柑橘褐斑病菌粗毒素的提取方法和產毒條件的製作方法
2024-03-26 05:21:05 2
柑橘褐斑病菌粗毒素的提取方法和產毒條件的製作方法
【專利摘要】本發明涉及生物【技術領域】，具體涉及柑橘褐斑病菌粗毒素的提取方法和產毒條件。本發明保藏號為CCTCC M2014484的柑橘褐斑病菌，用於提取粗毒素，所得柑橘褐斑病菌粗毒素含量高、純度高，產量大，周期短，易於規模化製備。此外，用毒素代替病原菌作為研究對象，可以避免消除生物間的相互幹擾和交叉汙染等。本發明建立了一套簡便、經濟、高效的柑橘褐斑病菌毒素提取方法，為該病菌及其毒素的致病機理研究奠定了良好的基礎。CCTCC M201448420141015
【專利說明】柑橘褐斑病菌粗毒素的提取方法和產毒條件
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物【技術領域】，具體涉及柑橘褐斑病菌粗毒素的提取方法和產毒條 件。
【背景技術】
[0002] 病原真菌在與寄主植物相互作用的過程中能產生引起寄主生理生化反應的代謝 產物，主要包括酶、激素和毒素。其中毒素具有對寄主植物誘發病害的敏感性誘導因子，是 近幾年研究的熱點。病原真菌產生的毒素根據其對寄主致病範圍不同可分為寄主選擇性毒 素（HST)和非寄主選擇性毒素（NHST)。目前已知約20種病原真菌產生HST，其中大多數 HST是病原菌的次級代謝產物。1933年Tanaka從梨黑斑病菌-菊池鏈格孢（Alternaria kikuchiana)中首次分離到鏈格孢菌產生的HST-AK毒素（Tanaka)。引起柑橘褐斑病的鏈 格孢菌主要是橘致病型鏈格孢菌，其專化性為害橘及其雜種，產生ACT毒素。Nakatsuka等 於1989年，純化了該病菌產生的毒素並將其命名為ACT毒素 I b和II b。其中I b是主要 成分。ACT毒素由三個部分組成即EDA(9, 10-環氧基-8-羥基-9-甲基三烯酸）、纈氨酸和 一個聚酮化合物。Kohmoto等研究發現在理察培養基中25°C，靜置培養24d產毒量最高， 同時在培養基中加入微量的Zn 2+，能增加產毒量。目前已知的病原菌毒素均為有機類物質， 因此可以通過萃取、層析、色譜等方法提取。優化病菌產生毒素的條件是研究病原物生物學 特性的重要方面，對毒素的大量製備與提取等研究工作有重要作用。
[0003] 現有技術中，尚未有提取柑橘褐斑病菌粗毒素的相關報導。
【發明內容】
[0004] 針對現有技術中的不足，本發明的目的在於提供一種適合該柑橘褐斑病菌提取粗 毒素的技術和產毒條件，為研究柑橘褐斑病菌粗毒素的生物學特性奠定基礎。
[0005] 本發明首先公開了一種柑橘褐斑病菌株，其保藏號為：CCTCC M 2014484。
[0006] 本發明從採自重慶萬州陳家壩紅橘果實中分離篩選到一柑橘褐斑病菌株 CJBHJF-2,該菌株已於2014年10月15日在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC M 2014484。在PDA培養基上，菌落呈灰色至橄欖色或青褐色，分生孢子梗單生或數根簇生， 直立或頂端微彎曲，有分隔，未見分枝，色澤從基部到頂部深褐色漸變為淺褐色，分生孢子 單生或鏈生，倒棍棒形、倒梨形或近橢圓形，淡褐色至褐色，具縱橫隔膜，幼齡孢子多為卵圓 形，顏色淡褐色，〇?1個橫隔，老齡孢子多為棍棒形，顏色深褐色或黑褐色，縱橫隔膜較多。
[0007] 經形態學和分子生物學鑑定，確定該菌株為鏈格孢屬鏈格孢菌[Alternaria alternata (Fr.) Keissler]，在柑橘上引起褐斑病，命名為柑橘褐斑病菌CJBHJF-2,中國典 型培養物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC M 2014484。所述柑橘褐斑病菌，生物學特性穩定， 菌株產毒量高。
[0008] 本發明第二方面公開了從柑橘褐斑病菌中提取粗毒素的方法，具體包括以下步 驟：
[0009] (1)產毒培養：轉接柑橘褐斑病菌於PDA培養基上培養至形成菌落，然後取一定大 小的菌絲塊，於液體培養基中繼續培養一段時間，至菌絲開始變黑，得產毒培養液；
[0010] (2)濾液製備：將步驟（1)中所得產毒培養液，過濾除去菌絲，離心棄去沉澱，上清 液即為培養濾液；
[0011] (3)粗毒素提取：採用小分子萃取法，在步驟（2)中所得培養濾液中加入有機溶 齊?，萃取，去除有機溶劑，得濃縮物。然後將濃縮物復溶於水中，得粗毒素。
[0012] 優選的，步驟⑴中，所述柑橘褐斑病菌為CJBHJF-2,其保藏號為：CCTCC Μ2014484。
[0013] 優選的，步驟（1)中，PDA培養基上培養的方式為：28°C，連續黑暗，培養5?7d。
[0014] 優選的，步驟（1)中，所述液體培養基選自PSK培養基、理察培養基、改良理察 培養基、Fries培養基或改良Fries培養基中的任意一種。更優選為改良理察培養基。
[0015] 優選的，步驟（1)中，於液體培養基中培養的時間為5?30d，更優選為8?10d。
[0016] 優選的，步驟（1)中，於液體培養基中培養的溫度為10?35°C，更優選為28°C。
[0017] 優選的，步驟（1)中，於液體培養基中培養的光照條件為連續光照、12光照/12h黑 暗或全黑暗，更優選為連續光照。
[0018] 優選的，步驟（1)中，於液體培養基中培養的方式為靜置培養或振蕩培養，更優選 為振蕩培養，最優選為ll〇r/min振蕩培養。
[0019] 優選的，步驟（1)中，液體培養基的pH值為3?7,更優選為4?5。
[0020] 優選的，步驟（3)中，所述有機溶劑選自丙酮、甲醇、乙酸乙酯、氯仿或四氯化碳中 的任意一種或多種。更優選甲醇。
[0021] 優選的，步驟（3)中，所述有機溶劑與培養濾液等體積。
[0022] 優選的，步驟（3)中，去除有機溶劑時採用旋轉蒸發法。
[0023] 本發明第三方面公開了由前述方法提取獲得的柑橘褐斑病菌粗毒素。
[0024] 本發明第四方面公開了前述柑橘褐斑病菌在提取柑橘褐斑病菌粗毒素中的應用。
[0025] 本發明的有益效果如下：
[0026] 本發明系統比較了時間、溫度、光照、通氣量、pH值和培養基，優化了柑橘褐斑病菌 毒素的產生條件。該方法比較了丙酮、甲醇、乙酸乙酯、氯仿、四氯化碳五種萃取劑，甲醇萃 取效果最好。選擇甲醇作萃取劑，採用旋轉蒸發法去除有機溶劑，方法簡單易行，操作簡便， 成本低。所得柑橘褐斑病菌粗毒素含量高、純度高，產量大，周期短，易於規模化製備。此外， 用毒素代替病原菌作為研究對象，可以避免消除生物間的相互幹擾和交叉汙染等。本發明 建立了一套簡便、經濟、高效的柑橘褐斑病菌毒素提取方法，為該病菌及其毒素的致病機理 研究奠定了良好的基礎。
[0027] 本發明菌株保藏信息如下：
[0028] 菌株名稱：CJBHJF-2 ;
[0029] 保藏號為：CCTCC M 2014484。
[0030] 保藏日期：2014年10月15日；
[0031] 保減單位名稱：中國典型培養物保減中心；
[0032] 保藏單位簡稱：CCTCC ;
[0033] 保藏單位地址：武漢市武昌珞珈山街道武漢大學生命科學學院。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0034] 圖1有機溶劑萃取柑橘褐斑病菌毒素致病性測定
[0035] 圖2不同培養時間對柑橘褐斑病菌產毒的影響
[0036] 圖3不同培養溫度對柑橘褐斑病菌產毒的影響
[0037] 圖4不同培養條件對柑橘褐斑病菌產毒的影響
[0038] 圖5不同pH值對柑橘褐斑病菌產毒的影響
[0039] 圖6不同培養基對柑橘褐斑病菌產毒的影響
[0040] 圖7接種ACT毒素後兩天葉片症狀
【具體實施方式】
[0041] 以下通過特定的具體實例說明本發明的實施方式，本領域技術人員可由本說明書 所揭露的內容輕易地了解本發明的其他優點與功效。本發明還可以通過另外不同的具體實 施方式加以實施或應用，本說明書中的各項細節也可以基於不同觀點與應用，在沒有背離 本發明的精神下進行各種修飾或改變。
[0042] 在進一步描述本發明【具體實施方式】之前，應理解，本發明的保護範圍不局限於下 述特定的具體實施方案；還應當理解，本發明實施例中使用的術語是為了描述特定的具體 實施方案，而不是為了限制本發明的保護範圍；在本發明說明書和權利要求書中，除非文中 另外明確指出，單數形式"一個"、"一"和"這個"包括複數形式。
[0043] 當實施例給出數值範圍時，應理解，除非本發明另有說明，每個數值範圍的兩個端 點以及兩個端點之間任何一個數值均可選用。除非另外定義，本發明中使用的所有技術和 科學術語與本【技術領域】技術人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設備、 材料外，根據本【技術領域】的技術人員對現有技術的掌握及本發明的記載，還可以使用與本 發明實施例中所述的方法、設備、材料相似或等同的現有技術的任何方法、設備和材料來實 現本發明。
[0044] 除非另外說明，本發明中所公開的實驗方法、檢測方法、製備方法均採用本技術 領域常規的分子生物學、生物化學、染色質結構和分析、分析化學、細胞培養、重組DNA技 術及相關領域的常規技術。這些技術在現有文獻中已有完善說明，具體可參見Sambrook 等 MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989and Third edition,2001 ;Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John ffiley&Sons,New York,1987and periodic updates ；the series METHODS IN ENZYM0L0GY,Academic Press,San Diego ；ffolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998 ；METH0DS IN ENZYM0L0GY, Vol. 304,Chromatin(P. M. Wassarman and A. P. ffolffe,eds.),Academic Press, San Diego, 1999 ;和 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, Chromatin Protocols (P.B. Becker, ed. )Humana Press，Totowa，1999 等。
[0045] 實施例I產毒菌株的篩選
[0046] I. 1.菌株與植物
[0047] 供試菌株：CJBHJF-2、TJCHJ35B、CJBHJL-2、SP-36等29個菌株分離自重慶、西班 牙、廣東、廣西、浙江等地的褐斑病典型發病葉片、枝條和果實。
[0048] 生物測定材料：採自網室內1年生3?4cm長紅橘葉片。
[0049] 試驗中涉及的培養基配方：
[0050] PDA培養基（PDA Medium):馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂18g，加蒸餾水定容至 IL0
[0051] PSK培養基（PSK Medium):馬鈴薯200g，蔗糖30g，K2HPO4Ig,加蒸餾水定容至1L。
[0052] 理察培養基（Richard，s Medium):蔗糖 50g，KNO3IOg, KH2P045g，MgS042. 5g， FeCl2O. 02g，加蒸饋水至1L。
[0053] 改良理察培養基（Improved-Richard Medium):葡萄糖 50g，KNO3IOg, KH2P045g， MgS042. 5g，FeCl2O. 02g，ZnSO4O. 005g，加蒸餾水至 1L。
[0054] Frie' s培養基（Frie' s Medium):鹿糖30g，酒石酸銨5g，酵母浸出液0. 5g， NH4NO3Ig, KH2PO4Ig, MgSO4. 7H20 0· 5g，NaCl 0· lg，CaCl2. H2O 0· lg，加蒸餾水至 1L。
[0055] 改良Frie's培養基（Improved-Fries Medium):鹿糖20g，酒石酸銨5g，酵母浸出 液 lg，NH4NO3Ig, KH2PO4Ig, MgSO4. 7H20 0· 5g，NaCl 0· lg，CaCl2. H2O 0· 13g，加蒸餾水至 1L。
[0056] 查彼克培養基（Czapek-Dox Medium):鹿糖 30g，NaN032g，K2HPO4Ig, KCl 0· 5g， MgSO4. 7H20 0· 5g，FeSO4O. Olg，加蒸餾水至 1L。
[0057] I. 2產毒培養方法
[0058] 轉接菌種於PDA培養基上培養5?7d (28°C，連續黑暗），然後取一定大小的菌絲 塊放於盛有50ml改良Richard's液體培養基的250ml三角瓶中，28°C，12h光照/12h黑暗 (12L/12D)，110r/min培養8d，至菌絲開始變黑。
[0059] 1. 3粗毒素的製備及其接種方法
[0060] 粗毒素的製備方法：菌株按上述產毒方法培養後，先用4層紗布過濾，除去菌絲。 濾液經15000r/min離心30min，得上清。上清中加入等體積甲醇，300r/min，萃取30min。 然後旋轉蒸發儀65°C蒸餾至近幹，以去除甲醇，溶液用無菌水定容至5ml離心管中，經 0.22 μ m濾膜過濾，得粗毒素。
[0061] 接種方法：採用離體葉片針刺法測定毒力。培養皿中放入無菌濾紙（Thomma 2003),並用無菌水浸溼，葉片放於其中。在距葉片中脈2cm處針刺,滴加50 μ 1粗毒素,保 鮮膜保溼，置於培養箱中一段時間，測量產生的病斑直徑。
[0062] 1. 4產毒菌株
[0063] 從本實驗室保存的29個鏈格孢菌株中篩選出兩個菌株。這兩個菌株用於產毒特 性試驗，同時比較國外和國內的這兩個菌株的產毒條件是否有差異。
[0064] 實施例2產毒條件的優化
[0065] 2.1萃取劑的選擇
[0066] 高產毒菌株按確定的產毒條件培養後，得到培養濾液。分別取15ml培養濾液加入 等體積的丙酮、甲醇、乙酸乙酯、氯仿、四氯化碳，300r/min萃取30min。旋轉蒸發儀蒸發去 除有機溶劑，得到的粗毒素用離體葉片針刺法進行生測。
[0067] 2. 2產毒培養條件的優化
[0068] 2. 2. 1按實施例1中方法篩選出的菌株用於產毒培養條件的優化實驗。
[0069] 2. 2. 2時間：按實施例1中1.2方法在液體培養基中培養5、10、15、20、25、30d取 樣，製備粗毒素。
[0070] 2. 2. 3溫度：按實施例1中1. 2方法分別於5、10、15、20、25、28、30、35°C條件下，在 液體培養基中培養菌株一定時間，製備粗毒素。
[0071] 2. 2. 4光照條件：按實施例1中1. 2方法分別於連續光照、12L/12D、全黑暗三種條 件下，在液體培養基中培養菌株一定時間，製備粗毒素。
[0072] 2. 2. 5通氣量：分別於靜置和110r/min振蕩條件下，在液體培養基中培養菌株一 定時間，製備粗毒素。
[0073] 2.2.6?!1值：調節改良1^1^(1'8培養基的？!1值為2、3、4、5、6、7，培養菌株一定 時間，製備粗毒素。
[0074] 2. 2. 7 培養基：PSK、Richard' s、改良 Richard' s、Fries、改良 Fries、Czapek 六種 培養基培養菌株，一定時間後製備粗毒素。
[0075] 各處理得到的粗毒素在用於生物測定前均可保存於4°C。離體葉片針刺法進行 生物測定。以無菌水和經0.22 μ m濾膜過濾的培養基分別作為清水對照（CKO)和負對照 (CKl)。
[0076] 2. 3數據分析
[0077] 每個條件處理3個重複，離體葉片接種粗毒素兩天後拍照，應用IMGEJ軟體計算 病斑直徑。實驗結果採用Microsoft Excel 2007進行數據統計，利用SPSS軟體進行數據 的方差分析和多重比較。
[0078] 2. 4 結果
[0079] 2. 4. 1產毒菌株
[0080] 從本實驗室保存的29個鏈格孢菌株中篩選出兩個菌株：西班牙菌株SP-36和萬州 菌株CJBHJF-2。這兩個菌株用於產毒特性試驗。
[0081] 2. 4. 2萃取劑的選擇
[0082] 結果表明：不同的萃取劑分層特徵不同（見表1)，萃取效果也不同（見圖1)。ACT 毒素是小分子物質，主要存在於水相中。四氯化碳、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、丙酮這五種萃取 劑的極性分別是I. 60、3. 40、4. 30、5. 10、5. 40。由圖1可以看出，用極性強、與水互溶的甲醇 和丙酮萃取，均產生少量白色絮狀沉澱物。經離心除去沉澱後的溶液基本為澄清狀態，把有 機溶劑和水的混合相經減壓蒸發去除有機溶劑，分別將得到的濃縮物和離心獲得的沉澱物 復溶於水中進行生物活性測定。甲醇有機相減壓蒸發後得到的濃縮物所產生的病斑直徑較 大，而絮狀沉澱引起的病斑較小，說明甲醇的有機相中含有大量的毒素，而且柑橘褐斑病菌 在液體培養基中產生的毒素成分是小分子物質，甲醇萃取效果最好。由此可知，毒素的極性 較大，在5. 10?5. 40之間。
[0083] 表1有機溶劑萃取柑橘褐斑病菌毒素有機相和水相的外觀性狀
[0084]
【權利要求】
1. 一種柑橘褐斑病菌株，其保藏號為：CCTCC M 2014484。
2. -種從柑橘褐斑病菌株中提取粗毒素的方法，具體包括以下步驟： (1) 產毒培養：轉接柑橘褐斑病菌株於PDA培養基上培養至形成菌落，然後取一定大小 的菌絲塊，於液體培養基中繼續培養一段時間，至菌絲開始變黑，得產毒培養液； (2) 濾液製備：將步驟（1)中所得產毒培養液，過濾除去菌絲，離心棄去沉澱，上清液即 為培養濾液； (3) 粗毒素提取：採用小分子萃取法，在步驟（2)中所得培養濾液中加入有機溶劑，萃 取，去除有機溶劑，得濃縮物。然後將濃縮物復溶於水中，得柑橘褐斑病菌粗毒素。
3. 根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，步驟（1)中，所述柑橘褐斑病菌株為 CJBHJF-2,其保藏號為：CCTCC M 2014484。
4. 根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述液體培養基選自PSK培養基、理察 培養基、改良理察培養基、Fries培養基或改良Fries培養基中的任意一種。
5. 根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，步驟（1)中，於液體培養基中培養的時間 為5?30d ;於液體培養基中培養的溫度為10?35°C ;於液體培養基中培養的光照條件為 連續光照、12光照/12h黑暗或全黑暗。
6. 根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，步驟（1)中，於液體培養基中培養的方式 為靜置培養或振蕩培養。
7. 根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，步驟⑴中，液體培養基的pH值為3? 7。
8. 根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，步驟（3)中，所述有機溶劑選自丙酮、甲 醇、乙酸乙酯、氯仿或四氯化碳中的任意一種或多種。
9. 一種由權利要求2-8任一項權利要求所述的方法製備獲得的柑橘褐斑病菌粗毒素。
10. 根據權利要求1所述的柑橘褐斑病菌株在提取柑橘褐斑病菌粗毒素中的應用。
【文檔編號】C07K14/37GK104388319SQ201410578773
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月24日 優先權日:2014年10月24日
【發明者】唐科志, 王玲傑, 李中安, 周常勇 申請人:中國農業科學院柑桔研究所