一種檢測楊樹潰瘍病病原真菌的基因晶片及其應用的製作方法

2023-04-26 17:22:36

一種檢測楊樹潰瘍病病原真菌的基因晶片及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測楊樹潰瘍病病原真菌的基因晶片，包括載體，以及位於載體上的寡核苷酸探針、雜交過程陽性對照及空白的點塗層；所述雜交過程陽性對照為Biotin；所述寡核苷酸探針包括28條真菌探針，其序列如SEQ?ID?NO.2、3、8～33所示；或所述寡核苷酸探針包括35條真菌探針，其序列如SEQ?ID?NO.1～35所示。本發明的基因晶片可用於檢測楊樹潰瘍病病原真菌，涵蓋5屬16種。本發明所建立的多重PCR擴增環境樣本的晶片通量檢測診斷楊樹潰瘍病技術在北京地區的楊樹潰瘍病的檢測中得到初步應用。本發明能為建立其它有害生物的高通量檢測技術、及相關生物多樣性為基礎的應用和研究服務。
【專利說明】一種檢測楊樹潰瘍病病原真菌的基因晶片及其應用

【技術領域】
[0001]本發明涉及一種檢測楊樹潰瘍病病原真菌的基因晶片及其應用，屬於基因晶片【技術領域】。

【背景技術】
[0002]樹木潰瘍病病原種類多樣，寄主廣泛,有性型和無性型並不是--對應關係,無性型多樣，其形態特徵差異小，有性型在自然界中不常發現。目前檢測鑑定的方法還依賴於病原菌的分離培養，這限制了生態條件下對樹木潰瘍病發生、發展和防治的研究。
[0003]現有技術中的病原菌鑑定檢測手段主要停留在可培養技術、形態生物學及一些生化技術和常規分子方法上，這些技術和方法只能對非常有限的種群數量進行有限的研究，難以構成病原微生物較大規模種群流行生態學的研究。基於核酸序列和PCR技術的微生物檢測技術和鑑定手段發展了十多年，主要分子技術平臺有:失活梯度凝膠電泳技術(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE)、溫度差異性凝膠電泳技術(Temperature Gradient Gel Electrophoresis, TGGE)、單鏈構象多態性技術(Single-strand Conformat1n Polymorphism, SSCP)、擴增片斷長度多態性 AFLP 技術(Amplified Fragment Length Polymorphism)、突光原位雜交技術(Fluorescent in-situHybridizat1n, FISH) > RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)、RFLP(Restrict1nFragment Length Polymorphism)等。這些技術的應用雖極大地促進了微生物生態的發展，並大大提高了判定和分析微生物種群的能力，但這種以具有遺傳背景的分子標記性方法，因不同對象和生態條件而變化，存在著種群限制和較為耗時的技術規程問題。隨著越來越多的微生物種和其他生物種的基因組序列的測定完成，一批以組學為基礎發展起來的高通量技術和平臺被建立如生物晶片技術及其平臺。而且，近些年這些技術迅速地向生態學和環境科學滲透發展，促進了分子生態學和生態基因組學(ecogenomics，ecologicalgenomics)和宏基因組學(metagenomics)的快速發展。在這樣一個生物分子手段與生態和環境技術逐漸結合的時代，對於植物病理學、流行學以及微生物生態相關學科而言，亟需基於更大規模生態下的微生物種群的監測、檢測、鑑定和量化研究的先進技術，這一領域下的生物晶片技術和平臺的應用和發展也正是在這時代背景下迅速興起。
[0004]生物晶片是基於核酸雜交技術的微陣列技術，將含有生物信息的被稱為探針的核酸序列或蛋白成分以微型點陣形式，排列在固體的基片上，來自待分析樣本的核酸或蛋白(靶標)通過與其雜交、染色、掃描儀判讀、結果輸出分析，從而了解和反映出生物發育或在特定生態或環境下的基因表達、代謝及功能的特徵。目前，根據用途、目的、探針性質以及構造生物晶片平臺可以分有很多類型，如核酸晶片(基因晶片)、蛋白質晶片、抗體晶片；cDNA晶片、寡聚核苷酸晶片是、CHIP晶片；還有測序晶片、流體晶片、晶片實驗(Lab on Chip)、ChIP — chip等20多種類型，而商業化了的只是幾個很有名的晶片公司，如Affymetrix、Applied B1systems、Agilent、TaqMan等。這些生物晶片技術和平臺中，按照用途可以簡單地將他們歸為表達型生物晶片和檢測性生物晶片。表達型晶片是目前研究利用的主導類晶片，發展較早，應用目的主要是基因表達和轉錄圖譜分析，目前已有很多的成熟的平臺和技術，商業化的生物晶片絕大部分也是為這類目的設計的。檢測性生物晶片以監測、檢測、鑑定和量化為目標，應用目的如基因單鹼基多態檢測(SNP)，以及特定生態或環境下的生物種群屬性及其功能基因的定性和定量研究。檢測型晶片最近在醫學臨床、環境微生物檢測鑑定、病蟲害檢疫、轉基因植物檢測等領域發展很快，一些專門為檢測而發展起來的晶片平臺也得到興起，如ArrayTube平臺技術。
[0005]ArrayTube生物晶片平臺與技術是由德國Clondiag公司發展起來的可用於微生物檢測和鑑定的可定製晶片體系。該平臺和技術已經被歐美科學家們接受，尤其在歐洲，該平臺與其它知名生物技術公司的平臺一樣得到較好的應用。利用該平臺技術發表的科學結果在包括美國國家科學院院刊(PNAS)的許多知名期刊上發表。一些歐洲公司也以該平臺和晶片生產為基礎，消化研發出自己的一套檢測系統，如荷蘭的Check-Points BV公司，利用ArrayTube平臺和技術,開發出可以用於沙門氏亞型鑑定的晶片產品:SalmonellaSerovar ArrayTM,他們希望通過這個平臺能為全部的1000多個沙門氏亞型作鑑定。這生物晶片技術在病毒、細菌、真菌等微生物分型分化、個體和種群，以及致病功能基因和一些環境響應基因的鑑定、檢測上都已經開展了工作和取得了相應的一些成果。ArrayTube平臺技術的性能價比很高，一是分析通量上，遠高於基於傳統可培養技術及基於核酸和PCR方法發展出來的常規分子標記方法；二是通量處理具有即時性與平行進行的特點；三是與同類生物晶片技術相比，在晶片技術所需核心設備上，它佔有非常大的優勢，其它類型的生物晶片平臺需要專門的晶片雜交儀和掃描儀，有的還需專門的樣品製備裝置，成本上百萬人民幣；ArrayTube生物晶片只需ArrayTube讀器一臺，雜交過程比常規實驗室的分子雜交簡單，讀器成本價格不過10萬人民幣。ArrayTube晶片單管點陣常規密度為14x 14，管數可集成達8管，從而提高形成更高密度的ArrayTube晶片以滿足更高通量目標檢測的需要。初次定製單片成本也僅需300~500元人民幣，續制單片成本可降至100元以內。


【發明內容】

[0006]針對上述現有技術，本發明針對我國楊樹潰瘍病病原真菌的的種類特點，提供了一種檢測楊樹潰瘍病病原真菌的基因晶片，以及其在檢測楊樹潰瘍病病原真菌中的應用。
[0007]本發明是通過以下技術方案實現的:
[0008]一種檢測楊樹潰瘍病病原真菌的基因晶片，包括載體，以及位於載體上的寡核苷酸探針、雜交過程陽性對照點及空白的點塗層；所述寡核苷酸探針包括28條真菌探針，其序列如SEQ ID N0.2、3、8~33所示，，詳見表1 ;或所述寡核苷酸探針包括35條真菌探針，其序列如SEQ ID N0.1~35所示，詳見表1 ;所述雜交過程陽性對照為B1tin。
[0009]表1寡核苷酸探針序列及物種信息
[0010]

【權利要求】
1.一種檢測楊樹潰瘍病病原真菌的基因晶片，其特徵在於:包括載體，以及位於載體上的寡核苷酸探針、雜交過程陽性對照及空白的點塗層；所述雜交過程陽性對照為B1tin ;所述寡核苷酸探針包括28條真菌探針,其序列如SEQ ID N0.2、3、8~33所示；或所述寡核苷酸探針包括35條真菌探針，其序列如SEQ ID N0.1~35所示。
2.根據權利要求1所述的檢測楊樹潰瘍病病原真菌的基因晶片，其特徵在於:所述載體為1.5mlEppendort離心管,晶片點制在截面了的底部內面。
3.根據權利要求1所述的檢測楊樹潰瘍病病原真菌的基因晶片，其特徵在於:所述寡核苷酸探針、雜交過程陽性對照及空白的點塗層呈陣列式分布在載體上。
4.根據權利要求3所述的檢測楊樹潰瘍病病原真菌的基因晶片，其特徵在於:所述載體上的陣列式分布布局為如圖1所示的布局，I平方毫米麵積中點陣為14X 14，圖中al-al4和bl-bl4組合示表1中的晶片點陣行列，阿拉伯數字表示位於該點上的探針ID。
5.權利要求1~4中任一項所述的檢測楊樹潰瘍病病原真菌的基因晶片在檢測楊樹潰瘍病病原真菌中的應用。
6.根據權利要求5所述的應用，其特徵在於:具體應用方式如下: (一)樣品製備:提取待檢測物的真菌DNA，然後利用真菌特異性引物多重PCR擴增和生物素螢光標記DNA，得標記的DNA擴增產物，用於下述雜交反應； (二)雜交反應:取上述標記的DNA擴增產物，與雜交液混合，加樣於晶片的點樣區，雜交反應；雜交反應後，洗去雜交液； (三)信號檢測和結果分析:向晶片中加入辣根過氧化物酶，洗去未反應的辣根過氧化物酶；再加入底物四甲基對聯苯二胺，則辣根過氧化物酶將底物轉化成藍色沉澱，洗去未反應的底物四甲基對聯苯二胺；檢測沉澱及其分布的位置，判斷待檢測物中是否含有楊樹潰瘍病病原真菌，判斷依據為:若晶片上有藍色沉澱，則待檢測物中含有楊樹潰瘍病病原真菌，反之則無；並可根據寡核苷酸探針的陣列式分布判斷出待檢測物中含有哪種楊樹潰瘍病病原真菌。
7.根據權利要求6所述的應用，其特徵在於:所述步驟(一)中，DNA提取採用常規 CTAB 法，具體為:2 X CTAB 緩衝液:2 % CTAB, 200mmol/L Tris-HCl (pH8.0)，50mmol/LEDTA(pH8.0)，1.4mol/L NaCl,2% PVP,0.5% β -巰基乙醇；10XCTAB 提取液:10% CTAB,0.7mol/L NaCl，其餘同CTAB緩衝液；具體方法如下: (1)取冷凍乾燥菌絲0.05g放入2mL離心管，用研磨杵研磨至粉末； (2)加入lmL65°C預熱的2X CTAB緩衝液和20 μ L β -巰基乙醇，放入65°C的水浴鍋中水浴60min ； (3)12000r/min離心，取上清液，放入新的離心管中，加入等體積的混合液(氯仿:異戍醇=24: I,體積比),上下顛倒2~3min,混勻，12000r/min離心1min ； (4)重複步驟(3)I~2次，直到界面層的沉澱物質很少後，進入下一步驟； (5)取上清液放入新的離心管中，加入上清液1/10體積的10XCTAB緩衝液，再加入等體積的混合液(Tris飽和酚:氯仿:異戊醇=25: 24: 1，體積比)，上下顛倒，混勻2~3min, 12000r/min 離心 1min ；
(6)取上清液放入新的離心管中，加入上清液1/10體積的醋酸鈉，再加入管液2~2.5倍體積的冰凍無水乙醇，沉澱DNA ；(7) lOOOOr/min 4°C離心10min，倒掉上清液，用70%酒精洗DNA 2~3次，37°C乾燥至無酒精味，加入150 μ L的Elut1n buffer溶解DNA，即為標記的DNA擴增產物。
8.根據權利要求6所述的應用，其特徵在於:所述步驟(一)中，特異性引物為ITSl/ITS4和EF1-728F/EF1-986R，反向引物5』端添加生物素標記。
9.根據權利要求6所述的應用，其特徵在於:所述步驟(一)中，PCR擴增條件如下:反應體積 50μ L，反應組分為:5μ L 1XEx Taq buffer (Mg2+), 4 μ L dNTP Mixture(各2.5mM) ,0.25 μ L Taq 酶(5U/μ L) (TaKaRa)，2 μ L 各正反向引物(10 μ Μ)，2 μ L DNA 模板，滅菌水補足50 μ L ?』參考Fujita(2001)反應程序修改為:94°C預變性4min，94°C變性30s，55.6°C退火30s，72。。延伸lmin，31個循環，最後72°C延伸4min。
10.根據權利要求6所述的應用，其特徵在於:所述步驟(二)、(三)具體步驟如下: (1)提前預熱熱混儀到55°C，加入10μ L標記的DNA擴增產物，再加入90 μ L的Cl，混勻，得雜交混合液； (2)取出管芯，加入200μ L去尚子水，用槍頭混勻，不要碰到管芯底部； (3)棄去步驟(2)中的去離子水，加入10yL的Cl，55°C，550rpm羽化2min; (4)棄去步驟(3)中的Cl，將步驟(1)中的10yL雜交混合液轉移到管芯中，避免泡沫，蓋上蓋子，55 0C，550rpm, Ih ； (5)從恆溫振蕩器中取出管芯，將恆溫振蕩器調到30°C用於HRP-連接； (6)小心打開孔蓋，儘可能完全的棄去雜交液，加入200μ L的C2，小心混勻，棄去清洗液，重複兩次；
(7)加入100 μ L 的 C3-C4 混合液(C3: C4 = 1:100，體積比)30°C，550rpm，1min ; (8)棄去C3-C4混合液，加入200μ L的C5，清洗，棄去C5 ;再加入200 μ L的C5，清洗，棄去C5 ； (9)加入100μ L的D1，室溫放置5min,勿攪動，棄去Dl, ArrayTube 03設相分析(不能超過20min)； (10)利用IC0N0CLUST軟體進行分析數據； 所述(:1、02、03、(:4、05、01的含義如下: Cl:雜交緩衝液，組成為:1 % BSA 或 1XSSPE，10mmol/L NaHPO4,0.18mol/L NaCl，lmmol/LEDTA,餘量為水，pH7.4 ；其中，IXSSPE 的組成為:150mM NaCl，1mM sodiumphosphate, ImM EDTA,餘量為水； C2:衝洗液I，組成為:2XSSC，0.2%十二烷基硫酸鈉或0.01% Trit1n x-100，餘量為水；其中，IXSSC的組成為:0.15M NaCl,0.0015M檸檬酸鈉，餘量為水，pH7.0 ;
C3:HRP 連接液 100，10pg/ μ I ； C4:連接緩衝液，組成 為:6XSSPE,0.05% Trit1n χ-100，餘量為水；其中，6XSSPE的組成為:60mM 磷酸鈉，1.08M NaCl, 6mM EDTA，餘量為水，ρΗ7.4 ； C5:衝洗液 II，組成為:2XSSC,0.01% Trit1n x-100，餘量為水；
Dl:Horseradish Peroxidase substrate TMB0
【文檔編號】C40B40/06GK104131115SQ201410422977
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年8月26日 優先權日:2014年8月26日
【發明者】嚴東輝, 張星耀, 趙文霞, 馮小慧, 李永, 賈秀貞 申請人:嚴東輝