用於水稻細菌性谷枯病菌檢測的引物對及檢測方法
2024-03-26 05:25:05
專利名稱：用於水稻細菌性谷枯病菌檢測的引物對及檢測方法
技術領域：
本發明涉及生物檢測技術，具體地說涉及水稻細菌性谷枯病菌檢測用引物和檢測方法。
背景技術：
水稻細菌性谷枯病(Bacterial grain rot of rice)是由穎殼伯克氏菌(Burkholderia glumae)引起，是近年來一種危害嚴重的水稻種傳病害，它不但侵害穀粒，而且還引起水稻秧苗腐爛，造成水稻的嚴重減產和損失。種子帶菌是該病菌遠距離傳播的主要途徑，播種帶菌病穀粒，遇有適宜的發病條件，如高溫多日照，降雨量少易發病。病菌可通過氣孔和傷口侵入，病菌在植株體內繁殖，在細胞間擴散，引起葉鞘薄壁組織的分解。
1970年代後期由於推行機械化生產而進行大面積的工廠化育秧，導致B. glumae引起的水稻苗腐病大流行，目前該病已成為日本水稻最嚴重的病害之一，並造成傳播流行。目前水稻細菌性谷枯病已經蔓延到印度尼西亞、泰國、越南、韓國、斯裡蘭卡、馬來西亞、菲律賓等東南亞國家及南美洲的哥倫比亞等國。非洲的坦尚尼亞及美國的路易安那洲相繼報告有該病發生。Shahjahan等報導該病在美國可導致15 80X的產量損失。我國臺灣地區1983年也有水稻細菌性谷枯病的發生報導並在病原及品種抗性方面做過一些研究。也曾有報導我國貴州省有細菌性谷枯病的發生，但未得到進一步的證實。
近年來，隨著我國農業產業的多樣化和引種種植及加工貿易的發展，我國農業種子出入境貿易在品種和規模上都逐年增長。目前我國有幾十萬噸水稻種子出口到國外，也有水稻、玉米等多種種質資源進口 ，經濟一體化和引種種植等，我國對外的種子貿易逐年加大。水稻細菌性谷枯病隨種子和相關材料從境外傳入我國的風險加大。據報導，在具有枯萎症狀的胡椒、番茄、馬鈴薯、茄子、紫蘇、芝麻和向日葵中都分離到了B. glumae菌，說明其傳入的潛在風險進一步加大。我國雜交水稻種子出口到多個國家，印尼等一些國家對我國的雜交水稻種子提出了細菌性谷枯病的檢測要求，從檢疫上也制約了我國水稻種子的進入。為了嚴格控制水稻細菌性谷枯病傳入我國，嚴重危害我國的水稻種植和農業生產安全，我國必須加強對多種植物種子和材料的水稻細菌性谷枯病的檢疫和控制。目前我國尚無水稻細菌性谷枯病的檢測方法和相關的病理材料，極不適應我國檢驗檢疫部門在種子出入境檢疫中對該病的檢測和控制。 日本、韓國、美國、越南等國已有多起細菌性谷枯病分離和危害的報導。日本和韓國由於Burkholderia glumae.對水稻的危害嚴重，在病原和危害發生等方面進行了較多的研究。1986年Tushima， S. ， S. Wakimoto，等研究了檢測Burkhol deria glumae的檢測性培養基；2000年，Mitsuo K， Kiyotsugu. 0等研究用於分離Burkholderia glumae的選擇性培養基；1987年Wakimoto S.等對Burkholderia glumae特異性的血清學方面行了研究。Won, So-Yo皿，Lim， Jae-Yoon等對Burkholderia glumae全基因序歹腿行了分析；Jeong，Yeonwa， Kim， Jinwoo等確證了從多種萎蔫症植物中分離到Burkholderia glumae並提出其毒黃菌素與其產生腐根和爛種病理症狀相關；日本學者Yukiiko Maeda等用MAMA-PCR方法檢測Burkholderia glumae中的抗oxolinic acid基因。Schaad. N. W等在PLANTPATHOGENIC BACTERIA (Third Edition 2001)中就伯克氏菌的檢測進行了論述。在檢測方法方面，一些學者已建立了 Burkholderia glumae分離培養及細菌學鑑定方法，也有關於Burkholderia glumae的分子生物學檢測的研究和報導，Ronald J. Sayler等曾設計了檢測水稻細菌性谷枯病菌的引物及探針，並採用常規PCR方法和實時螢光PCR方法對水稻細菌性谷枯病菌進行了檢測，Toru Takeuchi等也曾設計了一對檢測水稻細菌性谷枯病菌的引物。 水稻細菌性谷枯病在我國還屬於一種新病害(除臺灣外)，被國家質檢總局納入了《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》。我國對於Burkholderia glumae的研究很少，病原材料和研究資料也相當缺乏。浙江大學謝關林等人在進行水稻穀枯病的風險分析研究。目前我國缺乏水稻細菌谷枯病的檢測方法和標準。
發明內容
本發明目的在於提供用於水稻細菌性谷枯病菌雙重PCR-DHPLC檢測的引物和方法。 本發明通過已報導的水稻細菌性谷枯病菌ITS區域序列(genebank D87080)和gyrB基因(genebank AB207074)序列，設計了用於本發明的引物對，所述的兩對由正向和反向引物組成的引物對，其核苷酸序列分別為
SEQ ID NO. 1 :5' -ACACGGAACACCTGGGTA-3'
SEQ ID NO. 2 :5' -TCGCTCTCCCGAAGAGAT-3，
SEQ ID NO. 3 :5' -GCAGCGGCAAGGAAGACG-3'
SEQ ID NO. 4 :5， -GTCGTCGCCCGACGTCTC—3，。 本發明還給出了應用上述引物的雙重PCR-DHPLC方法，其以細菌DNA為模板，進行雙重PCR擴增，擴增後的PCR產物直接進行DHPLC分析。 其反應體系為10XTaq buffer 2. 5 ii L， dNTPs (lOmmol/L) 0. 5 ii L，MgCl2(25,l/L)2iiL，10iimol/L弓l物各l.OiiL， Taq DNA polymerase (2U/ii L) 1. 0 ii L，lng/ ii L 10ng/ ii L DNA模板5 y L，以滅菌雙蒸水補足至25 y L。 其中，上述反應條件可以是96。C預變性5min ;96。C變性30s， 55。C退火30s， 72°C延伸30s，循環反應30次；72。C延伸5min。 DHPLC分析條件設定為進樣量5iiL，柱溫50。C，起始A液(0. lmol *L—'三乙胺乙醯鹽)濃度為44. 8%， B液(0. lmol L—1三乙胺乙醯鹽和25%乙腈)濃度為55. 2%，起始時間為0. 5min，結束A液濃度為35. 8% ，B液濃度為64. 2% ，結束時間為5min，流速0. 9mL/miru 本發明還建立了進一步對雙重PCR-DHPLC分析得到結果陽性的PCR產物進行鑑定的DHPLC分子鑑定體系和分子標本。即以引物SEQ ID NO. 3和4擴增水稻細菌性谷枯病菌菌株DNA的PCR產物作為PCR-DHPLC鑑定方法的標記物。未知擴增產物通過與該標記物進行半變性DHPLC分析可以對未知菌進行水稻細菌性谷枯病菌的鑑定。DHPLC檢測條件為設定片段大小為317bp，每次進樣5 ii L，檢測溫度Tm = 64°C ，以流速0. 9mL min—1進行分析。
4
本發明還提供含有所述弓I物的試劑盒。 進一步，本發明提供的試劑盒中還有引物SEQ ID N0.3和4擴增的陽性片段。
本發明設計用於檢查水稻細菌性谷枯病菌的引物特異性好，檢測靈敏度高，本發明的檢測方法準確性高、靈敏度高，其能夠快速簡單地判斷樣品是否有水稻細菌性谷枯病菌，為進出口安全提供了保證。
圖1雙重PCR-DHPLC檢測水稻細菌性谷枯病菌DNA結果；
圖2本發明方法靈敏度檢測結果； 圖3引物BGF3-BGR3擴增水稻細菌性谷枯病菌DNA片段DHPLC半變性檢測。
具體實施例方式
下面實施例用於對本發明的進一步說明，但不用來限制本發明的範圍。 實施例1 引物的設計和合成 根據報導的水稻細菌性谷枯病菌ITS區域序列(genebank D87080)，設計了引物序列為 SEQ ID NO. l(正向):5， -ACACGGAACACCTGGGTA—3，;
SEQ ID NO. 2(反向)5， -TCGCTCTCCCGAAGAGAT—3，。 根據報導的水稻細菌性谷枯病菌gryB基因(genebank AB207074)，設計了引物和探針，引物序列為 SEQ ID NO. 3(正向):5， —GCAGCGGCAAGGAAGACG—3，;
SEQ ID NO. 4(反向):5， -GTCGTCGCCCGACGTCTC—3，。
實施例2 雜交稻種中水稻細菌性谷枯病菌的分離 選用文獻報導的水稻細菌性谷枯病菌半選擇性分離培養基S-PG瓊脂培養基對水稻材料中的病菌進行分離培養。細菌性谷枯病菌在S-PG上呈現兩種生長形態，一種菌落為紅褐色、圓形、光滑、隆起；另一種菌落為淡紫色、圓形、光滑、隆起。
樣品處理方法 大量種子樣品先用蒸餾水衝洗後，稱取10g或400粒種子放入90mL 0. 001 %吐溫_磷酸鹽緩衝液(pH7. 0)中低溫(5°C 15°C )浸泡4 6h，用均質器打碎，製備樣品提取液。如果是檢測少量的種子樣品，取20粒種子加入10mL滅菌的0. 001%吐溫-磷酸鹽緩衝液(pH7. 0)，用滅菌槌和研缽或是攪拌器將種子充分碾磨，製成提取液。
將樣品提取液置於22°C 25t:環境中4 6h後，旋渦混勻懸浮液5min，懸浮液進行十倍梯度稀釋，稀釋後的IOX，和100X以及1000X三個稀釋度的懸浮液取1. OmL，分別放入到5個S-PG平皿中(每個平皿加0. 2mL)。用L-型玻璃棒將液體均勻塗布在瓊脂的表面。 接種後的平皿28°C 士rC培養2d 3d後觀察生長菌落形態。
實施例3
細菌DNA的提取 1)直接挑取S-PG平板上生長的典型或疑似菌落至少5個至1. 5mL離心管中，加入lmL滅菌水充分振蕩，12000g離心3min，棄上清，再向管中加入lmL滅菌水，重複三次，取沉澱進行DNA提取； 2)在沉澱中加入TE緩衝液600 ii L， 10% SDS溶液30 y L， 20mg/mL蛋白酶K15 y L，
混勻，37t:水浴孵育lh。 3)加入等體積的三氯甲烷-異戊醇(24 : l)，混勻。10000g離心5min，將上清液
移至一個新離心管中。4)加入等體積酚-三氯甲烷-異戊醇(25 : 24 : 1)，混勻，10000g離心5min，將
上清液移至一新離心管。 5)加入O. 6倍體積的異丙醇，輕輕混勻，-2(TC沉澱lh， 10000g離心5min，棄上清。
6)加入lmL70X乙醇洗滌沉澱，8000g離心，棄上清，晾乾。
7)加入50 ii LTE緩衝液溶解DNA沉澱，-2(TC長期保存備用。
實施例4 雙重PCR-DHPLC檢測方法的建立 本方法選擇了 8株購買自NCPPB的不同國家地區發生的水稻細菌性谷枯病菌菌株作為陽性對照，同時採用了水稻種子中分離的部分微生物、幾種常見並與水稻細菌性谷枯病菌近緣的植物病原菌及部分其它植物病原菌做為參試菌株進行比較分析。供試菌株具體情況如表l。 表1供試菌及其來源
菌株菌種名稱來源菌株編 號菌種名稱來源
Al水稻細菌性谷枯病菌NCPPB2391CK6洋蔥伯克霍爾德氏菌CGMCC 1. 1813
A2水稻細菌性谷枯病菌NCPPB2891CK7燕麥假單胞菌CGMCC 1. 1726
A3水稻細菌性谷枯病菌NCPPB3591CK8丁香假單胞菌黍致病變種NCPPB 1835
A4水稻細菌性谷枯病菌NCPPB3673CK9成團泛菌NCPPB 2274
A5水稻細菌性谷枯病菌NCPPB3674CK10胡蘿蔔軟腐歐文氏胡蘿 卜軟腐變種CGMCC 1. 1000
A6水稻細菌性谷枯病菌NCPPB3708CK11水稻白葉枯病菌NCPPB 2446
A7水稻細菌性谷^t病菌NCPPB3923CK12水稻細菌性條斑病菌NCPPB 1632
A8水稻細菌性谷枯病菌NCPPB3924CK13西瓜細菌性果斑病菌NCPPB 4207
CK1唐菖蒲伯克霍爾德菌自然種子分離CK14玉米細菌性^ 萎病菌ATCC 29227
CK2黃單胞菌屬菌自然種子分離CK15草生歐文氏菌NCPPB 1269
CK3假單胞菌屬菌自然種子分離CK16梨火疫病菌ATCC 15580
CK4泛菌屬自然種子分離CK17蘭花褐斑病菌ATCC 10200
CK5洋蔥軟腐病菌ATCC 11662CK18番茄潰瘍病菌ATCC 14456 對上述菌株進行DNA提取後，應用下述反應體系和條件進行雙重PCR檢測研究。所使用PCR儀器為Biometra公司產品。 反應體系10 X Taq buffer 2. 5 ii L， dNTPs (lOmmol/L) 0. 5 ii L， MgCl2 (25,1/ L) 2 ii L， 10 ii mol/L弓|物各1. 0 ii L， Taq DNA polymerase (2U/ ii L) 1. 0 ii L， lng/ ii L 10ng/ ii LDNA模板5 ii L，以滅菌雙蒸水補足至25 y L。 反應條件96。C預變性5min ;96。C變性30s，55。C退火30s，72。C延伸30s，循環反 應30次；72。C延伸5min。 將PCR產物放入DHPLC進樣室，洗脫液由緩衝液A(O. lmol *L—'三乙胺乙醯鹽)和 緩衝液B(O. lmol *L—工三乙胺乙醯鹽和25%乙腈)組成，在檢測起始為時間0. 5min，洗脫液 A液起始濃度為44. 8% ，緩衝液B液起始濃度55. 2% ，檢測結束時間為5min，洗脫液A液終 止濃度為35. 8% ，緩衝液B液終止濃度64. 2% ，柱溫50°C ，系統自動按照線性遞增的方式， 以流速0. 9mL min—1的流速將DNAS印柱上的DNA分子洗脫下來，波長260nm處讀取吸光 值，經系統自動處理後，形成DHPLC峰型圖譜，供分析鑑定。
特異性檢測 採用提取得到的水稻細菌性谷枯病菌陽性菌株DNA和其它參試菌株DNA進行檢
測，用水作為對照進行擴增。 試驗結果 8株水稻細菌性谷枯病菌均擴增出明顯的陽性峰，見圖1。其它參試菌株DNA均無 陽性信號。 靈敏度檢測 接種水稻細菌性谷枯病菌於100ml PSA液體培養基中，28。C震蕩培養24h，用平板 計數法對菌濃度進行測定，並將培養液用生理鹽水製成105、 104、 103、 102、 101 (CFU/mL) 5個稀 釋梯度。提取DNA，進行雙重PCR-DHPLC靈敏度檢測。 試驗結果如圖2，利用本方法能有效地從含有4X 102CFU/mL的水稻細菌性谷枯病 菌的菌液中檢測出該病原菌。 實施例5PCR-DHPLC分子標準體系的建立 通過鑑定8株水稻細菌性谷枯病菌DNA擴增產物序列的同源性是否一致，以期建 立統一的分子標本和分子標準體系。 採用DHPLC對同一對引物擴增得到的PCR產物間進行了序列半變性檢測將每兩 種同數量級濃度的PCR產物相互間按照1 : 1的比例混合，將混合產物及單一 PCR產物在 PCR儀上進行以下變性_復性過程95t:起始變性5min，94. 5"C變性20s，以後每20s —個 循環降低0. 5t:，緩慢降溫到25°C，以形成同源或異源雙鏈DNA分子混合物。將降溫處理後 的PCR產物放入DHPLC進樣室，輸入被檢測片段序列，設定每次進樣5ii L。檢測溫度以該序 列片段的解鏈溫度(Tm = 63. 9°C )為參照，分別選擇柱溫為64。C，設定片段大小317bp，以 流速0. 9mL min—、進行DHPLC分析。 通過變性並緩慢復性處理的PCR混合產物，進行半變性DHPLC分析結果為引物 SEQID NO. 1和2擴增8株陽性菌株DNA得到的PCR產物進行DHPLC半變性比較分析時， 部分陽性菌株出現非特異性的多峰，可能在擴增片段區間內存在部分位點的差異而影響 DHPLC分析結果；引物SEQ ID NO. 3和4擴增水稻細菌性谷枯病菌A1-A8DNA的PCR產物在 4. 27min(圖3)左右均只出現一個明顯的吸收峰，結果與相同處理後的單一 PCR產物結果一致。試驗證明通過引物SEQ ID NO. 3和4進行PCR擴增後，各水稻細菌性谷枯病菌DNA 的PCR產物片段序列一致，同源性高，無突變位點。 因引物SEQ ID NO. 3和4擴增8株菌株的PCR產物序列均一致，可以建立起以引 物SEQ ID NO. 3和4擴增A1-A8中任意一株菌株DNA的PCR產物作為PCR-DHPLC鑑定方法 的標記物。將未知的片段大小一致或相近的PCR產物與分子標本進行變性並緩慢復性處理 後，進行DHPLC半變性分析。DHPLC鑑定條件為設定片段大小為317bp，每次進樣5 y L。檢 測溫度Tm = 64°C ，以流速0. 9mL *min—、進行DHPLC分析。結果出現單一的峰型且其它峰 型正常情況下，可判斷為水稻細菌性谷枯病菌。序列表〈110〉湖南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心〈120〉用於水稻細菌性谷枯病菌檢測的引物對及檢測方法〈130>PLH09659〈140>200910043810. 4〈141>2009-07-01〈160>4〈170>PatentIn version 3. 1〈210>1〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>13C3cgg朋ca cctgggte〈210>2〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>2tcgctctccc gaagagat〈210>3〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>3gcagcggc朋gg朋gacg〈210>4〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>4
gtcgtcgccc gacgtctc 18
權利要求
用於水稻細菌性谷枯病菌檢測的引物對，其核苷酸序列為SEQ ID NO.15』-ACACGGAACACCTGGGTA-3』；SEQ ID NO.25』-TCGCTCTCCCGAAGAGAT-3』。SEQ ID NO.35』-GCAGCGGCAAGGAAGACG-3』；SEQ ID NO.45』-GTCGTCGCCCGACGTCTC-3』。
2. —種利用引物SEQ ID N0.3和4所擴增的陽性片段。
3. —種檢測水稻細菌性谷枯病菌的方法，該方法以水稻細菌性谷枯病菌的DNA為模 版，利用權利要求1所述的引物進行雙重PCR擴增，反應結束後應用DHPLC進行結果分析和 判定。
4. 如權利要求3所述的方法，其特徵在於，雙重PCR的反應過程中的退火溫度為55°C。
5. 如權利要求3所述的方法，其特徵在於，DHPLC檢測過程中，檢測片段設定大小為 317bp。
6. 如權利要求3所述的方法，其特徵在於，DHPLC判定過程中，應用權利要求2中的 陽性片段作為分子標本並建立分子標準體系進行水稻細菌性谷枯病菌的判定，判定柱溫為 64°C。
7. 含有權利要求1所述引物的試劑盒。
8. 如權利要求7所述的試劑盒，其還包括權利要求2所述的陽性片段。
全文摘要
本發明提供了兩對水稻細菌性谷枯病菌檢測用的引物，所述引物的核苷酸序列為SEQID NO.15』-ACACGGAACACCTGGGTA-3』；SEQ ID NO.25』-TCGCTCTCCCGAAGAGAT-3』和SEQ ID NO.35』-GCAGCGGCAAGGAAGACG-3』；SEQ ID NO.45』-GTCGTCGCCCGACGTCTC-3』。本發明還進一步提供了檢測水稻細菌性谷枯病菌的方法，該方法對樣品中水稻細菌性谷枯病菌進行分離，以細菌DNA為模板，利用上述引物進行雙重PCR擴增，擴增產物進行DHPLC分析，得到的陽性結果，利用引物BGF3和BGR3擴增得到陽性片段作為的分子標本進行鑑定。本發明引物特異性好，檢測方法準確性高，靈敏度高，為進出口安全提供了保證。
文檔編號C12Q1/68GK101712982SQ200910043810
公開日2010年5月26日 申請日期2009年7月1日 優先權日2009年7月1日
發明者朱金國, 莫瑾 申請人:湖南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心