產黃青黴工程菌及其在生產7－氨基－3－脫乙醯氧基頭孢烷酸的應用的製作方法

2024-03-26 05:48:05

專利名稱：產黃青黴工程菌及其在生產7－氨基－3－脫乙醯氧基頭孢烷酸的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及β-內醯胺類抗生素的生產領域，特別是涉及產黃青黴工程菌及其在生產7-氨基-3-脫乙醯氧基頭孢烷酸(7-ADCA)的應用。
背景技術：
β-內醯胺類抗生素構成最重要的一類抗生素，具有悠久的臨床應用歷史。這類抗生素中，突出的有青黴素類半合成抗生素和頭孢菌素類半合成抗生素。合成這些抗生素的主要起始原料為6-氨基青黴烷酸(6-APA)、7-氨基頭孢烯酸(7-ACA)和7-氨基-3-脫乙醯氧基頭孢烷酸(7-ADCA)。產黃青黴菌發酵生產得到青黴素，從而可製得6-APA；7-ACA由頭孢菌素C製得，頭孢菌素C則通過產黃頂頭孢菌發酵產生，頭孢菌素C在任何pH下都非常易溶於水，所用的柱層析分離技術操作繁瑣、成本昂貴，而且工藝周期長，從而增加了成本。
7-ADCA是製造頭孢氨苄、頭孢羥氨苄、頭孢拉定等半合成頭孢菌素的重要中間體，與7-ACA相比，在3位消除了不穩定的乙醯氧基。它可由價廉易得的青黴素G(或V)經酯化、擴環重排、酶解去側鏈而得。其反應過程包括青黴素G在低溫下經過氧乙酸氧化後用雙-三甲基矽脲進行酯化保護；吡啶和溴乙醯作用下加熱進行開環、脫水、分子重排產生6-元的頭孢菌素環結構；水解去三甲基矽後醯化酶水解脫側鏈得到7-ADCA。
產黃青黴菌(Penicillium chrysogenum)不能直接發酵得到頭孢菌素環結構，但來自帶小棒鏈黴菌(Streptomyces clavuligerus)的青黴素N擴環酶可以進行這種環擴張，當被引入產黃青黴菌後，它能將青黴素環結構轉變為頭孢菌素環結構，如Cantwell等在Proc.R.Soc.Lond.B.248(1992)，283-289；及EP-A-05 32341和EP-A-0540210中所述。在EP-A-05 32341中描述了擴環酶結合己二酸作為原料在產黃青黴中的應用，5-羧基戊醯側鏈作為產黃青黴中醯基轉移酶的底物，這導致形成5-羧基戊醯-6-APA，後者通過引入產黃青黴菌中的擴環酶產生5-羧基戊醯-7-ADCA，最後去除5-羧基戊醯側鏈生成終產物7-ADCA；EP-A-05 40210描述了製備7-ACA的相似方法，但上述專利由於沒有認識到擴環酶在細胞中與醯基轉移酶同時表達的問題，所提供的方法不夠經濟有效。
ZL94192932.9和ZL94192933.7描述了補加兩種不同的前體3，3』-硫代二丙酸和3』-羧甲硫基丙酸，並結合擴環酶和醯基轉移酶的同時表達，來生產7-ADCA的方法，在實用化上前進了一步，但由於需要補加特殊而且昂貴的前體，使生產成本高。

發明內容
本發明的目的是提供一株能用於生產7-ADCA的產黃青黴工程菌。
本發明所提供的產黃青黴工程菌是產黃青黴菌(Penicillium chrysogenum)，該菌株已於2003年09月27日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC № 1018。
本發明所提供的產黃青黴工程菌在YPD培養基上生長良好。菌落直徑為1.1-1.3釐米。菌落周圍有一圈白邊、圓形，周邊飽滿；中間隆起、灰綠色，孢子豐富。菌落隆起部位的中央有凹陷。
在選育工程菌的過程中，本發明發明人構建了兩個新的載體產黃青黴菌的重組載體pPIPKA，是利用載體pGEM-T與啟動子Pipns序列酶切、連接，得到載體pGEM-T/Pipns；然後將載體pGEM-T/Pipns與載體pCR4Blunt-TOPO、pPICZA酶切、連接，構建得到的；和產黃青黴菌的表達青黴素N擴環酶基因的重組表達載體pPCE9，是將青黴素N擴環酶基因cefE與啟動子Pipns序列連接，然後與重組載體pPIPKA酶切、連接，構建得到重組表達載體pPCE9，這兩個載體也屬於本發明的保護範圍。
本發明的另一個目的是提供一種生產7-氨基-3-脫乙醯氧基頭孢烷酸(7-ADCA)的方法。
本發明所提供的生產7-氨基-3-脫乙醯氧基頭孢烷酸的方法，包括1)發酵產黃青黴菌(Penicillium chrysogenum)CGMCC № 1018，從發酵液中提取5』-羥基-N-己二醯基-7-氨基-3-脫乙醯氧基頭孢烷酸；2)將5』-羥基-N-己二醯基-7-氨基-3-脫乙醯氧基頭孢烷酸製備成7-ADCA。
其中，步驟1)所述的提取步驟可以採用兩種方法第一種，採用有機溶劑萃取法在發酵液中加入萃取劑，調節pH值至1-2，分離有機相；然後在有機相中加水，調節pH值至6-7，分離水相，得5』-羥基-N-己二醯基-7-氨基-3-脫乙醯氧基頭孢烷酸；所述萃取劑為正丁醇、異丙醇或乙酸乙酯。
第二種，採用大孔吸附樹脂提取法將發酵液調節pH2-3，酸化、過濾除蛋白，清液用大孔吸附樹脂吸附，洗脫得到5』-羥基-N-己二醯基-7-氨基-3-脫乙醯氧基頭孢烷酸。
常用的大孔吸附樹脂有XAD-16、XAD-1600、SP-207等，一般以pH7-8乙酸鈉溶液作為洗脫劑，即可得到5』-羥基-N-己二醯基-7-氨基-3-脫乙醯氧基頭孢烷酸。
步驟2)所述的5』-羥基-N-己二醯基-7-氨基-3-脫乙醯氧基頭孢烷酸製備成7-ADCA，也有兩種方式第一種，化學法將5』-羥基-N-己二醯基-7-氨基脫乙醯氧基頭孢烷酸在五氯化磷、吡啶的甲醇溶液中反應1-2h，得到7-ADCA。製備過程的反應溫度可以選擇-40--20℃。
第二種，酶法a)將所得5』-羥基-N-己二醯基-7-氨基-3-脫乙醯氧基頭孢烷酸溶解於含有偏亞硫酸鈉的磷酸鹽緩衝液中，在25-30℃、pH6.5條件下通入氧氣用固定化D．胺基酸氧化酶催化氧化，過濾得到戊二醯-7-ADCA溶液；b)向所得戊二醯-7-ADCA溶液中加入固定化GL-7-ACA醯化酶，在25-30℃、pH8條件下催化醯化，得到7-ADCA。
酶法中步驟a)所述氧氣的通氣流量通常控制在0.1-0.5L/min之間。在酶法製備過程中一般採用濃度為5％的氨水控制反應pH，使反應pH在酶催化反應過程中能比較穩定。
本發明的產黃青黴工程菌選擇青黴素N合成酶基因的調控元件進行驅動，從而使該基因能在最佳時間範圍內表達，提高了青黴素分子擴環反應的效率，使得在發酵培養基中不需要補加前體，直接發酵得到5』-羥基-N-己二醯基-7-氨基-3-脫乙醯氧基頭孢烷酸，所得到的發酵產物經過化學法或酶法脫去其側鏈，即可製備得到7-ADCA，簡化了7-ADCA的製備工藝，降低了其生產成本。本發明工程菌培養條件簡單，表達量高，一般可得到2.2g7-ADCA/L發酵液，可廣泛用於抗生素生產工業。


圖1為質粒pPIPKA的物理圖譜；圖2為質粒pPCE9的物理圖譜；圖3為工程菌發酵產物的紅外光譜圖；圖4為工程菌發酵產物的紫外光譜圖；圖5為工程菌發酵產物的1H核磁共振譜；圖6為工程菌發酵產物的13C核磁共振譜；圖7為工程菌發酵產物的13C核磁共振譜通過DEPT譜；圖8為工程菌發酵產物的13C核磁共振譜通過HMQC譜；圖9為工程菌發酵產物的低分辨質譜；圖10為工程菌發酵產物的高分辨質譜；圖11為工程菌發酵產物的1H-1H COSY譜；圖12為工程菌發酵產物的HMBC圖譜；圖13為工程菌發酵產物的化學結構式；圖14A為產黃青黴基因工程菌CGMCC № 1018發酵產物HPLC圖譜；圖14B為產黃青黴菌ATCC10003(X-1612)發酵產物HPLC圖譜；圖15A為產黃青黴基因工程菌CGMCC № 1018發酵產物青黴素酶消化後的HPLC圖譜；圖15B為產黃青黴基因工程菌CGMCC № 1018發酵產物頭孢菌素酶消化後的HPLC圖譜。
具體實施例方式
除有特別說明外，本發明中所用的試劑均為市售分析純試劑，購自天津試劑公司。
實施例1、產黃青黴工程菌(Penicillium chrysogenum)CGMCC № 1018的選育酵母表達載體pPICZA和原核生物基因克隆載體pCR4Blunt-TOPO均購自Invitrogen公司。產黃青黴細胞壁裂解酶Novozyme234購自Sigma公司。
同源性選擇性標記，如amdS基因、胺基酸或核苷酸營養缺陷型互補基因等，和異源性選擇標記基因，如腐草黴素抗性的編碼基因或寡黴素抗性的編碼基因等，都可用於轉基因陽性克隆的選擇。本發明選用腐草黴素抗性的編碼基因作為篩選標記，腐草黴素抗性的編碼基因Shble來自於酵母表達載體pPICZA。在該載體中，Sh ble基因受酵母的TEF1(Transcription elongation factor 1)啟動子和原核啟動子EM7的雙重調控，3』端則為酵母CYC1基因的終止序列(cyc1TT)，抗性基因既可以在大腸桿菌也可以在酵母細胞中表達，可分別用於原核及真核篩選。為了在產黃青黴中應用該抗性，需引入能被絲狀真菌產黃青黴RNA聚合酶識別的啟動子。
異青黴素N合成酶(IPNS)基因pcbC的啟動子Pipns、醯基轉移酶(AT)基因penDE啟動子Pat、構巢麴黴(Aspergillus nidulans)磷酸甘油激酶基因gpdA的啟動子PgpdA、構巢麴黴(Aspergillus nidulans)色氨酸合成酶基因trpC的啟動子PtrpC、粗糙脈胞黴(Neurospora crassa)交叉途徑控制基因(cpc-1)的啟動子Pcpc-1等都可用於啟動選擇性標記基因的表達。本發明選用產黃青黴中異青黴素N合成酶(IPNS)基因pcbC的啟動子Pipns。
1、基因克隆和基因轉化載體的構建將產黃青黴菌ATCCl0003(X-1612)培養在YPD(1％酵母提取物，2％蛋白腖，2％葡萄糖)培養基中培養24h，菌絲過濾後，加液N2磨碎，用Easy-DNA kit(Invitrogen公司，K1800-01)提取得到產黃青黴基因組DNA。
帶小棒鏈黴菌ATCC 27064在YD(1％酵母萃取液，1％葡萄糖)培養液中生長24h，提取該菌株的染色體DNA。
根據文獻(Carr et al.，1986，Gene 48257～266)，以pip1(SEQ ID NO.6)5』-TCGCGGATCCTGTCCCTAGTGCTGGGCTTGAAGTATG-3』和pip2(SEQ IDNO.7)5』-TGGAAGCCATGGTGTCTAGAAAAATAATGGTGAAAACT-3』為引物，以產黃青黴ATCC10003(x-1612)菌株基因組DNA為模板，進行PCR擴增，PCR條件為94℃，5分；94℃1分，62℃1分，72℃1.5分-30循環；72℃7分；4℃保存。將PCR產物採用常規方法克隆測序，結果表明克隆產物具有序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列，長度為1168bp，和文獻報導基本一致，只在589位由G變為A，證明得到了Pipns序列。在克隆得到的1.16kb Pipns序列5』和3』端分別引入BamH I和NcoI酶切位點，然後用DNA連接酶與pGEM-T載體(Promega公司，A1360)在16℃溫度下連接12小時，得到質粒pGEM-T/Pipns。
以pCR4Blunt-TOPO質粒為模板，利用引物pk1(SEQ ID NO.2)5』-TGA AGCTTG TCA GCT ACT GGG CTA TCA GGA C-3』、pk2(SEQ ID NO.3)5』-ACA GATCTA AAG TGC CAC CTG TAT GCG GTG TG-3』，進行PCR擴增得到卡那黴素的抗性基因(kanr)，並在其5』端和3』端分別引入Hind III、BglII酶切位點。
pPICZA質粒用Hind III/Bgl II雙酶切後回收2.46kb片段，與經過同樣酶切的kanr片段在16℃連接12小時，得到pPICZA/kan質粒，然後採用CaCl2轉化法轉化大腸桿菌DH5α，篩選同時具有卡那黴素和腐草黴素抗性的陽性克隆，從中提取pPICZA/kan質粒。
pPICZA/kan質粒經BamH I/Nco I部分消化，回收3.1kb片段。pGEM-T/Pipns同樣用BamH I/Nco I酶切，回收1.16kb片段。將兩片段在16℃連接12小時，得到產黃青黴的轉化載體，定名為pPIPKA，其物理譜圖如圖1所示。
根據帶小棒鏈黴菌(Streptomyces clavuligerus)的青黴素N擴環酶基因(cefE)序列(Kovacevic et al.J Bacteriol.(1984)，754-760)，設計引物CEF1(SEQ ID NO.4)5』-GTGAGAGTCCATGGACACGACGGTGCCCACCTTCAGCCTG-3』CEF2(SEQ IDNO.5)5』-TTAGATAAGCTTCGCCTTGACCGCGGTGAGGTCGACTC-3』。
用帶小棒鏈黴菌染色體DNA為模板，以CEF1、CEF2為引物進行PCR擴增，得到0.9kb PCR產物，該PCR產物為cefE開放閱讀框，其5』端引入了Nco I內切酶位點，3』端引入了Hind III內切酶位點。
將棒狀鏈黴菌的擴環酶基因cefE經Nco I酶切，然後與經過同樣酶切處理的Pipns序列(帶有BamH I和Nco I酶切位點)在16℃下連接12小時，得到表達盒pcef；然後將連接產物經BamH I/Hind III雙酶切，與同樣經BamH I/Hind III雙酶切的質粒pPIPKA連接，得到產黃青黴菌的表達載體pPCE9，其物理譜圖如圖2所示。
在構建載體的過程中，酶切、回收、克隆、連接等操作均按照常規的分子生物學實驗方法進行。
2、產黃青黴菌的轉化與陽性克隆的篩選採用Ca-PEG介導的原生質體轉化法來轉化細胞。具體操作按Cantoral的方法(Bio/Technol.1987，5494-497)進行，用pPCE9載體轉化產黃青黴ATCC10003。陽性克隆在含有平陽黴素的YPD選擇性培養基中篩選，得到產黃青黴工程菌(Penicilliumchrysogenum)CGMCC № 1018。單一的穩定菌落用於製備孢子並篩選含有cefE表達盒的轉化子，平陽黴素抗性菌落的菌體以Novozyme234消化，用苯酚抽提後作為PCR模板，所用引物為CEF15′--GTG AGA GTC CAT GGA CAC GAC GGT GCC CAC CTT CAGCCT G--3′和CEF25′—TTA GAT AAG CTT CGC CTT GAC CGC GGT GAG GTCGAC TC--3′，擴增產物經酶切分析，證明該菌體含有cefE表達盒。
實施例2、產黃青黴工程菌(Penicillium chrysogenum)CGMCC № 1018的發酵及發酵產物結構鑑定一、產黃青黴工程菌發酵將產黃青黴工程菌(Penicillium chrysogenum)CGMCC № 1018以2×106分生孢子/ml接種到種子培養基，26℃培養48小時。種子培養基配方(g/l)葡萄糖，30；乳糖，10；棉籽餅粉，10；酵母粉，10；玉米漿，10；(NH4)2SO4，2；KH2PO4，1；CaCO3，5；pH5.8。
然後將種子培養物以5％接種量接種到發酵培養基，26℃培養144小時。發酵培養基培養為(g/l)乳糖，120；棉籽餅粉，30；玉米漿，20；(NH4)2SO4，5；KH2PO4，1；K2SO4，5；CaCO3，10；pH6.5。
發酵結束後，離心發酵液以8000g離心力離心15分鐘除去菌絲體，得到工程菌發酵上清液。
二、發酵產物鑑定1、發酵產物的酶解分析按步驟一的發酵條件發酵產黃青黴ATCC10003(X-1612)，得到宿主菌發酵上清液。
將所得工程菌上清液和宿主菌上清液以表1中的條件進行HPLC分析，分別如圖14A和圖14B所示，結果表明工程菌比宿主菌在保留時間為16.8分鐘處多了一個洗脫峰，說明工程菌比宿主菌多一個發酵產物。
表1 目的產物HPLC分析條件


已知青黴素酶可特異水解青黴素的內醯胺環，頭孢菌素酶可特異水解頭孢菌素的內醯胺環。按表2所列的條件以青黴素酶和頭孢菌素酶於25℃，1小時分別水解發酵產物，然後進行HPLC分析，其色譜圖分別如圖15A和圖15B所示，結果表明青黴素酶消化的發酵液與沒加酶處理的對照發酵液的HPLC圖譜相同，而頭孢菌素酶消化的發酵液保留時間為16.8分鐘的洗脫峰消失，這表明基因工程菌發酵液中新得到的發酵產物是青黴素環擴環產物。
表2 發酵液酶處理條件

2、發酵產物結構分析1)發酵產物的提取將600ml正丁醇加入到120ml工程菌發酵液中，在劇烈攪拌的情況下用濃度為8.5g/ml的磷酸調pH1-2，靜置，分相，得到560ml正丁醇相。在正丁醇相中加入400ml蒸餾水，在劇烈攪拌的情況下用濃度為1M的NaOH調pH6-7，靜置，分相，水相在30℃熱浴下濃縮至幹，得深色粘稠狀固體粗品。
粗品以少量DMSO溶解，經高速離心後直接用於HPLC製備，HPLC條件如表3。
表3 HPLC純化條件


收集保留時間為8.4分鐘的洗脫液，然後在30℃熱浴下濃縮至幹，得到白顏色或淡黃色固體。固體產物用DMSO溶解，依表4的HPLC條件進行進一步純化，收集保留時間為7.3分鐘的洗脫液，濃縮得到25mg純品。
表4 HPLC純化條件

2)產物質譜解析儀器低分辨質譜JC-MS DX-300Autospec-Ultima-TOf高分辨質譜APEX II FT-ICRMS(Bruker Dallonics.Inc)條件a)低分辨FAB-MS NBA+Glycerolb)高分辨P-SIMS-Glycerol(+NaCl)結果分別如圖9、圖10所示。
a)低分辨質譜出現3個離子碎片M/Z 解析359.1(M+H)185.16元環部分158.0己二醯-7-氨基部分b)高分辨M+Na(m/z)為381.0726793，由高分辨質譜得知，該化合物的分子式為C14H18N2O7S·Na，按分子式C14H18N2O7S·Na計算理論值應為381.0732，誤差1.4ppm。
由此判斷該化合物可能是5』-羥基-N-己二醯基-7-氨基-3-脫乙醯氧基頭孢烷酸，分子式C14H18N2O7S，分子量按國際原子量表計算分子量為358.3722。
3)產物紅外吸收光譜儀器Nicolet Magna-IR 550型傅立葉紅外光譜儀，測定條件KBr壓片。波數用聚苯乙烯薄膜校正，該化合物的紅外光譜圖如圖3所示，測定數據及解析見表5。
表5 紅外光譜數據及解析

4)產物紫外吸收光譜儀器美國Beckman DU-640紫外分光光度計溶劑水，供試液濃度99.0×10-3g/100ml紫外光譜圖如圖4所示。
樣品的UV光譜圖表明該物質的最大吸收波長λ＝257nm，在200nm處有末端吸收。
5)產物1H核磁共振譜儀器Varian INOVA-500型核磁共振譜儀溶劑DMSO1H-NMR譜如圖5所示。
1H-NMR譜解析該化合物1H-NMR譜中有10個信號，根據氫．氫化學位移相關譜(1H-1H COSY)實驗(結果如圖11所示)，對各質子進行了歸屬，結果如表6所示。圖譜中所有信號的化學位移及多重性(裂分方式及偶合常數)均與圖13所確定的結構式相吻合，結構式中各原子的編號見圖13。
表 6產物1HNMR數據及各質子歸屬(DMSO，500MHZ)

6)產物13C核磁共振譜儀器Varian INOVA-500核磁共振譜儀溶劑DMSO13C核磁共振譜如圖6所示。
3C核磁共振譜解析在13C NMR圖譜中共出現14個信號，通過如圖7的無畸變極化增益法譜(DEPT譜)和圖8的異核多量子相干譜(HMQC譜)，對各個信號進行了歸屬，各碳原子的歸屬見表7，解析過程詳見綜合解析。從DEPT圖譜上可看出有1個甲基，4個亞甲基，3個次甲基，6個季碳。
表7 產物13CNMR數據及歸屬(DMSO，125MHZ)

7)產物綜合解析由高分辨質譜得知，該化合物的分子式為C14H18N2O7S。由DEPT譜得知化合物中有1個CH3、4個CH2、3個CH、6個季碳，這與5』-羥基-N-己二醯基-7-氨基脫乙醯氧基頭孢烷酸結構式中的碳個數和碳的種類完全一致。
由圖11的1H-1HCOSY譜可對1HNMR中的各質子信號進行歸屬，結果如表5所示。最高場1.5-1.6ppm多重峰信號分別與2.18ppm、3.87ppm處的多重峰信號偶合，並同時有自身偶合，說明1.5-1.6ppm信號為3』、4』位上的亞甲基，2.18ppm處的信號為2』位亞甲基，3.87ppm處的多重峰為5』次甲基；出現在高場2.0ppm的最強信號為3位甲基峰；出現在3.29ppm和3.51ppm處的兩個雙峰之間的偶合常數為18Hz，屬於同碳偶合，歸屬於2位亞甲基兩個不等價的氫。出現在5.52ppm處的質子同時與4.98ppm以及8.74ppm兩處的信號相偶合，說明該信號為7位次甲基，與相鄰6位次甲基(4.98ppm)偶合常數為4.5，而與相鄰的-NH-(8.74ppm)偶合常數為8.5。
該化合物碳譜中共有14個碳信號，通過HMQC實驗，由氫的歸宿確認與氫直接相連的碳，對碳原子進行歸屬，結果見表8。
表8 產物碳-氫相關關係

最終用如圖12所示的異核多鍵相干譜(HMBC)實驗，不但對季碳原子進行了解析和歸屬，而且證實了所有碳氫原子的歸屬。出現在較高場的兩個季碳信號(122.835ppm、129.992ppm)與2位氫有遠程偶合，因此，可以推斷122.835ppm、129.992ppm兩處的季碳為3、4位季碳；與6位氫和7位氫均有遠程偶合的季碳為8位羰基季碳(164.54ppm)；與2』位氫(2.19ppm)、3』位氫(1.5～1.6ppm)以及7位氫(5.52ppm)均有遠程偶合的季碳為1』位羰基季碳(172.979ppm)；與4』位氫(1.5～1.6ppm)、5』位氫(3.87ppm)同時有遠程偶合的季碳為6』位羰基季碳(175.737ppm)；最後只剩下4位上的羧基季碳(163.556ppm)，由於該季碳與周圍任何氫相距較遠，不能產生偶合。
綜上所述，該化合物各碳氫圖譜上的信號都得到了合理的歸屬，由此可以推斷該化合物的結構式如圖13所示，中文名5』-羥基-N-己二醯基-7-氨基-3-脫乙醯氧基頭孢烷酸英文名5』-hydroxy-N-hexanedioyl-7-amino-3-deacetoxy cephalosporanic acid實施例3、5』-羥基-N-己二醯基-7-氨基-3-脫乙醯氧基頭孢烷酸的分離及化學法製備7-ADCA
按照實施2的方法發酵產黃青黴工程菌(Penicillium chrysogenum)CGMCC №1018，發酵結束後，1升發酵液過濾除去菌絲體；菌體以水洗並與濾液合併得到1.5升濾液。濾液經10％H2SO4水溶液酸化到pH1.5左右，加入2/3體積的丁醇，充分混勻，靜置分相。水相以丁醇重複提取1次。合併有機相後用活性炭脫色，以pH2的水洗，再以0.2升2mol/L NaOH提取，靜置分相，無水硫酸鈉乾燥得到5』-羥基-N-己二醯基-7-氨基-3-脫乙醯氧基頭孢烷酸。
將所得5』-羥基-N-己二醯基-7-氨基-3-脫乙醯氧基頭孢烷酸加入到7ml五氯化磷、吡啶的甲醇溶液(其中，含有1g五氧化磷和2ml吡啶)中，於-30℃反應2小時脫去側鏈。然後以3份100ml飽和丁醇水溶液於pH0.4條件下提取，提取液以NaOH中和，7-ADCA從水相中結晶析出。晶體過濾，水洗，乾燥，得到1.1克純度為95％的7-ADCA。
採用下面的HPLC方法進行檢測，結果與購自華北製藥集團倍達有限公司的7-ADCA保留時間一致。分析方法HPLC色譜柱Inertsil C184.6×250mm，5μm；流速1.0mL/min；流動相梯度洗脫，A相pH4.00.015M NH4Ac，HAc調pH，B相甲醇，梯度曲線為0min98％A2％B；10min90％A 10％B；20min85％A 15％B；25min5％A 95％B。
實施例4、5-羥基-N-己二醯-7-ADCA和己二醯-7-ADCA酶法製備7-ADCA1、發酵液中提取5-羥基-N-己二醯-7-ADCA和己二醯-7-ADCA由於發酵液中組分雜、雜質多，採用大孔樹酯(SP207購自北京綠百草科技發展有限公司)吸附法分離。
取1L工程菌發酵液，用20％H2SO4調節pH2.5，酸化4h，加硅藻土助濾，除去蛋白得到5-羥基-N-己二醯-7-ADCA(adi-OH-7-ADCA)的清液；清液用大孔吸附樹酯吸附，再用pH＝8的乙酸鈉溶液解吸，液相監測得到5-羥基-N-己二醯-7-ADCA和己二醯-7-ADCA(adi-7-ADCA)這兩種純的組分溶液，旋轉蒸發儀蒸乾得adi-OH-7-ADCA和adi-7-ADCA。
2、將adi-OH-7-ADCA或adi-7-ADCA氧化為戊二醯-7-ADCA(gl-7-ADCA)在100ml三口燒瓶中，取1g adi-OH-7-ADCA或adi-7-ADCA溶解在含0.013g偏亞硫酸鈉鹽的40ml 25mM磷酸鉀緩衝液中，加入固定化氧化酶(D-Amino acidoxidase，購自SIGMA公司)。在溫度25-30℃下攪拌，並向反應器中通入氧氣進行反應，氧氣的通氣量為0.3L/min，用5％的氨水控制反應液pH7.5，反應75min後，反應體系pH基本不再變化，過濾得到含有gl-7-ADCA的反應液。
3、gl-7-ADCA到7-ADCA的生物轉化以上得到的gl-7-ADCA反應液中加入固定化醯化酶(長沙福來格生物技術有限公司)，在25-30℃下攪拌反應，用5％氨水控制pH8.0，反應120min後，pH基本穩定，過濾並用少量水洗滌，得到7-ADCA溶液。
4、7-ADCA的結晶得到的7-ADCA溶液用1g活性炭室溫攪拌15min，過濾除去炭，用少量水洗滌；濾液用6N硫酸調節pH4.5，緩慢攪拌15min以便養晶，用冰水浴降溫並保持在5℃以下，最後再調到pH3.5-3.7，2h後過濾得晶體，用少量水洗滌，產物結晶率95％，晶體純度含量在99％以上。
所得產物核磁和HPLC分析，其保留時間與購自華北製藥集團倍達有限公司的7-ADCA一致，證明所得產物即為7-ADCA，每升發酵液可以得到2.2g7-ADCA。
序列表160721012111168212DNA213產黃青黴菌(Penicillium chrysogenum)4001ggatcctgtc cctagtgctg ggcttgaagt atgccattgc tgggtttgat ggtcccattt 60ttcacactcg agctcccact ggcgttcagg gatgtagtgg ccgagaagcc tatcggcgtg120gttccgttcg gtggcttcag ttgagtcatg tctgtcaatg accaataatt ggtagggacg180gatcggatgc aacaacaagt gttagaaaaa acgcaatcac agacaagctc gaggggaatt240ccttatactg ggcctgctgc attggtctgc cattgcaggg tatatatggc tgacctggcc300aatctccatc gagaatctgg gcgactgaag cactgcccgc agacaagatg gagactttcg360tctagcacgg tctagggcag atccgatgcc attggctctg tcaactgtcg actacatgta420tctgcatgtt gcatcgggaa atcccaccac agggacagcc aagcggcccc gcgacttggc480agtgggcaaa ctacgcccga ttctggtgcc aagaaccgag aagaatgaga cagacccacg540ttgcactcta accggatgct atcgacttac ggtggctgaa gattcaacac gctgcaacga600gagccaaggt ggtccggaca ttttctacgt gccggtttac cttggaacat cgccgtcgtt660gagtgcacgt tgcctactct ctcgtggctt ggctgggccc acgagcccga ttgactcgac720ggtgttactt gggtatctat ggccccgttt tctggcacgg taatgataag tacttactag780tcttcgagcg ggggagtgtt gctctgcccg agcatcaacg attggcctga tcgcaccgtc840tgcaaatgcc acggtgcgga ccgactgaaa tctcagacca ccaaagaccc tccgacttcg900agatacggtt actaatttta cactggctcc agcggcccca tccagtaagc atctgggctg960caagcgtata atgtctccag gttgtctcag cataaatacc ccgcccccgc tcaggcacac 1020aggaagagag ctcaggtcgt ttccattgcg tccatactct tcactcattg tcatctgcag 1080gagaacttcc cctgtccctt tgccaagccc tctcttcgtc gttgtccacg ccttcaagtt 1140ttcaccatta tttttctaga caccatgg 1168210221131212DNA213人工序列220
223
4002
tgaagcttgt cagctactgg gctatcagga c31210321132212DNA213人工序列220
223
4003acagatctaa agtgccacct gtatgcggtg tg 32210421140212DNA213人工序列220
223
4004gtgagagtcc atggacacga cggtgcccac cttcagcctg 40210521138212DNA213人工序列220
223
4005ttagataagc ttcgccttga ccgcggtgag gtcgactc 38210621137
212DNA213人工序列220
223
4006tcgcggatcc tgtccctagt gctgggcttg aagtatg 37210721138212DNA213人工序列220
223
4007tggaagccat ggtgtctaga aaaataatgg tgaaaact 38
權利要求
1.產黃青黴菌(Penicillium chrysogenum)CGMCC№1018。
2.一種產黃青黴菌的重組載體pPIPKA，是利用載體pGEM-T與啟動子Pipns序列酶切、連接，得到載體pGEM-T/Pipns；然後將載體pGEM-T/Pipns與載體pCR4Blunt-TOPO、pPICZA酶切、連接，構建得到重組載體pPIPKA。
3.一種產黃青黴菌的表達青黴素N擴環酶基因的重組表達載體pPCE9，是將青黴素N擴環酶基因cefE與啟動子Pipns序列連接，然後與權利要求2所述的重組載體pPIPKA酶切、連接，構建得到重組表達載體pPCE9。
4.權利要求1所述產黃青黴菌的應用，為一種生產7-氨基-3-脫乙醯氧基頭孢烷酸的方法，包括1)發酵產黃青黴菌(Penicillium chrysogenum)CGMCC №1018，從發酵液中提取5』-羥基-N-己二醯基-7-氨基-3-脫乙醯氧基頭孢烷酸；2)將5』-羥基-N-己二醯基-7-氨基-3-脫乙醯氧基頭孢烷酸製備成7-ADCA。
5.根據權利要求4所述的應用，其特徵在於，步驟1)所述的提取是指在發酵液中加入萃取劑，調節pH值至1-2，分離有機相；然後在有機相中加水，調節pH值至6-7，分離水相，得5』-羥基-N-己二醯基-7-氨基-3-脫乙醯氧基頭孢烷酸；所述萃取劑為正丁醇、異丙醇或乙酸乙酯。
6.根據權利要求4所述的應用，其特徵在於步驟1)所述提取是指將發酵液調節pH2-3，酸化、過濾，清液用大孔吸附樹脂吸附，洗脫得到5』-羥基-N-己二醯基-7-氨基-3-脫乙醯氧基頭孢烷酸。
7.根據權利要求6所述的應用，其特徵在於所述洗脫採用pH7-8乙酸鈉溶液。
8.根據權利要求4-7任一所述的應用，其特徵在於，步驟2)所述的製備是指將所述的5』-羥基-N-己二醯基-7-氨基脫乙醯氧基頭孢烷酸在五氯化磷、吡啶的甲醇溶液中反應1-2h，得到7-ADCA。
9.根據權利要求8所述的應用，其特徵在於反應溫度為-40--20℃。
10.根據權利要求4-7任一所述的應用，其特徵在於，步驟2)所述的製備具體包括a)將所得5』-羥基-N-己二醯基-7-氨基-3-脫乙醯氧基頭孢烷酸溶解於含有偏亞硫酸鈉的磷酸鹽緩衝液中，在25-30℃、pH7.5條件下通入氧氣用固定化D-胺基酸氧化酶催化氧化，過濾得到戊二醯-7-ADCA溶液；b)向所得戊二醯-7-ADCA溶液中加入固定化GL-7-ACA醯化酶，在25-30℃、pH8條件下催化醯化，得到7-ADCA。
全文摘要
本發明公開了一種產黃青黴工程菌及其在生產7－氨基－3－脫乙醯氧基頭孢烷酸(7－ADCA)的應用，涉及β－內醯胺類抗生素的生產領域。本發明所提供的工程菌是產黃青黴菌(Penicillium chrysogenum)CGMCC №1018。本發明所提供的生產7－氨基－3－脫乙醯氧基頭孢烷酸的方法，包括1)發酵產黃青黴菌(Penicilliumchrysogenum)CGMCC №1018，從發酵液中提取5』－羥基－N－己二醯基－7－氨基－3－脫乙醯氧基頭孢烷酸；2)將5』－羥基－N－己二醯基－7－氨基－3－脫乙醯氧基頭孢烷酸製備成7－ADCA。本發明的產黃青黴工程菌直接發酵得到5』－羥基－N－己二醯基－7－氨基－3－脫乙醯氧基頭孢烷酸，經過化學法或酶法脫去其側鏈，即可製備得到7－ADCA，簡化了7－ADCA的製備工藝，降低了其生產成本。本發明工程菌培養條件簡單，表達量高，一般可得到2.2g7－ADCA/L發酵液。
文檔編號C12N15/79GK1807581SQ200510002430
公開日2006年7月26日 申請日期2005年1月21日 優先權日2004年1月30日
發明者徐平, 王富強, 任志紅, 牛長群, 周子振, 趙穎, 王紅怡, 代明偉, 夏紅雪, 王亞娟 申請人:華北製藥集團有限責任公司