一種生物材料和組織工程材料的製作方法

2023-12-02 08:09:36

專利名稱：一種生物材料和組織工程材料的製作方法
技術領域：
本發明屬於新型生物材料在組織工程中的應用領域。
目前可以作為組織工程的生物材料的可降解聚合物有許多種，其中聚乳酸(polylactic acid,PLA)和聚乙醇酸(polyglycolic acid,PGA)以其降解產物無毒和良好的生物相容性，已經被美國FDA批准廣泛用於臨床。雖然PLA,PGA在組織工程中應用較為廣泛，但仍然存在一些問題，如親水性不足，細胞粘附力較弱；易引起無菌炎症反應；機械強度不足等。聚羥基脂肪酸(Polyhydroxyalkanoate,PHA)是由生物合成的一類可降解的高分子聚合物，對其作為組織工程材料研究較多的是聚羥基丁酸(PHB)，羥基丁酸和羥基戊酸共聚物(Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)，或簡稱為PHBV)，由於具有較好的壓電效應，適合於用作骨組織工程細胞的外基質材料，但是可塑性和機械性能差等缺點限制了它們的廣泛應用。表面改性能夠增加表面的親水性，從而提高表面的生物相容性，如經過NaOH處理聚合物材料，親水性和生物相容性增加，但是其缺點是腐蝕性較強，容易引起材料的機械性能改變，影響組織功能的行使。
本發明的目的在於為克服已有的組織工程生物材料的不足之處，提出一種新型的PHA,3-羥基丁酸和3-羥基己酸共聚物(PHBHHx)用作為組織工程材料，具有一定的機械強度和良好的延展性，易加工成型；具有較好的表面親水性，利於組織細胞的粘附。
本發明還將PHBHHx引用PHB形成的共混物用作為組織工程材料，可以改善PHB的可塑性和機械性能，並通過調節PHBHHx與PHB在共混物中的比例適應不同組織結構的強度和韌性的需要；進一步，本發明應用脂肪酶對PHB、PHBHHx或其共混物材料進行表面改性的處理後用作為組織工程材料，可以提高細胞在聚合物表面的粘附和增殖。
本發明提出一種生物材料和組織工程材料，其特徵在於，所說的生物材料和組織工程材料為3-羥基丁酸和3-羥基己酸共聚物(PHBHHx)。
所說的生物材料和組織工程材料還可為PHBHHx與PHB形成的共混物。
本發明還提出以脂肪酶作為表面改性劑對PHBHHx或PHB/PHBHHx材料進行表面處理後用作為組織工程材料。其具體方法為根據處理對象的不同，可以選擇不同種類的脂肪酶，脂肪酶溶液的pH範圍為7.0-7.5，處理的溫度範圍為30-40℃。脂肪酶進行表面改性的處理方法時，將聚合物形成的膜完全浸泡於酶溶液中，恆溫保持24小時後，用去離子水反覆蕩洗，去除殘餘的酶液，乾燥。
本發明所述的生物材料與已有的應用於組織工程中的生物材料如PHB和聚乳酸PLA相比，具有以下特點(1)是完全由微生物合成的生物高分子材料；(2)具有較好的有機溶劑的溶解性；(3)具有較好的延展性，易加工成型；(4)具有較好的細胞相容性和生物可降解性；(5)分子量可通過發酵條件控制，從30,000到2,000,000道爾頓；(6)通過分子量還可以調節PHBHHx的降解速度；(7)與PHB共混形成的共混物，可進一步改變物理性能和生物相容性。
本發明中以脂肪酶作表面改性劑與已有的表面改性方法相比，具有以下特點(1)不使用腐蝕性強的溶劑，操作方法簡單，處理條件溫和；(2)使用的脂肪酶價格便宜，且用量不大。(3)脂肪酶對材料的表面改性作用溫和，不會影響材料的物理強度和其他機械性能。(4)對PHB和PHBHHx共混物的表面處理，細胞相容性的改變尤為明顯。
附圖簡要說明

圖1為脂肪酶Lipolase100T對PHB和PHBHHx共混物膜表面的細胞相容性的影響。對照樣品PLA。
圖2為脂肪酶Novozym398對L929細胞在PHBHHx與PHB共混物膜表面增殖。
實施例一細胞在PHBHHx膜表面的增殖細胞系小鼠成纖維細胞L929；膜表面細胞增殖測定的對照聚-L-乳酸(PLA)(分子量約為30~40萬)；本實施例的操作如下將純化的PHBHHx溶解於三氯甲烷，室溫下展膜，經冰凍乾燥去除殘餘在膜中的有機溶劑，乾燥，紫外照射過夜滅菌。取生長旺盛的L929細胞接種到膜表面，初始的細胞濃度在2~5×104/ml，培養72小時後，通過MTT(溴化-3-(4,5-二甲基噻唑基-2-)-2,5-二苯基四唑)檢測細胞在聚合物表面的增殖。
細胞在PLA膜上的增殖量為0.9×105/ml，在PHB膜上的增殖量為0.13×105/ml在PHBHHx膜上的增殖量為5.7×105/ml。與PLA和PHB相比，PHBHHx具有更好的細胞相容性。
實施例二細胞在用脂肪酶水溶液Lipolase100T處理的PHA膜表面PHB/PHBHHx共聚物膜表面的增殖細胞系小鼠成纖維細胞L929；PHB與PHBHHx的質量比1/0；0.9/0.1；0.75/0.25；0.5/0.5；0.25/0.75；0.1/0.9；0/1。
脂肪酶Lipolase100T(0.1g/ml，酶活約為1KLU/ml，由丹麥諾和諾德公司提供)；脂肪酶溶液的pH值7.0；脂肪酶處理溫度30℃；脂肪酶處理時間24小時；膜表面細胞增殖測定的對照聚乳酸(PLA)(分子量約為30~40萬)
本實施例的操作如下將純化的PHBHHx再按要求的比例溶解於PHB的三氯甲烷溶液中，室溫下展膜，經冰凍乾燥去除殘餘在膜中的有機溶劑。將1g固體顆粒的脂肪酶Lipolase100T溶於100ml去離子水，用NaOH調節pH值為7.0。將膜完全浸入到脂肪酶液30℃恆溫保持24小時，用去離子水反覆蕩洗，去除殘餘的酶液，乾燥，紫外照射過夜滅菌。取生長旺盛的L929細胞接種到膜表面，初始的細胞濃度在2~5×104/ml，培養72小時，通過MTT(溴化-3-(4,5-二甲基噻唑基-2-)-2,5-二苯基四唑)檢測細胞在聚合物表面的增殖。
細胞在PHA共混物膜上的增殖如圖1所示，細胞與聚合物材料表面的相容性是與聚合物的組成有關。未經酶處理之前，細胞在PHB和PHBHHx共混物膜上的增殖量是隨著PHBHHx的含量比的增加而出現遞增的趨勢，在PHBPHHx膜上的細胞增殖量5.7×105/ml比PHB膜上的0.2×105/ml增大近30倍。經過脂肪酶Lipolase100T處理後細胞在不同比率的PHB和PHBHHx共混物膜的增殖量都有了明顯的增加，細胞量為5~10×105/ml，大大超過了PLA膜上的細胞增殖(1×105/ml)。Lipolase100T對於PHB相對含量比較高的共混物膜的細胞相容性有明顯的增強作用，相反對於PHBHHx相對含量比較高共混物膜的細胞的增殖改變較小。
實施例三細胞在用脂肪酶Novozym398溶液處理的PHB/PHBHHx共聚物膜表面的增殖細胞系小鼠成纖維細胞L929；PHB與PHBHHx的質量比0.25/0.75；0.5/0.5；0.75/0.25；0/1。
脂肪酶Novozym398(液體)(30％，酶原液活力為20000LU，由丹麥諾和諾德公司提供)；脂肪酶溶液的pH值7.5；脂肪酶處理溫度40℃；脂肪酶處理時間24小時；本實施例的操作如下將純化的PHBHHx再按要求的比例溶解於PHB的三氯甲烷溶液中，室溫下展膜，經冰凍乾燥去除殘餘在膜中的有機溶劑。將液態脂肪酶Novozym398稀釋為30％(液體體積比)，用NaOH調節pH值為7.5。將膜完全浸入到脂肪酶液40℃恆溫保持24小時，用去離子水反覆蕩洗，去除殘餘的酶液，乾燥，紫外照射過夜滅菌。取生長旺盛的L929細胞接種到膜表面，初始的細胞濃度約為1×104/ml，培養72小時，通過MTT(溴化-3-(4,5-二甲基噻唑基-2-)-2,5-二苯基四唑)檢測細胞在聚合物表面的增殖。
與PHBHHx相比，沒有經過表面改性的共混物的膜表面的細胞增殖數量小於在PHBHHx表面細胞增殖量的二分之一，如圖2所示。經過Novozym398處理後的膜表面的細胞增殖發生很大變化，對於純的PHBHHx來說，細胞的數量只增大了近1倍。而經過酶處理的共混物膜表面的細胞增加了20~30倍，在PHB含量30％的共混物膜上，其細胞量達到最高值為3.3×105/ml，比經過酶改性的PHBHHx膜表面的細胞量(0.6×105/ml)增大了5~6倍。Novozym398的表面改性作用更適用於PHB/PHBHHx共混物。
通過以上三個實施例說明，和PLA和PHB相比較，PHBHHx具有更好的細胞相容性，加上其優良的機械性能和生物可降解性，能夠滿足組織工程對生物材料的要求，是一種良好的新型生物材料。在PHB中引入PHBHHx形成共混物，不僅提高PHB的延展性和可塑性，而且其表面的生物相容性可以通過脂肪酶的表面改性得到很大的提高，拓展了PHB在組織工程中的應用。
另外，通過利用脂肪酶對聚合物膜表面進行修飾，說明脂肪酶對材料表面生物相容性的影響是與聚合物的組成相關的，對於PHB及PHB相對含量較高的PHB/PHBHHx共混物的細胞相容性有比較大的提高，而對於PHBHHx和PHBHHx相對含量較高的PHB/PHBHHx共混物膜表面的細胞增殖沒有明顯的增大；對於共混物膜表面的生物相容性的提高程度要大於純的PHBHHx。
權利要求
1．一種生物材料和組織工程材料，其特徵在於，所說的生物材料和組織工程材料為3-羥基丁酸和3-羥基己酸共聚物(PHBHHx)。
2．用如權利要求1所述的生物材料和組織工程材料，其特徵在於，以脂肪酶作為表面改性劑對所說的PHBHHx的表面進行處理，以提高聚合物表面的親水性，增強細胞在聚合物膜表面的粘附、增殖的狀態。
3．用如權利要求2所述的生物材料和組織工程材料，其特徵在於，所說的以脂肪酶作為表面改性劑對聚合物進行表面處理的方法具體包括所說的脂肪酶溶液的pH範圍為7.0-7.5，處理的溫度範圍為30-40℃，將聚合物膜完全浸於脂肪酶溶液中，恆溫保持24小時後，用去離子水反覆蕩洗，乾燥。
4．一種生物材料和組織工程材料，其特徵在於，所說的生物材料和組織工程材料為的3-羥基丁酸和3-羥基己酸共聚物PHBHHx/PHB共混物。
5．用如權利要求4所述的生物材料和組織工程材料，其特徵在於，以脂肪酶作為表面改性劑對所說的PHB/PHBHHx共混物的表面進行處理，以提高聚合物表面的親水性，增強細胞在聚合物膜表面的粘附、增殖的狀態。
6．用如權利要求4所述的生物材料和組織工程材料，其特徵在於，所說的以脂肪酶作為表面改性劑對聚合物進行表面處理的方法具體包括所說的脂肪酶溶液的pH範圍為7.0-7.5，處理的溫度範圍為30-40℃，將聚合物膜完全浸於脂肪酶溶液中，恆溫保持24小時後，用去離子水反覆蕩洗，乾燥。
全文摘要
本發明屬於新型材料作為生物材料在組織工程中的應用領域。本發明不但提供了一種新型的生物材料PHBHHx,而且通過與PHB形成共混物可提高PHB的生物相容性,拓寬了PHB在組織工程中的應用。用脂肪酶進行的表面改性較其他表面改性的方法具有許多優點,條件溫和且不會影響材料本身的物理和機械性能。
文檔編號A61L31/04GK1324666SQ01129618
公開日2001年12月5日 申請日期2001年6月22日 優先權日2001年6月22日
發明者陳國強, 楊霰霜, 趙鍇, 陳金春 申請人:清華大學