嵌合抗體是在COS-7細胞中表達、純化、並且評價的抗體。
(iii)人源化H鏈「a」型和人源化L鏈「a」型的結合產生人源化H鏈「a」型和人源化L鏈「a」型結合的抗體(a-a)，並且通過細胞ELISA測定對抗原的結合活性。發現在高濃度區結合抗原的量減少。與陽性對照嵌合抗體相比，Fxa產生-抑制作用針對抗原的中和活性弱。因此，決定通過FR-改組進行人源化H鏈和L鏈的翻譯程序。其中使用的嵌合抗體是在COS-7細胞中表達的抗體，純化，並且評價。
(iv)人源化H鏈「b」型，「c」型和「d」型和嵌合L鏈的結合產生抗體(分別是「b-ch」，「c-ch」，和「d-ch」)，它們是通過FR-改組進行翻譯程序並結合嵌合L鏈的人源化H鏈，通過細胞ELISA測定對抗原的結合活性。「d-ch」表現出與嵌合抗體的結合活性相等的結合活性，「b-ch」和「c-ch」表現出稍微較低的結合活性。另一方面，發現與陽性對照嵌合抗體相比，針對抗原的中和活性在「b-ch」中幾乎相等，在「d-ch」中稍弱。在「c-ch」型中顯著比嵌合抗體的弱。因此，認為人源化H鏈「b」型和「d」型是表現出高活性的人源化H鏈。
(v)人源化H鏈「b」型和人源化L鏈「a」型的結合產生抗體(b-a)，它是通過FR-改組進行翻譯程序並結合人源化L鏈「a」型的人源化H鏈「b」型，通過細胞ELISA測定對抗原的結合活性。發現在高濃度下結合抗原的量減少。另一方面，與陽性對照嵌合抗體相比，針對抗原的中和活性顯著弱。因此，「b-a」和「a-a」是表現出高活性的。其中使用的嵌合抗體是在COS-7細胞中表達、純化、並且評價的抗體。
(vi)人源化L鏈「b」型和「c」型與嵌合H鏈的結合產生抗體(分別是「ch-b」和「ch-c」)，它們是與嵌合H鏈結合的人源化L鏈「b」型和「c」型，發現它們兩個都具有與該嵌合抗體相等的與抗原的結合活性和針對抗原的中和活性。因此，選擇「b」型和「c」型作為人源化抗體L鏈的候選者。就抗原性來說，認為胺基酸殘基數較少的小鼠抗體-衍生的「b」型比「c」型好。這裡使用的嵌合抗體是在CHO細胞DG44中表達、純化、並且評價的抗體。在下面的評述中，該抗體用作陽性對照。
(vii)人源化H鏈「b」型和人源化L鏈「b」型和「c」型的結合產生抗體(分別是「b-b」和「b-c」)，它們是與人源化L鏈「b」型和「c」型結合的人源化H鏈「b」型，並且測定與抗原的結合活性和針對抗原的中和活性。在結合活性和中和活性方面，它們兩個具有比嵌合抗體稍弱的活性。
(viii)人源化H鏈「b」型和「d」型與嵌合L鏈「b」型的結合產生抗體(分別是「b-b」和「d-b」)，它們是通過FR-改組進行翻譯程序並結合人源化L鏈「b」型的人源化H鏈，通過細胞ELISA測定對抗原的結合活性。「d-b」表現出與嵌合抗體相等的結合活性，而「b-b」在高濃度時表現出稍低的結合活性。另一方面，與陽性對照嵌合抗體相比，針對抗原的中和活性在「b-b」稍低，在「d-b」顯著弱。因此證明「b-b」是高中和活性型，而「d-b」是高結合活性型。
(ix)人源化H鏈「e」型和嵌合L鏈和人源化L鏈「b」型的結合產生抗體(分別是「e-ch」和「e-b」)，它們是與嵌合L鏈和人源化「b」型結合的人源化L鏈「e」型。「e-ch」表現出與嵌合抗體相等的結合活性，但是在「e-b」中表達抗體的量非常少並且損失了大部分的結合活性。與嵌合抗體相比，「e-ch」針對抗原的中和活性顯著弱。因此證明與L鏈「b」型結合的H鏈「e」型不能好地工作。
(x)人源化H鏈「f」型，「g」型和「h」型和人源化L鏈「b」型的結合產生抗體(分別是「f-b」，「g-b」和「h-b」)，它們是與人源化L鏈「b」型結合的人源化H鏈「f」型，「g」型和「h」型。在「f-b」和「h-b」抗體中，表達的抗體的量非常少。對於「f」和「h」型，產生與嵌合L鏈結合的抗體，但是不表達。低濃度下「g-b」達到飽和，並且與嵌合抗體相比表現出更弱的結合活性。與嵌合抗體相比，「g-b」的針對抗原的中和活性顯著弱。
(xi)人源化H鏈「b1」型和「d1」型和人源化L鏈「b」型的結合產生抗體(分別是「b1-b」和「d1-b」)，它們是與人源化L鏈「b」型結合的人源化H鏈「b1」型和「d1」型。在它們的任何一個中幾乎不表達抗體。對於它們，產生與嵌合L鏈結合的抗體，但是不表達。
(xii)人源化H鏈「b3」型和「d3」型和人源化L鏈「b」型的結合產生抗體(分別是「b3-b」和「d3-b」)，它們是與人源化L鏈「b」型結合的人源化H鏈「b3」型和「d3」型。與嵌合抗體相比，「d3-b」對抗原的結合活性稍低，而「b3-b」則低得多。「b3-b」針對抗原的中和活性比「b-b」高，但是低於嵌合抗體，並且「d3-b」和「b-b」保持活性相等。
(xiii)人源化H鏈「i」型和「j」型和嵌合L鏈和人源化L鏈「b」型的結合產生抗體(分別是「i-ch」和「j-ch」)，它們是與嵌合L鏈結合的人源化H鏈「i」型和「j」型，並產生與人源化L鏈「b」型結合的抗體(分別是「i-b」和「j-b」)，測定對抗原的結合活性和針對抗原的中和活性。任何抗體的結合活性與嵌合抗體的幾乎相等，「i-ch」表現出比嵌合抗體高的中和活性，而「j-ch」顯著低於嵌合抗體的中和活性。「i-b」表現出與嵌合抗體相等的中和活性，而「j-b」顯著低於嵌合抗體的中和活性。
(xiv)人源化L鏈「b1」型和「b2」型產生抗體(分別是「ch-b1」和「ch-b2」)，它們是與嵌合H鏈結合的人源化L鏈「b1」型和「b2」型，它們兩個都表現出與該嵌合抗體相等的與抗原的結合活性。關於針對抗原的中和活性，「ch-b1」表現出與嵌合抗體相等的結合活性，而「ch-b2」表現出在高濃度下比嵌合抗體稍高的活性。「b1」型和「b2」型能是人源化抗體L鏈的候選者，而「b2」的優越性在於其具有更強的活性。
(xv)人源化H鏈「b」型和人源化L鏈「b2」型的結合產生抗體(「b-b2」)，它是與人源化L鏈「b2」型結合的人源化H鏈「b」型，測定對抗原的結合活性和針對抗原的中和活性。結合活性稍低於嵌合抗體的。中和活性儘管稍高於「b-b」，但是低於「i-b」。
(xvi)人源化H鏈「i」型和人源化L鏈「b1」型或「b2」型的結合產生抗體(分別是「i-b1」和「i-b2」)，它們是與人源化L鏈「b1」型或「b2」型結合的人源化H鏈「i」型，測定對抗原的結合活性和針對抗原的中和活性。「i-b2」的結合活性幾乎與嵌合抗體的相等，而「i-b1」的稍弱於嵌合抗體的。「i-b1」和「i-b2」的中和活性高於嵌合抗體和「i-b」的，其漸低順序是「i-b2」＞「i-b1」。
參照實施例7.產生人源化抗體的CHO細胞的製備及其活性評價(1)建立穩定產生CHO的細胞係為了建立穩定產生人源化抗體(b-b，i-b和i-b2)的細胞系，將抗體表達基因載體引入CHO細胞(DG44)順應無血清培養基。
用限制酶SspI(Takara Shuzo)消化質粒DNA，hHvb-hLvb/N5KG4P，hHvi-hLvb/N5KG4P，和hHvi-hLvb2/N5KG4P並且線性化，用苯酚和氯仿提取，並且通過乙醇沉澱進行純化。使用電穿孔儀器(Gene Pulser；BioRad)將線性化表達基因載體引入DG44細胞。以1×107細胞/毫升將DG44細胞懸浮於PBS，並且向大約0.8毫升該懸浮液加入10或50微克該DNA，使其接受1500V和25μF電容脈衝。
室溫下10分鐘恢復期之後，將處理過的細胞懸浮於含有次黃嘌呤/胸苷(GIBCO)(下文稱之為HT)的CHO-S-SFMII培養基(GIBCO)中，以100微升/孔接種兩個96-孔板(Falcon)，並且在CO2培養箱中培養。開始培養之後8-9小時，加入100微升/孔含有HT和1毫克/毫升GENETICIN的CHO-S-SFMII培養基(GIBCO)替換500微克/毫升GENETICIN篩選培養基，並且篩選其中引入了抗體基因的細胞。每3-4天一次用新鮮培養基更換1/2體積的培養基。更換篩選培養基之後大約2周時，從其中4-5天之後觀察到良好細胞生長的孔回收一等份培養上清液。通過上面對於測定抗體濃度描述的ELISA測定培養上清液中表達的抗體濃度，並且篩選具有抗體高產率的細胞。
(2)大規模純化人源化抗體如上篩選產生人源化抗體(「b-b」，「i-b」和「i-b2」)的DG44細胞系之後，使用2升滾瓶(CORNING)在500毫升/瓶CHO-S-SFMII培養基中培養幾天，收穫培養基並且加入新鮮CHO-S-SFMII培養基再培養。將培養基離心去除細胞碎屑，用0.22μm或0.4μm過濾器過濾。通過重複該操作，獲得總共大約2升的培養上清液。從獲得的培養上清液，通過與蛋白質A親和柱(Poros)連接的ConSep LC100系統(Millipore)純化抗體。
(3)通過ELISA測定抗體濃度如下製備用於測定抗體濃度的ELISA平板用100微升山羊抗-人IgGγ抗體(BIO SOURCE)固定96-孔ELISA平板(Maxisorp，NUNC)的每個孔，所用的山羊抗-人IgGγ抗體是用CB製備成濃度為1微克/毫升的。用200微升DB封閉之後，用DB系列稀釋其中表達抗體的CHO細胞的培養上清液或者純化的抗體，然後加入到各孔中。
室溫下溫育1小時之後用RB洗滌，加入用DB稀釋1000倍的100微升鹼性磷酸酶-偶聯的山羊抗-人IgGγ抗體(BioSource)。室溫下溫育1小時之後用RB洗滌，加入100微升底物溶液，然後使用MicroplateReader(Bio Rad)測定405/655nm處的吸光度。作為測定濃度的標準，使用人IgG4κ(結合位點)。
(4)與抗原的結合活性的測定如下製備用於測定抗原結合的細胞ELISA平板。使用的細胞是人膀胱癌細胞J82(ATCC HTB-1)。以1×105細胞的細胞量將其接種到96-孔細胞培養板。在CO2培養箱中(含有10％胎牛血清(GIBCO)的RPMI1640培養基)培養一天使得細胞生長匯合。棄除培養物液體之後，用PBS將每個孔洗滌兩次。向每個孔加入100微升PFA/PBS，並且置於冰上10分鐘固定細胞。
棄除PFA/PBS，用300微升PBS將每個孔洗滌兩次，然後用250微升DB封閉。在上述測定結果的基礎上，用DB系列稀釋純化的抗體，稀釋從10微克/毫升乘2開始，將其100微升加給每個孔。室溫下溫育2小時之後用RB洗滌，加入用DB稀釋1000倍的100微升鹼性磷酸酶-偶聯的山羊抗-人IgGγ抗體(BioSource)。室溫下溫育1小時之後用RB洗滌，加入100微升底物溶液，然後使用Microplate Reader(Bio Rad)測定405/655nm處的吸光度。
(5)針對TF中和活性的測定(針對Fxa產生的因子抑制活性)通過人胎盤產生的凝血因子III，Thromborel S(Boehringer AG)，用針對因子Xa-產生活性的抑制活性作為指數，測定人源化抗體的因子Xa產生-抑制活性。因此，向10微升5毫克/毫升Thromborel S和10微升抗體中加入60微升緩衝液(含有5mM氯化鈣和0.1％BSA的TBS)，然後將其在室溫下在96-孔板中溫育1小時。用緩衝液從200微克/毫升乘5開始系列稀釋抗體。
向其中各加入10微升3.245微克/毫升人因子X(CelsusLaboratories)和82.5ng/ml人因子VIIa(Enzyme Research)，並且進一步在室溫下溫育45分鐘。加入10微升0.5M EDTA中止反應，向其中加入50微升顯色底物溶液，並且使用Microplate Reader(Bio Rad)測定405/655nm處的吸光度。室溫下反應30分鐘之後，再次測定405/655nm處的吸光度。以沒有抗體加入時30分鐘吸光度變化為100％活性，通過從吸光度的每一次變化確定殘留活性(％)。
通過根據所附說明書的說明，溶解Testzyme顯色底物S-2222(Chromogenix)，並且以1∶1的比例與1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物溶液(0.6毫克/毫升六二亞甲基溴化物，SIGMA)混合來製備顯色底物溶液。
(6)針對TF中和活性的測定(針對FX-結合的抑制活性)用人胎盤產生的凝血因子III，Thromborel S(Boehringer AG)測定針對人源化抗體的FX-結合的抑制活性，其中事先形成了TF和因子VIIa的複合物，並且使用該TF-VIIa複合物的因子Xa產生活性為指數，測定針對FX-結合的抑制活性。因此，向10微升5毫克/毫升Thromborel S和10微升82.5ng/ml人因子VIIa(Enzyme Research)中加入60微升緩衝液(含有5mM氯化鈣和0.1％BSA的TBS)，然後將其在室溫下在96-孔板中溫育1小時。
向其中各加入10微升抗體溶液，在室溫下溫育5分鐘，加入10微升3.245微克/毫升人因子X(Celsus Laboratories)，並且進一步在室溫下溫育45分鐘。從200微克/毫升乘2開始用緩衝液系列稀釋抗體。加入10微升0.5M EDTA中止反應，向其中加入50微升顯色底物溶液，並且使用Microplate Reader(Bio Rad)測定405/655nm處的吸光度。室溫下反應30分鐘之後，再次測定405/655nm處的吸光度。以沒有抗體加入時30分鐘吸光度變化為100％活性，通過從吸光度的每一次變化確定殘留活性(％)。
通過根據所附說明書的說明，溶解Testzyme顯色底物S-2222(Chromogenix)，並且以1∶1的比例與1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物溶液(0.6毫克/毫升六二亞甲基溴化物，SIGMA)混合來製備顯色底物溶液。
(7)針對對於血漿凝固抑制活性的中和活性的測定用人胎盤產生的凝血因子III，Thromborel S(Boehringer AG)測定的凝血酶原時間為指數測定針對人源化抗體TF的中和活性(針對血漿凝固的抑制活性)。因此，向樣品杯加入100微升人血漿(Cosmo Bio)，向其中加入稀釋成各種濃度的50微升抗體，並且在37℃加熱3分鐘。加入事先在37℃預熱的50微升1.25毫克/毫升Thromborel S開始血漿凝固。使用與Amelung CR-A連接的Amelung KC-10A(兩者都從M.C.Medical獲得)測定凝固時間。
從80微克/毫升乘2開始用含有0.1％BSA的TBS(下文稱之為BSA-TBS)系列稀釋抗體。以沒有抗體加入的凝固時間為100％TF血漿凝固活性，以通過Thromborel S的濃度對凝固時間作圖獲得的標準曲線為基礎，從抗體加入的各個凝固時間計算殘留TF活性。
從各種濃度的Thromborel S作出標準曲線並且測定凝固時間。向50微升適當稀釋的Thromborel S加入50微升BSA-TBS，在37℃加熱3分鐘，加入在37℃預熱的100微升人血漿開始凝固，並且測定凝固時間。從6.25毫克/毫升乘2開始，用含有25mM氯化鈣的Hank緩衝液(GIBCO)系列稀釋Thromborel S。在橫坐標軸上對Thromborel S濃度作圖，並在log-log紙上的縱坐標軸上對凝固時間作圖，作出標準曲線。
(8)活性評價所有的人源化抗體，「b-b」，「i-b」和「i-b2」具有等於或大於嵌合抗體的活性(圖1)。對於針對Fxa產生的抑制活性以及針對FX-結合抑制活性和針對血漿凝固抑制活性，人源化抗體「b-b」，「i-b」和「i-b2」具有等於或大於嵌合抗體的活性，活性遞減順序是「i-b2」＞「i-b」＞「b-b」(圖2，3，和4)。
序列表110CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA120與血液凝固相關的疾病的預防或治療劑130H795-PCT160104210121128212DNA213人工序列220
223引物MHC-G14001ggatcccggg ccagtggata gacagatg 28210221127212DNA213人工序列220
223引物MKC4002ggatcccggg tggatggtgg gaagatg 27210321117212DNA213人工序列220
223M13引物M44003gttttcccag tcacgac 17210421117212DNA213人工序列220
223M13引物RV4004caggaaacag ctatgac172105211408212DNA213小鼠220
221單鏈肽222(1)...(57)220
221成熟肽222(58)...(408)223編碼抗-TF小鼠單克隆抗體ATR-5的H鏈V區的核苷酸序列4005atg aaa tgc agc tgg gtc atc ttc ttc ctg atg gca gtg gtt aca ggg48Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly-15 -10 -5gtc aat tca gag gtt cag ctg cag cag tct ggg act aac ctt gtg agg96Val Asn Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Asn Leu Val Arg1 5 10cca ggg gcc tta gtc aag ttg tcc tgc aaa ggt tct ggc ttc aac att 144Pro Gly Ala Leu Val Lys Leu Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Asn Ile15 20 25aaa gac tac tat atg cac tgg gtg aag cag agg cct gaa cag ggc ctg 192Lys Asp Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu30 35 40 45gag tgg att gga ggg aat gat cct gcg aat ggt cat agt atg tat gac 240Glu Trp Ile Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp50 55 60ccg aaa ttc cag ggc aag gcc agt ata aca gca gac aca tcc tcc aac 288Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Ser Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn65 70 75
aca gcc tac ctg cag ctc agc agc ctg aca tct gag gac act gcc gtc 336Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val80 85 90tat ttc tgt gct aga gac tcg ggc tat gct atg gac tac tgg ggt caa 384Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln95 100 105gga acc tca gtc acc gtc tcc tca 408Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser110 1152106211381212DNA213小鼠220
221單鏈肽222(1)...(60)220
221成熟肽222(61)...(381)223編碼抗-TF小鼠單克隆抗體ATR-5的L鏈V區的核苷酸序列4006atg agg gcc cct gct cag ttt ttt ggg atc ttg ttg ctc tgg ttt cca48Met Arg Ala Pro Ala Gln Phe Phe Gly Ile Leu Leu Leu Trp Phe Pro-20 -15 -10 -5ggt atc aga tgt gac atc aag atg acc cag tct cca tcc tct atg tat96Gly Ile Arg Cys Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr1 5 10gca tcg ctg gga gag aga gtc act atc act tgc aag gcg agt cag gac 144Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp15 20 25att aaa agc ttt tta agt tgg tac cag caa aaa cca tgg aaa tct cct 192Ile Lys Ser Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Trp Lys Ser Pro30 35 40
aag acc ctg atc tat tat gca aca agc ttg gca gat ggg gtc cca tca 240Lys Thr Leu Ile Tyr Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser45 50 55 60aga ttc agt ggc agt gga tct ggg caa gat tat tct cta acc atc aac 288Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Asn65 70 75aac ctg gag tct gac gat aca gca act tat tat tgt cta cag cat ggt 336Asn Leu Glu Ser Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly80 85 90gag agc ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa 381Glu Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys95 100 105210721135212DNA213人工序列220
223引物ch5HS4007gtctgtcgac ccaccatgaa atgcagctgg gtcat 35210821128212DNA213人工序列220
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223引物ch5LS4009gtctagatct ccaccatgag ggcccctgct cagtt 35
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223引物ch5LA40010tgttcgtacg ttttatttcc agcttggt 2821011211104212DNA213人工序列220
223CDR移植引物hR5Hv1S40011ttctgtcgac ccaccatgaa atgcagctgg gtcatcttct tcctgatggc agtggttaca 60ggggttaact cacaggtgca gctgttggag tctggagctg tgct 10421012211108212DNA213人工序列220
223CDR移植引物hR5Hv2840012acaggtgcag ctgttggagt ctggagctgt gctggcaagg cctgggactt ccgtgaagat 60ctcctgcaag gcttccggat tcaacattaa agactactat atgcattg 10821013211108212DNA213人工序列220
223CDR移植引物hR5Hv4S40013gaatggccat agtatgtatg acccgaaatt ccagggcagg gccaaactga ctgcagccac 60atccgccagt attgcctact tggagttctc gagcctgaca aatgagga 108
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223CDR移植引物hR5Hv3A40014tcatacatac tatggccatt cgcaggatca ttcccaccaa tccattctag accctgtcca 60ggcctctgtt ttacccaatg catatagtag tctttaatgt tgaatccgga 11021015211110212DNA213人工序列220
223CDR移植引物hR5Hv5A40015agaagctagc tgaggagacg gtgaccaggg tgccttggcc ccagtagtcc atggcatagc 60ccgagtctct tgcacagtaa tagaccgcag aatcctcatt tgtcaggctc 1102101621119212DNA213人工序列220
223引物hR5HvPrS40016ttctgtcgac ccaccatga192101721119212DNA213人工序列220
223引物hR5HvPrA40017agaagctagc tgaggagac1921018
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221單鏈肽222(1)...(57)220
221成熟肽222(58)...(415)223編碼人源化H鏈V區的「a」型的核苷酸序列40018atg aaa tgc agc tgg gtc atc ttc ttc ctg atg gca gtg gtt aca ggg48Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly-15 -10 -5gtt aac tca cag gtg cag ctg ttg gag tct gga gct gtg ctg gca agg96Val Asn Ser Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg1 5 10cct ggg act tcc gtg aag atc tcc tgc aag gct tcc gga ttc aac att 144Pro Gly Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile15 20 25aaa gac tac tat atg cat tgg gta aaa cag agg cct gga cag ggt cta 192Lys Asp Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu30 35 40 45gaa tgg att ggt ggg aat gat cct gcg aat ggc cat agt atg tat gac 240Glu Trp Ile Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp50 55 60ccg aaa ttc cag ggc agg gcc aaa ctg act gca gcc aca tcc gcc agt 288Pro Lys Phe Gln Gly Arg Ala Lys Leu Thr Ala Ala Thr Ser Ala Ser65 70 75att gcc tac ttg gag ttc tcg agc ctg aca aat gag gat tct gcg gtc 336Ile Ala Tyr Leu Glu Phe Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val80 85 90tat tac tgt gca aga gac tcg ggc tat gcc atg gac tac tgg ggc caa 384Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln95 100 105
ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tca gct agc 415Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser110 11521019211119212PRT213人工序列220
223人源化H鏈V區的「a」型的胺基酸序列40019Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg Pro Gly Thr1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr20 25 30Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp Pro Lys Phe50 55 60Gln Gly Arg Ala Lye Leu Thr Ala Ala Thr Ser Ala Ser Ile Ala Tyr65 70 75 80Leu Glu Phe Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110Val Thr Val Ser Ser Ala Ser11521020211100212DNA213人工序列220
223FR改組引物F3RFFS40020ttcttggcca tagtatgtat gacccgaaat tccagggccg agtcacaatc actgcagaca 60catccacgaa cacagcctac atggagctct cgagtctgag100
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223FR改組引物F3RFBS40021ggagctctcg agtctgagat ctgaggacac agccatttat tactgtgcaa gagactcggg 60ctatgccatg gttct7521022211100212DNA213人工序列220
223FR改組引物F3RFFA40022ctcagactcg agagctccat gtaggctgtg ttcgtggatg tgtctgcagt gattgtgact 60cggccctgga atttcgggtc atacatacta tggccaagaa1002102321175212DNA213人工序列220
223FR改組引物F3RFBA40023agaaccatgg catagcccga gtctcttgca cagtaataaa tggctgtgtc ctcagatctc 60agactcgaga gctcc7521024211100212DNA213人工序列220
223FR改組引物F3NMFS40024ttcttggcca tagtatgtat gacccgaaat tccagggccg agtcacaatg ctggtagaca 60
catccaagaa ccagttctcc ctgaggctct cgagtgtgac1002102521175212DNA213人工序列220
223FR改組引物F3NMBS40025gaggctctcg agtgtgacag ccgcggacac agccgtatat tactgtgcaa gagactcggg 60ctatgccatg gttct7521026211100212DNA213人工序列220
223FR改組引物F3NMFA40026gtcacactcg agagcctcag ggagaactgg ttcttggatg tgtctaccag cattgtgact 60cggccctgga atttcgggtc atacatacta tggccaagaa1002102721175212DNA213人工序列220
223FR改組物F3NMBA40027agaaccatgg catagcccga gtctcttgca cagtaatata cggctgtgtc cgcggctgtc 60acactcgaga gcctc7521028211414212DNA213人工序列220
221單鏈肽222(1)...(57)
220
221成熟肽222(58)...(414)223編碼人源化H鏈V區的「b」型的核苷酸序列40028atg aaa tgc agc tgg gtc atc ttc ttc ctg atg gca gtg gtt aca ggg48Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly-15 -10 -5gtt aac tca cag gtg cag ctg ttg gag tct gga gct gtg ctg gca agg96Val Asn Ser Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu A1a Arg1 5 10cct ggg act tcc gtg aag atc tcc tgc aag gct tcc gga ttc aac att 144Pro Gly Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile15 20 25aaa gac tac tat atg cat tgg gta aaa cag agg cct gga cag ggt cta 192Lys Asp Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu30 35 40 45gaa tgg att ggt ggg aat gat cct gcg aat ggc cat agt atg tat gac 240Glu Trp Ile Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp50 55 60ccg aaa ttc cag ggc cga gtc aca atc act gca gac aca tcc acg aac 288Pro Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn65 70 75aca gcc tac atg gag ctc tcg agt ctg aga tct gag gac aca gcc att 336Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile80 85 90tat tac tgt gca aga gac tcg ggc tat gcc atg gac tac tgg ggc caa 384Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln95 100 105ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tca gct agc 414Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser110 11521029211119212PRT213人工序列
220
223人源化H鏈V區的「b」型的胺基酸序列40029Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg Pro Gly Thr1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr20 25 30Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp Pro Lys Phe50 55 60Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110Val Thr Val Ser Ser Ala Ser11521030211414212DNA213人工序列220
221單鏈肽222(1)...(57)220
221成熟肽222(58)...(414)223編碼人源化H鏈V區的「c」型的核苷酸序列40030atg aaa tgc agc tgg gtc atc ttc ttc ctg atg gca gtg gtt aca ggg48Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly-15 -10 -5
gtt aac tca cag gtg cag ctg ttg gag tct gga gct gtg ctg gca agg96Val Asn Ser Gln Val Gln Leu Leu Glu ger Gly Ala Val Leu Ala Arg1 5 10cct ggg act tcc gtg aag atc tcc tgc aag gct tcc gga ttc aac att 144Pro Gly Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile15 20 25aaa gac tac tat atg cat tgg gta aaa cag agg cct gga cag ggt cta 192Lys Asp Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu30 35 40 45gaa tgg att ggt ggg aat gat cct gcg aat ggc cat agt atg tat gac 240Glu Trp Ile Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp50 55 60ccg aaa ttc cag ggc cga gtc aca atg ctg gta gac aca tcc aag aac 288Pro Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Leu Val Asp Thr Ser Lys Asn65 70 75cag ttc tcc ctg agg ctc tcg agt gtg aca gcc gcg gac aca gcc gta 336Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val80 85 90tat tac tgt gca aga gac tcg ggc tat gcc atg gac tac tgg ggc caa 384Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln95 100 105ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tca gct agc 414Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser110 11521031211119212PRT213人工序列220
223人源化H鏈V區的「c」型的胺基酸序列40031Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg Pro Gly Thr1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp Pro Lys Phe50 55 60Gln Gly Arg Val Thr Met Leu Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser65 70 75 80Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110Val Thr Val Ser Ser Ala Ser11521032211100212DNA213人工序列220
223FR改組引物F3EPS40032ttcttggcca tagtatgtat gacccgaaat tccagggcag agtcacgatt actgcggacg 60aatccacgag cacagcctac atggagctct cgagtctgag1002103321175212DNA213人工序列220
223FR改組引物F3EPA40033agaaccatgg catagcccga gtctctcgca cagaaatata cggccgagtc ctcagatctc 60agactcgaga gctcc752103421120212DNA213人工序列220
223引物F3PrS
40034ttcttggcca tagtatgtat 202103521118212DNA213人工序列220
223引物F3PrA40035agaaccatgg catagccc 1821036211100212DNA213人工序列220
223FR改組引物F3VHS40036ttcttggcca tagtatgtat gacccgaaat tccagggcag agtctcgatt accgcggacg 60agtcaacgaa gatagcctac atggagctca acagtctgag1002103721175212DNA213人工序列220
223FR改組引物F3VHA40037agaaccatgg catagcccga gtctctcgca cagaaataaa cggccgtgtc ctcagatctc 60agactgttga gctcc7521038211414212DNA213人工序列220
221單鏈肽222(1)...(57)
220
221成熟肽222(58)...(414)223編碼人源化H鏈V區的「d」型的核苷酸序列40038atg aaa tgc agc tgg gtc atc ttc ttc ctg atg gca gtg gtt aca ggg48Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly-15 -10 -5gtt aac tca cag gtg cag ctg ttg gag tct gga gct gtg ctg gca agg96Val Asn Ser Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg1 5 10cct ggg act tcc gtg aag atc tcc tgc aag gct tcc gga ttc aac att 144Pro Gly Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile15 20 25aaa gac tac tat atg cat tgg gta aaa cag agg cct gga cag ggt cta 192Lys Asp Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu30 35 40 45gaa tgg att ggt ggg aat gat cct gcg aat ggc cat agt atg tat gac 240Glu Trp Ile Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp50 55 60ccg aaa ttc cag ggc aga gtc acg att act gcg gac gaa tcc acg agc 288Pro Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser65 70 75aca gcc tac atg gag ctc tcg agt ctg aga tct gag gac tcg gcc gta 336Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val80 85 90tat ttc tgt gcg aga gac tcg ggc tat gcc atg gac tac tgg ggc caa 384Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln95 100 105ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tca gct agc 414Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser110 11521039211119212PRT213人工序列
220
223人源化H鏈的「d」型的胺基酸序列40039Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg Pro Gly Thr1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Aep Tyr20 25 30Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp Pro Lys Phe50 55 60Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110Val Thr Val Ser Ser Ala Ser11521040211414212DNA213人工序列220
221單鏈肽222(1)...(57)220
221成熟肽222(58)...(414)223編碼人源化H鏈V區的「e」型的核苷酸序列40040atg aaa tgc agc tgg gtc atc ttc ttc ctg atg gca gtg gtt aca ggg 48Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly-15 -10 -5
gtt aac tca cag gtg cag ctg ttg gag tct gga gct gtg ctg gca agg96Val Asn Ser Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg1 5 10cct ggg act tcc gtg aag atc tcc tgc aag gct tcc gga ttc aac att 144Pro Gly Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile15 20 25aaa gac tac tat atg cat tgg gta aaa cag agg cct gga cag ggt cta 192Lys Asp Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu30 35 40 45gaa tgg att ggt ggg aat gat cct gcg aat ggc cat agt atg tat gac 240Glu Trp Ile Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp50 55 60ccg aaa ttc cag ggc aga gtc tcg att acc gcg gac gag toa acg aag 288Pro Lys Phe Gln Gly Arg Val Ser Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Lys65 70 75ata gcc tac atg gag ctc aac agt ctg aga tct gag gac acg gcc gtt 336Ile Ala Tyr Met Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val80 85 90tat ttc tgt gcg aga gac tcg ggc tat gcc atg gac tac tgg ggc caa 384Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln95 100 105ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tca gct agc 414Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser110 11521041211119212PRT213人工序列220
223人源化H鏈V區的「e」型的胺基酸序列40041Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg Pro Gly Thr1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp Pro Lys Phe50 55 60Gln Gly Arg Val Ser Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Lys Ile Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110Val Thr Val Ser Ser Ala Ser11521042211100212DNA213人工序列220
223FR改組引物F3SSS40042ttcttggcca tagtatgtat gacccgaaat tccagggcag agtcacgatt accgcggaca60catccacgag cacagcctac atggagctca ggagcctgag 1002104321175212DNA213人工序列220
223FR改組引物F3SSA40043agaaccatgg catagcccga gtctctcgca cagtaataca cggccgtgtc gtcagatctc60aggctcctga gctcc 7521044211100212DNA213人工序列220
223FR改組引物F3CDS
40044ttcttggcca tagtatgtat gacccgaaat tccagggcaa agccactctg actgcagacg60aatcctccag cacagcctac atgcaactct cgagcctacg 1002104521175212DNA213人工序列220
223FR改組引物F3CDA40045agaaccatgg catagcccga gtctcttgca caagaataga ccgcagagtc ctcagatcgt60aggctcgaga gttgc 7521046211414212DNA213人工序列220
221單鏈肽222(1)...(57)220
221成熟肽222(58)...(414)223編碼人源化H鏈V區的「f」型的核苷酸序列40046atg aaa tgc agc tgg gtc atc ttc ttc ctg atg gca gtg gtt aca ggg48Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly-15 -10 -5gtt aac tca cag gtg cag ctg ttg gag tct gga gct gtg ctg gca agg96Val Asn Ser Cln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg1 5 10cct ggg act tcc gtg aag atc tcc tgo aag gct tcc gga ttc aac att 144Pro Gly Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile15 20 25
aaa gac tac tat atg cat tgg gta aaa cag agg cct gga cag ggt cta192Lys Asp Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu30 35 40 45gaa tgg att ggt ggg aat gat cct gcg aat ggc cat agt atg tat gac240Glu Trp Ile Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp50 55 60ccg aaa ttc cag ggc aga gtc acg att acc gcg gac aca tcc acg agc288Pro Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser65 70 75aca gcc tac atg gag ctc agg agc ctg aga tct gac gac acg gcc gtg336Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val80 85 90tat tac tgt gcg aga gac tcg ggc tat gcc atg gac tac tgg ggc caa384Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln95 100 105ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tca gct agc414Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser110 11521047211119212PRT213人工序列220
223人源化H鏈V區的「f」型的胺基酸序列40047Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg Pro Gly Thr1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr20 25 30Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp Pro Lys Phe50 55 60Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
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221單鏈肽222(1)...(57)220
221成熟肽222(58)...(414)223編碼人源的H鏈V區的「g」型的核苷酸序列40048atg aaa tgc agc tgg gtc atc ttc ttc ctg atg gca gtg gtt aca ggg48Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly-15 -10 -5gtt aac tca cag gtg cag ctg ttg gag tct gga gct gtg ctg gca agg96Val Asn Ser Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg1 5 10cct ggg act tcc gtg aag atc tcc tgc aag gct tcc gga ttc aac att 144Pro Gly Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile15 20 25aaa gac tac tat atg cat tgg gta aaa cag agg cct gga cag ggt cta 192Lys Asp Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu30 35 40 45gaa tgg att ggt ggg aat gat cct gcg aat ggc cat agt atg tat gac 240Glu Trp Ile Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp50 55 60
ccg aaa ttc cag ggc aaa gcc act ctg act gca gac gaa tcc tcc agc288Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser65 70 75aca gcc tac atg caa ctc tcg agc cta cga tct gag gac tct gcg gtc336Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val80 85 90tat tct tgt gca aga gac tcg ggc tat gcc atg gac tac tgg ggc caa384Tyr Ser Cys Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln95 100 105ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tca gct agc414Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser110 11521049211119212PRT213人工序列220
223人源化H鏈V區的「g」型的胺基酸序列40049Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg Pro Gly Thr1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr20 25 30Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp Pro Lys Phe50 55 60Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Ser Cys85 90 95Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110Val Thr Val Ser Ser Ala Ser11521050
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221單鏈肽222(1)...(57)220
221成熟肽222(58)...(414)223編碼人源化H鏈「h」型的核苷酸序列40052atg aaa tgc agc tgg gtc atc ttc ttc ctg atg gca gtg gtt aca ggg 48Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly-15 -10 -5gtt aac tca cag gtg cag ctg ttg gag tct gga gct gtg ctg gca agg 96Val Asn Ser Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg1 5 10
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221單鏈肽222(1)...(57)220
221成熟肽222(58)...(414)223編碼人源化H鏈V區的「j」型的核苷酸序列40060atg aaa tgc agc tgg gtc atc ttc ttc ctg atg gca gtg gtt aca ggg48Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly-15 -10 -5gtt aac tca cag gtg cag ctg ttg gag tct gga gct gtg ctg gca agg96Val Asn Ser Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg1 5 10cct ggg act tcc gtg aag atc tcc tgc aag gct tcc gga ttc aac att 144Pro Gly Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile15 20 25aaa gac tac tat atg cat tgg gta aaa cag agg cct gga cag ggt cta 192Lys Asp Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu30 35 40 45gaa tgg att ggt ggg aat gat cct gcg aat ggc cat agt atg tat gac 240Glu Trp Ile Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp50 55 60ccg aaa ttc cag ggc aga gtc acc ttt acc gcg gac aca tcc gcg aac 288Pro Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ala Asn65 70 75aca gcc tac atg gag ttg agg agc ctc aga tct gca gac acg gct gtt 336Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Ala Asp Thr Ala Val80 85 90tat tat tgt gcg aga gac tcg ggc tat gcc atg gac tac tgg ggc caa 384Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln95 100 105
ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tca gct agc 414Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser110 11521061211119212PRT213人工序列220
223人源化H鏈V區的「j」型的胺基酸序列40061Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg Pro Gly Thr1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr20 25 30Tyr Mat His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp Pro Lys Phe50 55 60Gln Gly Arg Val Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110Val Thr Val Ser Ser Ala Ser1152106221179212DNA213人工序列220
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221單鏈肽222(1)...(57)220
221成熟肽222(58)...(414)223編碼人源化H鏈V區的「b1」型的核苷酸序列40064atg aaa tgc agc tgg gtc atc ttc ttc ctg atg gca gtg gtt aca ggg48Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly-15 -10 -5gtt aac tca cag gtg cag ctg ttg gag tct gga gct gtg ctg gca agg96Val Asn Ser Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg1 5 10cct ggg act tcc gtg aag atc tcc tgc aag gct tcc gga ttc aac att 144Pro Gly Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile15 20 25aaa gac tac tat atg cat tgg gtg cgc cag gct cca gga cag ggc ctg 192Lys Asp Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu30 35 40 45
gag tgg atg gga ggg aat gat cct gcg aat ggc cat agt atg tat gac240Glu Trp Met Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp50 55 60ccg aaa ttc cag ggc cga gtc aca atc act gca gac aca tcc acg aac288Pro Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn65 70 75aca gcc tac atg gag ctc tcg agt ctg aga tct gag gac aca gcc att336Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile80 85 90tat tac tgt gca aga gac tcg ggc tat gcc atg gac tac tgg ggc caa384Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln95 100 105ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tca gct agc414Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser110 11521065211119212PRT213人工序列220
223人源化H鏈V區的「b1」型的胺基酸序列40065Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg Pro Gly Thr1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr20 25 30Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp Pro Lys Phe50 55 60Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser11521066211414212DNA213人工序列220
221單鏈肽222(1)...(57)220
221成熟肽222(58)...(414)223編碼人源化H鏈V區的「d1」型的核苷酸序列40066atg aaa tgc agc tgg gtc atc ttc ttc ctg atg gca gtg gtt aca ggg48Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly-15 -10 -5gtt aac tca cag gtg cag ctg ttg gag tct gga gct gtg ctg gca agg96Val Asn Ser Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg1 5 10cct ggg act tcc gtg aag atc tcc tgc aag gct tcc gga ttc aac att 144Pro Gly Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile15 20 25aaa gac tac tat atg cat tgg gtg cgc cag gct cca gga cag ggc ctg 192Lys Asp Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu30 35 40 45gag tgg atg gga ggg aat gat cct gcg aat ggc cat agt atg tat gac 240Glu Trp Met Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp50 55 60ccg aaa ttc cag ggc aga gtc acg att act gcg gac gaa tcc acg agc 288Pro Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser65 70 75aca gcc tac atg gag ctc tcg agt ctg aga tct gag gac tcg gcc gta 336Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val80 85 90
tat ttc tgt gcg aga gac tcg ggc tat gcc atg gac tac tgg ggc caa 384Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln95 100 105ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tca gct agc 414Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser110 11521067211119212PRT213人工序列220
223人源化H鏈V區的「d1」型的胺基酸序列40067Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg Pro Gly Thr1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr20 25 30Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp Pro Lys Phe50 55 60Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110Val Thr Val Ser Ser Ala Ser1152106821179212DNA213人工序列220
223FR改組引物F2VHS
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221單鏈肽222(1)...(57)220
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aaa gac tac tat atg cat tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt192Lys Asp Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu30 35 40 45gag tgg att gga ggg aat gat cct gcg aat ggc cat agt atg tat gac240Glu Trp Ile Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp50 55 60ccg aaa ttc cag ggc cga gtc aca atc act gca gac aca tcc acg aac288Pro Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn65 70 75aca gcc tac atg gag ctc tcg agt ctg aga tct gag gac aca gcc att336Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile80 85 90tat tac tgt gca aga gac tcg ggc tat gcc atg gac tac tgg ggc caa384Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln95 100 105ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tca gct agc414Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser110 11521071211119212PRT213人工序列220
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221單鏈肽222(1)...(57)220
221成熟肽222(58)...(414)223編碼人源化H鏈V區的「d3」型的核苷酸序列40072atg aaa tgc agc tgg gtc atc ttc ttc ctg atg gca gtg gtt aca ggg48Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly-15 -10 -5gtt aac tca cag gtg cag ctg ttg gag tct gga gct gtg ctg gca agg96Val Asn Ser Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg1 5 10cct ggg act tcc gtg aag atc tcc tgc aag gct tcc gga ttc aac att 144Pro Gly Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile15 20 25aaa gac tac tat atg cat tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt 192Lys Asp Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu30 35 40 45gag tgg att gga ggg aat gat cct gcg aat ggc cat agt atg tat gac 240Glu Trp Ile Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp50 55 60
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223人源化H鏈V區的「d3」型的胺基酸序列40073Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg Pro Gly Thr1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr20 25 30Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp Pro Lys Phe50 55 60Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110Val Thr Val Ser Ser Ala Ser11521074
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223FR改組載體h5Lv1S40074gtctagatct ccaccatgag ggcccctgct cagttttttg ggatcttgtt gctctggttt60ccagggatcc gatgtgacat ccagatgacc cagtctcc982107521198212DNA213人工序列220
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223FR改組載體h5Lv2A40076cttaagaagc ttttaatgtc ctgtgaggcc ttgcacgtga tggtgactct gtctcctaca60gatgcagaca gggaggatgg agactgggtc atctggat982107721198212DNA213人工序列220
223FR改組載體h5Lv3A40077gatgggaccc catctgccaa actagttgca taatagatca ggagcttagg ggctttccct60ggtttctgct gataccaact taagaagctt ttaatgtc98
2107821194212DNA213人工序列220
223FR改組載體h5Lv5A40078tgttcgtacg tttgatctcc accttggtcc ctccgccgaa cgtgtacggg ctctcaccat60gctgcagaca gtagtaagtt gcaaaatctt cagg942107921120212DNA213人工序列220
223引物h5LVS40079gtctagatct ccaccatgag202108021119212DNA213人工序列220
223引物h5LvA40080tgttcgtacg tttgatctc 1921081211381212DNA213人工序列220
221單鏈肽222(1)...(60)220
221成熟肽222(61)...(381)
223編碼人源化L鏈V區的「a」型的核苷酸序列40081atg agg gcc cct gct cag ttt ttt ggg atc ttg ttg ctc tgg ttt cca48Met Arg Ala Pro Ala Gln Phe Phe Gly Ile Leu Leu Leu Trp Phe Pro-20 -15 -10 -5ggg atc cga tgt gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct96Gly Ile Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser1 5 10gca tct gta gga gac aga gtc acc atc acg tgc aag gcc tca cag gac 144Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp15 20 25att aaa agc ttc tta agt tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct 192Ile Lys Ser Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro30 35 40aag ctc ctg atc tat tat gca act agt ttg gca gat ggg gtc cca tca 240Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser45 50 55 60agg ttc agt ggc tcc gga tct ggt acc gat ttc act ctc acc atc tcg 288Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser65 70 75agt ctg caa cct gaa gat ttt gca act tac tac tgt ctg cag cat ggt 336Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly80 85 90gag agc ccg tac acg ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc aaa 381Glu Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys95 100 10521082211107212PRT213人工序列220
223人源化L鏈V區的「a」型的胺基酸序列40082
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Ser Phe20 25 30Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Prc Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Lou Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Tyr85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 1052108321177212DNA213人工序列220
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223FR改組引物F3SA40084tgttctgcag acaatagtaa gttgcaaaat cttcaggctg gaggctcgag atggtgagag60tgtaatcggt accagac 772108521177212DNA213人工序列
220
223FR改組引物F3RS40085gtctggtacc gattacactc tcaccatctc gagcctccag cctgaagata ttgcaactta60ctattgtctg cagaaca 772108621177212DNA213人工序列220
223FR改組引物F3RA40086tgttctgcag acaatagtaa gttgcaatat cttcaggctg gaggctcgag atggtgagag60tgtaatcggt accagac 7721087211381212DNA213人工序列220
221單鏈肽222(1)...(60)220
221成熟肽222(61)...(381)223編碼人源化L鏈V區的「b」型的核苷酸序列40087atg agg gcc cct gct cag ttt ttt ggg atc ttg ttg ctc tgg ttt cca 48Met Arg Ala Pro Ala Gln Phe Phe Gly Ile Leu Leu Leu Trp Phe Pro-20 -15 -10 -5ggg atc cga tgt gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct 96Gly Ile Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser1 5 10gca tct gta gga gac aga gtc acc atc acg tgc aag gcc tca cag gac144Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp15 20 25
att aaa agc ttc tta agt tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct192Ile Lys Ser Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro30 35 40aag ctc ctg atc tat tat gca act agt ttg gca gat ggg gtc cca tca240Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser45 50 55 60agg ttc agt ggc tcc gga tct ggt acc gat tac act ctc acc atc tcg288Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser65 70 75agc ctc cag cct gaa gat ttt gca act tac tat tgt ctg cag cat ggt336Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly80 85 90gag agc ccg tac acg ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc aaa381Glu Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys95 100 10521088211107212PRT213人工序列220
223人源化L鏈V區的「b」型的胺基酸序列40088Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Ser Phe20 25 30Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Tyr85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105
21089211381212DNA213人工序列220
221單鏈肽222(1)...(60)220
221成熟肽222(61)...(381)223編碼人源化L鏈V區的「c」型的核苷酸序列40089atg agg gcc cct gct cag ttt ttt ggg atc ttg ttg ctc tgg ttt cca48Met Arg Ala Pro Ala Gln Phe Phe Gly Ile Leu Leu Leu Trp Phe Pro-20 -15 -10 -5ggg atc cga tgt gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct96Gly Ile Arg cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser1 5 10gca tct gta gga gac aga gtc acc atc acg tgc aag gcc tca cag gac 144Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp15 20 25att aaa agc ttc tta agt tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct 192Ile Lys Ser Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro30 35 40aag ctc ctg atc tat tat gca act agt ttg gca gat ggg gtc cca tca 240Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser45 50 55 60agg ttc agt ggc tcc gga tct ggt acc gat tac act ctc acc atc tcg 288Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser65 70 75agc ctc cag cct gaa gat att gca act tac tat tgt ctg cag cat ggt 336Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly80 85 90
gag agc ccg tac acg ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc aaa381Glu Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys95 100 10521090211107212PRT213人工序列220
223人源化L鏈V區的「c」型的胺基酸序列40090Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Ser Phe20 25 30Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Tyr85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 1052109121172212DNA213人工序列220
223FR改組引物F2SS40091gtctcttaag ttggttccag cagaaaccag ggaaatctcc taagaccctg atctactatg 60caactagtaa ca 722109221172
212DNA213人工序列220
223FR改組引物F2SA40092tgttactagt tgcatagtag atcagggtct taggagattt ccctggtttc tgctggaacc60aacttaagag ac722109321172212DNA213人工序列220
223FR改組引物F2XS40093gtctcttaag ttggtatcag cagaaaccag agaaagcccc taagtccctg atctattatg60caactagtaa ca722109421172212DNA213人工序列220
223FR改組引物F2XA40094tgttactagt tgcataatag atcagggact taggggcttt ctctggtttc tgctgatacc60aacttaagag ac7221095211381212DNA213人工序列220
221單鏈肽222(1)...(60)220
221成熟肽222(61)...(381)
223編碼人源化L鏈V區的「b1」型的核苷酸序列40095atg agg gcc cct gct cag ttt ttt ggg atc ttg ttg ctc tgg ttt cca48Met Arg Ala Pro Ala Gln Phe Phe Gly Ile Leu Leu Leu Trp Phe Pro-20 -15 -10 -5ggg atc cga tgt gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct96Gly Ile Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser1 5 10gca tct gta gga gac aga gtc acc atc acg tgc aag gcc tca cag gac 144Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp15 20 25att aaa agc ttc tta agt tgg ttc cag cag aaa cca ggg aaa tct cct 192Ile Lys Ser Phe Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro30 35 40aag acc ctg atc tac tat gca act agt ttg gca gat ggg gtc cca tca 240Lys Thr Leu Ile Tyr Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser45 50 55 60agg ttc agt ggc tcc gga tct ggt acc gat tac act ctc acc atc tcg 288Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser65 70 75agc ctc cag cct gaa gat ttt gca act tac tat tgt ctg cag cat ggt 336Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly80 85 90gag agc ccg tac acg ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc aaa 381Glu Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys95 100 1052109621l107212PRT213人工序列220
223人源化L鏈V區的「b1」型的胺基酸序列40096
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Ser Phe20 25 30Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile35 40 45Tyr Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Tyr85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 10521097211381212DNA213人工序列220
221單鏈肽222(1)...(60)220
221成熟肽222(61)...(381)223編碼人源化L鏈V區的「b2」型的核苷酸序列40097atg agg gcc cct gct cag ttt ttt ggg atc ttg ttg ctc tgg ttt cca48Met Arg Ala Pro Ala Gln Phe Phe Gly Ile Leu Leu Leu Trp Phe Pro-20 -15 -10 -5ggg atc cga tgt gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct96Gly Ile Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser1 5 10gca tct gta gga gac aga gtc acc atc acg tgc aag gcc tca cag gac 144Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp15 20 25
att aaa agc ttc tta agt tgg tat cag cag aaa cca gag aaa gcc cct 192Ile Lys Ser Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro30 35 40aag tcc ctg atc tat tat gca act agt ttg gca gat ggg gtc cca tca 240Lys Ser Leu Ile Tyr Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser45 50 55 60agg ttc agt ggc tcc gga tct ggt acc gat tac act ctc acc atc tcg 288Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser65 70 75agc ctc cag cct gaa gat ttt gca act tac tat tgt ctg cag cat ggt 336Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly80 85 90gag agc ccg tac acg ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc aaa 381Glu Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys95 100 10521098211107212PRT213人工序列220
223人源化L鏈V區的「b2」型的胺基酸序列40098Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Ser Phe20 25 30Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile35 40 45Tyr Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Tyr85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105
21099211117212PRT213小鼠220
223抗TF小鼠單克隆抗體ATR-5的H鏈V區的胺基酸序列40099Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Asn Leu Val Arg Pro Gly Ala5 10 15Leu Val Lys Leu Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr20 25 30Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp Pro Lys Phe50 55 60Gln Gly Lys Ala Ser Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser100 105 110Val Thr Val Ser Ser115210100211107212PRT213小鼠220
223抗TF小鼠單克隆抗體ATR-5的L鏈V區的胺基酸序列400100Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly5 10 15Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Ser Phe20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Trp Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile35 40 45Tyr Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Asn Leu Glu Ser65 70 75 80Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Tyr85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105210101211780212DNA213人220
223編碼可溶性人TF的DNA400101atg gag acc cct gcc tgg ccc cgg gtc ccg cgc ccc gag acc gcc gtc48Met Glu Thr Pro Ala Trp Pro Arg Val Pro Arg Pro Glu Thr Ala Val-30 -25 -20gct cgg acg ctc ctg ctc ggc tgg gtc ttc gcc cag gtg gcc ggc gct96Ala Arg Thr Leu Leu Leu Gly Trp Val Phe Ala Gln Val Ala Gly Ala-15 -10 -5 -1tca ggc act aca aat act gtg gca gca tat aat tta act tgg aaa tca 144Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser1 5 10 15act aat ttc aag aca att ttg gag tgg gaa ccc aaa ccc gtc aat caa 192Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln20 25 30gtc tac act gtt caa ata agc act aag tca gga gat tgg aaa agc aaa 240Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys35 40 45tgc ttt tac aca aca gac aca gag tgt gac ctc acc gac gag att gtg 288Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val50 55 60
aag gat gtg aag cag acg tac ttg gca cgg gtc ttc tcc tac ccg gca366Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala65 70 75 80ggg aat gtg gag agc acc ggt tct gct ggg gag cct ctg tat gag aac384Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn85 90 95tcc cca gag ttc aca cct tac ctg gag aca aac ctc gga cag cca aca432Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr100 105 110att cag agt ttt gaa cag gtg gga aca aaa gtg aat gtg acc gta gaa480Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu115 120 125gat gaa cgg act tta gtc aga agg aac aac act ttc cta agc ctc cgg528Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg130 135 140gat gtt ttt ggc aag gac tta att tat aca ctt tat tat tgg aaa tct576Aap Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser145 150 155 160tca agt tca gga aag aaa aca gcc aaa aca aac act aat gag ttt ttg624Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu165 170 175att gat gtg gat aaa gga gaa aac tac tgt ttc agt gtt caa gca gtg672Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val180 185 190att ccc tcc cga aca gtt aac cgg aag agt aca gac agc ccg gta gag720Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu195 200 205tgt atg ggc cag gag aaa ggg gaa ttc aga gaa gac tac aaa gac gat768Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu Asp Tyr Lys Asp Asp210 215 220gac gat aaa taa780Asp Asp Lys225210102211259212PRT220
223可溶性人TF的胺基酸序列400102Met Glu Thr Pro Ala Trp Pro Arg Val Pro Arg Pro Glu Thr Ala Val-30 -25 -20Ala Arg Thr Leu Leu Leu Gly Trp Val Phe Ala Gln Val Ala Gly Ala-15 -10 -5 -1Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Aan Leu Thr Trp Lys Ser1 5 10 15Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln20 25 30Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys35 40 45Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val50 55 60Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala65 70 75 80Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn85 90 95Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr100 105 110Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu115 120 125Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg130 135 140Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser145 150 155 160Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu165 170 175Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val180 185 190Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu195 200 205Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu Asp Tyr Lys Asp Asp210 215 220Asp Asp Lys225210103
211780212DNA213人220
223編碼人TF的DNA400103atg gag acc cct gcc tgg ccc cgg gtc ccg cgc ccc gag acc gcc gtc48MET Glu Thr Pro Ala Trp Pro Arg Val Pro Arg Pro Glu Thr Ala Val-30 -25 -20gct cgg acg ctc ctg ctc ggc tgg gtc ttc gcc cag gtg gcc ggc gct96Ala Arg Thr Leu Leu Leu Gly Trp Val Phe Ala Gln Val Ala Gly Ala-15 -10 -5 -1tca ggc act aca aat act gtg gca gca tat aat tta act tgg aaa tca 144Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser1 5 10 15act aat ttc aag aca att ttg gag tgg gaa ccc aaa ccc gtc aat caa 192Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln20 25 30gtc tac act gtt caa ata agc act aag tca gga gat tgg aaa agc aaa 240Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys35 40 45tgc ttt tac aca aca gac aca gag tgt gac ctc acc gac gag att gtg 288Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val50 55 60aag gat gtg aag cag acg tac ttg gca cgg gtc ttc tcc tac ccg gca 336Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala65 70 75 80ggg aat gtg gag agc acc ggt tct gct ggg gag cct ctg tat gag aac 384Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn85 90 95tcc cca gag ttc aca cct tac ctg gag aca aac ctc gga cag cca aca 432Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr100 105 110att cag agt ttt gaa cag gtg gga aca aaa gtg aat gtg acc gta gaa 480Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu115 120 125
gat gaa cgg act tta gtc aga agg aac aac act ttc cta agc ctc cgg528Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg130 135 140gat gtt ttt ggc aag gac tta att tat aca ctt tat tat tgg aaa tct576Asp Val Pha Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser145 150 155 160tca agt tca gga aag aaa aca gcc aaa aca aac act aat gag ttt ttg624Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu165 170 175att gat gtg gat aaa gga gaa aac tac tgt ttc agt gtt caa gca gtg672Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val180 185 190att ccc tcc cga aca gtt aac cgg aag agt aca gac agc ccg gta gag720Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu195 200 205tgt atg ggc cag gag aaa ggg gaa ttc aga gaa ata ttc tac atc att768Cys MET Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu Ile Phe Tyr Ile Ile210 215 220gga gct gtg gta ttt gtg gtc atc atc ctt gtc atc atc ctg gct ata816Gly Ala Val Val Phe Val Val Ile Ile Leu Val Ile Ile Leu Ala Ile225 230 235 240tct cta cac aag tgt aga aag gca gga gtg ggg cag agc tgg aag gag864Ser Leu His Lys Cys Arg Lys Ala Gly Val Gly Gln Ser Trp Lys Glu245 250 255aac tcc cca ctg aat gtt tca taa888Asn Ser Pro Leu Asn Val Ser ***260210104211259212PRT220
223可溶性人TF的胺基酸序列400104MET Glu Thr Pro Ala Trp Pro Arg Val Pro Arg Pro Glu Thr Ala Val-30 -25 -20Ala Arg Thr Leu Leu Leu Gly Trp Val Phe Ala Gln Val Ala Gly Ala-15 -10 -5 -1
Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser1 5 10 15Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln20 25 30Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys35 40 45Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val50 55 60Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala65 70 75 80Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn85 90 95Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr100 105 110Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu115 120 125Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg130 135 140Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser145 150 155 160Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu165 170 175Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val180 185 190Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu195 200 205Cys MET Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu Ile Phe Tyr Ile Ile210 215 220Gly Ala Val Val Phe Val Val Ile Ile Leu Val Ile Ile Leu Ala Ile225 230 235 240Ser Leu His Lys Cys Arg Lys Ala Gly Val Gly Gln Ser Trp Lys Glu245 250 255Asn Ser Pro Leu Asn Val Ser260
權利要求
1.一種實驗動物，其中植入了其中插入了編碼人組織因子(TF)的基因或者其部分並且能表達所述基因的動物細胞，所述動物是保持長時間凝固性過高狀態的非人動物。
2.根據權利要求1的動物，其中所述人組織因子的部分缺少胞內區。
3.根據權利要求1或2的動物，其中所述動物細胞是哺乳動物細胞。
4.根據權利要求3的動物，其中所述哺乳動物細胞是人骨髓瘤細胞。
5.根據權利要求1-4任一項的動物，其中所述動物是小鼠。
6.根據權利要求1-5任一項的動物，其中所述凝固性過高狀態由至少一種下面的現象指徵，包括人組織因子血漿濃度的提高，血小板減少，纖維蛋白原減少，可溶性纖維蛋白單體複合物濃度提高，以及凝血酶-抗凝血酶III複合物濃度提高。
7.產生根據權利要求1-6任一項的動物的方法，其中對非人動物植入其中插入了編碼人組織因子(TF)的基因或者其部分並且能表達所述基因的動物細胞，然後選擇具有持久性凝固性過高狀態的動物。
8.篩選抗血栓形成劑的方法，該方法包括使用根據權利要求1-6任一項的動物。
9.用於具有持久性凝固性過高狀態的疾病的預防或治療劑，所述製劑包含對人組織因子(人TF)的抗體。
10.根據權利要求9的預防或治療劑，其中所述抗體是多克隆抗體。
11.根據權利要求9的預防或治療劑，其中所述抗體是單克隆抗體。
12.根據權利要求9或11的預防或治療劑，其中所述抗體是重組抗體。
13.根據權利要求9或12的預防或治療劑，其中所述抗體是改變的抗體。
14.根據權利要求9，12或13的預防或治療劑，其中所述改變的抗體是嵌合抗體或人源化抗體。
15.根據權利要求14的預防或治療劑，其中所述人源化抗體是人源化抗體b-b，i-b或i-b2型。
16.根據權利要求9或權利要求12-15任一項的預防或治療劑，其中所述抗體是修飾的抗體。
17.根據權利要求16的預防或治療劑，其中所述修飾的抗體是抗體片段Fab，F(ab』)2或Fv，或者單鏈Fv(scFv)。
18.用於由感染導致的凝固性過高狀態的預防或治療劑，所述製劑包含針對人組織因子(人TF)抗體。
19.根據權利要求18的預防或治療劑，其中所述抗體是多克隆抗體。
20.根據權利要求18的預防或治療劑，其中所述抗體是單克隆抗體。
21.根據權利要求18或20的預防或治療劑，其中所述抗體是重組抗體。
22.根據權利要求18或2 1的預防或治療劑，其中所述抗體是改變的抗體。
23.根據權利要求18，21或22的預防或治療劑，其中所述改變的抗體是嵌合抗體或人源化抗體。
24.根據權利要求23的預防或治療劑，其中所述人源化抗體是人源化抗體b-b，i-b或i-b2型。
25.根據權利要求18或權利要求21-24任一項的預防或治療劑，其中所述抗體是修飾的抗體。
26.根據權利要求25的預防或治療劑，其中所述修飾的抗體是抗體片段Fab，F(ab』)2或Fv，或者單鏈Fv(scFv)。
27.用於靜脈血栓形成的預防或治療劑，所述製劑包含對人組織因子(人TF)的抗體。
28.根據權利要求27的預防或治療劑，其中所述抗體是多克隆抗體。
29.根據權利要求27的預防或治療劑，其中所述抗體是單克隆抗體。
30.根據權利要求27或29的預防或治療劑，其中所述抗體是重組抗體。
31.根據權利要求27或30的預防或治療劑，其中所述抗體是改變的抗體。
32.根據權利要求27，30或31的預防或治療劑，其中所述改變的抗體是嵌合抗體或人源化抗體。
33.根據權利要求32的預防或治療劑，其中所述人源化抗體是人源化抗體b-b，i-b或i-b2型。
34.根據權利要求27或權利要求30-33任一項的預防或治療劑，其中所述抗體是修飾的抗體。
35.根據權利要求34的預防或治療劑，其中所述修飾的抗體是抗體片段Fab，F(ab』)2或Fv，或者單鏈Fv(scFv)。
36.用於動脈血栓形成的預防或治療劑，所述製劑包含對人組織因子(人TF)的抗體。
37.根據權利要求36的預防或治療劑，其中所述抗體是多克隆抗體。
38.根據權利要求36的預防或治療劑，其中所述抗體是單克隆抗體。
39.根據權利要求36或38的預防或治療劑，其中所述抗體是重組抗體。
40.根據權利要求36或39的預防或治療劑，其中所述抗體是改變的抗體。
41.根據權利要求36，39或40的預防或治療劑，其中所述改變的抗體是嵌合抗體或人源化抗體。
42.根據權利要求41的預防或治療劑，其中所述人源化抗體是人源化抗體b-b，i-b或i-b2型。
43.根據權利要求36或權利要求39-42任一項的預防或治療劑，其中所述抗體是修飾的抗體。
44.根據權利要求43的預防或治療劑，其中所述修飾的抗體是抗體片段Fab，F(ab』)2或Fv，或者單鏈Fv(scFv)。
45.用於由血管中層增厚導致的疾病的預防或治療劑，所述製劑包含對人組織因子(人TF)的抗體。
46.根據權利要求45的預防或治療劑，其中所述抗體是多克隆抗體。
47.根據權利要求45的預防或治療劑，其中所述抗體是單克隆抗體。
48.根據權利要求45或47的預防或治療劑，其中所述抗體是重組抗體。
49.根據權利要求45或48的預防或治療劑，其中所述抗體是改變的抗體。
50.根據權利要求45，48或49的預防或治療劑，其中所述改變的抗體是嵌合抗體或人源化抗體。
51.根據權利要求50的預防或治療劑，其中所述人源化抗體是人源化抗體b-b，i-b或i-b2型。
52.根據權利要求43或權利要求48-51任一項的預防或治療劑，其中所述抗體是修飾的抗體。
53.根據權利要求52的預防或治療劑，其中所述修飾的抗體是抗體片段Fab，F(ab』)2或Fv，或者單鏈Fv(scFv)。
全文摘要
本發明通過植入細胞例如腫瘤細胞提供具有持久性凝固性過高狀態的動物。其中對實驗動物例如小鼠植入人組織因子的基因，然後通過使所述細胞生長，從而對所述實驗動物持久性供給人組織因子。該動物模型對於研究和開發用於具有持久性凝固性過高狀態的疾病的治療劑是有用的。本發明還提供了用於具有持久性凝固性過高狀態疾病、感染導致的凝固性過高狀態、靜脈血栓形成、動脈血栓形成和由於血管中層的肥大導致的疾病的預防或治療劑，所述製劑含有針對人組織因子(人TF)的抗體作為活性成分。
文檔編號A61P9/00GK1589098SQ00813720
公開日2005年3月2日 申請日期2000年9月29日 優先權日2000年9月29日
發明者齊藤浩之, 北沢剛久, 吉橋一隆, 服部有宏 申請人:中外製藥株式會社