用於收集及處理dna和rna檢測樣品的方法、試劑盒和系統的製作方法

2023-05-26 01:46:11 1

專利名稱：用於收集及處理dna和rna檢測樣品的方法、試劑盒和系統的製作方法
用於收集及處理DNA和RNA檢測樣品的方法、試劑盒和系統
相關申請的交叉引用
本專利申請根據美國法典第35條119款要求提交於2008年5月19日的美國臨 時申請61/U8238的優先權。發明領域
本發明涉及收集及處理生物學樣品(例如植物和動物組織等)用於分析或鑑定 (檢測)特定基因組材料(DNA和RNA)目的的方法；並且還涉及用於實施該方法以及檢測 此類材料的試劑盒和系統。
發明背景
來自昆蟲的微生物、細菌和病毒病原體是威脅人類和動物健康並極大增加食品生 產成本和財政風險的有害物劑。這些威脅在農場和水產業以及其中「牲畜」在高強度生產設 施中生長的環境下是尤其真實的。目前很好地建立了通過基因組材料經由PCR、RT-PCR(其 中PCR指聚合酶鏈反應而RT-PCR指反轉錄PCR)和基因測序檢測並鑑定這些物劑的方法並 且提供了檢測和控制這些物劑的可用方法。然而，應用這些方法直接檢測水產業、農業、環 境和臨床樣品中包含的核酸已經常常證明是無效的，並且多半是不可能的。
已知這種檢測無效的多個原因。這些原因包括實際上靶核酸很多情況下包含在或 定位於微生物內部並且位於宿主的組織內部。這種定位可致使微生物的基因組材料(「靶 核酸」)不可用於直接檢測。因此，需要一種釋放並溶解靶核酸的方法來用於檢測。在已知 的方法中，靶核酸與抑制劑和細胞及組織中包含的大量宿主DNA和RNA結合，使得靶核酸的 檢測複雜化。
動物、海洋和環境樣品被樣品中的固體沉澱物、膠體、乳液、可溶解的和不溶解的 鹽、生物大分子、生物可降解碎片、惰性材料和汙染的工業化學品和天然化學製品進一步復 雜化。這些樣品的異質性和複雜性可抑制直接的核酸檢測方法或使其無效。當顏色是分析 或檢測方法的一部分時，樣品著色也會干擾測試結果。
在多種情況下微生物和病原體的直接檢測被進一步複雜化，因為樣品僅包含靶基 因組材料的一些拷貝。此外，在一些樣品中靶基因組材料很多情況下與樣品中存在的大量 來自宿主和非靶生物的基因組材料一起存在。因為靶標的低拷貝數和高濃度的背景基因組 材料和抑制劑，直接檢測方法如PCR、RT-PCR和免疫測定方法的靈敏度和特異性受到化學 幹擾並且無法有效進行檢測。
為了避免這些問題，需要一些形式的樣品處理以從幹擾材料中濃縮、純化並釋放 出靶基因組材料。已開發了多種樣品製備方法以避免由於基因組定位、抑制劑和無效的基 因組檢測引起的靈敏度喪失和不良特異性產生的不精確及假性結果。
一般來講，這些處理方法涉及i)破壞組織並溶解細胞以釋放靶基因組材料，ii) 將基因組材料吸附在固體支持體如膜或吸附劑材料上，iii)洗滌吸附的基因組材料使其不 含汙染物，以及iv)從固體支持體上釋放基因組材料用於檢測。
雖然上述方法已經證明對檢測和鑑定基因組材料是有用的，但它們仍需要在分析前進行多步驟處理以純化並分離基因組材料。此類方法不但需要使用支持設備和材料(例 如離心、膜過濾和/或化學沉澱)，它們還可能需要毒性化學製品和溶劑以穩定基因組材料 並有助於從固體支持體中釋放基因組材料。這些方法不但增加了分析的複雜性、成本和時 間，而且還可能需要在實驗室中使用真空或電氣設備。
因此，仍需要一種檢測有害物劑如包括細菌和病毒病原體在內的微生物的方法， 該方法能夠在現場使用，不需要實驗室真空或電氣設備，使用迅速且簡便，不需要無毒的化 學製品，成本低廉並且能夠基於診斷基因序列用於病原體的迅速檢測和鑑定。「現場」是指 例如生長或生產或加工食物產品的場所，包括但不限於農場(水產業和農業)、食品加工和 包裝場所等。
為了監控和控制有害微生物及控制它們引起的病害，還需要簡單的樣品處理技 術，該技術能夠在現場使用以從樣品中收集、處理和回收基因組材料，其中發現的微生物對 其靶核酸進行分析。
本發明滿足了這些需要。
發明概述
本發明通過提供一種柔性壁容器和用於收集並處理樣品中核酸的方法以及適用 於該方法的診斷系統來解決上述問題，所述診斷系統包括一個試劑盒，其中該方法能以低 成本操作、使用簡便並且能夠在現場使用。所述方法包括收集並處理基因組材料，它們是來 自樣品的核酸)，不需要對樣品基因組材料進行純化。所述方法能夠與試劑盒一起使用以 提供對動物和植物流體或組織中包含的細菌和病毒病原體的低成本的、迅速的原位(在現 場)檢測。
本發明的一個目標是提供有效的、簡便的、迅速的和廉價的容器和方法以收集並 回收樣品中的核酸用於靶核酸或特定基因序列的分析或鑑定。該方法能夠在現場使用。本 發明的另一個目的是提供釋放並溶解核酸以及使得它們不含幹擾溶質和抑制劑(其能抑 制或減少檢測結果)的方法。本發明的另一個目的是提供廉價的試劑盒和診斷系統以達到 前述目標。
本發明提供用於收集、處理並分析樣品中的靶核酸的方法、試劑盒和系統。該方法 包括(a)提供包含核酸的樣品；(b)將所述樣品轉移到柔性壁容器中；(c)將萃取液加到容 器中；(d)用萃取液和一種或多種處理試劑在容器中處理所述樣品以從樣品中釋放核酸以 溶解核酸並產生回收液；以及(e)將一部分來自步驟(d)的回收液或產物轉移到合適的檢 測系統以用於靶核酸的檢測。
步驟(d)中的「處理」在本文是指包括將樣品與萃取液和一種或多種處理試劑混 合併且任選地處理混合物，例如用萃取液和一種或多種處理試劑浸軟樣品。
任選地，可在轉移樣品至容器之前將一種或多種處理試劑加到容器中。一種或多 種處理試劑可有助於釋放並溶解核酸和/或移除或滅活抑制物質(「抑制劑」)，所述抑制 物質幹擾靶核酸中的基因序列的後續檢測。也可加熱或冷凍柔性壁容器以滅活抑制劑和/ 或保存或穩定核酸。
任選地，柔性壁容器可包含過濾介質以利於在步驟(d)之後和步驟(e)之前，在已 經釋放並溶解核酸後除去微粒。
適用的檢測系統使用PCR、RT-PCR、等溫擴增、基因測序或探針雜交技術。
還提供一個試劑盒，該試劑盒提供材料和容器以製備樣品並經由PCR、RT-PCR、等 溫擴增、基因測序或探針雜交技術檢測或鑑定診斷性靶DNA或RNA。該試劑盒包括(a)在其 內處理樣品的柔性壁容器，(b)萃取液，(c) 一種或多種處理試劑和(d)移液管，該移液管 用於收集並測量用萃取液和一種或多種處理試劑在容器中處理樣品而產生的回收液，並且 用於將回收液轉移到合適的檢測系統中。該試劑盒還可包括壓碎裝置用於輔助壓碎固體樣 品，以及過濾裝置。
該試劑盒還可包括檢測介質，它包含一種或多種檢測試劑用於PCR、RT-PCR、等溫 擴增、基因測序或探針雜交產物的檢測和鑑定。
該試劑盒通常還包括描述使用試劑盒組件進行樣品製備和診斷性靶DNA或RNA核 酸檢測的方法的說明書。
還提供了診斷系統，它用於樣品製備和樣品中包含的靶核酸的檢測或鑑定。該系 統包括如上文所述的試劑盒以及檢測系統。該檢測系統取決於靶核酸是DNA或RNA、或cDNA 產物。該檢測系統或試劑盒包括檢測介質。該檢測系統包括用於檢測DNA或RNA、或cDNA 產物的處理器。檢測可使用PCR、RT-PCR、等溫擴增、基因測序或探針雜交技術完成。完成 檢測的處理器包括熱循環儀或烘箱式加熱器。
該檢測系統還包括檢測方法。檢測方法可選自標準非變性凝膠電泳(例如丙烯醯 胺或瓊脂糖)、變性梯度凝膠電泳、溫度梯度凝膠電泳、毛細管電泳、或螢光檢測。
術語和縮寫
以下縮寫和定義用於闡明權利要求書和說明書。
dNTP核苷酸
DNA脫氧核糖核酸
PCR聚合酶鏈反應
RNA核糖核酸
DNase脫氧核糖核酸酶
RNA酶核糖核酸酶
RT反轉錄
RT-PCR反轉錄聚合酶鏈反應
定義
如本文所用，術語微生物指具有適於分析或檢測的DNA或RNA的任何細菌、病毒、 真核或原核生物細胞。微生物可為活的、死的、或已被損壞了的，即細胞壁或細胞膜上有 損傷的。具體地講，關於蝦養殖業，尤其值得注意的微生物是病原體，包括白斑症候群病 毒(「WSSV」)；傳染性皮下及造血組織壞死病毒(「IHHNV」)；桃拉(taura)症候群病毒 (「TSV」)；以及哈氏弧菌(革蘭氏陰性菌)。作為特定病原體的診斷劑的診斷性靶DNA或RNA 和/或它們的片段是已知的。參見例如WO 2008/024294 (WSSV) ；W02008/024293 (IHHNV) ；WO 2008/024292 (TSV)；和WO 2008/048673 (哈氏弧菌)。蝦和其他牲畜的其他病原體可使用本 文所公開的方法、試劑盒和診斷系統進行簡便的檢測，本領域的技術人員將認識到這一點。
如本文所用，術語「DNA」指包含脫氧核糖的核酸分子，它與具有核糖的「RNA」相 反。如本文所用，「DNA」和「RNA」指DNA和RNA的所有種類，它們分別包括信使RNA (mRNA)、 核糖體RNA(rRNA)、轉運RNA(tRNA)以及具有調節功能的小RNA種類。「小RNA種類」具有特定的意義並且指細菌中具有持家或調節功能的未翻譯RNA。「小RNA種類」不是rRNA或 tRNAo
如本文所用，術語「抑制劑」指化學製劑或其他製劑，它們具有幹擾PCR或RT-PCR 作用的能力
如本文所用，術語「RNA酶抑制劑」指化學製劑或其他製劑，它們具有幹擾RNA酶如 大多數細菌細胞產生的內源RNA酶作用的能力。需要澄清的是，RNA酶是核糖核酸酶，它是 催化RNA中的核苷酸裂解的酶。
術語「靶核酸」指在本發明的方法、試劑盒和診斷系統中使用PCR、RT_PCR、等溫擴 增、基因測序或探針雜交技術檢測的DNA或RNA核酸或DNA或RNA片段。靶核酸可為基因 序列。
如本文所用，術語「診斷性靶DNA或RNA」分別指是特定微生物、病原體或病害的診 斷劑的DNA或RNA分子或片段。一般來講，靶核酸是診斷性靶DNA或RNA。
如本文所用，術語「診斷性靶DNA產物」指從診斷性靶RNA轉錄得到或用診斷性靶 RNA作模板轉錄得到的DNA拷貝合成的DNA分子或片段。
如本文所用，術語「反轉錄後的聚合酶鏈反應」或「RT-PCR」指用是RNA序列的一 個拷貝的序列合成並擴增DNA分子的技術。RT-PCR用於檢測RNA種類如在基因表達的定量 分析中進行檢測，以及用於製備RNA的DNA拷貝用於克隆、cDNA文庫構建、探針合成、以及 原位雜交中的信號擴增。該技術由兩部分組成通過反轉錄(RT)從RNA合成cDNA，以及通 過聚合酶鏈反應(PCR)擴增特定的cDNA。逆轉錄酶是依賴RNA的DNA聚合酶，它使用模板 RNA或RNA:DNA雜交體中的RNA分子催化核苷酸的聚合。
如本文所用，術語「引物」指合成的或天然存在的寡核苷酸。當被置於其中通過聚 合酶催化互補鏈合成的條件下時，它能夠作為沿模板鏈進行核酸合成或複製的起始點。在 反轉錄情況下，引物由核酸構成並且最適用於RNA模板。在PCR情況下，引物由核酸構成並 且最適用於DNA模板。
如本文所用，術語「擴增產物」指在引物引導的擴增反應期間產生的核酸片段。引 物引導的擴增的典型方法包括聚合酶鏈反應(PCR)、RT-PCR、連接酶鏈反應(LCR)或鏈置換 擴增反應(SDA)。
如本文所用，術語「溶解」指破壞或改變細胞壁以利於接近或釋放細胞RNA或DNA。 溶解概念基本上不需要完全破壞或破損細胞壁。
如本文所用，術語「溶解劑」指適於溶解或打開細胞壁的任何劑或條件、或者劑或 條件的組合。溶解劑可包含酶(如溶菌酶、或噬菌體溶胞酶)或化學製品(如氯仿)、去汙 劑、溶解緩衝液、加熱或可涉及物理剪切裝置如使用超聲波降解、砂磨機、弗氏壓碎器等。溶 解劑是為本領域人們所熟知的。
如本文所用，術語「熱循環」指在RT-PCR或PCR檢測分析期間改變溫度的整個模 式。該方法是本領域常見並熟知的。參見例如Sambrook，J.，Fritsch，E. F.和Maniatis， Τ. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.，1989 ；和授予Mullis等人的美國專利公開4，683，202以及授 予Mullis等人的美國專利公開4，683，195。一般來講，PCR熱循環包括初始的高溫變性步 驟，隨後是設計使得模板變性、引物退火、以及聚合酶引起的退火引物延伸的一系列重複溫度循環。
如本文所用，術語「直接檢測」指在不分離或純化診斷性靶DNA或RNA的情況下檢 測和/或鑑定存在的診斷性靶DNA或RNA的檢測分析法。
發明詳述
本發明提供檢測有害物劑如包括細菌和病毒病原體的微生物的方法，以及適用於 該方法的試劑盒和系統。具體地講，本發明可應用於檢測病原體，所述病原體是或可能是病 害引發劑。所述方法包括收集、處理並檢測靶核酸(DNA或RNA)或者在存在有害物劑的代表 性樣品中，不需要純化該樣品。該方法和試劑盒及系統提供廉價的、迅速的原位(在現場) 檢測動物和植物組織中包含的病毒和細菌病原體。
本發明提供用於收集、分析或鑑定樣品中的靶核酸的方法、試劑盒和系統。該基因 序列用於檢測並鑑定樣品中存在的有害物劑。該方法包括(a)提供包含核酸的樣品；(b)將 所述樣品轉移到柔性壁容器中；(c)將萃取液加到容器中；(d)用萃取液和一種或多種處理 試劑在容器中處理所述樣品以從樣品中釋放核酸以溶解核酸並產生回收液；以及(e)將一 部分來自步驟(d)的回收液或產物轉移到合適的檢測系統以用於靶核酸的檢測。因此，本 發明的方法提供直接檢測。不需要純化靶核酸。
步驟(d)中的「處理」本文指包括將樣品與萃取液和一種或多種處理試劑混合。可 通過振蕩容器作為混合的一部分來輔助核酸的回收。處理可包括附加的處理步驟，例如用 萃取液和一種或多種處理試劑浸軟樣品。「浸軟」是指壓碎或破碎樣品中的固體以幫助從樣 品中釋放核酸。當樣品是固體如生物組織時浸軟可起到作用。可通過例如施加外力到容器 壁上完成浸軟。在浸軟期間，可使容器壁互相接觸，引起樣品在容器壁之間被壓碎或浸軟。 可改變或破壞組織和細胞膜以便能夠將其中包含的靶核酸溶解在萃取液中供利用。因此， 該任選步驟有助於溶解和回收核酸。如果樣品是均質流體，例如血液或血淋巴，可不進行壓 碎。
處理試劑可包括酶或其他試劑。處理試劑可用於處理或降解抑制劑。此外，可在 步驟(e)之前滅活處理試劑以便它們不對靶核酸的後續檢測產生負面影響。
在步驟(e)中，將步驟(d)中的一部分回收液轉移到合適的檢測系統中用於靶核 酸的檢測和/或鑑定。適用的檢測系統基於PCR、RT-PCR、等溫擴增、基因測序或探針雜交 技術。
任選地，可通過孵育和/或加熱容器中的樣品及萃取液進一步促進核酸的回收。 期望的孵育和/或加熱時間取決於樣品中包含的抑制劑的特性和類型。例如孵育和/或加 熱程度取決於滅活或降解抑制劑所需的時間和溫度。加熱也可用於滅活處理試劑如用於滅 活或降解抑制劑的酶。
用於檢測靶核酸的優選檢測系統使用PCR或RT-PCR擴增靶核酸，使用WSSV、 IHHNV、TSV和哈氏弧菌的診斷引物序列，該檢測系統詳述於WO 2008/024294(WSSV) ；WO 2008/024293 (IHHNV) ；WO 2008/024292 (TSV)；和 WO 2008/048673 (哈氏弧菌)中。
本發明的試劑盒包括製備樣品及檢測或鑑定診斷性靶DNA或RNA的材料和容器， 例如經由PCR、RT-PCR、等溫擴增、基因測序或探針雜交技術檢測或鑑定靶DNA或RNA。試劑 盒包括(a)在其內處理樣品的柔性壁容器，(b)萃取液，(c)處理試劑，(d)移液管，該移液 管用於收集並測量用萃取液在容器中混合樣品製備的回收液，並且用於將容器內容物轉移到檢測系統中。
下文描述了樣品、柔性壁容器、萃取液和檢測系統。移液管可為能夠將流體從一個 容器轉移到另一個容器的任何裝置。可用的移液管的一個實例是精確定量移液管，例如那 些可從 Poly-Pipets，Inc. (Englewood Cliffs, NJ)商購獲得的移液管。
試劑盒還可包括用於輔助壓碎固體樣品的壓碎裝置、過濾裝置和/或過濾介質以 及一種或多種處理試劑以幫助釋放和溶解核酸並移除或滅活抑制物質。
試劑盒通常還包括描述使用試劑盒組件進行樣品製備的說明書。
用於檢測靶核酸的試劑盒可包括以乾燥形式或液體形式存在的檢測介質，所述介 質用於雜交靶和探針核酸以及通過洗滌移除非期望的和未雜交形式的核酸。試劑盒可包括 固體支持體(例如量油計、小珠等)，來源於分離的診斷引物序列的未標記核酸探針被固定 在它上面(或與其結合)。試劑盒還可包括與相同DNA鏈的第二及不同區域互補的標記探 針，未標記的核酸探針與該DNA鏈雜交。標記探針也可來源於本文所公開的分離診斷引物 序列。
試劑盒還可包括與檢測系統一起使用的檢測介質。檢測介質可包含酶、三磷酸脫 氧核苷酸、螢光劑、至少一對內部樣品對照引物、至少一個內部模板對照物和至少一對內部 模板對照引物、以及包含與靶核酸至少一個區域的一部分互補的序列的探針，該探針能夠 用試劑盒中包含的診斷引物序列擴增。檢測介質可為多種形式，例如液體、乾燥物、或片劑 形式，並且可存在於任何合適的容器或多個容器中，例如小瓶、管等。
還提供了診斷系統，它用於樣品製備和樣品中包含的靶核酸的檢測或鑑定。所述 系統包括如上文所述的試劑盒、包含一種或多種用於檢測診斷性靶核酸的檢測試劑的檢測 介質、以及用於檢測DNA或RNA、或cDNA產物的處理器。完成檢測的處理器包括熱循環儀或 烘箱式加熱器。
在擴增後，例如使用PCR或RT-PCR，可將擴增的核苷酸序列連接到合適載體上，隨 後用所述載體轉化合適的宿主生物。因此確保較容易利用的擴增序列的供應。作為另外一 種選擇，如下文所述，在擴增後可化學合成擴增序列或其一部分用作核苷酸探針，將該探針 用於雜交測定。在任一種情況下DNA序列的可變區可使用以下方法確定例如雙脫氧方法 (Sanger,F.等人，Proc. Natl. Acad. 74:5463-5467(1977))。獲取的序列用於指導生物 探針的選擇並選擇最合適的序列。
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一般來講，樣品來自食品生產(即，食品或與食品接觸的液體)、水產業、農業、食 品生產的工業過程、以及環境。該列表是示例性的而非詳盡的。尤其值得關注的應用是從 與養殖的牲畜或水產品的生長相關聯的樣品中回收靶核酸。這些包括食品和飼料生產及加 工、處理和食品製備。尤其關注的是由於病原體的發展及由此引起汙染的樣品，所述樣品與 海洋水產養殖業和食品供應相關聯。一般來講，樣品包含水、飼料、種魚、動物組織、體液和 /或生產的食品。
可通過擦洗表面收集組織或體液、萃取固體或半固體樣品提供樣品。其他方法是 本領域技術人員已知的。在一個優選的實施方案中，樣品是蝦組織，更具體地講一個或多個 蝦腹肢。在本發明中，可使用蝦腹肢檢測蝦中的常見病原體。更具體地講，白斑症候群病毒 (WSSV)能在蝦場或其他養蝦設施或場所中使用本發明的方法、試劑盒和診斷系統對蝦進行檢測。
柔件壁容器
使用柔性收集容器收集、處理並回收靶核酸進行檢測或鑑定。密封該容器的壁以 形成小袋，其一端開口-頂部-並且提供液體密封的容器。
該容器主要的和基本的特徵是其壁是柔性的，這種柔性提供以下功能。
(i)可將外力施加到容器壁上以便能在壁間壓碎固體樣品(例如生物組織)。因 此，通過減小樣品材料的粒度、浸軟組織結構並破壞生物樣品材料的細胞壁，將能夠進行並 改善靶核酸的回收。
(ii)容器的柔性提供了收集樣品的多種方法。例如能將柔性容器裡外翻轉使得外 壁變成內壁。一旦裡外翻轉了容器壁，操作人員可把手伸入翻轉後的容器中收集樣品材料， 然後將容器壁翻轉回最初的一邊並從而將樣品放入容器中。因此操作人員避免了自己的手 對樣品造成汙染。這種特殊的技術可在對海產品和農產品進行採樣時有利地使用。例如可 輕易地從蝦上移除蝦腹肢並將其置於容器中，不需要使用其他收集輔助工具如解剖刀或鑷 子。
(iii)容器的柔性還提供在萃取液中攪動並懸浮樣品材料的手段。通過簡單地對 壁施加並釋放外部壓力，可攪動並懸浮萃取液中的樣品材料。
為了提高本發明的方法和試劑盒及系統的效用，柔性容器優選具有連接到容器頂 部的閉合件，以便在本方法中能在開口和封閉情況下翻轉該容器。該閉合件能進行密封並 使得樣品和回收液通過方法步驟，所述步驟可包括收集材料、混合樣品與萃取液、和將處理 試劑加到樣品中以及防止容器內容物的溢出和汙染。可使用多種閉合機構，優選細條紋和 槽型以及拉鏈袋。
可使用多種合成聚合物和天然衍生聚合物(例如玻璃紙)製備容器壁。一般來講， 優選聚丙烯和聚乙烯。為了保持柔韌性並提供合適的強度，壁的厚度一般介於1和8密耳 之間(0. 025至0. 20mm)，優選壁的厚度為2至6密耳(0. 51至0. 15mm)。雖然不意欲進行 限制，但容器的尺寸一般大到足以包含0. 5至1，OOOmL的體積，優選1至15mL的體積。
萃取液
加入萃取液以溶解存在於容器中或者加到容器中的任何處理試劑並且溶解樣品 中包含的靶核酸。萃取液可溶解並化學處理樣品以促進核酸回收。萃取液可包含一種或多 種處理試劑以滅活或降解樣品組分，所述樣品組分抑制核酸的檢測(「抑制劑」)。
萃取液是流體。萃取液可為水。萃取液可包含水和一種或多種處理試劑。將萃取 液加入柔性容器以溶解並從樣品中回收靶核酸。因為可將這種流體轉移到檢測介質上，它 的化學組成必須與檢測系統相容並且不幹擾檢測系統(基於PCR、RT-PCR、等溫擴增、探針 雜交、或基因測序)，包括不幹擾在系統中的反應。樣品與萃取液的混合產物本文稱為「回 收液」。因此，回收液包含已從樣品中釋放並溶解的核酸。
在一個優選的實施方案中，回收液作為檢測介質的唯一稀釋劑使用，所述檢測介 質包含一種或多種檢測試劑如乾燥的或凍幹的檢測試劑組合物。用這種方法，通過將單獨 的檢測液加到乾燥檢測試劑中，將能夠進行簡便的、無需後續步驟的檢測。
還需要萃取液的體積足以有效地從樣品中萃取靶核酸，同時足以稀釋樣品中的抑 製劑以便抑制劑不幹擾檢測。一般來講萃取液的體積應在檢測反應體積的25至500倍的範圍內。更優選地，萃取液的體積應在檢測反應體積的50至200倍的範圍內。
處理試劑
試劑盒還可包括一種或多種處理試劑以利於溶解核酸用於通過PCR、RT_PCR、等溫 擴增、基因測序、或探針雜交對它們進行檢測和鑑定。加入一種或多種處理試劑行使兩種不 同的功能。第一，加入處理試劑以從樣品中釋放並溶解靶核酸。處理試劑的第二種功能是 支持靶核酸的擴增。
通常加入一種以上的處理試劑。例如第一處理試劑可為包含溶解劑的組合物，它 可用於破壞細胞壁以接觸靶核酸。溶解劑可為或可包含去汙劑、酶、或它們的組合。去汙劑 可為促進溶解靶核酸的表面活性劑。酶也可通過引起蛋白沉澱或換句話講移除或滅活抑 製劑來與萃取液協同作用。可將多種酶和其他溶解試劑固定在支持體上以協助過濾顆粒。 因此，可處理樣品並且在將樣品轉移到檢測系統之前移除處理試劑。附加溶解劑在例如US 2005/0266468A1中進行了描述，其教導以引用方式併入本文。
第二處理試劑可為包含pH在7至7. 8範圍內的緩衝液、氯化鎂、和氯化鉀的組合 物。這種組合物有助於擴增靶核酸。
處理試劑還可包含抑制RNA酶和DNase的穩定劑。
雖然不意欲進行限制，但回收液的可用組合物為50mM Tris-HCl緩衝液，3. OmM MgCl2, 28mM KCl, 0. 1% Triton X-100 表面活性劑(Triton X-IOO 是得自 Dow Chemical Co.，Midland MI的表面活性劑)。
可在加入樣品和萃取液之前，將一種或多種處理試劑加到柔性壁容器中。除此之 外或作為另外一種選擇，可將處理試劑加到萃取液中。
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本發明的方法任選地包括在將回收液加到檢測系統之前，過濾回收液以移除不需 要的顆粒的步驟。回收液中不需要的顆粒可包括抑制劑和過多的靶核酸。因此過濾可有助 於移除抑制劑並改善測試的再現性。
通過在試劑盒中加上過濾介質可容易地進行過濾，例如在柔性容器中加上過濾介 質。所述方法可包括使得回收液通過柔性容器中的過濾器。作為另外一種選擇，試劑盒可 包括移液管，其中移液管在其管內具有過濾介質。過濾通過轉移回收液使其通過移液管中 的過濾介質進行，並且將過濾後的液體轉移到檢測系統。在將回收液分配到檢測系統中前 應移除過濾器。
試劑盒也可包括過濾介質和/或可為吸附劑或非吸附劑的顆粒。也可將過濾介質 和顆粒加到容器中或在方法中使用以移除抑制劑和/或輔助過濾過程。
過濾介質包括加工的或非加工的天然纖維以及非織造的合成纖維。這些材料可為 經處理的或未經處理的，它們有助於樣品相容性和潤溼。例如可使用纖維如棉花和尼龍。
過濾顆粒包括吸附的和非吸附的顆粒，它們可用於吸附並從回收液中移除不需 要的材料或用於輔助過濾。吸附的和非吸附的顆粒也可與過濾介質聯合使用。吸附劑應 具有大於1. 0克每毫升的密度。具體的吸附劑包括J. Τ. Baker硅藻土(cat. #1939-01)、 CELITE4/4、KENITE4/4200、CELAT0M4/4 FW6、CUN04/4 M-901、CUN04/4m802、PERFL04/4200、 PERFL04/463、PERFL04/430、ALITE4/4150、ALITE4/4180、或它們的混合物、J. T. Baker 硅藻土(cat. # 1939-01)、CELITE4/4、KENITE4/4200、CELAT0M4/4FW6、CUN04/4M-901、CUN04/4m802、PERFL04/4200、PERFL04/463、和 PERFL04/430 吸附劑。
雖然使用的過濾介質或顆粒的量取決於樣品的大小，但每mL回收液應有10至 170mg的吸附劑，優選每mL回收液有10_60mg的吸附劑。
檢測系統
檢測系統包括檢測設備和與設備一起使用的檢測介質。設備和檢測介質可基於 PCR、RT-PCR、等溫擴增、基因測序或探針雜交技術。當檢測系統使用PCR時，檢測系統包 括具有引物混合物的檢測介質，所述引物混合物包含至少一個與靶核酸互補的引物組；耐 熱聚合酶；核苷酸(dNTP)；緩衝液和一種或多種檢測探針。當檢測系統使用RT-PCR時，檢 測系統包括具有引物混合物的檢測介質，所述引物混合物包含至少一個與靶RNA互補的引 物；熱活化的耐熱聚合酶；逆轉錄酶；核苷酸(dNTP)；緩衝液；和RNA酶抑制劑。當檢測系 統使用等溫擴增時，所述檢測系統包括具有DNA聚合酶和一套四個專門設計的引物的檢測 介質，所述引物識別靶核酸總計六個不同的序列。當檢測系統使用基因測序時，所述檢測系 統包括具有一個或多個標記終止子、緩衝液和合適的酶的檢測介質。當檢測系統使用探針 雜交時，所述檢測系統包括具有寡核苷酸(合成的或天然存在的)的檢測介質，所述寡核苷 酸與靶核酸顯著互補並且雜交到其上。當檢測系統使用等溫擴增時，所述檢測系統包括具 有DNA聚合酶和一套四個專門設計的引物的檢測介質，所述引物識別靶核酸總計六個不同 的序列。
本發明的診斷系統不受檢測方法的限制並且可通過檢測PCR、RT-PCR、等溫擴增、 基因測序或探針雜交技術的產物的任何方法使用。優選PCR和RT-PCR。
一般來講，PCR熱循環包括初始的高溫變性步驟，隨後是設計使得模板變性、引物 退火、以及聚合酶引起的退火引物延伸的一系列重複溫度循環。一般來講，最初在約95°C加 熱樣品約2至10分鐘以變性雙鏈DNA樣品。然後在每個循環開始時，取決於樣品和所用儀 器的類型，變性樣品約10至60秒。在變性後，允許引物在較低溫度下對靶DNA進行退火， 從約40°C至約60°C退火約20至60秒。聚合酶催化的引物延伸常常在約60°C至約72°C的 溫度範圍內進行。延伸所用的時間將取決於擴增子的大小和用於擴增的酶的類型並且通過 常規實驗容易地測定。此外，退火步驟可與延伸步驟組合使用，產生兩步驟循環。在PCR檢 測分析法中熱循環也可包括附加的溫度變化。在任何檢測分析法中使用的循環數可由本領 域的技術人員用常規實驗容易地測定。在完成熱循環後任選地可增加最終的延伸步驟以確 保所有擴增產物的合成。
在擴增後，可將擴增的核苷酸序列連接到合適載體上，隨後用所述載體轉化合適 的宿主生物。因此確保較容易利用的擴增序列的供應。作為另外一種選擇，如下文所述在擴 增後可化學合成擴增序列或其一部分用作核苷酸探針，將該探針用於雜交測定。在任一種 情況下DNA序列的可變區可使用以下方法確定例如雙脫氧方法(Sanger，F.等人.，Proc. Natl. Acad. Sci. 74 5463-5467(1977)) 0獲取的序列用於指導生物探針的選擇並選擇最合 適的序列。
在RT-PCR中，反轉錄通常在組合物中進行，所述組合物包含雜交到靶RNA以引導 拷貝DNA合成的引物、四種三磷酸脫氧核苷酸的混合物(即dATP、dCTP、dTTP、和dGTP)、 MgCl2、逆轉錄酶和逆轉錄酶緩衝液。此外，所述組合物可任選地包含RNA酶抑制劑，如異硫 氰酸胍、焦碳酸二乙酯、SuperaseIn (Ambion，Inc. ,Austin, TX)、RNA 酶 Block(StratageneCorp. ,La Jolla，CA)、人胎盤核糖核酸酶抑制劑、豬肝臟RNA酶抑制劑(Takara Mirus Bio Company, Madison, WI)、Anti-RNA 酶(Novagen, Inc. , Madison, WI)、Ribonuclease Inhib III (PanVera Corp. ， Madison, WI) > RNAlater (Ambion, Inc.) RNA Protect Bacteria Reagent (Qiagen，Inc.，Valencia, CA)。合適的逆轉錄酶是為本領域人們所熟知的，包括但 不限於 HIV 逆轉錄酶(Ambion, Inc. )、Transcriptor 逆轉錄酶(Roche Applied Science Corp.，Indianapolis, IN) > Thermoscript 逆轉錄Sl (Invitrogen Corp.，Carlsbad, CA)。
無論反轉錄和擴增是分兩步完成還是一步完成，首先進行的是反轉錄步驟，它通 常由在介於約37°C和約70°C之間的單溫度孵育組成。不同的溫度適用於不同的逆轉錄酶 和不同的引物，這一點是本領域技術人員已知的。
在本文公開的方法中可使用本領域熟知的多種檢測方法。這些檢測方法包括但不 限於標準非變性凝膠電泳(例如丙烯醯胺或瓊脂糖)、變性梯度凝膠電泳、溫度梯度凝膠電 泳、毛細管電泳、以及螢光檢測。
螢光檢測方法對擴增產物提供迅速靈敏的檢測。螢光檢測還提供了實時檢測的能 力，其中在熱循環過程期間監控擴增產物的形成。此外，初始靶的量可使用螢光檢測進行定 量。螢光檢測可通過在熱循環過程之前或之後將核酸結合螢光劑加入反應混合物中完成。 核酸結合螢光劑優選地是一種插入染料，它能夠以非共價形式插入核酸雙螺旋結構的堆疊 鹼基對之間。然而非插入核酸結合螢光劑也是適用的。
本發明方法中可用的核酸結合螢光劑的非限制性實例為溴化乙錠和STOR Green I (得自Molecular Probes ；Eugene, OR)。在熱循環之前將核酸結合螢光劑加到反應混合物 中允許實時監控擴增產物的形成，這在Higuchi (美國專利5，994，056)中進行了描述。能 夠進行實時螢光測量的熱循環儀可從公司如Applied Biosystems (Foster City, CA)、MJ Research (Waltham，MA) JPMratagene (La Jolla, CA)商購獲得。在擴增後,可使用本領域 已知的方法測定產物的熔融溫度，由此評估形成的擴增產物，所述方法例如使用螢光測量 生成熔融曲線。
也可使用本領域已知的其他方法完成擴增產物的螢光檢測，例如使用螢光標記 探針。所述探針包含至少一部分擴增產物的互補序列。此類探針的非限制性實例包括 TaqMan 探針(Applied Biosystems)和分子信標(Goel 等人，J. Appl. Microbiol. 99 (3) 435-442 (2005))。例如，用於與TSV引物一起使用以構建螢光標記探針的基因序列可通過分 析TSV基因並測試擴增子進行選擇，分析使用可商購獲得的分析軟體如I^rimer Express v2. O (Applied BioSystems Inc.，Foster City California)，這在 WO 2008/024292 Al 的 實施例9和10中進行了詳述。用於與本文公開的WSSV引物一起使用以構建螢光標記探針 的基因序列可通過分析WSSV基因並測試擴增子進行選擇，這在W02008/0M^4A2的實施例 11和12中進行了詳述。選擇的探針序列位於特定測試擴增子的近端。可使用本領域已知 的方法螢光標記探針，例如那些下述的標記雜交探針的方法。就實時螢光檢測而言，可對 探針進行雙標記。例如可使用螢光基團如6FAMTM(Applied BioSystems)標記探針的5'末 端，使用淬滅劑染料如6-羧基四甲基羅丹明(TAMRA)標記探針的3'末端。就小溝結合探 針(minor groove binding probe)而言，可用淬滅劑染料和小溝結合複合物標記3『末端。 螢光標記探針可獲取自商業來源如Applied BioSystems0
在一個實施方案中，本發明提供用於定量樣品中的靶核酸的方法。在這個實施方案中，從推測含有靶核酸的樣品中提供DNA或RNA並生成互補DNA。用本文公開的至少一對 寡核苷酸引物通過介於至少一個變性溫度和一個延伸溫度之間的熱循環，在存在核酸結合 螢光劑或螢光標記探針的情況下擴增所述DNA。在熱循環期間測量通過核酸結合螢光劑或 螢光標記探針生成的螢光量。根據螢光測量，測定出一個循環數閥值，在該閥值上核酸結合 螢光劑或螢光標記探針生成的螢光量達到在基線值之上的固定閥值。循環數閥值本文稱為 CT數或值。CT數可手動測定或通過儀器自動測定。為了測定CT值，在初始擴增循環期間 測定每個樣品的基線螢光。然後使用數學算法確定什麼樣的統計意義上的顯著性螢光改變 將需要成為高於背景的螢光信號。將螢光超過其閥值時的循環數稱為CT數。通常在熱循 環開始時樣品中存在的DNA越多，達到閥值將進行的循環數越少。
因此CT數與樣品中的初始靶核酸的量逆相關。在測定了樣品的CT數後，樣品中 最初存在的靶核酸的量可通過比較測定的樣品中靶核酸循環數閥值與循環數閥值對使用 已知濃度標準溶液測定的模板濃度的對數的標準曲線進行計算，這是本領域熟知的方法。
下文描述了 WSSV和TSV的靶核酸序列。本領域的技術人員將認識到使用本發明 的方法、試劑盒和診斷系統能檢測或鑑定其他靶核酸序列。
序列描述
從下文的發明詳述及附帶的序列描述中可較充分地理解本發明的多個實施方案， 它們形成本專利申請的一部分。
以下序列符合37C. F. R. 1. 821-1. 825 (「對含有核酸序列和/或胺基酸序列公開的 專利申請的要求-序列規則」)並且與World Intellectual Property Organization(WIPO) Standard ST. 25(1998)以及 EPO 和 PCT (Rules 5. 2 和 49. 5 (a-bis)，以及 Administrative hstructions的kction 208和Annex C)的序列表要求一致。核苷酸的符號和格式以及 胺基酸序列數據符合如37C. F. R. § 1. 822所示的規則。
SEQ ID NO :1_8是用於檢測WSSV的WSSV診斷引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO :9-12是如實施例的一般方法部分所述的合成WSSV模板的核苷酸序 列。這些序列也是使用本文所公開的WSSV診斷引物對獲取的擴增產物的核苷酸序列。
SEQ ID NO :13-18是用於檢測TSV的桃拉症候群病毒(TSV)診斷引物的核苷酸序 列。
SEQ ID NO :19-21是如實施例的一般方法部分所述的合成TSV模板的核苷酸序 列。這些序列也是使用本文所公開的TSV診斷引物對獲取的擴增產物的核苷酸序列。
針對WSSV、IHHNV、TSV和哈氏弧菌描述了序列、擴增產物、和診斷引物，它們被更 充分地描述於 WO 2008/024294 (WSSV) ；WO 2008/024293 (IHHNV) ；WO 2008/024292 (TSV)； 和W02008/048673(哈氏弧菌)中。
一般來講兩個引物與樣品DNA、四種三磷酸脫氧核苷酸(即dATP、dCTP、dTTP、和 dGTP)的混合物、耐熱DNA聚合酶如TaqDNA聚合酶在緩衝液中混合。然後使用熱循環儀 使這種混合物進行熱循環以擴增期望的靶區域。熱循環儀可從許多來源商購獲得(例如 Applied Biosystems, Inc. , Foster City, CA ；Brinkmann Instruments, Inc. , Westbury, NY ；MJ Research, Inc. , ffaltham, MA ；Stratagene Corp. , La Jolla, CA)。
病毒基因組
白斑症候群病毒(WSSV)，也稱為白斑杆狀病毒(WSBV)，是一種主要的蝦病原體，它具有高致死率和廣泛的宿主範圍。已經對WSSV的全部基因組進行了測序(van Hulten等 人，Virology 286 :7-22(2001)；以及 Yang 等人，J. Virol. 75 11811-1182(^2001))。該基因 組由雙鏈環狀DNA組成，所述DNA包含305，107個鹼基對(bp)和181個開放閱讀框(ORF) (GenBank AF332093)。在泰國存在至少12個WSSV的變體，它們的區別在於ORF 94中的多 個重複序列長度不同(Wongteerasupaya 等人，Dis. Aquat. Org. 54 :253-257 (2003))
桃拉症候群病毒(TSV)是主要的蝦病原體，它具有高致死率和廣泛的宿主範圍。 已經對TSV的全部基因組進行了測序(GenBank AF277675)。該基因組由單鏈RNA組成，所 述RNA包含10，205個鹼基和2個開放閱讀框(ORF)。
WSSV診斷引物序列
本文所公開的是用於WSSV高靈敏度檢測的多種測定方法的診斷引物序列。這些 引物導向WSSV基因組的區域，它們是WSSV檢測的診斷劑。
引物序列使用一系列「矽片」(即，基於電腦的)序列分析工具根據經驗進行鑑定。 在這一過程中，形成包含所有已知WSSV序列的資料庫。使用Vector NTI 軟體(InforMax， Inc.，Bethesda, MD)基於與其他WSSV序列的同源性、特定的擴增子長度、鹽濃度、Tm (熔融 溫度)、C+G含量和免於形成髮夾結構及二級結構的參數，首先比對然後分析這些序列的引 物位置。然後參照GenBank序列篩選預期的引物。選擇那些確定與其他非靶基因序列的同 源性小於5個鹼基的引物進行PCR擴增效率和最少引物二聚體形成的實驗研究。選擇顯 示高擴增效率和最少引物二聚體形成的引物測試分離自感染多種蝦病原體的蝦的一組DNA 以及來自證實無病害的蝦的DNA。選擇如下那些引物作為可用的引物所述引物擴增所有 WSSV菌株並顯示對來自感染非WSSV病原體的蝦的DNA和分離自證實無病害的不同種類蝦 的DNA無響應。
用於檢測WSSV和它們在WSSV基因組中的位置的引物序列在表1中給出。這些引 物通過標準亞磷醯胺化學法合成或可購自公司如Sigma Genosys, LP。
表1 WSSV診斷引物序列
引物，方向SEQ ID NO:ORFWSSV基因組位置 (GenBank AF332093 )WSSV77F,正向17761335-61358WSSV77R,反向27761420-61443WSSV54F,正向35431287-31309WSSV54R,反向45431391-31414WSSV56F,正向55633145-33168WSSV56R,反向65633269-33292WSSVl30F,正向7130146110-146132WSSV130R,反向8130146212-146234
表1中列出的每個WSSV引物組的擴增子序列如表2所示。為了用作陽性對照，使用標準方法合成WSSV模板。合成模板的濃度和拷貝數通過在沈Onm(OD26tl)進行分光光度 測量來測定。用純化水將模板稀釋成特定的拷貝數並用作定量檢測分析法的陽性對照和標 準品。表2顯示基因組位置、序列鑑定、和靶模板的長度。用於WSSV檢測的引物序列如SEQ ID NO 1-8 所示。
表2 樽板序列
權利要求
1.用於收集、處理及分析來自樣品的靶核酸的方法，所述方法包括(a)提供包含核酸的樣品；(b)將所述樣品轉移到柔性壁容器中；(c)將萃取液加入到所述容器中；(d)用所述萃取液和一種或多種處理試劑在所述容器中處理所述樣品以從所述樣品中 釋放核酸以溶解所述核酸並產生回收液；以及(e)將一部分來自步驟(d)的回收液或產物轉移到合適的檢測系統以用於所述靶核酸 的檢測。
2.權利要求1的方法，其中所述樣品包含固體材料，並且所述處理步驟(d)包括用所述 萃取液和一種或多種處理試劑在所述容器中混合併浸軟所述樣品以幫助釋放所述核酸。
3.權利要求1的方法，其中所述一種或多種處理試劑包含裂解劑，所述裂解劑包含去 汙劑、酶、或者它們的組合；pH在7至7. 8範圍內的緩衝液；氯化鎂；和氯化鉀。
4.權利要求2的方法，其中所述樣品是蝦組織，所述核酸是蝦病原體的診斷劑，並且其 中所述病原體選自白斑症候群病毒、傳染性皮下及造血組織壞死病毒、桃拉症候群病毒、以 及哈氏弧菌。
5.試劑盒，所述試劑盒提供材料和容器以製備樣品並檢測或鑑定診斷性靶DNA或RNA， 所述試劑盒包括(a)柔性壁容器，樣品在該柔性壁容器中進行處理，(b)萃取液，(c)一種或多種處理試劑，以及(d)移液管，所述移液管用於收集並測量用所述萃取液和一種或多種處理試劑在所述 容器中處理所述樣品而產生的回收液，並且用於將所述回收液轉移到合適的檢測系統中。
6.權利要求5的試劑盒，其中所述容器具有連接到所述容器頂部的閉合件，並且其中 所述容器由聚丙烯或聚乙烯製成，具有介於1和8密耳之間(0. 025至0. 20mm)的厚度，並 且具有介於0. 5和1，OOOmL之間的尺寸。
7.權利要求5的試劑盒，所述試劑盒還包括過濾介質或過濾顆粒。
8.用於樣品製備和靶核酸檢測或鑑定的診斷系統，所述診斷系統包括(a)柔性壁容器，樣品在該柔性壁容器中進行處理；(b)萃取液；(c)一種或多種處理試劑；(d)移液管，所述移液管用於收集並測量用所述萃取液和一種或多種處理試劑在所述 容器中處理所述樣品而產生的回收液，並且用於將所述回收液轉移到合適的檢測系統中； 以及(e)檢測系統，所述檢測系統包括檢測介質、基於選自下組的技術的設備PCR、 RT-PCR、等溫擴增、基因測序或探針雜交技術、和處理器。
9.權利要求8的系統，其中所述處理器包括熱循環儀或烘箱式加熱器。
10.權利要求8的系統，所述系統還包括檢測方法，其中所述檢測方法是標準的非變性 凝膠電泳、變性梯度凝膠電泳、溫度梯度凝膠電泳、毛細管電泳、或螢光檢測。
11.權利要求8的系統，其中所述檢測系統基於PCR，並且所述檢測介質包含至少一個與靶核酸互補的引物組，所述靶核酸是DNA ；耐熱聚合酶；核苷酸；緩衝液和一種或多種檢 測探針。
12.權利要求8的系統，其中所述檢測系統基於RT-PCR，並且所述檢測介質包含至少一 個與靶核酸互補的引物，所述靶核酸是RNA ；熱活化的耐熱聚合酶；逆轉錄酶；核苷酸；緩衝 液；和RNA酶抑制劑。
全文摘要
本發明涉及用於收集和處理樣品以釋放和處理用於基因序列檢測的DNA和RNA的方法、試劑盒和系統。本文所述方法從組織和細胞材料中迅速簡便地釋放並回收DNA和RNA。
文檔編號C12Q1/68GK102037138SQ200980117982
公開日2011年4月27日 申請日期2009年5月19日 優先權日2008年5月19日
發明者J·A·裡文巴克, R·C·埃伯索爾 申請人:納幕爾杜邦公司