用於將基因導入淋巴細胞或血細胞中的啟動子及其應用的製作方法

2024-04-02 18:36:05 2

專利名稱：用於將基因導入淋巴細胞或血細胞中的啟動子及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於將基因導入淋巴細胞或血細胞中的啟動子以及其應用本申請是申請日為2006年9月5日，申請號為200680041278. 7的、發明名稱和本發明相同的發明專利申請的分案申請。
背景技術：
為了治療以淋巴細胞為靶的各種疾病，例如人免疫缺陷病毒(HIV)感染，亟待建立針對淋巴細胞實施基因治療的技術。但是，迄今尚未開發出令人滿意的、向淋巴細胞導入所需基因的載體系統。皰疹病毒(HHV)是屬於皰疹病毒屬的病毒的總稱。人皰疹病毒6和7(HHV_6 和HHV-7)均是屬於皰疹病毒屬β皰疹病毒亞屬的雙鏈DNA病毒，是引發幼兒急診的病毒(Yamanishi K.等人，「Identif ication of human herpesvirus 6 as a casual agent for exanthem subitum」，Lancetl988 ；i :1065-1067 以及 Tanaka K.等人，「Human herupesvirus 7 :Another casual agent for roseola (exanthem subitum)，，，J· pediatr·， 1994;125:1-5) ο HHV-6包括HHV-6A和HHV-6B兩株。它多在幼兒期患病，引起以突發高熱以及在退熱前後發疹子為特徵的病毒感染症，一般預後良好。由於HHV-7感染具有比HHV-6 感染遲的傾向(Tanaka K.等人，「Seroepidemiological study of human herpesvirus-6 and-7 in children ofdifferent ages and detection of those two viruses in throat swabs by polymerase chain reaction」，Journal of Medical Virology,1996 ；48 88-94)，故從臨床經驗來看，由HHV-7引起的幼兒急診多為第二次幼兒急診。有報導稱，血清流行病學檢查發現，幾乎所有兒童在2-3歲前均表現為HHV-6和HHV-7抗體陽性，隱性感染率為20-40%。HHV-7是1990年Frenkel等人在培養健康正常人末梢血的⑶4+T淋巴細胞過程中發生了細胞病理效應而發現的皰疹病毒(Frankel N.等人，「Isolation of a new herpesvirus from human CD4+T cells，，，ProNASUSA，87 :749-752, ProNAS USA, 87 749-752,1990) ο它是從人末梢血單核細胞中分離出來的病毒。HHV-6、HHV_7均為嗜⑶4+T 淋巴細胞的病毒。HHV-7通過細胞表面的CD4受體進行感染，它只能在人T淋巴細胞中增殖。因此，HHV-7是可用來對人T淋巴細胞進行基因修飾的病毒。HHV-7的基因組為雙鏈DNA，約145kbp。Nicholas等人已測定出了其全部的鹼基序列，已知其基因組中至少存在101個基因(John N.等人，Journal of Virology, Sep. 1996， 5975-5989)。然而，對於這些HHV來說，目前還沒有對它們的啟動子活性進行詳細分析。此外， 淋巴細胞對這些病毒具有特異性，這是由於這些病毒與細胞中的受體相互作用，以及這些病毒僅能夠在人T淋巴細胞中增殖的生活周期。此外，一般認為這些病毒對健康的正常人幾乎沒有危害，特別是HHV-7。將含有各種病毒(如腮腺炎病毒)的抗原決定簇的基因整合到HHV-7病毒基因組中並在HHV-7中進行表達，則HHV-7可用作為疫苗。但是，當HHV-7作為疫苗時，其在傳代培養的同時基因型會發生變化，從品質管理和品質保證的角度考慮，這是不優選的。因此，將重組病毒作為疫苗使用時，需要穩定地提供源於單一的重組基因型的病毒。為此，需要開發出製備具有單一基因型的HHV-7重組病毒的方法。再有，人們研究了 T淋巴細胞株SupTl細胞中HIV感染和親T淋巴細胞的人皰疹病毒(HHV-6A(U1102株)、HHV-7(MRK，MS0株))之間的關係。HHV-7株結合細胞表面的CD4 受體，能在SupTl細胞中很好地增殖，但其不能感染SupTl/HIV細胞。相反地，已經認識到 HHV-6A株可感染經HIV持續感染的SupTl細胞(SupTl/HIV)並呈現出明顯的CPE(Masao Yamada 等人，"HIV Jizokukansen SupTl Saiboheno HHV-6 oyobi-7 Choufukukannsen no Kokoromi(Attempt for HHV-6and_7 Superinfection to HIV Persistent Infection Sup-Tl Cell)，，,TitleNo. 122,Titles and Abstracts of the 7th Annual Meeting of the JapaneseSociety for AIDS Research,1993, Tokyo)。理想的HIV疫苗能夠產生針對所有類型HIV的優良而持久的保護作用。另一方面， 傳統的滅活HIV疫苗有優勢也有缺陷，下文將進行部分說明。一種製備重組疫苗的方法採用常規技術。然而，由於其難以維持免疫原性(imimmogenicity)(免疫原性低)，需要使用佐劑進行大劑量的抗原負載和頻繁地接種。安全性是最值得關注的。含有裸露的或重組的亞單位的亞單位疫苗是安全的。然而，由於使用亞單位並且免疫原性低，該疫苗需要用佐劑進行大劑量的抗原負載以及頻繁地接種。而且，安全性是最重要的問題。此外，含有裸露的或重組的亞單位的亞單位疫苗可能是安全的，但是由於這些亞單位的選擇性差以及免疫原性低而受到限制，因此，需要開發用於處理免疫應答細胞的有用疫苗，如HIV疫苗等等。[非專利文獻 1] Yamanishi K ^A "Identification of human herpesvirus 6 as a casual agent for exanthem subitum.，，，Lancet 1988 ；i :ρρ· 1065-1067[非專禾Ij文獻 2] Tanaka K 等人，「Human herpesvirus 7 Anothercasual agent for roseola (exanthem subitum)，，，J pediatr. 1994 ；125 :ρρ· 1-5[非專利文獻 3] Tanaka-Taya K 等人，「 Seroepidemiological study of human herpesvirus-6 and~7 in children of different ages and detection ofthose two viruses in throat swabs by polymerase chain reaction」， Journal ofMedical Virology. 1996 ；48 :ρρ·88-94[非專利文獻 4]Frankel N 等人，「 Isolation of a new herpesvirus fromhuman CD4+T cells. 」，ProNAS USA 87 :749-752, ProNAS USA 87 :749-752,1990[非專利文獻 5] John N.等人，Journal of Virology, Sep. 1996, pp. 5975-5989[非專利文獻6]Masao Yamada等人，「HIV Jizokukansen SupTl Saiboheno HHV-6 oyobi-7 Choufukukannsen no Kokoromi(Attempt for HHV-6and-7Superinfection to HIV Persistent Infection Sup-Tl Cell)」，TitleNo. 122，Titles and Abstracts of the 7th Annual Meeting of the JapaneseSociety for AIDS Research，1993，Tokyo

發明內容
發明要解決的技術問題本發明的目的在於提供一種啟動子，其在免疫系統細胞或血細胞中，如在淋巴細胞中選擇性地有效誘導基因表達。解決技術問題的手段本發明發現HHV6的MIE啟動子、HHV67的MIE啟動子以及HHV7的U95啟動子令人驚奇地在免疫應答細胞如T淋巴細胞或血細胞系細胞中誘導特異性表達，已經解決了上述問題。DNA疫苗是一種誘人的新技術，在其開發過程中，有效表達的啟動子是關鍵的。迄今，人巨細胞病毒(HCMV)立即早期(IE)啟動子被廣泛地用於DNA疫苗。這是由於一般認為總體上HCMV IE啟動子在各種細胞中具備有效活性。然而，據報導，HCMV IE啟動子在淋巴細胞系細胞中的表達效率低，並且出現由甲基化等原因而引起的滅活現象。而且，還存在與多種限制相關的問題，這阻礙HHV IE啟動子在DNA疫苗中的應用。已知HCMV能夠感染有限數量的細胞，其能夠感染成纖維細胞和血液內皮細胞等。 另一方面，HHV-6感染嬰兒，並引起幼兒急診或者幼兒玫瑰疹(roseola infantum)，並且已知在人淋巴細胞特別是T細胞中，HHV-6能夠很好地增殖。本發明人已經在本發明中闡明了 HHV-6的主要立即早期基因(MIE)與HCMV—樣，具有強大的啟動子活性，HHV-6屬於人皰疹病毒屬β皰疹病毒亞屬。本發明人還闡明MIE基因啟動子可用於DNA疫苗。HHV-7也是定向CD4+T淋巴細胞的病毒，並且它的啟動子可用於開發DNA疫苗，例如該疫苗用於阻止或治療與⑶4+Τ淋巴細胞相關的疾病。本發明人在本發明中還闡明HHV 7 MIE啟動子和HHV 7 U95啟動子的效用，因此也闡明了這些啟動子可被用於製備DNA疫苗。因此，本發明提供了如下內容(1)HHV6B 的 MIE 啟動子。(2)如1項的啟動子，其至少包含SEQ ID NO 1所示的序列中的8個毗鄰的核苷酸。(3)如1項的啟動子，其至少包含SEQ ID NO 1中所示的序列中的R3區或其功能性變體。(4)如1項的啟動子，其至少包含距離SEQ ID NO=I的轉錄起始點_574到-427的序列(SEQ ID NO :13)。(5)如1項的啟動子，其至少包含距離SEQ ID NO=I的轉錄起始點-1051到-427 的序歹丨J (SEQ ID NO 14)。(6)如1項的啟動子，其包含NF- κ B的基序和ΑΡ-1的基序。(7)如1項的啟動子，其包含SEQ ID NO 1中所示的序列。(8)如1項的啟動子，其中所述啟動子包含(a)具有SEQ ID NO :1中所示的鹼基序列或者與之對應的鹼基序列或其序列片段的多核苷酸；(b) SEQ ID NO :1中所示的鹼基序列或者與之對應的鹼基序列的等位基因變體或其序列片段的多核苷酸；(c)與(a)或(b) 的任何一種的多核苷酸雜交並且具有其一種生物活性的多核苷酸；或者(d)由(a)-(c)中的任何一種的鹼基序列或者具有至少70%同一性的互補序列組成並且具有其一種生物活性的多核苷酸。(9)如1項的啟動子，其長度至少為10個毗鄰的核苷酸(10)如8項的啟動子，其中所述生物活性是啟動子活性。(11) 一種包含如1項的啟動子的核酸構建體。
(12)如11項的核酸構建體，其包含編碼外源基因的序列，其與該啟動子不相關但是被可操作地連接到啟動子序列上。(13)如12項的核酸構建體，其中所述外源基因編碼RNAi分子、藥物、將被刪除的隱性基因或者選擇性標記。(14)如13項的核酸構建體，其中選擇性標記允許在培養基中選擇其中導入了該核酸構建體的宿主。(15)如13項的核酸構建體，其中選擇性標記允許從視覺上選擇其中導入了該核酸構建體的宿主。(16)如13項的核酸構建體，其中選擇性標記包含次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(hprt)或者一種選自由綠色螢光蛋白(GFP)、蘭綠色螢光蛋白(CFP)、黃色螢光蛋白 (YFP)和紅色螢光蛋白(dsRed)組成的組的螢光標記。(17)如13項的核酸構建體，其中選擇性標記對其中導入了核酸構建體的宿主基本上不具有毒性。(18)如13項的核酸構建體，其中將被刪除的隱性基因選自由ADA基因、PNP基因、 Y c鏈基因、TAP基因、MHC II基因、X-連接WASP、⑶40配體、PII樣基因和DNA解旋酶組成的組。(19)如13項的核酸構建體，其中藥物選自由細胞因子、趨化因子、生長因子、蛋白激素和肽激素(如幹擾素(IFN)-Ci、IFN-Y、白介素[IL]-2、IL-12、粒細胞集落刺激因子 W-CSF]、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子[GM-CSF])組成的組。(20)如12項的核酸構建體，其中所述啟動子在血細胞系細胞，特別是T細胞中誘導外源基因的特異性表達。(21) 一種包含如11項的核酸構建體的表達載體。(22) 一種包含如11項的核酸構建體的細胞。(23)如22項的細胞，其中所述細胞對於所述啟動子序列來說是異源的。(24) 一種包含如11項的核酸構建體的組織。(25) 一種包含如11項的核酸構建體的器官。(26) 一種包含如11項的核酸構建體的生物體。(27) 一種藥物組合物，其包含如1項的啟動子和編碼一種抗原的序列。(28)如27項的藥物組合物，其是DNA疫苗。(29) 一種用於治療其中期望進行淋巴細胞特異性治療的疾病、異常或症狀的藥物組合物，其包含如1項的啟動子以及用於所述治療的核酸序列。(30)如四項的藥物組合物，其中用於所述治療的核酸序列包含選自由編碼細胞因子、趨化因子、生長因子、蛋白激素、肽激素、核酶和RNAi (HIV-1 gp41 :AATAAGACAGGGCTTG GAAAGACACTTTCCAAGCCCTGTCTTATTTTT(SEQ ID NO 33)/HIV-I tat :AAGCATCCAGGAAGTCAGCC TACAAGGCTGACTTCCTGGATGCTTTTT(SEQ ID NO 34)/HTLV-I tax :GAACATTGGTGAGGAAGGCACAG CCTTCCTCACCAATGTTCTTTTT (SEQ ID NO 35))的那些序列組成的組的序列。(31)用於以淋巴細胞特異性方式地表達一種蛋白質的方法，包括步驟A)製備一種核酸構建體，其中如1項的啟動子被可操作地連接到編碼蛋白質的核酸序列上；和
B)將該核酸構建體放置在其中所述啟動子誘導編碼蛋白質的核酸序列表達的條件下。(32)用於以淋巴細胞特異性方式表達一種蛋白質的試劑盒，包含A) 一種核酸構建體，其中如1項的啟動子被可操作地連接到編碼蛋白質的核酸序列上；和B)用於將該核酸構建體放置在其中所述啟動子誘導編碼蛋白質的核酸序列表達的條件下的工具。(33)用於以淋巴細胞特異性方式表達一種蛋白質的試劑盒，包含A)如1項的啟動子；和B)用於製備其中所述啟動子被連接到編碼蛋白質的核酸序列上的核酸構建體的工具。(34)用於治療或預防一種需要以淋巴細胞特異性方式表達一種蛋白的疾病、異常或症狀的方法，包括步驟A)製備其中如1項的啟動子被連接到編碼蛋白質的核酸序列上的核酸構建體；和B)將該核酸構建體放置在其中所述啟動子誘導編碼蛋白質的核酸序列表達的條件下。(35)用於治療或預防一種需要以淋巴細胞特異性方式表達一種蛋白的疾病、異常或症狀的試劑盒，包含A)其中如1項的啟動子被連接到編碼蛋白質的核酸序列上的核酸構建體；和B)用於將該核酸構建體放置在其中所述啟動子誘導編碼蛋白質的核酸序列表達的條件下的工具。(36)用於治療或預防一種需要以淋巴細胞特異性方式表達一種蛋白的疾病、異常或症狀的試劑盒，包含A)如1項的啟動子；和B)用於製備其中所述啟動子被連接到編碼蛋白質的核酸序列上的核酸構建體的工具。(37) 一種製備蛋白質的方法，包括步驟A)製備其中如1項的啟動子被連接到編碼蛋白質的核酸序列上的核酸構建體；和B)將該核酸構建體放置在其中所述啟動子誘導編碼蛋白質的核酸序列表達的條件下。(38)用於製備蛋白質的試劑盒，包含A)其中如1項的啟動子被連接到編碼蛋白質的核酸序列上的核酸構建體；和B)用於將該核酸構建體放置在其中所述啟動子誘導編碼蛋白質的核酸序列表達的條件下的工具。(39)用於製備蛋白質的試劑盒，包含A)如1項的啟動子；和B)用於製備其中所述啟動子被連接到編碼蛋白質的核酸序列上的核酸構建體的工具。(40)如1項的啟動子的用途，用於製造一種用於治療或預防一種需要以淋巴細胞特異性方式表達一種蛋白的疾病、異常或症狀的藥物組合物。(41)HHV7 的 MIE 啟動子。(42)如41項的啟動子，其至少包含SEQ ID NO 2中所示的序列中的8個毗鄰的
核苷酸。(43)如41項的啟動子，其至少包含SEQ ID NO 2中所示的序列中的R2區或其功能性變體。(44)如41項的啟動子，其至少包含SEQ ID NO 2的+22到-233的序列。(45)如41項的啟動子，其至少包含SEQ ID NO 2的+22到-388的序列。(46)如41項的啟動子，其包含存在於R2區中的NF-κ B的基序。(47)如41項的啟動子，其包含SEQ ID NO 15中所示的序列。(48)如41項的啟動子，其中所述啟動子包含(a)具有SEQ ID NO 2中所示的鹼基序列或者與之對應的鹼基序列或其序列片段的多核苷酸；(b) SEQ ID NO :2中所示的鹼基序列或者與之對應的鹼基序列的等位基因變體或其序列片段的多核苷酸；(c)與(a)或(b)中的任何一種的多核苷酸雜交並且具有其一種生物活性的多核苷酸；或者(d)由(a)-(c)中的任何一種的鹼基序列或者具有至少70% 同一性的互補序列組成並且具有其一種生物活性的多核苷酸。(49)如41項的啟動子，其長度至少為10個毗鄰的核苷酸。(50)如48項的啟動子，其中所述生物活性是啟動子活性。(51) 一種包含如41項的啟動子的核酸構建體。(52)如51項的核酸構建體，其包含編碼外源基因的序列，其與該啟動子不相關但是被可操作地連接到啟動子序列上。(53)如52項的核酸構建體，其中所述外源基因編碼RNAi分子、藥物、將被刪除的隱性基因或者選擇性標記。(54)如53項的核酸構建體，其中選擇性標記允許在培養基中選擇其中導入了該核酸構建體的宿主。(55)如53項的核酸構建體，其中選擇性標記允許從視覺上選擇其中導入了該核酸構建體的宿主。(56)如53項的核酸構建體，其中選擇性標記包含次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(hprt)或者一種選自由綠色螢光蛋白(GFP)、蘭綠色螢光蛋白(CFP)、黃色螢光蛋白 (YFP)和紅色螢光蛋白(dsRed)組成的組的螢光標記。(57)如53項的核酸構建體，其中選擇性標記對其中導入了核酸構建體的宿主基本上不具有毒性。(58)如53項的核酸構建體，其中將被刪除的隱性基因選自由ADA基因、PNP基因、 Y c鏈基因、TAP基因、MHC II基因、X-連接WASP、⑶40配體、PII樣基因和DNA解旋酶組成的組。(59)如53項的核酸構建體，其中藥物選自由細胞因子、趨化因子、生長因子、蛋白激素和肽激素(如幹擾素(IFN)-Ci、IFN-Y、白介素[IL]-2、IL-12、粒細胞集落刺激因子 W-CSF]、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子[GM-CSF])組成的組。(60)如52項的核酸構建體，其中所述啟動子在血細胞系細胞，特別是T細胞中誘導外源基因的特異性表達。(61) 一種包含如51項的核酸構建體的表達載體。(62) 一種包含如51項的核酸構建體的細胞。(63)如62項的細胞，其中所述細胞對於所述啟動子序列來說是異源的。(64) 一種包含如51項的核酸構建體的組織。(65) 一種包含如51項的核酸構建體的器官。(66) 一種包含如51項的核酸構建體的生物體。(67) 一種藥物組合物，其包含如41項的啟動子和編碼一種抗原的序列。(68)如67項的藥物組合物，其是DNA疫苗。(69) 一種用於治療其中期望進行淋巴細胞特異性治療的疾病、異常或症狀的藥物組合物，其包含如41項的啟動子以及用於所述治療的核酸序列。(70)如69項的藥物組合物，其中用於所述治療的核酸序列包含選自由編碼細胞因子、趨化因子、生長因子、蛋白激素、肽激素、核酶和RNAi (HIV-1 gp41 :AATAAGACAGGGCTTG GAAAGACACTTTCCAAGCCCTGTCTTATTTTT(SEQ ID NO 33)/HIV-I tat :AAGCATCCAGGAAGTCAGCC TACAAGGCTGACTTCCTGGATGCTTTTT(SEQ ID NO 34)/HTLV-I tax :GAACATTGGTGAGGAAGGCACAG CCTTCCTCACCAATGTTCTTTTT (SEQ ID NO 35))的那些序列組成的組的序列。(71)用於以淋巴細胞特異性方式地表達一種蛋白質的方法，包括步驟A)製備一種核酸構建體，其中如41項的啟動子被可操作地連接到編碼蛋白質的核酸序列上；和B)將該核酸構建體放置在其中所述啟動子誘導編碼蛋白質的核酸序列表達的條件下。(72)用於以淋巴細胞特異性方式表達一種蛋白質的試劑盒，包含A) 一種核酸構建體，其中如41項的啟動子被可操作地連接到編碼蛋白質的核酸序列上；和B)用於將該核酸構建體放置在其中所述啟動子誘導編碼蛋白質的核酸序列表達的條件下的工具。(73)用於以淋巴細胞特異性方式表達一種蛋白質的試劑盒，包含A)如41項的啟動子；和B)用於製備其中所述啟動子被連接到編碼蛋白質的核酸序列上的核酸構建體的工具。(74)用於治療或預防一種需要以淋巴細胞特異性方式表達一種蛋白的疾病、異常或症狀的方法，包括步驟A)製備其中如41項的啟動子被連接到編碼蛋白質的核酸序列上的序列表達的條件下。(75)用於治療或預防一種需要以淋巴細胞特異性方式表達一種蛋白的疾病、異常或症狀的試劑盒，包含A)其中如41項的啟動子被連接到編碼蛋白質的核酸序列上的核酸構建體；和B)用於將該核酸構建體放置在其中所述啟動子誘導編碼蛋白質的核酸序列表達的條件下的工具。
(76)用於治療或預防一種需要以淋巴細胞特異性方式表達一種蛋白的疾病、異常或症狀的試劑盒，包含A)如41項的啟動子；和B)用於製備其中所述啟動子被連接到編碼蛋白質的核酸序列上的核酸構建體的工具。(77) 一種製備蛋白質的方法，包括步驟A)製備其中如41項的啟動子被連接到編碼蛋白質的核酸序列上的核酸構建體； 和B)將該核酸構建體放置在其中所述啟動子誘導編碼蛋白質的核酸序列表達的條件下。(78)用於製備蛋白質的試劑盒，包含A)其中如41項的啟動子被連接到編碼蛋白質的核酸序列上的核酸構建體；和B)用於將該核酸構建體放置在其中所述啟動子誘導編碼蛋白質的核酸序列表達的條件下的工具。(79)用於製備蛋白質的試劑盒，包含A)如41項的啟動子；和B)用於製備其中所述啟動子被連接到編碼蛋白質的核酸序列上的核酸構建體的工具。(80)如41項的啟動子的用途，用於製造一種用於治療或預防一種需要以淋巴細胞特異性方式表達一種蛋白的疾病、異常或症狀的藥物組合物。(81)HHV7 的 U95 啟動子。(82)如81項的啟動子，其至少包含SEQ ID NO 12中所示的序列中的8個毗鄰的
核苷酸。(83)如81項的啟動子，其至少包含SEQ ID NO :12所示的序列中的R2區或其功能性變體。(84)如81項的啟動子，其至少包含SEQ ID NO 12的+16到-233的序列。(85)如81項的啟動子，其至少包含SEQ ID NO 12的+16到-379的序列。(86)如81項的啟動子，其包含存在於R2區中的NF-κ B的基序。(87)如81項的啟動子，其包含SEQ ID NO 16中所示的序列。(88)如81項的啟動子，其中所述啟動子包含(a)具有SEQ IDNO :12中所示的鹼基序列或者與之對應的鹼基序列或其序列片段的多核苷酸；(b) SEQ ID N0:12中所示的鹼基序列或者與之對應的鹼基序列的等位基因變體或其序列片段的多核苷酸；(c)與(a) 或(b)中的任何一種的多核苷酸雜交並且具有其一種生物活性的多核苷酸；或者(d)由 (a)-(c)中的任何一種的鹼基序列或者具有至少70%同一性的互補序列組成並且具有其一種生物活性的多核苷酸。(89)如81項的啟動子，其長度至少為10個毗鄰的核苷酸。(90)如88項的啟動子，其中所述生物活性是啟動子活性。(91) 一種包含如81項的啟動子的核酸構建體。(92)如91項的核酸構建體，其包含編碼外源基因的序列，其與該啟動子不相關但是被可操作地連接到啟動子序列上。(93)如92項的核酸構建體，其中所述外源基因編碼RNAi分子、藥物、將被刪除的隱性基因或者選擇性標記。(94)如93項的核酸構建體，其中選擇性標記允許在培養基中選擇其中導入了該核酸構建體的宿主。(95)如93項的核酸構建體，其中選擇性標記允許從視覺上選擇其中導入了該核酸構建體的宿主。(96)如93項的核酸構建體，其中選擇性標記包含次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(hprt)或者一種選自由綠色螢光蛋白(GFP)、蘭綠色螢光蛋白(CFP)、黃色螢光蛋白 (YFP)和紅色螢光蛋白(dsRed)組成的組的螢光標記(97)如93項的核酸構建體，其中選擇性標記對其中導入了核酸構建體的宿主基本上不具有毒性。(98)如93項的核酸構建體，其中將被刪除的隱性基因選自由ADA基因、PNP基因、 Y c鏈基因、TAP基因、MHC II基因、X-連接WASP、⑶40配體、PII樣基因和DNA解旋酶組成的組。(99)如93項的核酸構建體，其中藥物選自由細胞因子、趨化因子、生長因子、蛋白激素和肽激素(如幹擾素(IFN)-Ci、IFN-Y、白介素[IL]-2、IL-12、粒細胞集落刺激因子 W-CSF]、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子[GM-CSF])組成的組。(100)如92項的核酸構建體，其中所述啟動子在血細胞系細胞，特別是T細胞中誘導外源基因特異性表達。(101) 一種包含如91項的核酸構建體的表達載體。(102) 一種包含如91項的核酸構建體的細胞。(103)如102項的細胞，其中所述細胞對於所述啟動子序列來說是異源的。(104) 一種包含如91項的核酸構建體的組織。(105) 一種包含如91項的核酸構建體的器官。(106) 一種包含如91項的核酸構建體的生物體。(107) 一種藥物組合物，其包含如81項的啟動子和編碼一種抗原的序列。(108)如107項的藥物組合物，其是DNA疫苗。(109) 一種用於治療其中期望進行淋巴細胞特異性治療的疾病、異常或症狀的藥物組合物，其包含如81項的啟動子以及用於所述治療的核酸序列。(110)如109項的藥物組合物，其中用於所述治療的核酸序列包含選自由編碼細胞因子、趨化因子、生長因子、蛋白激素、肽激素、解旋酶和RNAi (HIV-1 gp41 :AATAAGACAGGG CTTGGAAAGACACTTTCCAAGCCCTGTCTTATTTTT(SEQ ID NO 33)/HIV-I tat :AAGCATCCAGGAAGTC AGCCTACAAGGCTGACTTCCTGGATGCTTTTT(SEQ ID NO 34)/HTLV-I tax :GAACATTGGTGAGGAAGGC ACAGCCTTCCTCACCAATGTTCTTTTT (SEQ ID NO 35))的那些序列組成的組的序列。(111)用於以淋巴細胞特異性方式地表達一種蛋白質的方法，包括步驟A)製備一種核酸構建體，其中如81項的啟動子被可操作地連接到編碼蛋白質的核酸序列上；和B)將該核酸構建體放置在其中所述啟動子誘導編碼蛋白質的核酸序列表達的條件下。(112)用於以淋巴細胞特異性方式表達一種蛋白質的試劑盒，包含A) 一種核酸構建體，其中如81項的啟動子被可操作地連接到編碼蛋白質的核酸序列上；和B)用於將該核酸構建體放置在其中所述啟動子誘導編碼蛋白質的核酸序列表達的條件下的工具。(113)用於以淋巴細胞特異性方式表達一種蛋白質的試劑盒，包含A)如81項的啟動子；和B)用於製備其中所述啟動子被連接到編碼蛋白質的核酸序列上的核酸構建體的工具。(114)用於治療或預防一種需要以淋巴細胞特異性方式表達一種蛋白的疾病、異常或症狀的方法，包括步驟A)製備其中如81項的啟動子被連接到編碼蛋白質的核酸序列上的核酸構建體； 和B)將該核酸構建體放置在其中所述啟動子誘導編碼蛋白質的核酸序列表達的條件下。(115)用於治療或預防一種需要以淋巴細胞特異性方式表達一種蛋白的疾病、異常或症狀的試劑盒，包含A)如81項的啟動子被連接到編碼蛋白質的核酸序列上的核酸構建體；和B)用於將該核酸構建體放置在其中所述啟動子誘導編碼蛋白質的核酸序列表達的條件下的工具。(116)用於治療或預防一種需要以淋巴細胞特異性方式表達一種蛋白的疾病、異常或症狀的試劑盒，包含A)如81項的啟動子；和B)用於製備其中所述啟動子被連接到編碼蛋白質的核酸序列上的核酸構建體的工具。(117) 一種製備蛋白質的方法，包括步驟A)製備其中如81項的啟動子被連接到編碼蛋白質的核酸序列上的核酸構建體； 和B)將該核酸構建體放置在其中所述啟動子誘導編碼蛋白質的核酸序列表達的條件下。(118)用於製備蛋白質的試劑盒，包含A)其中如81項的啟動子被連接到編碼蛋白質的核酸序列上的核酸構建體；和B)用於將該核酸構建體放置在其中所述啟動子誘導編碼蛋白質的核酸序列表達的條件下的工具。(119)用於製備蛋白質的試劑盒，包含A)如81項的啟動子；和B)用於製備其中所述啟動子被連接到編碼蛋白質的核酸序列上的核酸構建體的工具。
(120)如81項的啟動子的用途，用於製造一種用於治療或預防一種需要以淋巴細胞特異性方式表達一種蛋白的疾病、異常或症狀的藥物組合物。在下文中，提供本發明的優選實施方案。應當理解，考慮到本領域熟知和常規使用的技術，本領域技術人員基於本發明的說明，顯然能夠實施這些技術方案，本發明所達到的功能和效果也是容易理解的。本發明的技術效果本發明提供啟動子，該啟動子在免疫系統細胞如淋巴細胞中選擇性地誘導蛋白質表達。本發明的啟動子可以用於提供方法和藥物，有效地預防或治療免疫疾病，如先天性免疫缺陷綜合症等。本發明還提供用於有效地實施基因治療的技術。
附圖簡介[

圖1]圖1描述了在黏著細胞中啟動子活性的比較。X軸排列多種啟動子，並且 Vero細胞、HEL細胞、細胞、293細胞和373細胞中的啟動子活性採用對數計數方式用 Log(RLU)/β-gal 表示。[圖2]圖2描述了在淋巴細胞中啟動子活性的比較。X軸排列多種啟動子，並且 THP-I細胞、SupTl細胞和U937細胞中的啟動子活性採用對數計數方式用Log (RLU) / β -gal 表不。[圖3]圖3描述了在用TPA刺激細胞(Vero細胞)時HHV-6MIE區的啟動子活性。 在X軸上排列多種啟動子，並且以對數方式用Log(RLU)/β -gal顯示有或無TPA時的啟動子活性。[圖4]圖4描述了當用TPO刺激細胞時HHV-6MIE區(L^9細胞)的啟動子活性。 在X軸上排列多種啟動子，並且以對數方式用Log(RLU)/β -gal表示當有或無TPA時針對相應的啟動子的啟動子活性。[圖5]圖5描述了HHV6B的啟動子區中的各種缺失突變體的圖解。上一組顯示啟動子區以及該啟動子區中的各種基序。[圖6]圖6描述了啟動子活性的測定系統。[圖7]圖7用HHV6B中的啟動子區的各種缺失突變體的圖解描述啟動子活性(相對的螢光素酶活性)。[圖8]圖8描述與HHV7的啟動子區相關的立即早期(IE)基因及其啟動子的圖解。左列從上到下顯示7MIE啟動子(-493)、7MIE啟動子(-388)和7MIE啟動子(-233)，以及右列從上到下顯示7U95啟動子(-484)、7U95啟動子(-379)和7U95啟動子(-304)。[圖9]圖9描述HHV7的IE啟動子在淋巴細胞系中的活性。左上圖顯示Jurkat 細胞，右上圖顯示Molt-3細胞，左下圖顯示SupTl細胞，以及右下圖顯示SAS-413細胞。各張圖表從左到右分別顯示 CMVP、6MIEP、6U95P、7MIE (-493)、7U95 和 P (-484)。[圖10]圖10描述R2缺失對啟動子活性的影響。左上圖顯示Jurkat細胞，右上圖顯示Molt-3細胞，左下圖顯示SupTl細胞，以及右下圖顯示SAS-413細胞。各張圖表從左到右顯示7MIE啟動子(_493)、7MIE啟動子(-388)、7MIE啟動子(-233)、7U95啟動子 (-484)、7U95 啟動子(-379)和 7U95 啟動子(-304)。[圖11]圖11描述在外周血單核細胞(PBMC)中的啟動子活性。在左上圖、右上圖和下圖中分別顯示細胞系1、細胞系2和細胞系3t
序列表簡介
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NO NO NO NO NO NO NO NO NO NO NO NO NO NO NO NO NO NO NO NO NO NO NO NO NO NO NO NO NO NO NO NO NO NO NO
1是HHV6B MIE啟動子的序列。 2是HHV7MIE啟動子的序列。 3是HHV6A MIE啟動子的序列。 4是HHV6B R3區的序列。 5是實施例1中所用的20u的序列。 6是實施例1中所用的9u的序列。 7是實施例1中所用的MIE的序列。 8是實施例1中所用的U95的序列。 9是實施例1中所用的CMV的序列。 10是實施例1中所用的MIE/I的序列。 11是實施例1中所用的U95/I的序列。 12是HHV7U95啟動子
13是距離HHV6B MIE的轉錄起始點-574到-427的序列。
14是距離HHV6B MIE的轉錄起始點-1051到-427的序列<
15是距離HHV7MIE的轉錄起始點+22到-493的序列。
16是距離HHV7 MIE的轉錄起始點+16到-484的序列。
17是實施例1中所用的9u-d2-7的序列。
18是實施例1中所用的9u-dl-4的序列。
19是實施例1中所用的9u-dl-5的序列。
20是實施例1中所用的9u-dl-7的序列。
21是實施例1中所用的9u-d3-7的序列。
22是實施例1中所用的9u-d5的序列。
23是實施例1中所用的9u-d6的序列。
24是實施例1中所用的9u-d7的序列。
25是實施例1中所用的9u-d8的序列。
26是實施例2中所用的7MIEP(-493)的序列。
27是實施例2中所用的7MIEP(-388)的序列。
28是實施例2中所用的7MIEP(-233)的序列。
29是實施例2中所用的7U95P(-484)的序列。
30是實施例2中所用的7U95P(-379)的序列。
31是實施例2中所用的7U95P(-304)的序列。
32是實施例2中所用的pGL3 Basic的序列。
33是HIV-lgp41的RNAi的一個例子。
34是HIV-Itat的RNAi的一個例子。
35是HIV-Itax的RNAi的一個例子。
實施本發明的最佳方式
以下，對本發明進行說明。在整個說明書中，除非另外明確地說明，
L數表達形式(例如英語中的「一個」，「一種」，「該」以及其語言中的冠詞、形容詞)應當理解為也包含其複數形式的概念範疇。除非另外指出，本文所使用的術語應具有本領域通常所指的含義。 因而，除非另外定義，本文中所使用的全部專業術語和科技用語，應理解為具有本發明所屬技術領域的普通技術人員通常所理解的含義。當發生矛盾時，首先依照本說明書(包括定義)。(術語的定義)下文描述本文所用術語的定義。本文所用的術語「HHV」是指人皰疹病毒，有1型、2型、3型、4型、5型、6型、7型和
8型等類型。除非另外指出，如本文所用，術語「皰疹病毒」包括所有的HHV-6A、HHV-6B和 HHV-7，包括它們的野生型和重組型。除非另外指出，本文中所用的術語「HHV-6(人皰疹病毒6) 」包括HHV-6A和HHV-6B，以及它們的野生型和重組型。如細胞巨化病毒HHV-5，HHV6 屬於β亞屬，HHV6B是誘發幼兒急診的病毒，一般認為，大部分日本人會在2周歲時感染 HHV6B。本文所用的術語「HHV-7(人皰疹病毒7)」是指屬於該型的任何皰疹病毒。HHV7也被認為是誘發幼兒急診的病毒，但是與HHV6B相比，其發生的概率較低，並且被感染的患者的年齡較大。與HHV6—樣，HHV7屬於β亞屬，並且它被認為是感染CD4+細胞，從而引起吉貝特玫瑰糠疹(pityriasis rosea Gibert)發生，而且一般認為，大部分日本人會在2周歲時感染HHV7。如本文所用，涉及皰疹病毒的術語「野生株」是指未經人工修飾，從自然界中分離的皰疹病毒株。野生株的例子包括但不限於Jl株。如本文所用，涉及HHV-6A的術語「野生株」是指未經人工修飾，從自然界中分離的 HHV-6A株。野生株的例子包括但不限於Ul 102株。如本文所用的術語「突變株」是指由於誘變、多次傳代培養等而發生突變的皰疹病毒株。皰疹病毒株的誘發突變既可以是隨機突變，也可以是位點特異性突變。如本文所用，涉及HHV-6B的術語「野生株」是指未經人工修飾，從自然界中分離的 HHV-6B株。野生株的例子包括但不限於HST株。本文所用的術語「蛋白質」、「多肽」、「寡肽」和「肽」具有相同的含義，均指具有任
意長度的胺基酸聚合物。本文所用的術語「多核苷酸」、「寡核苷酸」和「核酸」具有相同的含義，指具有任意長度的核苷酸聚合物。除非另外指出，特定的核酸序列還隱含明確說明的序列，以及其經保守修飾的突變體(例如簡併密碼子取代)及其互補序列。特別地，簡併密碼子取代可以通過製備一個或多個(或全部)所選擇密碼子的第三位被混合鹼基和/或脫氧次黃嘌呤核苷殘基取代的序列而完成(Batzer等人，Nucleic Acid Res. 19 :5081(1991)； Ohtsuka 等人，J. Biol. ChemJ60 :2605-2608(1985) ；Rossolini 等人，Mol. Cell. Probes 8 91-98(1994))。本文所用的術語「基因」是指確定一種遺傳性狀的元件。基因通常在染色體上以一定的順序排列。把確定蛋白質一級結構的基因稱為結構基因。調節結構基因表達的基因稱為調控基因。本文所用的「基因」是指「多核苷酸」、「寡核苷酸」、「核酸」、和/或「蛋白質」 「多肽」 「寡肽」和「肽」。如本文所用的，基因的「開放閱讀框」或「0RF」是指將基因的鹼基序列以每3個鹼基為一組進行分割時所得的三種讀框中的一個，其具有起始密碼子以及由終止密碼子出現而確定的一定長度，並且可能實際上編碼一種蛋白質。皰疹病毒基因組的全序列已經得到鑑定，其中至少鑑定了 101個基因，已知各基因分別具有開放閱讀框 (ORF)。本文所用的術語「RNAi」是RNA幹擾的縮寫，是指將引起RNAi的試劑例如雙鏈 RNA (也稱作為dsRNA)導入細胞中，特異性地降解與之同源的mRNA，從而抑制基因產物的合成的現象以及利用這種現象的技術。如本文所用的，RNAi具有與引起RNAi的試劑相同的含義。本文所用的術語「引起RNAi的試劑」是指能夠引起RNAi的任何試劑。如本文所用，「試劑引起基因RNAi」是指用試劑引起與基因有關的RNAi，並且成功地達到RNAi的效果 (例如抑制基因的表達等)。這種引起RNAi的試劑的例子包括但不限於與目標基因的核酸序列具有至少約70%同源性的序列或者在嚴謹條件下與之雜交的序列以及含有至少長10 個核苷酸的雙鏈部分的RNA或它們的變體。在此，該試劑優選為含有3』突出端的DNA，更加優選地該3』突出端長度為2個或更多個核苷酸(例如，長度為2-4個核苷酸)。雖然不期望受任何理論的約束，引起RNAi的機理被認為如下。當將引起RNAi的分子，例如dsRNA導入細胞，在RNA相對較長的情況下(例如40個或更多個鹼基對)，在存在 ATP時，具有解旋酶結構域的RNA酶III樣的核酸酶(所謂的切酶)從3』端以約20個鹼基對的間隔切割該分子。本文所用的術語「siRNA」是短的幹擾RNA的縮寫，是指具有10個或更多個鹼基對的短雙鏈RNA，通過人工化學合成或生物合成，由生物體合成或者在生物體內降解40個或更多個鹼基對的雙鏈RNA來製備。SiRNA通常具有包含5』 -磷酸鹽和3』 -OH 的結構，其中3』末端突出長度約2個鹼基。一種特定蛋白結合到siRNA上，形成RISC(RNA 誘導的沉默複合物)。該複合物識別並結合具有與siRNA相同序列的mRNA，並由於RNA酶 III樣酶促活性，在siRNA的中間切割mRNA。優選的是，siRNA的序列與作為靶點將被切割的mRNA的序列之間是100%匹配的。然而，在遠離siRNA中間的位點上發生的鹼基突變不能完全排除RNAi的切割活性，保留部分活性，而siRNA中間發生的鹼基突變影響很大，並且RNAi切割mRNA的活性相當低。利用這種特徵，僅具有突變的mRNA被特異性地降解。特別地，合成中間有突變的siRNA，並導入到細胞中。因此，在本發明中，將siRNA本身以及能夠製備siRNA的試劑(例如，代表性的約40個或更多個鹼基對的dsRNA)被用作能夠引起 RNAi的試劑。此外，雖然不期望受任何理論的約束，除了上述方式，siRNA的反義鏈結合mRNA， 而siRNA作為RNA依賴的RNA聚合酶(RdRP)的引物，從而合成dsRNA。該dsRNA再次作為切酶的底物，生成新的siRNA。可以預期這種反應被增強。因此，在本發明中，siRNA本身以及能夠製備siRNA的試劑是有用的。事實上，在昆蟲等中，如35dsRNA分子基本上或完全地降解1，000個或更多個拷貝的細胞內mRNA，因此，應當理解，siRNA本身以及能夠製備siRNA 的試劑是有用的。在本發明中，可以使用長度約20個鹼基的(例如，代表性的約21-23個鹼基)或者約少於20個鹼基的雙鏈RNA，稱作為siRNA。在細胞中siRNA的表達能夠抑制siRNA所靶向的病源性基因的表達。因此，siRNA可用於疾病的治療、預防、預後等本發明的siRNA可以是任何形式的，只要其能夠引起RNAi。
在另一個實施方案中，能夠引起RNAi的試劑具有一個短的髮夾結構，在3』末端有個粘性部分(shRNA ；短髮夾RNA)。本文所用的術語「 shRNA」是一個約20個或更多個鹼基對的分子，其中單鏈RNA特別地含有一個回文鹼基序列，在那裡形成雙鏈結構(即，髮夾結構)。可以人工合成shRNA。可替代地，以相反方向連接DNA序列的有義鏈和反義鏈，並在體外用該DNA作為模板，用T7RNA聚合酶合成RNA，製備shRNA。雖然不期望受任何理論的約束，應當理解，在將shRNA導入細胞後，shRNA在細胞中被降解成約20個鹼基的長度(例如，代表性為21個、22個、23個鹼基)，用siRNA引起RNAi，產生本發明的處理效果。應當理解，這種效果在廣泛的生物體中實現，例如，昆蟲、植物、動物(包括哺乳動物)等。因此， 當與siRNA在一起時，shRNA引出RNAi，並因此可被用作本發明的有效成分。SiRNA優選具有一個3』突出端。雙鏈部分的長度不是特別地受到限制，但是優選為約10個或更多個核苷酸，更優選約20個或更多個核苷酸。在此，3』突出端優選為DNA，DNA的長度更優選為至少2個核苷酸，甚至更加優選地，DNA的長度為2-4個核苷酸。本發明所用的引起RNAi的試劑是人工合成的(化學合成或生物化學合成)或天然存在的。對於本發明的效果來說，這兩者之間基本上沒有區別。化學合成的試劑優選是用液相層析等純化的。可以在體外製備在本發明中所用的能夠引起RNAi的試劑。在該合成系統中，用 T7RNA聚合酶和T7啟動子，從模板DNA上合成反義RNA和有義RNA。這些RNA被退火，然後被導入細胞中。在這種情況下，通過上述機理引起RNAi，從而達到本發明的技術效果。在此，例如採用磷酸鈣方法，將RNA導入細胞中。按照本發明的引起RNAi的試劑的另一個例子是與mRNA雜交的單鏈核酸或其所有核酸類似物。這種試劑可用於本發明的方法和組合物中。本文中所用的術語「相應的」胺基酸或核酸是指在給定的多肽或多核苷酸分子中的胺基酸或核苷酸，真具有或被期望具有與作為用於比較的參照多肽或多核苷酸中預先確定的胺基酸或核苷酸相似的功能。例如，在遍在蛋白的情況下，是指以相似方式對催化活性起作用並且在序列中的類似位置上存在的胺基酸(例如，C-末端上的甘氨酸)，其對賴氨酸起作用。例如，在為核酸序列的情形下，該術語是指對其所編碼的特定部分起類似作用的相似部分。本文所用的術語「相應的」基因(例如，多肽或多核苷酸分子)是指特定物種中的基因，其具有或被期望具有與作為用於比較的對照的物種中的預先確定的基因相似的功能。有大量具有這種功能的基因，該術語是指具有相同進化起源的基因。因此，相應於特定基因的基因是給定基因的直向同源物。因此，在其他生物體中(如7型皰疹病毒)，能夠找到相應於那些如6B型皰疹病毒和腫瘤的抗原等的基因。這種相應的基因可通過本領域熟知的技術來鑑定。因此，例如使用對照基因的序列(例如小鼠細胞周期蛋白基因等)作為比較(query)序列，通過檢索生物體(如6B型皰疹病毒)的序列資料庫，可以找到特定生物體中的相應基因。可替代地，通過試驗篩選文庫來找出相同的基因。本文所用的術語「被分離的」是指在正常環境下的天然伴隨的物質至少被降低，或者優選基本上或完全被除去。因此，術語「分離的細胞」是指基本上不含有天然環境下的其他伴隨物質(例如，其他細胞、蛋白質、核酸等)的細胞。術語「被分離的」涉及核酸或多肽時是指，如通過DNA重組技術製備時，核酸或多肽基本上不含有細胞物質或培養液；或者通過化學合成時不含有前體化學物質或其他化學物質。本文所用的術語「被純化的」生物製劑(例如，核酸、蛋白質等)是指其中至少一部分天然伴隨的物質被除去的製劑。因此，被純化的生物製劑的純度通常高於該生物物質在正常狀態下的純度(即被濃縮)。如本文所用，術語「被純化的，，和「被分離的，，是指相同類型的生物製劑優選以至
少70%重量存在，更優選以至少85%重量存在，甚至更優選以至少95%重量存在，最優選以至少98%重量存在。如本文所用的，涉及序列(例如，核酸序列、胺基酸序列等)的術語「同源性」是指兩個或兩個以上的基因序列之間的同一性程度。因此，兩個序列的同源性越高，則其序列的同一性或相似性越高。兩種基因是否具有同源性可以通過將兩個序列進行直接比較來判斷，也可以通過在嚴格條件下的雜交方法進行判定。將兩個基因序列直接進行比較時，如果所述基因的DNA序列典型地具有至少50 %的同一性，優選具有至少70 %的同一性，更優選具有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性時，認為這些基因具有同源性。如在此所用的，「多核苷酸在嚴謹條件下雜交」是指本領域通常使用和熟知的條件。使用選自本發明的多核苷酸，通過菌落雜交、噬菌斑雜交、DNA印記雜交來獲得這種多核苷酸。特別地，在65°C下，在存在0.7-1. OM NaCl時，用固定了來源於菌落或噬菌斑的DNA 的濾器實施雜交。接著，在65°C下，用0. 1-2倍濃度的SSC (檸檬酸鈉)溶液(1倍濃度SSC 溶液由150mM氯化鈉和15mM檸檬酸鈉組成)洗滌濾器。通過這種方法鑑定的多核苷酸被稱作為「在嚴謹條件下雜交的多核苷酸」。可以按照如Molecular Cloning 2nd ed. ,Current Protocols in Molecular Biology,Supplement 1-38,DNA Cloning 1 :Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等中描述的方法來實施雜交。在此，在嚴謹條件下雜交的序列優選排除僅含A或T的序列。「能夠雜交的多核苷酸」是指在上述雜交條件下能夠與其他多核苷酸雜交的多核苷酸。特別地，能夠雜交的多核苷酸至少包括與編碼具有本文特別公開的胺基酸序列的多肽的DNA的鹼基序列具有至少60%同源性的多核苷酸，優選是具有至少80%同源性的多核苷酸，以及更優選是具有至少95%同源性的多核苷酸。胺基酸序列和鹼基序列的相似性、同一性和同源性在此用默認參數下的FASTA比較。可替代地，例如，使用NCBI的BLAST 2. 2. 9 (2004年5月12日公開)進行同一性檢索。 如在此所用，同一性大小通常是指採用上述BLAST在默認參數下進行比對而獲得的數值。 如果改變參數能夠獲得更大的數值，那麼本文中將最大值作為同一性的數值。當要對多個區域進行同一性的評價時，那麼本文中將最大值作為同一性的數值。本文所用的術語「搜索」是指利用特定的核酸序列或者使用其他方法，找出其他具有特定的電子的或生物學的功能和/或特性的核酸鹼基序列。電子搜索的例子包括但是不限於 BLAST (Altschul 等人，J. Mol. Biol. 215 :403-410 (1990))、FASTA (Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci.，USA 85 :2444-2448 (1988))、Smith 和 Waterman 的方法(Smith 和 Waterman, J. Mol. Biol. 147 :195-197(1981))以及 Needleman 和 Wunsch 的方法(Needleman 和mmsch，J. Mol. Biol. 48 :443-453(1970))等。生物學搜索的例子包括但是不限於在進行嚴謹雜交條件下，PCR和原位雜交等時，基因組DNA附著到尼龍膜等上的大型陣列，或者基因組DNA附著到玻璃平板上的微陣列。如在此所用，本發明所用的啟動子包含通過這種電子搜索或生物學搜索的那些序列的啟動子是期望的。本文所用的術語基因產物例如基因、多核苷酸、多肽等的「表達」，是指基因等受預先確定的行為的影響，在體內變成另一種形式。優選地，術語「表達」是指基因、多核苷酸等發生轉錄並翻譯成多肽。在本發明的一個實施方案中，基因被轉錄成mRNA。更優選地，這些多肽發生翻譯後的加工修飾。如在此所用的，胺基酸可以通過一般已知的三字符形式表示，也可以以IUPAC-IUB 生物化學命名委員會所推薦的單字符形式表示。核苷酸也用通常所接受的公知的單字符縮
寫形式表示。
字符代碼如下
胺基酸
三字符單字符參考
AlaA丙氨酸
CysC半胱氨酸
AspD天冬氨酸
GluE穀氨酸
PheF苯丙氨酸
GlyG甘氨酸
HisH組氨酸
IleI異亮氨酸
LysK賴氨酸
LeuL亮氨酸
MetM甲硫氨酸
AsnN天冬醯胺
ProP脯氨酸
GlnQ穀氨醯胺
ArgR精氨酸
SerS絲氨酸
ThrT蘇氨酸
ValV纈氨酸
TrpW色氨酸
TyrY酪氨酸
Asx天冬氨酸或天冬醯胺
Glx穀氨酸或穀氨醯胺
Xaa未知的或其他的氨基
鹼基(核苷!酸)
縮寫參考
a腺嘌呤
g鳥嘌呤
C胞嘧啶
t胸腺嘧啶u尿嘧啶r鳥嘌呤或腺嘌呤y胸腺嘧啶/尿嘧啶或胞嘧啶m腺嘌呤或胞嘧啶氨基基團k鳥嘌呤或胸腺嘧啶尿嘧啶酮基團s鳥嘌呤或胞嘧啶w腺嘌呤或胸腺嘧啶/尿嘧啶b鳥嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶/尿嘧啶d腺嘌呤或鳥嘌呤或胸腺嘧啶/尿嘧啶h腺嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶/尿嘧啶ν腺嘌呤或鳥嘌呤或胞嘧啶η腺嘌呤或鳥嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶/尿嘧啶，未知的或其他的鹼基如本文所用，術語多肽或多核苷酸的「片段」是指相對於全長的多核苷酸或多肽 (其長度為η)，序列長度為1到η-1的多肽或多核苷酸。根據目的不同，片段的長度可以適當地變化，例如在為多肽的情形下，片段長度的下限包括3個、4個、5個、6個、7個、8個、9 個、10個、15個、20個、25個、30個、40個、50個或更多個胺基酸。用這裡沒有列舉的整數表示的長度(例如，11個等)作為下限也是適宜的。當指多核苷酸時，片段長度的下限包括5 個、6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個、25個、30個、40個、50個、75個、100個、200個、 300個、400個、500個、600個、700個、800個、900個、1000個或更多個核苷酸。用這裡沒有具體列舉的整數表示的長度(例如，11個等)作為下限也是適宜的。本發明中所用的多肽在其胺基酸序列中具有至少一個(例如1個或多個或者更多個)胺基酸取代、添加和/或缺失，只要其具有與野生型多肽基本上相同的功能。特定胺基酸被具有同樣疏水性指數的其它胺基酸替代，生成的蛋白質具有與起始蛋白質類似生物學功能(例如具有等價的酶活性的蛋白質)，這在本領域是眾所周知的。在這種胺基酸替代中，優選疏水性指數在士2以內，進一步優選在士 1以內，更優選在士0.5 以內。在本領域中一般理解，在對蛋白質進行修飾時會考慮親水性問題。如US4，5M，101 中公開的，胺基酸殘基被賦予如下的親水性指數精氨酸(+3. 0)；賴氨酸(+3. 0)；天冬氨酸 (+3. 0 士 1)；穀氨酸(+3. 0 士 1)；絲氨酸(+0. 3)；天冬醯胺(+0. 2)；穀氨醯胺(+0. 2)；甘氨酸 (0)；蘇氨酸(-0. 4)；脯氨酸(-0. 5 士 1)；丙氨酸(-0. 5)；組氨酸(-0. 5)；半胱氨酸(-1. 0)； 甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2. 5)；和色氨酸(-3. 4)。可以理解的是某種胺基酸可以被具有相同親水性指數的其它胺基酸替代而提供生物學等價體。在這種胺基酸替代中，親水性指數優選在士2以內，更優選在士 1以內，進一步優選在士 0. 5以內。親水性指數也可以用於本發明的胺基酸序列的修飾中。如US4，554，101中公開，胺基酸殘基被賦予如下的親水性指數精氨酸(+3. 0)； 賴氨酸(+3. 0)；天冬氨酸(+3. 0 士 1)；穀氨酸(+3. 0 士 1)；絲氨酸(+0. 3)；天冬醯胺(+0. 2)； 穀氨醯胺(+0. 2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(_0.5士1)；丙氨酸(-0. 5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；和色氨酸(-3.4)。可以理解的是某種胺基酸可以被具有相同親水性指數的其它胺基酸替代而提供生物學等價體。在這種胺基酸替代中， 親水性指數優選在士2以內，更優選在士 1以內，進一步優選在士0.5以內。術語「保守性替代」用於此是指一種胺基酸替代，其中被替代的胺基酸和替代後的胺基酸具有類似的親水性指數和/或疏水性指數。例如，保守性替代是親水性指數或疏水性指數在士2之內的胺基酸之間進行的替代，優選在士 1以內，更優選在士0.5以內。保守性替代的例子包括但是不限於在各個如下殘基對之間進行的替代精氨酸和賴氨酸；穀氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；穀氨醯胺和天冬醯胺；纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸，這都是本領域技術人員熟知的。如本文所用，術語「變體」是指部分地區別於起始物質的一種物質，例如多肽或多核苷酸等。這種變體的例子包括替代變體、添加變體、缺失變體、截短變體、等位基因變體等。這種變體的例子包括但是不限於，具有一個或幾個替代、添加和/或缺失的核苷或多肽，或者具有至少一個替代、添加和/或缺失的核苷或多肽。術語「等位基因(allele)」用於此是指與相應的基因位於同一基因座上但相互之間存在差異的基因變體。因此，術語「等位基因變異體」用於此是指與特定基因具有等位基因關係的變體。這種等位基因變體通常具有與相應的等位基因相同或高度相似的序列，並且通常具有幾乎相同的生物學活性，極少具有不同的生物學活性。術語「物種同源物」或「物種同系物」用於此是指具有與特定物種中的某種基因在胺基酸水平或核苷酸水平上同源的物質(優選至少60%同源，更優選至少80 %，至少85 %，至少90 %，至少95 %的同源性)。從本說明書的描述中，可以清楚地知曉獲得這種物種同源物的方法。術語「直向同源物」(也稱作直向同源基因)是指存在於來自共同祖先(經過物種分化)的不同物種中的基因。例如，以具有多種基因結構的血紅蛋白基因家族為例，人和小鼠的α-血紅蛋白基因是直向同源物，而人α-血紅蛋白基因和人 β-血紅蛋白基因是種內同源物(由於基因複製所產生的基因)。直向同源物對於分子系統樹的推定是有用的。通常，不同物種中的直向同源物與起始物種具有類似的功能。因此， 本發明的直向同源物在本發明中也是有用的。如本文所用，術語「功能性變體」是指保留了生物學活性的變體(特別是啟動子活性)，標準物的序列產生該活性。如在此所用，術語「保守的(或保守修飾的)變體」適用於胺基酸序列和核酸序列。 對於特定的核酸序列，經保守修飾所得的變體是可以編碼相同或基本上相同的胺基酸序列的那些核酸。由於遺傳密碼子的簡併性，許多功能相同的核酸編碼任何特定的蛋白質。例如，密碼子GCA，GCC, GCG和G⑶都編碼丙氨酸。因而在所有通過所述密碼子表示丙氨酸的位置，該密碼子可替換成任何所述的相應密碼子，而不改變所編碼的多肽。這種核酸變化是保守性變異的一種，即「沉默改變」。對於一種核酸來說，可以通過如測定啟動子活性來確定一種保守性替代。為了製備功能相同的多肽，除了胺基酸替代外，可以進行胺基酸添加、缺失或修飾。胺基酸替代是指用不同的胺基酸替換起始肽的至少一個胺基酸，例如，不同的胺基酸替換1-10個胺基酸，優選1-5個胺基酸，更優選1-3個胺基酸。胺基酸添加是指將至少一個胺基酸添加到起始肽鏈上，例如將1-10個胺基酸，優選1-5個胺基酸以及更優選1-3個胺基酸添加到起始肽鏈上。氨酸缺失是指缺失至少一個胺基酸，例如缺失1-10個胺基酸，優選1-5個胺基酸，更優選1-3個胺基酸。胺基酸修飾包括但是不限於，醯胺化、羧化、硫酸化 (sulfation)、滷化、平截、脂質化、烷基化、糖基化、磷酸化、羥基化、醯基化(例如乙醯化) 等。被取代或所添加的胺基酸是天然存在或非天然存在的胺基酸，或者胺基酸類似物。優選是天然存在的胺基酸。表達多肽的核酸例子用於此是指能夠表達本發明多肽的蛋白質實例的核酸。這種核酸包括如上所述的部分序列缺失或被其他鹼基替代的核酸，或者插入其他核酸序列的核酸，只要該核酸所表達的多肽基本上具有與天然存在的多肽相同的活性。可替代地，將其他核酸連接到核酸的5』端和/或3』端上。核酸分子包括在嚴謹條件下能夠與編碼多肽的基因雜交的核酸，並且編碼的多肽與所述基因編碼的多肽基本上具有相同的功能。這種基因是本領域知曉的並且可被用於本發明中。通過熟知的PCR方法，即化學合成方法，能夠獲得上述核酸。該方法可以與如位點特異性誘變、雜交等組合起來。如本文所用，術語對多肽或多核苷酸進行的「替代、添加或缺失」是指相對於起始的多肽或多核苷酸，發生胺基酸或其替代物或者核苷或其替代物的替代、添加或刪除。這可以通過本領域熟知的方法實現，包括位點特異性誘變方法等。多肽或多核苷酸具有任意數量(>0)的替代、添加或缺失。該數量最大可以達到具有該數量替代、添加或缺失的變體能夠保持特定功能(例如，激素和細胞因子的信息傳導功能等)。例如，該數量可以是1個或數個，優選在全長序列的20 %或10 %以內，或者不超過100個，不超過50個，不超過25
小絕
I寸°(啟動子)如本文所用，術語「啟動子(或啟動子序列)」是指決定基因轉錄起始點的鹼基序列，是直接調控轉錄頻率的DNA區域。RNA聚合酶結合到啟動子上，啟動轉錄。因此，如在此所用，具有基因的啟動子功能的部分是「啟動子部分」。可以用DNA分析軟體預測基因組鹼基序列中的蛋白質編碼區來推導出啟動子區。推導得出的啟動子區是變化的，通常位於結構基因的上遊，但是不僅限於在結構基因的上遊，也可能位於結構基因的下遊。如本文所用，術語「MIE啟動子」是主要立即早期啟動子，它是一種基因的啟動子， 該基因的轉錄是在病毒感染後被來自宿主或病毒粒子的轉錄因子立即啟動的。用放線菌酮處理的被感染細胞，提取RNA，使用該RNA通過RT-PCR鑑定MIE基因。本文所用的術語「U95啟動子」是指立即早期基因U95的啟動子。U95也是一種立即早期基因，其轉錄也是在病毒感染後被來自宿主或病毒粒子的轉錄因子立即啟動的。如本文所用的，鑑定啟動子的方法如下對位於結構基因附近的一些序列進行篩選(例如使用實施例中描述的表達盒)，並對具有啟動基因表達活性的序列進行作圖。如此，可以鑑定具有顯著啟動子活性的序列。通常，這些序列位於結構基因的上遊，但是不限於此。如本文所用，術語「HHV6B MIE啟動子」或「HHV6B的MIE啟動子」是指SEQ ID NO 1中的任何具有啟動子活性的序列。優選地，啟動子在距離SEQ ID NO :1中的轉錄起始點-814到0的位置。這種序列包括但是不限於SEQ ID NO :1或與之相應的序列。在HHV6B 基因的表達控制中，啟動子優選位於上遊的-574到-427區域，優選在-1051到-427區域， 其鹼基序列包括SEQ ID NO 15、16等中所示的序列。其中，本文已經闡明，NF-κ B和AP-I基序(距離轉錄起始點-603至-594對應於NF- κ B基序，而-488到-478和-249到-239 對應於AP-I基序)是來自鹼基序列替代試驗的基序。因此，優選地，本發明的HHV6B MIE 啟動子包括(a)具有SEQ ID NO :1所示的鹼基序列的，或者與之對應的鹼基序列或其序列片段的多核苷酸；(b) SEQ ID NO :1所示的鹼基序列的，或者與之對應的鹼基序列的等位基因變體或其序列片段的多核苷酸；(c)與(a)或(b)中的任何一種的多核苷酸雜交並且具有其一種生物活性的多核苷酸；或者(d)由(a)-(c)中的任何一種的鹼基序列或者具有至少70%同一性的互補序列組成並且具有其一種生物活性的多核苷酸。如本文所用，術語「HHV7 MIE啟動子」或「HHV7的MIE啟動子」是指SEQ ID NO :2中的任何具有啟動子活性的序列。優選地，啟動子在距離SEQ ID NO :2中的轉錄起始點-493 到+22的位置。這種序列包括但是不限於SEQ ID N0:2或與之相應的序列。在HHV7基因的表達控制中，啟動子優選位於上遊的-427區域，優選在-493區域，其鹼基序列包括SEQ ID NO 2等中所示的序列。其中，本文已經闡明，NF- κ B (距離轉錄起始點-464到-478和-359 到-350對應於NF-κ B基序)是來自鹼基序列替代試驗的基序。因此，優選地，本發明的 HHV7 MIE啟動子包括(a)具有SEQ ID NO 2中所示的鹼基序列或者與之對應的鹼基序列或其序列片段的多核苷酸；(b) SEQ ID NO :2中所示的鹼基序列或者與之對應的鹼基序列的等位基因變體或其序列片段的多核苷酸；(c)與(a)或(b)中的任何一種的多核苷酸雜交並且具有其一種生物活性的多核苷酸；或者(d)由(a)-(c)中的任何一種的鹼基序列或者具有至少70%同一性的互補序列組成並且具有其一種生物活性的多核苷酸。如本文所用，術語「HHV7 U95啟動子」或「HHV7的U95啟動子」是指SEQ ID N0:12中的任何具有啟動子活性的序列。優選地，啟動子在距離SEQ ID NO: 12中的轉錄起始點-484 到+16的位置。在HHV7基因的表達控制中，啟動子優選位於上遊的-379區域，優選在-484 區域，其鹼基序列包括SEQ ID NO :2等中所示的序列。其中，本文已經闡明，NF-kB(距離轉錄起始點-478到-469和-373到-364對應於NF- κ B基序)是來自鹼基序列替代試驗的基序。因此，優選地，本發明的HHV7 U95啟動子包括(a)具有SEQ ID N0:12所示的鹼基序列或者與之對應的鹼基序列或其序列片段的多核苷酸；(b) SEQ ID N0:12所示的鹼基序列或者與之對應的鹼基序列的等位基因變體或其序列片段的多核苷酸；(c)與(a)或(b) 中的任何一種的多核苷酸雜交並且具有其一種生物活性的多核苷酸；或者(d)由(a)-(c) 中的任何一種的鹼基序列或者具有至少70%同一性的互補序列組成並且具有其一種生物活性的多核苷酸。如本文所用，本發明的啟動子「組成型」表達基因是指在生物生長的任意階段，在生物的所有組織中，均以大致一定而不改變的量表達的性質。特別地，在與本說明書實施例同樣的條件下，利用RNA印跡分析時，例如在任意時間點(例如兩個或兩個以上的時間點， 例如第5天和第15天)在同一或相應部位均可以觀察到幾乎相同的表達量時，則在本發明意義上，表達是組成型表達。一般認為組成型表達的啟動子對正常生長環境下維持生物體的恆定性起作用。這些特性可以通過下述方式確定，由生物的任意部位提取RNA，利用RNA 印跡分析表達量。「增強子」可以用於提高目的基因的表達效率。作為增強子，優選包含CaMV35S啟動子內上遊序列的增強子區域。增強子，可以使用多個，也可以使用1個，還可以不使用。在啟動子中增強啟動子活性的區域也可以稱作為增強子。
如本文所用，「被可操作地連接」或「可操作地連接」指將目的序列的表達(起作用)置於某些轉錄翻譯調節序列(例如啟動子，增強子等)或翻譯調節序列的控制之下。為了將啟動子可操作地連接到基因上，啟動子通常位於該基因的上遊，但啟動子無需緊鄰該基因。(核酸構建體)本文所用的術語「核酸構建體」或「基因表達盒」可以互換使用，是指包含編碼基因的核酸(例如，DNA, RNA)的核酸序列，包含可操作地連接了啟動子基因(啟動子控制該核酸的表達)、啟動子和可選擇地可操作地連接了異源基因(即在讀框內)的核酸序列。可以預期，本發明包括這些表達盒或構建體選擇性地與其他調控元件組合的用途。優選地，表達盒或核酸構建體適合於被特定的限制性酶消化並且可以被回收。當本文提及基因時，術語「重組的載體」是指將感興趣的多核苷酸序列導入目的細胞的載體。這種載體能夠在宿主(例如，原核生物細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆蟲細胞、動物個體和植物個體等)中自我複製，或者可以被整合到染色體中，並且在適合本發明的多核酸轉錄的位置包含啟動子。在本申請中，可以使用BAC載體。BAC載體是一種以大腸桿菌的F質粒為基礎而製備的質粒，其能夠在細菌如大腸桿菌等中增殖和穩定地維持約 3001Λ或更長的DNA片段。BAC載體至少包含BAC載體複製所需的區域。這種複製所需的區域包括，如F質粒的複製起點oriS或其變體。如本文所用，「選擇性標記」是指起篩選含有核酸構建體或載體的宿主細胞的作用的基因。選擇性標記包括，但不限於螢光標記、發光標記和藥物選擇標記。「螢光標記」包括但是不限於編碼螢光蛋白的基因，如綠色螢光蛋白(GFP)、藍綠螢光蛋白(CFP)、黃色螢光蛋白(YFP)和紅色螢光蛋白(dsRFP)。「發光基因」包括但不限於，編碼如螢光素的螢光蛋白的基因。「藥物選擇性標記」包括但不限於次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(hprt)、 二氫葉酸還原酶基因、穀氨醯胺合酶基因、天冬氨酸轉氨酶、金屬硫蛋白(MT)、腺苷脫氨酶 (ADA)、腺苷脫氨酶(AMPD1，2)、黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶、UMP合酶、P-糖蛋白、天冬醯胺合酶以及鳥氨酸脫羧酶。一種藥物與藥物篩選標記包括編碼蛋白質的組合例如二氫葉酸還原酶基因(DHFR)和氨甲蝶呤(MTX)的組合；穀氨醯胺合酶(GQ基因與甲硫氨酸磺基肟(Msx)的組合；天冬氨酸轉氨酶(AST)基因與N-磷酸乙醯-L-天冬氨酸(PALA)的組合；MT基因和鎘(Cd2+)的組合；腺苷脫氨酶(ADA)基因和腺苷、亞硝基羥基丙氨酸、或 2'-脫氧柯福黴素的組合；腺苷脫氨酶(AMPDld)基因和腺嘌呤、重氮乙醯絲氨酸、或助間型黴素的組合；黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶基因和黴酚酸的組合；UMP合酶基因和6-氮尿苷或吡唑呋喃菌素的組合；P-糖蛋白(P-gp，MDR)基因和多種藥物的組合；天冬醯胺合酶(AQ基因和β-天冬氨醯異羥肟酸或合歡氨酸的組合；以及鳥氨酸脫羧酶(ODC)基因禾口 - α - 二氟甲基-鳥氨酸(DFMO)的組合。如本文所用，術語「表達載體」是指包含結構基因和用於調控結構基因表達的啟動子的核酸序列，在某些情況下還包含各種調節元件，使得它們可以在宿主細胞中進行操作。 調節元件優選包含終止子、耐藥性基因(例如卡那黴素抗性基因、潮黴素抗性基因等)之類的選擇性標記以及增強子等。生物體(例如動物)的表達載體的類型和所使用的調節元件的種類根據所用的宿主細胞而變化，這是本領域技術人員已知的。如本文所用的，術語「重組載體」是指可以將感興趣的多核苷酸序列導入目的細胞的載體。這種載體在宿主(原核生物細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆蟲細胞、動物個體和植物個體等)細胞中能夠自我複製或者整合到染色體中，並且在適合本發明的多核酸轉錄的位置包含啟動子。如本文所用的，術語「終止子」是指位於基因中編碼蛋白質的區域的下遊的序列， 其與DNA轉錄為mRNA時的轉錄終止以及poly A序列的添加相關。已知終止子增加mRNA 的穩定性，並影響基因的表達量。終止子包括但不限於包括AATAAA的序列。如本文所用的，術語「外源基因」是指在天然情形下不存在於特定生物體中的基因。這種外源基因可以是通過修飾天然存在於特定生物體中的基因而獲得的基因，或者天然存在於特定生物體之外的另一種生物體中的基因(例如AD基因)，或者人工合成的基因， 或者它們的複合物，如融合物。包含這種外源基因的生物體能夠表達實際上不被表達的基因產物。例如，將被刪除的隱性基因(例如，AD基因、PNP基因、γ c鏈基因、TAP基因、MHC II基因、X-連接的WASP、⑶40配體、PI3K樣基因、DNA解旋酶)可被用作一種外源基因。如本文所用的，外源基因是一種細胞因子的基因。如本文所用的，術語「細胞因子」以本領域中最寬廣的意思定義，是由一種細胞生成的具有生理活性的物質，作用於相同或不同的細胞。細胞因子通常是一種蛋白質或多肽，對免疫反應、內分泌系統的調控、神經系統的調控、抗腫瘤活性、抗病毒活性、細胞增殖的調控、細胞分化的調控等具有控制作用。 如本文所用的，細胞因子以蛋白質或核酸的形式存在，在真正起作用時，細胞因子通常呈蛋白質形式。如本文所用，術語「生長因子」是指能夠啟動或控制細胞生長的物質。在細胞培養或組織培養時，將生長因子添加到培養基中，替代血清大分子物質的作用。已經發現，許多生長因子作為細胞分化狀態而不是細胞生長的調控因子。細胞因子通常包括白介素、趨化因子、如集落刺激因子的造血因子、腫瘤壞死因子、幹擾素。生長因子通常包括源自血小板的生長因子(PDGF)、表皮生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、肝細胞生長因子 (HGF)、血管內皮生長因子(VEGF)等，它們具有生長活性。在本發明中，用那些與上述具有天然形式的外源基因具有同一性的基因作為將被表達的外源基因。具有這種同源性的外源基因包括但是不限於例如，當用Blast的默認參數與用於比較的參照外源基因進行比較時，核苷酸具有同一性或相似性至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約30%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、 至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約 95%、至少約99%的序列，或者多肽具有同一性或相似性至少約30%、至少約35%、至少約 40 %、至少約30 %、至少約45 %、至少約50 %、至少約55 %、至少約60 %、至少約65 %、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約99%的胺基酸序列。如本文所用的，術語如基因、多核苷酸、多肽等的基因產物的「表達」是指基因等在體內受到預先確定的活動的作用而改變為另一種形式。優選地，術語「表達」是指基因、多核苷酸等被轉錄和翻譯成多肽。在本發明的一個實施方案中，基因被轉錄為mRNA。更優選地，這些多肽發生翻譯後的加工修飾。因此，如本文所用的，基因、多核苷酸、多肽等的「表達下降」是指當本發明的一種製劑受到一定作用時，使得與該物質未受到一定作用時相比，表達量顯著下降。優選地，表達量降低包括多肽表達水平下降。如本文所用的，基因、多核苷酸、多肽等的「表達增加」是指當本發明的一種製劑受到一定作用(或者與基因表達相關的物質進入細胞，例如，將被表達的基因或者用於調控基因表達的物質)時，使得與該物質未受到一定作用時相比，表達量顯著增加。優選地，表達量增加包括多肽表達水平升高。如本文所用的，術語「誘導」基因的「表達」是指用一種物質作用於細胞使得基因的表達水平針高。因此，誘導表達包括當觀察到基因的表達水平從未表達的觀察水平升高到明顯的表達水平時。如本文所用的，術語基因的「特異性表達」是指不同於其他部位或時期的特定部位或時期中以不同的水平(優選為較高水平)表達。特異性表達是指在某些部位(特定部位)表達或者也指在另一個部位上表達。優選地，特異性表達是指僅在某些部位表達。導入重組載體的方法也可以用上述將DNA導入細胞的方法來實現，包括如轉染、轉導、轉化等，例如磷酸鈣法、脂質體法、DEAE葡聚糖法、電穿孔法、粒子槍法(基因槍)等，脂質轉染法、原生質球法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84，1929 (1978)]、醋酸鋰法 [J. Bacteriol.，153，163 (1983)]、以及[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75，1929 (1978)中描述的方法等。本文所用的用於除去基因組或基因座的Cre酶的過渡表達、染色體的DNA作圖等是本領域技術人員熟知的，在Saibo Kogaku Bessatsu Jikken Purotokooru siriizu(Cell Engineering,Special Edition,Experimental Protocol Series),Ken' i chi Matsubara, Hiroshi Y oshikawa, Shujunsha 編輯(Tokyo)的一部分，「FISH jikken purotokooru hito/genomukaiseki kara senshokutai/idenshi shindan made(FISH Experimental Protocol :from human/genomic analysis to chromosomal, /genetic diagnosis)」等中有描述。如本文所用的，基因表達(例如，mRNA表達、多肽表達)可以用合適的方法「檢測」或「量化」，包括mRNA測定和免疫學測定。分子生物學測定方法的例子包括RNA印記方法、點印記方法、PCR方法等。免疫學測定方法的例子包括ELISA法、RIA法、螢光抗體法、蛋白質印記法、免疫組織染色法等，其中使用微量滴定平板。量化方法的例子包括 ELISA法、RIA法等。採用使用陣列(例如，DNA陣列、蛋白質陣列)的基因分析方法。在 Saibo-Kogaku[Cell Engineering], special issue, "DNA Microarray and Up-to-date PCR Method」，Shujun-sha 編輯，對 DNA 陣列進行了廣泛的綜述。Natgenet. 2002Dec ;32 Suppl :526-32對蛋白質陣列進行了詳細描述。基因表達分析方法的例子包括，但是不限於除了上述方法外的RT-PCR法、RACE法、SSCP法、免疫沉澱法、雙雜交系統、體外翻譯法等。其他分析方法被描述在例如，"Genome Analysis Experimental Method，，,Yusuke Nakamura's Lab-Manual, YusukeNakamura編輯，Yodo-sha(2002)等中。所有上述出版物在此被引入作為參考。如本文所用的，術語「表達水平(或量)」是指在一個細胞中表達的多肽或mRNA的量。術語「表達水平」包括多肽表達的蛋白質水平，其是通過使用抗體的任何合適方法進行評價的，包括免疫測定方法(例如，ELISA法、RIA法、螢光抗體法、蛋白質印記法、免疫組織染色法等，也包括多肽表達的mRNA水平，其通過合適的方法評價，包括分子生物學測定法 (例如，RNA印記法、點印記法、PCR法等)。術語「表達水平的變化」是指多肽表達的蛋白質水平或mRNA水平的升高或降低，通過適當方法評價，包括上述的免疫測定法或分子生物學測定法。
如本文所用的，除非另外指出，術語「轉化」、「轉導」和「轉染」互換使用，是指將核酸導入宿主細胞中。作為一種轉化方法，任何將DNA導入宿主細胞的方法都是可用的，包括各種已知方法，例如電穿孔方法、粒子槍法(基因槍)、磷酸鈣法等。如本文所用的，術語「轉化體」是指通過轉化生產的生物體的整體或者部分，如細胞。轉化體的例子包括原核生物細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆蟲細胞等。根據對象的不同，轉化體是指轉化細胞、轉化組織、轉化宿主等。如本文所用的，包括所有轉化形式，但是在具體上下文中特指某種特定的形式。原核生物細胞的例子包括，大腸桿菌屬、沙雷氏菌屬Gerratia)、芽胞桿菌屬 (Bacillus)、短桿菌屬(Brevibacterium)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、微桿菌屬 (MicrcAacterium)、假單胞菌屬(I^seudomonas)等的原核細胞，例如大腸桿菌XLl-Blue， 大腸桿菌XL2-Blue，大腸桿菌DHl，大腸桿菌MClOOO，大腸桿菌KY3276，大腸桿菌W1485，大腸桿菌JM109，大腸桿菌HB101，大腸桿菌No. 49，大腸桿菌W3110，大腸桿菌NY49，大腸桿菌 BL21 (DE3)，大腸桿菌 BL21 (DE3) pLysS,大腸桿菌 HMS174 (DE3)，大腸桿菌 HMS174 (DE3) pLysS，無花果沙雷氏菌(Serratia ficaria)，居泉沙雷氏菌(Serratia fonticola), 液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)，粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescens)，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis),角軍澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens), 產氨短桿菌(Brevibacterium ammmoniagenes), Brevibacterium immariophilum ATCC14068,解糖短桿菌(Brevibacteriumsaccharolyticum)ATCC14066，穀氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC13032，穀氨酸棒桿菌 ATCC14067，穀氨酸棒桿菌 ATCC13869,嗜乙醯乙酸棒桿菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC13870,嗜氨微桿菌(Microbacterium ammoniaphilum) ATCC15354,假單胞菌某禾中(Pseudomonas sp.) D-0110，等等。動物細胞的例子包括臍帶血單核細胞、外周血單核細胞、Sup-Tl細胞，等等。術語「動物」以其最廣的含義用於本文中，是指脊椎動物和無脊椎動物(例如節肢動物)。動物的例子包括但不限於哺乳動物綱、鳥綱、爬行綱、兩棲綱、魚綱、昆蟲綱、蠕蟲綱等的任何動物。如本文所用的，所謂生物體的「組織」是基本上具有相同功能的細胞的集合。因此， 組織可以是器官的一部分。器官通常具有功能相同的細胞，並且同時存在功能略微不同的細胞。因此，如本文所用的，組織具有各種類型的細胞，只要這些細胞共同具有一定特性。如本文所用，術語「器官」是指具有一種獨立的形態，其中一種或一種以上的組織配合行使特定功能的結構體。對於植物，器官的例子包括但不限於愈傷組織、根、莖、植幹、 葉、花、種子、胚芽、胚、果實等。對於動物，器官的例子包括但不局限於胃、肝臟、腸、胰腺、 肺、氣管、鼻、心臟、動脈、靜脈、淋巴結(淋巴系統)、胸腺、卵巢、眼、耳、舌、皮膚等等。如本文所用的，術語「轉基因的」是指將特定基因整合到某生物體(例如，植物或動物(小鼠等))中或整合了這類基因的生物體。當本發明的生物體是動物時，轉基因生物體可以利用微注射法(微量注射法)、病毒載體法、胚胎幹細胞(EQ法、精子載體法、染色體片段導入法(體細胞轉染法 (transsomic method))、附加體法等來製備。這些轉基因動物的製備技術在本領域中是已知的。
如本文所用的，術語「篩選」是指使用特定操作/評價方法，從大量候選者中選擇具有感興趣特性的物質、宿主細胞、病毒等。應當理解，本發明包括通過篩選獲得的具有期望活性的病毒。如本文所用的，術語「晶片」或「微晶片」可以互換使用，是指具有多種功能的、構成系統的一部分的微型集成電路。晶片的例子包括但不限於DNA晶片、蛋白質晶片等。本發明的皰疹病毒啟動子用作一種藥物組合物的成分，該藥物用於處理、防止和/ 或治療淋巴細胞系的或血細胞系的、免疫的和感染的疾病。如本文所用，與藥物相關的術語「有效量」是指使得所述藥物具有實現目的藥效的含量。如本文所用的，對應於最小濃度的有效量將稱為最小有效量。這種最小有效量是本領域所公知的。通常，藥物的最小有效量由本領域的技術人員確定，或可由本領域的技術人員適宜地確定。要確定有效量除了實際施用以外，還可以使用動物模型來確定。在本發明中在確定此種有效量時是有用的。如本文所用，術語「藥學上可接受的載體」是指用於製造醫藥或農藥(如動物藥) 時所使用的物質，並且該物質對有效成分不產生不良影響。這種藥學上可接受的載體的例子包括但不限於抗氧化劑、防腐劑、著色劑、調味劑、稀釋劑、乳化劑、懸浮劑、溶劑、填料、 填充劑、緩衝液、呈遞載體、賦形劑、和/或農業的或藥學的佐劑。基於通過本發明方法所獲得的信息(例如與疾病相關的信息)，考慮使用目的、對象疾病(種類，嚴重程度等)、患者的年齡、體重、性別、既往病史、施用部位的形態或種類等，本領域的技術人員可以容易地確定本發明的處置方法中所使用的藥劑的種類和用量。 鑑於使用目的、對象疾病(種類、嚴重程度等)、患者的年齡、體重、性別、既往病史和治療過程等，本行業從業人員可以很容易決定對受試者(患者)施用本發明的監測方法的頻率。 作為監測疾病狀態的頻率包括每日一次到數月一次(例如一周一次到1個月一次)。優選地，基於治療進程，每周一次到每月一次地進行監測。如本文所用的，術語「指導說明書」針對實施本發明方法的醫生、患者等所作的對本發明方法的描述。該指導說明書指明了施用本發明的藥劑的時間，例如在放射性治療之前或之後(例如M小時之內等)。所述的說明書按照實施本發明的國家監督管理部門(例如，日本的厚生勞動省、美國的食品藥品局(FDA)等)所規定的樣式編寫，並標明已得到所述監督管理部門的認可。該指導說明書即所謂的包裝說明書，通常以紙為介質提供，但也並不局限於此，也可以通過例如電子媒體(例如通過網際網路提供的主頁或電子郵件)的形式提供。必要時，在本發明的治療中，可以使用兩種或兩種以上的藥劑。在使用兩種以上的藥劑時，這些藥劑具有類似性質或類似的來源，也可以具有不同性質或不同的來源。可以通過本發明的方法獲得有關使用兩種以上藥劑的方法中藥物抗性水平的相關信息。本發明中所用的培養方法在如"Doubutsu Baiyosaibo Manual (Animal Culture Cell Manual)，Seno等人編，Kyoritsu shuppan，1993中有描述並得到其支持，所述文獻在此全文引入作為參考。(製備多肽的方法)通過如下方法製備本發明的多肽，包括以標準的培養方式，培養來自具有重組載體的微生物或動物細胞的轉化體，該重組載體中插入了編碼本發明多肽的DNA，生產並沉澱本發明的多肽，從本發明的培養物中回收本發明的多肽。在培養基中培養本發明的轉化體的方法按照培養宿主的常規方法來實施。用於培養以原核生物細胞如大腸桿菌等或者真核細胞如酵母作為宿主而獲得的轉化體的培養液包括那些包括碳源、氮源、無機鹽等能夠被本發明的生物體吸收的物質的培養液，這些培養液能夠有效地培養轉化體，它們可以是天然的或合成的。可以使用能夠被微生物吸收的碳源，包括如葡萄糖、果糖、蔗糖、食糖或含有糖的蜂蜜、澱粉、澱粉水解產物、有機酸如醋酸和丙酸、醇如乙醇和丙醇等。例如，可以使用如下的氮源氨，無機酸或有機酸的各種銨鹽，例如氯化銨、硫酸銨、醋酸銨、磷酸銨，其他含氮物質等，肽，肉提取物，酵母提取物，玉米浸泡液，酪蛋白水解產物，大豆粉，大豆粉水解產物，各種發酵的細菌體，以及它們的消化產物等。例如，可以使用如下的無機鹽磷酸氫鉀，磷酸二氫鉀，磷酸鎂，硫酸鎂，氯化鈉，磷酸鐵，硫酸錳，硫酸銅，碳酸鈣等。在有氧條件下進行培養，例如搖床或者強通風攪動培養。培養溫度優選在15 40°C之間。培養時間通常從5小時到7天之間，但是不受此限制。培養過程中的PH值保持在3.0 9.0。通過添加無機酸或有機酸或者鹼性溶液、尿素、碳酸鈣氨水等來調節PH值。在培養過程中，按需要添加抗生素，如氨苄青黴素或四環素寸。當對用含有誘導型啟動子的表達載體轉化的微生物進行培養時，可選擇地往培養液中添加誘導劑。例如，當對用含有Iac啟動子的表達載體轉化的微生物進行培養時，往培養液中添加異丙基- β -D-硫代半乳糖吡喃糖苷等。當對用含有trp啟動子的表達載體轉化的微生物進行培養時，往培養液中添加吲哚丙烯酸等。使用發酵罐，大規模地培養導入基因的細胞或器官。本文使用通常使用的培養液，例如Murashige和Skoog(MS)液、White氏培養液或者那些添加了茁長素、細胞因子或植物激素等的培養液。例如，當使用動物細胞時，用於培養本發明的細胞的培養基包括，例如通常使用的那些培養基，例如 RMPI1640 培養基[The Journal of the American Medical Association，199，519 (1967)]、Eagle 氏 MEM 培養基[Science，122，501 (1952) ]、DMEM 培養基[Virology，8，396(1959)]、199 培養基[Proceedings of the Society for the Biological Medicine, 73,1 (1950)]或者添加了胎兒牛血清等的培養基。通常在如pH 6-8,25-400C>5% CO2的條件下培養1_7天。在培養過程中，可選擇地往培養基中添加抗生素，如卡納黴素、青黴素、鏈黴素等。使用本領域熟知和通常使用的分離或純化酶的常規方法，從用編碼多肽核酸序列轉化的轉化體培養物中分離或純化本發明的多肽。例如，本發明的多肽被分泌到用於生產多肽的轉化體外部對該培養物進行離心等操作，獲得可溶的部分。通過溶劑提取，用硫酸銨等進行鹽析/脫鹽，用有機溶劑進行沉澱，使用樹脂(例如二乙基氨基乙基(DEAE)-瓊脂糖、DIAION HPA-75 (Mitsubishi Chemical Corporation)等)進行陰離子交換層析，使用樹脂(例如S-瓊脂糖FF(Pharmacia)等)進行陽離子交換層析，用樹脂(如丁基瓊脂糖、 苯基瓊脂糖等)進行疏水性層析，用分子篩進行凝膠過濾，親合層析，層析聚焦，電泳(例如等電子聚焦電泳等)等方法，從可溶部分中獲得被純化的樣本。當本發明的多肽被表達並在細胞內形成不溶的實體時，收集細胞，研磨成粉末並離心。使用常用方法，從生成的沉澱中收集本發明的多肽。用多肽變性劑溶解不溶的多肽。當多肽變性劑的濃度太低而不能使多肽變性時，將得到的溶液進行稀釋，或者用無變性劑的溶液或稀溶液進行透析。使本發明的多肽形成正常的三維結構，通過上述的分離和純化方法獲得被純化的樣本。用常用的蛋白質純化方法(J.Evan.Sadler 等人Methods in Enzymology, 83, 458)進行純化。可替代地，本發明的多肽與其他蛋白質融合，生成一種融合蛋白，用與該融合蛋白具有親合性的物質，通過親合層析來純化融合蛋白(Akio Yamakawa, Experimental Medicine, 13,469-474 (1995)) 例如，按照 Lowe 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 86, 8227-8231 (1989)Genes Develop.，4，1288 (1990))中描述的方法，生成本發明的多肽與蛋白質A的融合蛋白，接著用免疫球蛋白G進行親合層析來純化。製備本發明的多肽與FLAG肽的融合蛋白，接著用FLAG抗體進行親合層析來進行純化(Proc. Natl. Acad. Sci.，USA, 86,8227 (1989)，GenesDevelop.，4，1288 (1990))。用結合多肽的抗體進行親合層析來純化本發明的多肽。按照已知方法(J.Biomolecular NMR,6,129-134 ；Science,242,1162-1164 ；J. Biochem. ，110， 166-168 (1991))，用體外轉錄/翻譯系統來製備本發明的多肽。根據多肽的胺基酸信息，通過化學合成方法來製備本發明的多肽，例如Fmoc法 (氟基甲氧基羰基法)>tBoc法(t- 丁氧基羰基法)等。使用肽合成法，化學合成該肽(可由 Advanced ChemTech, Applied Biosystems， Pharmacia Biotech， Protein Technology Instrument，SynthecelI-Vega, PerSeptive，Shimadzu 等公司合成)。被純化的本發明的多肽的結構可通過蛋白質化學工業中常用的方法來確定(參見，例如 Hisashi Hirano. "Protein Structure Analysis for GeneCloning，，，Tokyo Kagaku Dojin出版，1993)。按照已知的測定方法來測量本發明的多肽的生理學活性。(製備多肽變體的方法)通過本申請之前熟知的定點誘變方法，對本發明的多肽的胺基酸進行缺失、替代或添力口° 按照 Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols inMolecular Biology, Supplement 1 ~ 38, John Wiley & Sons (1987—1997)、Nucleic Acids Research, 10,6487 (1982) > Proc. Natl. Acad. Sci.，USA,79,6409(1982)，Gene, 34，315(1985)、NucleicAcids Research,13， 4431 (1985)，Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82,488 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci.，USA, 81, 5662(1984)、Science,224，1431(1984)、PCTW085/00817(1985)、Nature,316,601(1985)等中描述的方法，製備缺失、替代或添加了一個或多個胺基酸的那些多肽。(基因治療)在某些具體實施方式
中，施用包含編碼抗體或其功能性衍生物的序列的核酸來進行基因治療、處理、抑制或阻止與本發明中所用多肽的異常表達和/或活性相關的疾病或異常。基因治療是指通過施用在受試者中已經被表達或者能夠被表達的核酸而進行的治療。在本發明的具體實施方式
中，核酸生成其所編碼的蛋白質，而該蛋白質產生一種治療效^ ο任何本領域可獲得的用於基因治療的方法被用於本發明中。下文將描述示例性的方法。參見如下關於基因治療的綜述文章=Goldspiel等人，Clinical Pharmacy12 :488-505(1993) ；Wu and ffu, Biotherapy 3:87-95(1991) ；Tolstoshev, Ann.Rev. Pharmacol. Toxicol. 32 :573-596(1993) ；Mulligan, Science 260 :926-932(1993) ；and Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62 :191-217(1993)；以及 May，TIBTECH 11(5) 155-215(1993)。通常所知的用於基因治療的DNA重組法被描述在Ausubel等人(編輯)， CurrentProtocoIs in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY(1993)；以及 Kri egler,Gene Transfer and Expressi on,A Laboratory Manual,StocktonPress,NY(1990) 中。(治療活性或預防活性的證實)在應用於人之前，優選在體外，然後在體內檢測本發明的化合物或藥物組合物的期望治療活性或者預防活性。用於證實化合物或藥物組合物的治療或預防效用的體外分析包括化合物對細胞系或患者組織樣本的作用。使用本領域技術人員知曉的方法(包括但是不限於細胞溶解分析)，確定化合物或組合物對細胞系和/或組織樣本的作用。按照本發明，用於確定是否需要施用特定化合物的體外分析方法包括體外細胞培養分析，在該分析中，患者組織樣本在培養基中培養，暴露於一種化合物中或者給予一種化合物，並觀察該化合物對組織樣本的作用。(治療性的/預防性的給藥和組合物)本發明提供一種治療、阻止和預防方法，通過給受試者施用有效量的一種成分或藥物組合物，其中包含本發明的啟動子。在一個優選方面，包含啟動子的成分基本上是純化的(例如，包括其作用被降低或者基本上不含引起不期望的副作用的物質)。受試者優選是動物，包括但是不限於牛、豬、馬、雞、貓、狗等，並且優選靈長類，最優選是人。當將本發明的核酸分子或多肽用作藥劑時，該藥劑進一步包含藥學上可接受到載體。任何本領域已知的藥學上可接受到載體可被用於本發明的藥劑中。藥學上可接受的載體或合適的製劑物質包括但是不限於，抗氧化劑、防腐劑、著色劑、調味劑、稀釋劑、乳化劑、懸浮劑、溶劑、填料、填充劑、緩衝液、運載工具、和/或藥學佐劑。通常，本發明的藥劑以包含多肽或多核苷酸或其變體或片段，或其變體或衍生物，或者能夠調節這些物質的任何一種的試劑，以及至少一種生理學上可接受到載體、賦形劑或稀釋劑的形式給藥。例如，合適當載體是注射溶液、生理溶液或者人工腦積水液，其中可添加通常用於胃腸外呈遞組合物中的其他物質。本發明所用的可接受到載體、賦形劑或穩定劑優選對接受者沒有毒性，優選這裡所用的劑量和濃度下是惰性的，優選包括磷酸、檸檬酸或者其他有機酸；抗壞血酸，α -生育酚；小分子量的多肽；蛋白質(例如血清白蛋白、白明膠或者免疫球蛋白)；親水性聚合物(例如，聚乙烯吡咯烷酮)；胺基酸(例如甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、精氨酸或賴氨酸)；單糖、二糖，以及其他碳水化合物(葡萄糖、甘露糖或者糊精)；螯合劑(例如，EDTA)； 糖醇(例如甘露醇或山梨糖醇)；成鹽抗衡離子(例如鈉)；和/或非離子型表面活性劑(例如Tween，聚丙二醇或聚乙二醇(PEG))。合適載體的例子包括中性緩衝鹽水溶液或者與血清白蛋白混合的鹽水溶液。優選地，該產品用合適賦形劑(如蔗糖)配製成凍幹品。按需要還包括其他的標準載體、稀釋劑和賦形劑。其他示例性組合物包含PH 7. 0-8. 5的Tris緩衝液，或者pH 4. 0-5. 5的醋酸緩衝液，其中還包括山梨糖醇或者其合適的替代品。
本發明的藥劑通過口服或者胃腸外給藥。可替代地，本發明的藥劑通過靜脈內或皮下給藥。當全身給藥時，用於本發明中的藥劑可以是無熱原的藥學上可接受的水溶液。在製備這些藥學上可接受的組合物時，對於PH、滲透壓、穩定性等方面的調節是本領域內的技術。給藥的方式可以是口服、胃腸外施用(例如，靜脈內、肌肉內、皮下、皮內、應用到黏膜、 直腸內、陰道內、局部應用於作用部位，應用於皮膚等)。以任何製劑形式指示這種給藥方式。這種製劑形式包括液體製劑、注射劑、穩定的製備物等等。將具有期望純度的糖鏈組合物與可選擇的生理學上可接受的載體、賦形劑或 1 急定齊Ut昆合(Japanese Pharmacopeia ver. 14，或其±曾幹Ij 或者最新版本；Remington，s Pharmaceutical Sciences,第十八版，A. R. Gennaro 編輯，Mack Publishing Company, 1990 ；等等)，將本發明的藥劑製備成凍幹塊或者水溶液形式，便於保存。基於通過本發明方法所獲得的信息(例如與疾病相關的信息)，考慮使用目的、對象疾病(種類，嚴重程度等)、患者的年齡、體重、性別、既往病史、施用部位的形態或種類等，本領域的技術人員可以容易地確定本發明的處置方法中所使用的藥劑的種類和用量。 鑑於使用目的、對象疾病(種類，嚴重程度等)、患者的年齡、體重、性別、既往病史和治療過程等，本行業從業人員可以很容易決定對受試者(患者)施用本發明的監測方法的頻率。 作為監測疾病狀態的頻率包括每日一次到數月一次(例如一周一次到1個月一次)。優選地，基於治療進程，每周一次到每月一次地進行監測。(免疫治療)如本文所用的，術語「疫苗」是指一種組合物(例如懸浮液或者溶液)，其包含一種通常具有感染性的製劑或者感染性製劑的一部分，能夠產生這種製劑或其部分的物質(如基因序列)，以引發有效的免疫反應。含有抗原部分的疫苗可以是一種微生物(例如病毒或者細菌等)，從這種微生物中純化得到的天然產物、合成產物或遺傳工程化的蛋白質、肽、多糖或者類似產物以及包含編碼這種蛋白質的核酸序列的核酸分子。疫苗通過導致中和抗體的生成來發揮作用。如本文所用的，術語「基因疫苗」是指一種組合物(例如懸浮液或溶液等)，其包含一種物質(通常為核酸分子)，其在被施用的受試者中表達，並且該表達產物具有疫苗作用。典型的遺傳疫苗是核酸分子(例如，載體、質粒、裸DNA等)，其包含編碼具有抗原性的基因產物的核酸序列。如本文所用的，本發明的疫苗的作用可用任何本領域已知的方法來證實。這種方法包括但是不限於如CTL前體細胞頻率分析法、ELISP0T法、四聚物法、實時PCR法等。作為對CTL前體細胞頻率分析法的示例性說明，在存在IL-2時培養外周淋巴細胞或者抗原性肽與淋巴細胞，進行限制性稀釋，將IL-2和飼養細胞進行共培養，用疫苗或其候選物刺激包含子代的孔，用ELISA檢測是否生成IFN-γ。按照Poisson分析法，用作為陽性的孔計算前體細胞的頻率，以評價該疫苗效用。如本文所用的，陽性細胞的數目是抗原特異性CTL的數目，該數目越大，該疫苗的效用越高。本發明可用作一種癌症疫苗。在這種情形下，包含作為外源基因的癌症抗原。如本文所用的，術語「癌症抗原」是指一種在正常細胞的癌化過程中被重新表達的抗原分子。這種癌症抗原包括但是不限於例如(1)腫瘤病毒來源的抗原(例如，T抗原等，來自DNA型腫瘤病毒，如腺病毒、多瘤病毒、SV40等)。在人或小鼠的RNA型腫瘤病毒中，病毒來源的衣殼蛋白在細胞表面表達；(2)腫瘤特異性移植抗原(TSTA)；該抗原是指當癌症細胞由於產生特異性免疫反應而被排斥時，相同細胞系的癌症細胞的目標抗原。遺傳突變導致在癌症細胞中生成變異蛋白質，使得其在癌症細胞表面上表達，與其他細胞內正常蛋白質一樣，主要組織相容性 (MHC)抗原基因複合物分子作為肽片段；(3)與腫瘤相關的抗原(TAA)雖然該抗原對於癌症細胞來說並非必然特異性的， 但是其在癌化過程中特異性表達。例如，其對應於肝癌中的α-胎蛋白、腸癌中的癌胚抗原 (CEA)等。這些蛋白質最初僅存在於正常胎兒中，而不存在於成人組織中。然而，這些蛋白質在癌化過程中會再表達，也被稱作為癌胚(oncofetal)抗原。如本文所用，可以使用任何形式的癌症抗原，特別地，優選使用與癌症相關的抗原。這是因為其在與MHC相關的癌症細胞的表面表達。如本文所用，術語「佐劑」是指與免疫原混合而被施用時增加或改變免疫反應的物質。佐劑分為礦物質、細菌、植物、合成的或者宿主的產物。如本文所用，術語「病原體」是指一種能夠使得宿主開始患病或者出現異常的生物體或試劑。如本文所用，術語「預防」和「阻止」是指對一種疾病或異常進行的處理，使得該疾病或異常在其真正發作之前不被引發。如本文所用，術語「治療」和「處置」是指一種處置，但進行該處置時，能夠防止一種疾病或異常的惡化，優選地，至少保持該狀態，更優選地，緩和疾病或異常，更優選地消除該疾病或異常。在應用於人之前，優選在體外，然後在體內檢測本發明的疫苗是否具有期望的治療或預防活性。例如，體外分析本發明的疫苗的治療效用或預防效用的方法包括檢測疫苗對細胞系或者患者組織樣本的作用。疫苗對細胞系和/或組織樣本的作用可用本領域技術人員知曉的方法(例如，免疫分析如ELISA)來確定。體內檢測方法包括但是不限於如檢測是否生成中和抗體的方法。如本文所用。術語「患者」或「受試者」是指本發明的處置或組合物所應用的生物體。優選地，患者是人。本發明給受試者施用有效量的本發明的基因疫苗，提供處置、抑制和預防方法。在一個優選方面，該化合物基本上是純的(例如，基本上不含有限制其效用或者產生不期望的副作用的物質)。如本文所用，術語「施用」是指單獨地或者與其他治療劑組合，將本發明的多肽、多核苷酸等或者含有它們的藥物組合物摻入到生物體的細胞、組織或機體中。組合施用是伴隨進行(例如，化合物)，分開但是同時或者一起地施用；或者順序地施用。這包括組合試劑作為一種治療混合物共同施用的方式，也包括組合試劑分別但是同時地施用的程序(例如通過不同的或相同的黏膜進入同一個體)。「組合」施用還包括分別施用化合物或試劑之一，首先給予第一種，接著給予第二種。可通過任何方式施用本發明的疫苗，而優選是使用無針頭的注射器。這是因為其可以被施用而不會給患者帶來不當的負擔。如本文所用的，術語「無針頭的注射器」是指一種醫療裝置，其通過氣壓或者彈性元件的彈性移動活塞，將藥液轉移到皮膚中，從而將藥物成分施用到皮下或者優選施用到細胞的皮下部位。特別地，例如，Shimajet (由Shimadzu 公司加工)、Medi-JectorVision (由 Elitemedica加工)、PenJetTM(由PenJet加工)，它們都可以購買得到。基因槍(粒子槍) 是指一種醫學裝置和實驗裝置，其利用氦的氣壓等，使高密度粒子如包被了 DNA的金或鎢加速，將基因導入體內。基因槍的優點包括有效地往細胞內導入低含量的DNA，由不同的操作人員能夠獲得穩定結果。分別地，例如，美國Bio-Rad的Helios基因槍可以購買得到。如本文所用，術語「指導說明書」是針對實施給藥的醫生、患者等而對本發明的方法的描述。該指導說明書指明了施用本發明的藥劑的時間，例如在放射性治療之前或之後 (例如M小時之內等)。所述的說明書按照實施本發明的國家監督管理部門(例如，日本的厚生勞動省、美國的食品藥品局(FDA)等)所規定的樣式編寫，並標明已得到所述監督管理部門的認可。該指導說明書即所謂的包裝說明書，通常以紙為介質提供，但也並不局限於此，也可以通過例如電子媒體(例如通過網際網路提供的主頁或電子郵件)的形式提供。藉助用商業上購買得到的分析或裝置檢測抗體生成的結果，可判斷何時可終止用本發明的方法進行的處置或阻止。本發明還提供一種藥物包裝或試劑盒，其包含裝有一種或多種本發明的藥物組合物的容器。將按照監控藥物產品或生物產品的生產、使用和銷售的政府部門所確定形式的告示任意地粘貼到該容器上，表示得到有關政府機關對於施用於人的製造、使用或銷售予以認可。(本文所用的常規技術)除非另外指出，本文所用的技術都在本發明的技術領域內。這些技術通常被用於糖鏈科學、應用流體學、微型加工、有機化學、生物化學、遺傳工程學、分子生物學、微生物學、遺傳學領域以及它們的相關領域。這些技術在下文引證的文件和本文提及的其他文件中被充分地描述。微型加工在如 Campbell，S. A. (1996)，The Science and Engineering ofMicroelectronic Fabrication, Oxford University Press ；Zaut, P. V. (1996), Micromicroarray Fabrication :a Practical Guide to SemiconductorProcessing, Semiconductor Services ；Madou, Μ. J. (1997), Fundamentalsof Microfabrication, CRCl 5 Press ；Rai-Choudhury, P. (1997), Handbookof Microlithography, Micromachining & Microfabrication =Microlithography等中已經有描述，這些文獻中的相關部分在此被引入作為參考。本文所用的分子生物學技術、生物化學技術和微生物學技術是本領域熟知和通常使用的，在如 Maniatis，Τ.等人(1989)，Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor and its 3rd Ed. (2001) ；Ausubel, F. Μ·等人 eds, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sonslnc., NY,10158 (2000)； Innis, Μ. A. (1990), PCR Protocols :A Guide toMethods and Applications, Academic Press ；Innis, M. A.等人(1995), PCRStrategies, Academic Press ；Sninsky, J. J.等人 (1999), PCR Applications !Protocols for Functional Genomics, Academic Press ；Gait，Μ. J. (1985)，Oligonucleotide Synthesis :A Practical Approach，IRL Press ； Gait，M. J. (1990)，Oligonucleotide Synthesis :A Practical Approach，IRL Press ； Eckstein， F. (1991)， Oligonucleotides and Analogues :A Practical Approac, IRL Press ；Adams，R. L 等人(1992)，The Biochemistry of the NucleicAcids，Chapman & Hall ；Shabarova, Z.等人(1994)，Advanced OrganicChemistry of Nucleic Acids， Weinheim ；Blackburn, G. M.等人(1996)，Nucleic Acids in Chemistry and Biology, Oxford University Press ；Hermanson,G. Τ. (1996)，Bioconjugate Techniques，Academic Press ；Method in Enzymology 230，242，247，Academic Press，1994 ；Specialissue， Jikken Igaku (Experimental Medicine) 「Idenshi Donyu &Hatsugenkaiseki Jikkenho (Experimental Method for Gene introduction &Expression Analysis)，，， ^do-sha，1997等中有描述。這些出版物的相關部分(或可能是全部)在此被引入作為參考。(優選具體實施方式
的描述)下文將通過具體實施方式
來描述本發明。下文描述的具體實施方式
僅用於說明目的。因此，本發明的保護範圍不限於具體實施方式
，而是限於附隨的權利要求書。本領域技術人員將清楚認識到，在不背離本發明的保護範圍時，可參照本說明書進行各種變化和改進。一個方面，本發明提供HHV (包括HHV6A和HHV6B，特別是HHV6B)和HHV7的MIE啟動子，和/或HHV7的U95啟動子。特別地，已經發現，與HCMV的IE啟動子相比，HHV6B的 MIE啟動子、HHV7的MIE啟動子以及HHV7的U95啟動子對淋巴細胞的選擇性令人驚奇地增強。特別地，在黏著細胞093細胞、Vero細胞等)中僅表現出HCMV IE啟動子活性的百分之一，而在淋巴細胞例如SupTl、U937等中，表達效率增加了數倍。如此高水平的選擇性或特異性說明該啟動子可被用於開發一種藥物，該藥物作為DNA疫苗，用於基因治療，特別是針對淋巴細胞的治療。而且在體內表達系統中，即使在使用活性強大的CMV啟動子的情況下，由於甲基化酶的作用，啟動子的活性被降低，應當理解本發明的啟動子可用於保護血細胞或淋巴細胞的體內表達量。在遺傳疾病中，通常使用逆轉錄病毒對癌症進行基因治療， 然而，作為一種啟動子，LTR的活性並非如此有效，將本發明的啟動子導入將被表達的基因的上遊，可以在血細胞系細胞中實現有效表達。本發明還可以用於靶向血細胞疾病如白血病等的基因治療。此外，RNAi被用作去除基因表達的方法，而本發明的啟動子被用作髮夾型RNA表達載體的啟動子，能夠更為有效地抑制血細胞系細胞中的表達。用流式細胞儀，從天然外周血中純化得到巨噬細胞或樹突細胞等等，用所構建的質粒轉染這些細胞，所述質粒在本發明的啟動子控制下表達癌症特異性抗原或者腫瘤壞死因子(TNF)等，在被證實能夠表達癌症抗原後，將這些細胞重新導入到起始的機體中，由於腫瘤抗原特異性CTL通過 I-HLA型產生的有效作用，來對癌症進行基因治療。在一個具體實施方式
中，本發明的啟動子長度為至少8個毗鄰的核苷酸。優選地， 本發明的啟動子至少包括SEQ ID NO :1中所示的序列的R3區或其功能性變體。本發明的啟動子至少包含距離SEQ ID NO 1的轉錄起始點-574到-427的序列；更優選地，至少包含距離SEQ ID NO 1的轉錄起始點-1051到-427的序列。這是因為可以預期這些區域包括具有增強子活性的區域。
在一個具體實施方式
中，本發明的啟動子包括NF-K B的基序和AP-I的基序。在一個優選的具體實施方式
中，本發明的啟動子包括SEQ ID NO :1中所示的序列， 更優選地基本上由SEQ ID NO 1中所示的序列組成。在一個具體實施方式
中，本發明的啟動子包括(a)具有SEQ IDNO 1中所示的鹼基序列或者與之對應的鹼基序列或其序列片段的多核苷酸；(b) SEQ ID NO :1所示的鹼基序列的，或者與之對應的鹼基序列的等位基因變體或其序列片段的多核苷酸；(c)與(a) 或(b)中的任何一種的多核苷酸雜交並且具有其一種生物活性的多核苷酸；或者(d)由 (a)-(c)中的任何一種的鹼基序列或者具有至少70%同一性的互補序列組成並且具有其一種生物活性的多核苷酸。如本文所用，生物活性是啟動子活性和/或增強子活性，但是不限於此。啟動子活性和增強子活性可以用本領域熟知的方法來測定，本文中描述了這種方法，並在實施例中列舉。在一個優選的具體實施方式
中，在上述(a)-(d)中所述的替代、添加和缺失的數量限於，例如，優選地50個或更少個、40個或更少個、30個或更少個、20個或更少個、15個或更少個、10個或更少個、9個或更少個、8個或更少個、7個或更少個、6個或更少個、5個或更少個、4個或更少個、3個或更少個、或者2個或更少個。替代、添加和缺失的數量優選較小，但是只要能夠保持生物活性也可以較大(優選地，其活性與HHV6B MIE啟動子的活性相似或者基本上相同)。在一個具體實施方式
中，與上述(a)-(d)中所述的多核苷酸的任何一種或其互補序列的同一性至少約80 %，更優選至少約90 %，甚至更優選至少約98 %，最優選至少約 99%。在一個優選的具體實施方式
中，本發明的核酸分子的長度至少為8個毗鄰的核苷酸。根據使用本發明的目的，本發明的核酸分子的合適長度可能是變化的。更優選地，本發明的核酸分子的長度至少為10個毗鄰的核苷酸，甚至更優選為至少15個毗鄰的核苷酸， 而更優選為至少20個毗鄰的核苷酸。核苷酸長度的下限在上面特別指定的數量之間(例如，9個、11個、12個、13個、14個、16個等)或者大於上面特別指定的數量(例如，21個、22 個、...30個等)。本發明多肽的長度的上限不受限制，只要其可被用於特定目的(例如啟動子)。嚴謹性可以是高的、中度的或低的，並且可根據情況適當地確定嚴謹性水平。在不同的具體實施方式
中，本發明的啟動子的長度為至少8毗鄰的核苷酸。優選地，本發明的啟動子至少包括SEQ ID NO :2中所示序列中的R2區或其功能性變體。更優選地，本發明的啟動子至少包括距離SEQ ID NO 2的轉錄起始位點-388到+22的序列；更優選地，至少包括距離SEQ ID NO :2的轉錄起始位點-493到+22的序列。這是因為可以預期這些區域包括具有增強子活性的區域。在一個實施方式中，本發明的啟動子包括NF-K B基序(SEQ ID N0:2中的-464 到-478 以及-359 到-350)。在一個優選的實施方式中，本發明的啟動子包括，SEQ ID NO 2中所示的序列，更優選地，基本上由SEQ ID NO 2中所示序列組成。在一個實施方式中，本發明的啟動子包括(a)具有SEQ ID NO :2中所示的鹼基序列或者與之對應的鹼基序列或其序列片段的多核苷酸；(b) SEQ ID NO :2中所示的鹼基序列或者與之對應的鹼基序列的等位基因變體或其序列片段的多核苷酸；(c)與(a)或(b)中的任何一種的多核苷酸雜交並且具有其一種生物活性的多核苷酸；或者(d)由(a)-(c)中的任何一種的鹼基序列或者具有至少70%同一性的互補序列組成並且具有其一種生物活性的多核苷酸。如本文所用的，生物活性是啟動子活性和/或增強子活性，但是不限於此。 啟動子活性和增強子活性可以用本領域熟知的方法來測定，本文中描述了這種方法，並在實施例中列舉。在一個優選的實施方式中，在上述(a)-(d)中所述的替代、添加和缺失的數量限於，例如，優選地50個或更少個、40個或更少個、30個或更少個、20個或更少個、15個或更少個、10個或更少個、9個或更少個、8個或更少個、7個或更少個、6個或更少個、5個或更少個、4個或更少個、3個或更少個、或者2個或更少個。替代、添加和缺失的數量優選較小，但是只要能夠保持生物活性也可以較大(優選地，其活性與HHV7MIE啟動子的活性相似或者基本上相同)。在一個優選的實施方式中，與上述(a)-(d)中所述的多核苷酸的任何一種或其互補序列的同一性至少約80%，更優選至少約90%，甚至更優選至少約98%，最優選至少約 99%。在一個優選的實施方式中，本發明的核酸分子的長度至少為8個毗鄰的核苷酸。 根據使用本發明的目的，本發明的核酸分子的合適長度可能是變化的。更優選地，本發明的核酸分子的長度至少為10個毗鄰的核苷酸，甚至更優選為至少15個毗鄰的核苷酸，而更優選為至少20個毗鄰的核苷酸。核苷酸長度的下限在上面特別指定的數量之間(例如，9個、 11個、12個、13個、14個、16個等)或者大於上面特別指定的數量(例如，21個、22個、.· · 30 個等)。本發明多肽的長度的上限不受限制，只要其可被用於特定目的(例如啟動子)。嚴謹度可以是高的、中度的或低的，並且可根據具體情況適當地確定嚴謹度水平。在另一個實施方式中，本發明的啟動子的長度為至少8毗鄰的核苷酸。優選地，本發明的啟動子至少包括SEQ ID NO :12所示序列中的R2區域或其功能性變體。更優選地， 本發明的啟動子至少包括距離SEQID NO 12的轉錄起始位點-3798到+16的序列；更優選地，至少包括距離SEQ ID NO :2的轉錄起始位點-484到+16的序列。這是因為可以預期這些區域包括具有增強子活性的區域。在一個實施方式中，本發明的啟動子包括NF-κ B的基序(SEQ IDNO :12中的-478 到-469 以及-373 到-364)。在一個優選的實施方式中，本發明的啟動子包括，SEQ ID NO :12中所示的序列，更優選地，基本上由SEQ ID NO 12中所示序列組成。在一個實施方式中，本發明的啟動子包括(a)具有SEQ ID NO :12中所示的鹼基序列或者與之對應的鹼基序列或其序列片段的多核苷酸；(b) SEQ ID N0:12中所示的鹼基序列或者與之對應的鹼基序列的等位基因變體或其序列片段的多核苷酸；(c)與(a)或(b) 中的任何一種的多核苷酸雜交並且具有其一種生物活性的多核苷酸；或者(d)由(a)-(c) 中的任何一種的鹼基序列或者具有至少70%同一性的互補序列組成並且具有其一種生物活性的多核苷酸。如本文所用的，生物活性是啟動子活性和/或增強子活性，但是不限於此。啟動子活性和增強子活性可以用本領域熟知的方法來測定，本文中描述了這種方法，並在實施例中列舉。在一個優選的具體實施方式
中，在上述(a)-(d)中所述的替代、添加和缺失的數量限於，例如，優選地50個或更少個、40個或更少個、30個或更少個、20個或更少個、15個或更少個、10個或更少個、9個或更少個、8個或更少個、7個或更少個、6個或更少個、5個或更少個、4個或更少個、3個或更少個、或者2個或更少個。替代、添加和缺失的數量優選較小，但是只要能夠保持生物活性也可以較大(優選地，其活性與HHV7U95啟動子的活性相似或者基本上相同)。在一個優選的實施方式中，與上述(a)-(d)中所述的多核苷酸的任何一種或其互補序列的同一性至少約80%，更優選至少約90%，甚至更優選至少約98%，最優選至少約 99%。在一個優選的具體實施方式
中，本發明的核酸分子的長度至少為8個毗鄰的核苷酸。根據使用本發明的目的，本發明的核酸分子的合適長度可能是變化的。更優選地，本發明的核酸分子的長度至少為10個毗鄰的核苷酸，甚至更優選為至少15個毗鄰的核苷酸， 而更優選為至少20個毗鄰的核苷酸。核苷酸長度的下限在上面特別指定的數量之間(例如，9個、11個、12個、13個、14個、16個等)或者大於上面特別指定的數量(例如，21個、22 個、...30個等)。本發明多肽的長度的上限不受限制，只要其可被用於特定目的(例如啟動子)。嚴謹度可以是高的、中度的或低的，並且可根據具體情況適當地確定嚴謹度水平。在另一個方面，本發明提供包括本發明的啟動子(HHV6的MIE啟動子、HHV7的MIE 啟動子、HHV7的U95啟動子等)的核酸構建體。這種核酸構建體具有在淋巴細胞中特異誘導表達的性能，其有效性高，與人巨細胞病毒(HCMV)IE啟動子相比，具有出乎意料的高特異性。因此，在一個具體實施方式
中，本發明的核酸構建體包括編碼外源基因的序列，該序列與本發明的啟動子具有不同來源，並且與本發明的序列可操作地連接。這種外源基因包括，但是不限於例如，編碼RNAi分子、藥物抗性、將被刪除的隱性基因、選擇性標記等的那些基因。優選地，用於本發明中的選擇性標記是能夠在培養基中選擇導入了該核酸構建體的宿主的那些標記，並且例如這些選擇性標記是能夠從視覺上選擇導入了該核酸構建體的宿主的那些標記，例如次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(hprt)或者一種選自由綠色螢光蛋白(GFP)、蘭綠色螢光蛋白(CFP)、黃色螢光蛋白(YFP)和紅色螢光蛋白(dsRed)組成的組的螢光標記。優選地，本發明的核酸構建體中所包括的選擇性標記有利地是對其中按照本發明導入了核酸構建體的宿主基本上不具有毒性的那些標記。這是因為當本發明用於治療或預防目的時，優選不產生副作用。本發明的核酸構建體中包括的選擇性標記包括例如，將被刪除的隱性基因。如本文所用的，將被刪除的隱性基因是指被刪除時會造成患病狀況的任何隱性基因，包括但是不限於，例如ADA基因(與嚴重的聯合免疫缺陷(SCID)相關)、PNP基因(嚴重的聯合免疫缺陷(SCID)), ye鏈基因(與嚴重的聯合免疫缺陷(SCID)相關)、TAP基因(與MHCI缺陷相關)、MHC II基因(與MHC II缺陷相關)、X-連接的WASP (與Wiskott-Aldrich症候群相關)、⑶40配體(與X-連接高IgM症候群相關)、PI3K-樣基因(與肉芽瘤毛細血管擴張相關)和DNA解旋酶(與Bloom氏症候群相關)等。在一個優選的具體實施方式
中，本發明核酸構建體所包括的藥物是蛋白質試劑，例如細胞因子、趨化因子、生長因子、蛋白激素和肽激素，如IFN-α、IFN-Y、IL_2、IL-12、 G-CSF、GM-CSF 等。在一個具體實施方式
中，在本發明的核酸構建體中，啟動子在血細胞系細胞，特別是T細胞中誘導外源基因的特異性表達。在另一個方面，本發明提供一種包含本發明的核酸構建體的表達載體。這種表達載體可以以可操作的連接方式包括表達所需的元件，這些元件不存在於本發明的核酸構建體中，例如，終止子、增強子序列，允許在宿主中進行表達。在另一個優選的具體實施方式
中，選擇性標記是無限增殖基因(例如bcl-2)。可替代地，根據條件不同，選擇性標記是次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(hprt)、編碼毒性產物的基因、毒性基因產物與自殺性底物的組合(例如，單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK) 與無環鳥苷的組合)。另一個方面，本發明提供包含本發明的核酸構建體的細胞。當這種細胞為淋巴細胞時，能夠促進編碼蛋白質的外源基因的表達。優選地，當本發明的細胞與本發明的啟動子序列是異源的時是有利的。即使該細胞為異源的也能夠實現啟動子活性，這是令人驚奇的效果之一。將核酸導入本發明所用的細胞中的方法在本領域是熟知的，這在上文中已有詳細描述。可替代地，通過從包含細胞的樣本中篩選包含核酸分子的細胞來鑑定這種細胞。包含本發明的核酸分子的細胞優選處於未分化的狀態。表達本發明的核酸分子的細胞通常處於未分化的狀態。由於處在未分化的狀態下，因此導入這種核酸分子的細胞能夠以可調控的方式表達。可替代地，用這種細胞來大量製備本發明的核酸。這種製備方法在本領域是熟知的，並在本文描述的文獻中有記載。另一個方面，本發明提供包含本發明的核酸構建體的組織。這種核酸序列優選被可操作地連接到控制序列上。這種器官是動物組織或者其他生物體如植物的組織。可替代地，用這種組織大量地製備本發明的核酸分子。這種製備方法在本領域是熟知的，並在本文描述的參考文獻中有記載。另一個方面，本發明提供包含本發明的核酸構建體的器官。這種核酸序列優選被可操作地連接到控制序列上。這種器官是動物組織或者其他生物體如植物的組織。可替代地，用這種器官大量地製備本發明的核酸分子。這種製備方法在本領域是熟知的，並在本文描述的參考文獻中有記載。另一個方面，本發明提供包含本發明的核酸構建體的生物體。用這種生物體大量地製備本發明的核酸分子。這種製備方法在本領域是熟知的，並在本文描述的參考文獻中有記載。另一個方面，本發明提供包含本發明的啟動子的藥物組合物。如本文所用的，所用的抗原是被期望能夠在宿主中引發免疫反應的任何蛋白質。這種抗原包括但是不限於，例如，癌症抗原等。因此，本發明的藥物組合物優選是DNA疫苗。另一個方面，本發明提供治療其中期望進行淋巴細胞特異性治療的疾病、異常或症狀的藥物組合物，其包括本發明的啟動子以及用於所述處理的核酸序列。如本文所用的， 藥物組合物的靶點合適地是期望進行淋巴細胞特異性治療的任何疾病、異常或症狀，例如是獲得性免疫缺陷症候群。獲得性免疫缺陷症候群包括，嚴重的聯合免疫缺陷(SCID)、MHC I缺陷、MHC II缺陷、成斯科特-奧爾德裡奇症候群、X-連接的高IgM症候群、肉芽瘤毛細血管擴張、Bloom氏症候群等。儘管不期望受任何理論的約束，獲得性免疫缺陷症候群是由隱性基因(在此也被稱作為要被刪除的隱性基因)的某些缺陷引起的。因此，有可能實施體細胞基因治療，其中將要被刪除的基因導入到從患者獲得的骨髓細胞中，然後將這些細胞重新導入到患者中。在這方面，本發明的HHV6B MIE啟動子可能被用於提高將分化為T 細胞巨噬細胞等的細胞中的基因表達效率。例如，可能用逆轉錄病毒等來導入這種基因構建體。在一個優選的實施方式中，用於所述治療的核酸序列包括選自由編碼細胞因子、 趨化因子、生長因子、蛋白激素、肽激素、核酶和siRNA(HIV-1 gp41 :AATAAGACAGGGCTTGGAAA GACACTTTCCAAGCCCTGTCTTATTTTT(SEQ ID NO 33)/HIV-I tat :AAGCATCCAGGAAGTCAGCCTACA AGGCTGACTTCCTGGATGCTTTTT(SEQ ID NO :34)/HTLV-1 tax :GAACATTGGTGAGGAAGGCACAGCCTT CCTCACCAATGTTCTTTTT (SEQ ID NO 35))的那些序列組成的組的序列。另一個方面，本發明提供以淋巴細胞特異性方式表達一種蛋白質的方法，包括步驟:A)製備一種核酸構建體，其中本發明的啟動子被可操作地連接到編碼蛋白質的核酸序列上；和B)將該核酸構建體放置在其中所述啟動子誘導編碼蛋白質的核酸序列表達的條件下。另一個方面，本發明提供用於以淋巴細胞特異性方式表達一種蛋白質的試劑盒， 包含A) —種核酸構建體，其中本發明的啟動子被可操作地連接到編碼蛋白質的核酸序列上；和B)用於將該核酸構建體放置在其中所述啟動子誘導編碼蛋白質的核酸序列表達的條件下的工具。另一個方面，本發明還提供用於以淋巴細胞特異性方式表達一種蛋白質的試劑盒，包含A)本發明的啟動子；和B)用於製備其中所述啟動子被連接到編碼蛋白質的核酸序列上的核酸構建體的工具。另一個方面，本發明還提供用於治療或預防一種需要以淋巴細胞特異性方式表達一種蛋白的疾病、異常或症狀的方法，包括步驟:A)製備其中根據本發明的啟動子被連接到編碼蛋白質的核酸序列上的核酸構建體；和B)將該核酸構建體放置在其中所述啟動子誘導編碼蛋白質的核酸序列表達的條件下。另一個方面，本發明還提供用於治療或預防一種需要以淋巴細胞特異性方式表達一種蛋白的疾病、異常或症狀的試劑盒，包含A)其中根據本發明的啟動子被連接到編碼蛋白質的核酸序列上的核酸構建體；和B)用於在該啟動子誘導編碼蛋白質的核酸序列表達的條件下放置核酸構建體的工具。另一個方面，本發明還提供用於治療或預防一種需要以淋巴細胞特異性方式表達一種蛋白的疾病、異常或症狀的試劑盒，包含A)本發明的啟動子；和B)用於製備其中所述啟動子被連接到編碼蛋白質的核酸序列上的核酸構建體的工具。另一個方面，本發明還提供一種製備蛋白質的方法，包括步驟:A)製備其中根據本發明的啟動子被連接到編碼蛋白質的核酸序列上的核酸構建體；和B)在該啟動子誘導編碼蛋白質的核酸序列表達的條件下放置該核酸構建體。另一個方面，本發明還提供用於製備蛋白質的試劑盒，包含A)本發明的啟動子被連接到編碼蛋白質的核酸序列上的核酸構建體；和B)用於將核酸構建體放置在其中所述啟動子誘導編碼蛋白質的核酸序列表達的條件下的工具。
另一個方面，本發明還提供用於製備蛋白質的試劑盒，包含A)本發明的啟動子； 和B)用於製備其中所述啟動子被連接到編碼蛋白質的核酸序列上的核酸構建體的工具。另一個方面，本發明還提供本發明的啟動子的用途，用於製造一種用於治療或預防一種需要以淋巴細胞特異性方式表達一種蛋白的疾病、異常或症狀的藥物組合物。本文引用的所有科技文獻、專利、公開的專利申請以及出版物在此引入作為參考， 如同其在本文中完全列出一樣。至此已經描述了本發明的優選具體實施方式
，其用於更好地理解本發明。下面將通過實施例來描述本發明。下文描述的實施例僅用於說明目的，因此，本發明的保護範圍僅受附隨權利要求書的限制。
實施例對如下實施例中所用的動物的處理遵照Osaka大學的規定。(實施例1搜索HHV6B啟動子以及開發DNA疫苗)對於HHV-6立即早期蛋白質的啟動子(9U、20U、MIE、U95、MIE/;3K、U95/3K，在大小上存在差別)來說，將它們的活性與巨細胞病毒(CMV)啟動子的活性進行比較。在方法方面，將各個啟動子區插入到pGL3-BasiC載體(!Iomega)的螢光素酶的上遊，然後用其轉染各個細胞，並用螢光素酶活性作為參考來比較啟動子的活性。下文將對材料和方法進行詳細描述。(材料與方法)(概略)克隆HHV-6B的MIE基因的啟動子區(約1. 21Λρ)，將其連接到日本腦炎病毒北京-1株cDNA下遊的外膜糖蛋白，來構建體質粒p9u/JEVenv。所用的綠色螢光蛋白質表達質粒pEGFP-Nl可購買得到(從Clontech獲得)。用質粒(pcDNA3. Ι/JEVenv)作為參照，其中JEVenv被連接到pcDNA3. IZeo+載體的HCMV-IE啟動子的下遊。所用的綠色螢光蛋白質表達質粒pEGFP-m可購買得到(從BD Biosciences獲得)。此外，本文所用的螢光素酶表達質粒是已經構建的質粒(pGL3-BasiC ； 從Promega獲得)。將這些質粒導入到如下細胞中293細胞(來自人腎臟)、Vero細胞(來自猿猴腎臟)、SupTl細胞(來自人T淋巴細胞)、U937細胞(來自人單核細胞)等(這些細胞可從美國典型培養物保藏中心(ATCC)、RIKEN細胞庫、基因庫等獲得)。使用抗JEV的多克隆抗體，通過間接螢光抗體法，對細胞提取物進行蛋白質印跡分析，分析外膜糖蛋白在細胞中的表達情況。將HHV-6MIE的啟動子區插入到螢光素酶載體pGL3_Basic (Promega)的螢火蟲螢光素酶基因的上遊而形成p9u，通過綠豆核酸外切酶從MIE啟動子的上遊除去鹼基，用p9u 製備截斷的突變體。通過脂質轉染法，用這些截斷的突變體和海鰓螢光素酶表達質粒轉染Vero細胞， 進行轉染效率修正(phRL-SV40)。轉染M小時後收集細胞，加入細胞溶解液。接著，測定溶解產物中螢火蟲螢光素酶和海鰓螢光素酶的發光水平。為了修正轉染效率，用螢火蟲螢光素酶的發光水平除以海鰓螢光素酶的發光水平。
1)細胞用如下8種細胞系測定啟動子活性。(I)Vero細胞(來自猿猴腎臟)(2) HEL細胞(來自人胚胎成纖維細胞)(3) L929細胞(來自鼠科成纖維細胞)G)293細胞(來自人腎臟)(5) U373細胞(來自人神經膠質瘤)(6) THP-I細胞(來自人單核細胞)(7) SupTl細胞(來自人T細胞)(8) U937細胞(來自人單核細胞)(這些細胞可從美國典型培養物保藏中心(ATCC)購買)。2)用於測定啟動子活性的質粒為了測定啟動子的活性，使用具有螢火蟲螢光素酶基因的pGL3-BasIc(Promega)。 該質粒不具有來自真核生物細胞的啟動子序列或增強子序列，將各種鹼基序列導入到螢光素酶基因的上遊，測定螢光素酶的表達量，以測定所插入序列的啟動子活性。3)插入到pGL3_Basic中的啟動子序列如下文所述，為了進行測定，使用HHV-6MIE的啟動子區、HHV-6的U95基因的啟動子區和HHV-6的立即早期基因啟動子區以及HCMVMIE的啟動子區域，它們存在於可購買得到的表達載體中。HHV-6的啟動子區在進行PCR擴增並插入到pGL3-BasiC中後被使用。(l)20u [其中插入 HHV-6MIE 的啟動子區(139381 — 140624 :1243bp)] (SEQ ID NO 5)(2)9u [其中插入 HHV-6MIE 的啟動子區(139381 — 140427 :1046bp)] (SEQ ID NO :6)( MIE[其中插入 HHV-6MIE 的啟動子區(139457 — 140211 :754bp)] (SEQ ID NO :7)⑷U95[其中插入 HHV"6U95 基因的啟動子區 Q41823 — 142578 :756bp)] (SEQ ID NO :8)(5)CMV[其中插入從購買得到的表達載體(pcDNA3. 1)中切出的HCMV MIE啟動子 750bp](SEQ ID NO :9)(6)MIE/3K[其中插入 HHV-6MIE 的啟動子區(139443 — 142578 :3136bp)] (SEQ ID NO 10)(7)U95/3K[其中插入 HHV-6MIE 的啟動子區(139443 — 142578 :3136bp)] (SEQ ID NO :11)，用未插入鹼基序列的pGL3-BasiC作為對照。此外，製備多種缺失變體。這些示意圖在圖5中給出。作為變體，如圖5製備如下產物。(l)9u :-1051 到+1 (SEQ ID NO 5)(2)9u-d2-7 :-814 到 +1 (SEQ ID NO 17)(3)9u-dl-4 :-574 到 +1 (SEQ ID NO 18)(4) 9u-dl-5 :-427 到 +1 (SEQ ID NO 19)(5)9u-dl-7 :-350 到 +1 (SEQ ID NO 20)(6)9u-d3-7 :-276 到 +1 (SEQ ID NO 21)(7) 9u-d5 :-240 到 +1 (SEQ ID NO 22)(8)9u-d6 :-212 to+1 (SEQ ID NO :23)
(9) 9u-d7 :-116 到 +1 (SEQ ID NO 24)(10)9u-d8 :_77 到 +1 (SEQ ID NO 25)4)用質粒轉染細胞採用脂質轉染方法，用Superfect (QIAGEN)進行轉染。為了修正轉染效率，同時將β -半乳糖苷酶表達質粒(pCHl 10，Wiarmacia)導入到細胞中，並測定β-半乳糖苷酶活性。PCHllO在SV40早期啟動子控制下表達β-半乳糖苷酶。將pGL3構建體(8 μ 1)和pCHllO (0. 2 μ 1)混合在一起，並往其中加入Superfect 試劑(8μ1)來進行轉染。5)測量螢光素酶活性用螢光素酶分析系統(!Iomega)分析螢光素酶活性。對pGL3構建體和pCHllO進行共轉染，48小時後收集細胞。用PBS洗滌兩次後，將細胞溶解在150 μ L細胞溶解液中。往細胞溶解液上清液(20 μ L)中加入100 μ L螢光素酶底物溶液，30秒後，用照度計測量發光度。 6)測量β -半乳糖苷酶活性用β -gal報導系統(Clontech)測量β -半乳糖苷酶活性。以與在螢光素酶活性測量中相似的方式製備細胞溶解液，並往20 μ L細胞溶解液中添加100 μ L發光底物溶液，1 小時後，用照度計測量發光度。7)在用TPA激活細胞的條件下測量啟動子活性用質粒轉染Vero細胞和細胞，在對小時後，在TPAQ5ng/ml)存在和不存在的條件下再培養M小時。此後，收集細胞，測量螢光素酶活性和半乳糖苷酶活性。(結果)1)HHV-6MIE區的啟動子活性HHV-6MIE區的啟動子活性以及HCMV MIE的啟動子活性在上皮黏著細胞和淋巴細胞中具有不同表現。(1)在黏著細胞中的啟動子活性的比較(圖1)在黏著細胞中，HHV-6MIE的啟動子序列的活性低於HCMV，具有一些啟動子活性。 U95啟動子和HHV-6立即早期基因的啟動子的活性很低。另一方面，在黏著細胞中，HCMV MIE啟動子的活性比HHV-6MIE啟動子的活性約高10 50倍。特別地，在HEL細胞和U373 細胞，HCMV能夠繁殖的細胞中，它顯示了強有力的活性。至於HHV-6MIE區的啟動子活性，那些長0. 7kb 1. 2kb的啟動子區域的活性基本上相同，但是一般認為31Λ序列的活性有所下降。(2)在淋巴細胞中的啟動子活性的比較(圖2)HHV-6能夠在淋巴細胞中繁殖，在淋巴細胞中，HHV-6MIE區的啟動子活性比HCMV 約高10倍。特別地，HHV-6MIE區在THP-I和U937中具有強有力的活性，這些細胞屬於單核的巨噬細胞系。HCMVMIE啟動子在淋巴細胞中不具有如此強大的活性。當啟動子區長0. 7kb 1. 2kb時，HHV-6MIE區的啟動子活性升高，然而，當長度為 31Λ時，其啟動子活性降低。2)當採用具有TPA的細胞激發時，HHV-6MIE區的啟動子活性(圖3和4)
採用12-0-十四醯佛波醇13-醋酸鹽(TPA)激活Vero細胞，來測量HHV-6MIE的啟動子活性，所有的啟動子活性升高，並且顯示出與HCMV MIE啟動子基本上相同的活性(圖 3)。然而，在細胞中，用TPA激活細胞也沒有觀察到啟動子活性升高(圖4)。一般認為這是由於不同類型細胞對TPA的反應存在差別。在Vero細胞中，一般認為TPA通過誘導產生大量不同的轉錄活化因子，從而提高 HHV-6MIE啟動子活性。也就是說，HHV-6MIE啟動子的最大活性與HCMV MIE啟動子一樣。 因此，已經證明了本發明的啟動子的特異性和選擇性。如此，在本發明中，在黏著細胞如Vero細胞、HEL細胞、L929細胞、293細胞、U373 細胞中，CMV啟動子的活性比HHV-6高10倍(圖1)。然而，在來自人淋巴細胞的細胞，例如 THP-I細胞、SupTl細胞、U938細胞中，HHV-6啟動子的活性是CMV啟動子活性的數倍，並且還發現，啟動子越短活性越大。已經證明了 HHV-6的啟動子是有前景的，並且根據這些結果，可以理解，這些啟動子可被用於DNA疫苗中(腮腺炎疫苗)，並且極具前景。用HCMV IE啟動子作為對照，在螢光素酶表達系統中比較研究本發明人克隆的 HHV-6B MIE啟動子的活性。結果，在黏著細胞如293細胞、Vero細胞等中，HHV-6MIE啟動子的活性約為HCMHE啟動子活性的十分之一。然而，在淋巴細胞例如SupTl和U937等中， HHV-6MIE啟動子的表達效率高數倍。採用將JEV cDNA連接到本發明啟動子下遊的p9u/ JEVenv，來分析JEV的外膜糖蛋白的表達，在轉染48小時後在任何黏著細胞或者平滑的淋巴細胞中未檢測到JEV蛋白質的表達。另一方面，在使用HCMV的IE啟動子的pCDNA3. Ι/JEVenv中，證實了存在JEV蛋白質的表達。而且在JEV感染的Vero細胞中，其作為陽性對照，很容易地檢測到外膜糖蛋白。為了分析其中原因，用GFP蛋白質表達質粒來驗證轉染效率。結果，其在SupTl細胞中的導入效率低至0. 或更低，然而，293細胞和Vero細胞分別具有45%和20%的較高的導入效率。在淋巴細胞中，所克隆的HHV-6MIE啟動子的表達活性比HCMV MIE啟動子高數倍。然而，被表達的基因轉化為JEV的外膜糖蛋白時，不能檢測到其活性。有意思的是，在淋巴細胞中，本發明克隆的HHV-6MIE啟動子的表達活性比 HCMV-IE啟動子高數倍。然而，當將被表達的基因從報導基因轉化為JEV的外膜糖蛋白時， 未檢測到活性，這是不可預期的。因此，其中原因可能是所表達的JEV蛋白質以反饋的方式起作用，從而以相反的方式抑制該啟動子活性，或者可能是所表達的抗原在這些細胞中不穩定。本實施例被總結如下1)在淋巴細胞中，特別是在單核細胞/巨噬細胞中，HHV-6MIE啟動子活性比HCMV MIE啟動子約高10倍。2)在上皮黏著細胞，HHV6MIE啟動子活性約為HCMV MIE啟動子活性的十分之一。幻在誘導產生大量不同的轉錄因子的情況下，HHV-6MIE啟動子具有與HCMV MIE 啟動子相同的活性。如上所述，在本實施例中，那些在HHV-6B的主要立即早期(MIE)基因上遊插入約12kbp(6MIEP)和在pGUBasic載體(Promega)的螢光素酶基因插入約700bp U95基因 (6U95)的構建體被使用。與常規啟動子比較，為了研究這些IE啟動子應用於DNA疫苗中的可能性，使用血細胞系細胞，與人細胞巨化病毒(HCMV) IE增強子-啟動子(CMVP)進行活性比較。在本實施例中，證明了人皰疹病毒6B(HHV-6B)所編碼的立即早期(IE)啟動子在血細胞系細胞中具有極高度的活性。4)此外，如圖7中所描述的，研究了各個片段的活性，並且至少起始位點上遊的-572到-427，特別是-1051到-427具有啟動子活性，並優選具有增強子活性。_417到 +1部分對於啟動子活性來說似乎是必需的，而增強子活性對於保證特異性似乎是必需的。 發揮增強子活性的部分包括NF-K B和AP-I基序。因此，具有這些基序是重要的，以在淋巴細胞中體現出特異性。(實施例2:HHV-7的MIE啟動子和U95啟動子)接著，實施涉及來自HHV-7的啟動子的實驗。對HHV-7的兩種立即早期啟動子(7MIEP、7U95P)的活性與細胞巨化病毒(CMV)啟動子以及HHV-6IE啟動子(9U*U%)的活性進行比較。比較方法如下將各個啟動子區插入到pGL3-BasiC載體(!Iomega)的螢光素酶基因的上遊，用該載體轉染各個細胞，以螢光素酶活性作為參照，比較啟動子的活性。為了研究各個啟動子上遊的R2區的作用，製備了多種缺失變體以測量啟動子活性。( _既述)作為一種報導質粒，將分別來自HHV-7的MIE和u95基因的約500bp片段(7MIEP 和7U95P)插入到pGL3BasiC載體(!Iomega)的螢光素酶基因的上遊，用於本實施例中。用脂質轉染法，將報導質粒導入到T細胞系(Jurkat、Molt_3、SupT-I)、骨髓細胞系(SAS-413)中，用電穿孔法將報導質粒導入到外周血單核細胞(PBMC)中，來測量螢光素酶活性。結果，與HCMVMIE啟動子相比，在T細胞系中，HHV-7MIE啟動子和HHV-7U95啟動子的活性比HCMV MIE啟動子高數倍，而在SAS-413細胞中，HCMVMIE啟動子的活性高十倍以上。在對三批PBMC實施導入的實驗中，HHV-7MIE啟動子和HHV-7U95啟動子的活性較低。 與HHV-6IE啟動子(9U*U%)相比，HHV-7的兩種啟動子在任何細胞種類中的活性都較低。 此外，在使用HHV7MIE啟動子和HHV7U95啟動子的缺失變體的實驗中，儘管在不同細胞類型之間存在差別，R2對這兩種啟動子起主要的增強子活性。在本實施例中，已經證明，人皰疹病毒7(HHV-7)所編碼的立即早期(IE)啟動子在血細胞系細胞中具有極高度活性。下文將詳細描述材料與方法。(材料與方法)1)細胞如下五種細胞用於測定啟動子活性。(1) Jurkat細胞(來自人T細胞)
(2) Molt-3細胞(來自人T細胞)⑶SupTl細胞(來自人T細胞)(4) SAS-413細胞(來自人骨髓細胞)(5)外周血單核細胞(PBMC)2)用於測定啟動子活性的質粒
用具有螢火蟲螢光素酶基因的pGLSBasica^romega)測量啟動子活性。3)插入pGL3Basic中的啟動子序列通過PCR擴增約500bp的HHV-7的MIE基因的啟動子區(7MIEP)和HHV-7的U95 基因的啟動子區(U95P)，並製備它們的缺失變體。圖8對這些啟動子進行示意性說明。(1)7ΜΙΕΡ(-493)[插入了距離HHV-7MIE基因的轉錄起始位點上遊493pb到下遊 22bp] (SEQ ID NO :26)(2) 7MIEP (-388)[插入了距離HHV-7MIE基因轉錄起始位點上遊388pb到下遊 22bp] (SEQ ID NO :27)(3)7MIEP(-233)[插入了距離HHV-7MIE基因轉錄起始位點上遊233pb到下遊 22bp] (SEQ ID NO :28)(4) 7U95P (-484)[插入了距離HHV-7U95基因轉錄起始位點上遊484pb到下遊 16bp] (SEQ ID NO :29)(5)7U95P(-379)[插入了距離HHV-7U95基因轉錄起始位點上遊379pb到下遊 16bp] (SEQ ID NO :30)(6) 7U95P (-304)[插入了距離HHV-7U95基因轉錄起始位點上遊304pb到下遊 16bp] (SEQ ID NO :31)用無啟動子序列的pGL3 Basic作為對照。4)用質粒轉染細胞M Lipofectamine 2000 (Invitrogen)，M Jurkat MM^ Molt-3 MM^ SupTl MM 和SAS-413細胞進行脂質轉染，用Nucleofector (amaxa)對PBMC進行電穿孔。為了修正轉染效率，同時將海鰓螢光素酶表達質粒(pRL-TK，Promega)導入細胞中，並測定海鰓螢光素酶活性。PRL-TK在單純皰疹病毒胸苷激酶(TK)啟動子的控制下表達海鰓螢光素酶。pGL3報導子(1. 2 μ g)和pRL_TK(50ng)混合在一起，往其中力Π入2 μ 1 Lipofectamine 2000 來實施轉染。5)測量螢光素酶活性為了測量螢光素酶活性，使用雙螢光素酶報導分析系統(!Iomega)。轉染16小時後，收集細胞，並溶解在細胞溶解液(100 μ 1)中。往5μ 1細胞溶解液上清液中加入螢火蟲螢光素酶底物溶液(25 μ 1)，隨後立即用照度計測量發光度。接著， 在測量後往樣本中加入海鰓螢光素酶底物溶液(25 μ 1)，隨後立即用照度計測量發光度。(結果)1)HHV-7MIE啟動子區的活性使用四種細胞系的實驗結果表明，當與CMV啟動子的活性比較時，7ΜΙΕΡ(_493)在 Molt-3細胞和SuptTl細胞中具有約高6 7倍的活性，在Jurkat細胞中具有類似活性， 在SAS-413細胞中只有約1/11的活性。而且當與HHV-6IE啟動子(9U和U95)比較時， 7MIEP(-493)在所有類型細胞中的活性都較低(圖9)。使用三批PBMC的實驗結果表明，7MIEP (-493)的活性與CMV啟動子和9U的活性相似或者略低，與HHV-6U95的活性類似或略高(圖10)。2)HHV_7U95啟動子區的活性
使用四種細胞系的實驗結果表明，當與CMV啟動子的活性比較時，7U95P(_484)的活性在Jurkat細胞中約高2. 5倍，在Molt_3細胞中約高4倍，在SupT細胞中約高20倍， 而在SAS-413細胞中約為1/8。而且當與HHV-6IE啟動子(9U和U95)比較時，U95P (-484) 在SupTl中的活性略高於U95，但是約為9U活性的1/2，U95P(_484)在其他細胞中的活性較低(圖9)。在使用三批PBMC的實驗中，7U95P(_494)的活性僅約為其他啟動子活性的1/2 1/4(圖 10)。3)R2區對啟動子活性的影響將7MIEP和7U95P的各個缺失突變體導入4種細胞系的實驗結果已經說明，刪除R2是否會降低啟動子活性取決於細胞的類型。特別地，在Jurkat細胞中，刪除R2區對 7MIEP的活性沒有影響，但是在其他細胞系中，刪除R2區會使7MIEP的活性降低約1/5 1/2。而且在SAS-413細胞中，刪除R2對7U95P的活性沒有影響，但是在其他細胞系中，刪除R2區會使7U95P的活性降低約1/7 1/2 (圖11)。(總結)將本實施例總結如下1)7MIEP (-493)和7U95P(_494)在T細胞系中通常具有高於CMV啟動子的活性，但是在骨髓細胞系SAS-413細胞中的活性較低。在PBMC中，7MIEP0(-493)的活性與CMV啟動子基本上相同，而7U95P(-494)的活性低於CMV啟動子。2)與HHV-6IE啟動子相比，HHV-6的兩種IE啟動子(9U和U95)在所有類型細胞中的活性高於 7MIEP (-493)和 7U95 (-494)。3)已經證明，在大量細胞中，R2區對7MIEP和7U95P起增強子的作用。與R2區結合的轉錄因子還未被確定，但是鑑於HHV-6的R3區結合NF-κ B，其起到U95啟動子的增強子的作用等事實，以重複方式存在於R2區中的NF- κ B結合基序極有可能導致R2區具有增強子活性(圖8)。(實施例3特定缺失系統的構建)用IE啟動子和RNAi法，破壞血細胞系細胞中的基因表達。由於IE啟動子能夠在血細胞系細胞中大量表達，這對於分析來說是十分有利的。1)細胞的準備(在為巨噬細胞的情形下)獲取健康人的外周血，並用菲可/泛影葡胺，通過密度梯度離心來進行分離和純化。在添加了 M-CSF (研發系統，100U/ml)的AIM V血清培養基(Life Technologies)中培養PBMC。每3天換液1次，第6天或第7天的巨噬細胞用於實驗。2)製備SiRNA表達逆轉錄病毒載體為了表達髮夾型RNA，製備包含「有義鏈靶序列」、「環序列」、「反義鏈靶序列」和「終止子序列」的合成寡-DNA。這種有義鏈靶序列、環序列、反義鏈靶序列和終止子序列用本領域熟知的方法來製備。本領域技術人員能夠容易地理解，當真正使用這些序列時，能夠根據實際情形採用適當的序列。將上述DNA插入到質粒載體中，其中寡-DNA連接到IE序列、gag、pol和env的下遊，gag、pol和erw是逆轉錄病毒複製所必需的，還包括能夠利用限制性酶序列的NecZ基因等。將所製備的質粒載體(10μ 1)添加到100μ 1感受態細胞中，進行轉染，鋪到LBAmp平板上後，在37°C下培養16小時。在37°C下，通過轉化獲得的克隆在LBApm液體培養基中培養16小時，用常規方法從培養液中提取和純化質粒。將表達gag、p0l和env的逆轉表病毒包裝細胞鋪到直徑IOcm圓盤上，添加轉染試劑來轉染質粒(1(^力。對 48小時後，將細胞限制性稀釋到含有6418的培養基(500 μ g/ ml)中並傳代。每3 4天，對G418培養基進行換液，總共培養約2周。收集克隆，當在6孔平板上生長到匯合水平時，將培養基換成無G418的培養基，M小時後收集上清液。將細胞存儲。對包含在上清液中的逆轉錄病毒載體進行限制性稀釋，感染OTH/3T3細胞，計數生長的克隆來計算感染的效價。3)使用逆轉錄病毒載體的基因導入實驗用逆轉錄病毒載體來感染血細胞系細胞，例如1)中製備的巨噬細胞。洗滌後立即進行鋪板，在平板上形成0. 5 2. 5xl04細胞/cm2。感染後M小時，將培養基換成含有G418 的培養基，每3 4天換液一次。約2周後，獲得導入基因的細胞。用該細胞來驗證期望被敲除的基因的表達水平。實施這些實驗，實際上證明了在導入基因後，用本發明的啟動子能夠破壞外源基因在淋巴細胞中的特異性表達。(實施例4特異性表達)替代實施例3的RNAi，導入期望被表達的編碼基因的核酸分子(例如，細胞因子例如 TGF β )通過實施與實施例3相似的實驗，結果證明，在導入基因後，本發明的啟動子實際上誘導外源基因以淋巴細胞特異性方式地表達。如上所述，通過優選的具體實施方式
對本發明進行闡述。然而，應當理解，本發明的保護範圍僅由附隨的權利要求書來解釋。還應當理解，本文引用的專利、專利申請和文獻應當結合進來作為參考，如同其在本文中完全列出。對於本領域技術人員來說，在不背離本發明的保護範圍和精神的情況下，各種其他改進是顯然的，也是容易實施的。因此，附隨的權利要求書的保護範圍不限於說明書的描述，權利要求書應被寬泛地解釋。[工業實用性]本發明提供在免疫反應細胞例如T淋巴細胞中選擇性地誘導蛋白質表達到啟動子。本發明的啟動子在用於有效阻止或處理免疫疾病如獲得性免疫缺陷症候群等的方法和藥物中是有用的。本發明在用於有效實施基因治療的方法中也是有用的。
權利要求
1.HHV6B的MIE啟動子。
2.按照權利要求1的啟動子，其至少包含SEQID NO :1中所示的序列中的8個毗鄰的核苷酸。
3.按照權利要求1的啟動子，其至少包含SEQID NO :1中所示的序列中的R3區或其功能性變體。
4.按照權利要求1的啟動子，其至少包含距離SEQID NO :1的轉錄起始點-574到-427 的序歹丨J (SEQ ID NO :13)。
5.按照權利要求1的啟動子，其至少包含距離SEQID NO 1的轉錄起始點-1051 到-427 的序歹Ij (SEQ ID NO 14)。
6.按照權利要求1的啟動子，其包含NF-KB的基序和AP-I的基序。
7.按照權利要求1的啟動子，其包含SEQID NO 1中所示的序列。
8.按照權利要求1的啟動子，其中所述啟動子包含(a)具有SEQID NO :1中所示的鹼基序列或者與之對應的鹼基序列或其序列片段的多核苷酸；(b) SEQ ID NO :1中所示的鹼基序列或者與之對應的鹼基序列的等位基因變體或其序列片段的多核苷酸；(c)與(a)或(b) 中的任何一種的多核苷酸雜交並且具有其一種生物活性的多核苷酸；或者(d)由(a)-(c) 中的任何一種的鹼基序列或者具有至少70%同一性的互補序列組成並且具有其一種生物活性的多核苷酸。
9.按照權利要求1的啟動子，其長度至少為10個毗鄰的核苷酸。
10.按照權利要求8的啟動子，其中所述的生物活性是啟動子活性。
11.一種包含按照權利要求1的啟動子的核酸構建體。
12.按照權利要求11的核酸構建體，其包含編碼外源基因的序列，其最初與該啟動子不相關但是現在被可操作地連接到啟動子序列上。
13.按照權利要求12的核酸構建體，其中所述的外源基因編碼RNAi分子、藥物、將被刪除的隱性基因或者選擇性標記。
14.按照權利要求13的核酸構建體，其中選擇性標記允許在培養基中選擇其中導入了所述核酸構建體的宿主。
15.按照權利要求13的核酸構建體，其中選擇性標記允許從視覺上選擇導入所述核酸構建體的宿主。
16.按照權利要求13的核酸構建體，其中選擇性標記包含次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(hprt)或者一種選自由綠色螢光蛋白(GFP)、蘭綠色螢光蛋白(CFP)、黃色螢光蛋白 (YFP)和紅色螢光蛋白(dsRed)組成的組的螢光標記。
17.按照權利要求13的核酸構建體，其中選擇性標記對其中導入了核酸構建體的宿主基本上不具有毒性。
18.按照權利要求13的核酸構建體，其中將被刪除的隱性基因選自由ADA基因、PNP基因、Y c鏈基因、TAP基因、MHC II基因、X-連接的WASP、⑶40配體、PII樣基因和DNA解旋酶組成的組。
19.按照權利要求13的核酸構建體，其中所述藥物選自由細胞因子、趨化因子、生長因子、蛋白激素和肽激素組成的組。
20.按照權利要求12的核酸構建體，其中所述啟動子在血細胞系細胞，特別是T細胞中誘導外源基因的特異性表達。
21.一種包含按照權利要求11的核酸構建體的表達載體。
22.一種包含按照權利要求11的核酸構建體的細胞。
23.按照權利要求22的細胞，其中所述細胞對於所述啟動子序列來說是異源的。
24.一種包含按照權利要求11的核酸構建體的組織。
25.一種包含按照權利要求11的核酸構建體的器官。
26.一種包含按照權利要求11的核酸構建體的生物體。
27.一種藥物組合物，其包含按照權利要求1的啟動子和編碼一種抗原的序列。
28.按照權利要求27的藥物組合物，其是DNA疫苗。
29.一種用於治療期望進行淋巴細胞特異性治療的疾病、異常或症狀的藥物組合物，其包含按照權利要求1的啟動子以及用於所述治療的核酸序列。
30.按照權利要求四的藥物組合物，其中用於所述治療的核酸序列包含選自由編碼細胞因子、趨化因子、生長因子、蛋白激素、肽激素、核酶和RNAi。
31.用於以淋巴細胞特異性方式表達一種蛋白質的方法，包括步驟A)製備一種核酸構建體，其中按照權利要求1的啟動子被可操作地連接到編碼蛋白質的核酸序列上；和B)將該核酸構建體放置在其中所述啟動子誘導編碼蛋白質的核酸序列表達的條件下。
32.用於以淋巴細胞特異性方式表達一種蛋白質的試劑盒，包含A)一種核酸構建體，其中按照權利要求1的啟動子被可操作地連接到編碼蛋白質的核酸序列上；和B)用於將該核酸構建體放置在其中所述啟動子誘導編碼蛋白質的核酸序列表達的條件下的工具。
33.用於以淋巴細胞特異性方式地表達一種蛋白質的試劑盒，包含A)按照權利要求1的啟動子；和B)用於製備其中所述啟動子被連接到編碼蛋白質的核酸序列上的核酸構建體的工具。
34.用於治療或預防一種需要以淋巴細胞特異性方式表達一種蛋白的疾病、異常或症狀的方法，包括步驟A)製備其中按照權利要求1的啟動子被連接到編碼蛋白質的核酸序列上的核酸構建體；和B)將該核酸構建體放置在其中所述啟動子誘導編碼蛋白質的核酸序列表達的條件下。
35.用於治療或預防一種需要以淋巴細胞特異性方式表達一種蛋白的疾病、異常或症狀的試劑盒，包含A)其中按照權利要求1的啟動子被連接到編碼蛋白質的核酸序列上的核酸構建體；和B)用於將該核酸構建體放置在其中所述啟動子誘導編碼蛋白質的核酸序列表達的條件下的工具。
36.用於治療或預防一種需要以淋巴細胞特異性方式表達一種蛋白的疾病、異常或症狀的試劑盒，包含A)按照權利要求1的啟動子；和B)用於製備其中所述啟動子被連接到編碼蛋白質的核酸序列上的核酸構建體的工具。
37.一種製備蛋白質的方法，包括步驟A)製備其中按照權利要求1的啟動子被連接到編碼蛋白質的核酸序列上的核酸構建體；和B)將該核酸構建體放置在其中所述啟動子誘導編碼蛋白質的核酸序列表達的條件下。
38.用於製備蛋白質的試劑盒，包含A)其中按照權利要求1的啟動子被連接到編碼蛋白質的核酸序列上的核酸構建體；和B)用於將該核酸構建體放置在其中所述啟動子誘導編碼蛋白質的核酸序列表達的條件下的工具。
39.用於製備蛋白質的試劑盒，包含A)按照權利要求1的啟動子；和B)用於製備其中所述啟動子被連接到編碼蛋白質的核酸序列上的核酸構建體的工具。
40.按照權利要求1的啟動子的用途，用於製造一種用於治療或預防一種需要以淋巴細胞特異性方式表達一種蛋白的疾病、異常或症狀的藥物組合物。
全文摘要
本發明提供一種啟動子，其在免疫系統細胞和/或血細胞，如淋巴細胞中選擇性地有效誘導基因表達。在本發明中，通過發現在免疫系統細胞和/或血細胞，如T淋巴細胞中，HHV6MIE啟動子、HHV7MIE啟動子和HHV7U95啟動子出乎意外地誘導特性的基因表達，從而實現發明目的。利用這些啟動子，能夠實現選擇性地遞送DNA疫苗等。
文檔編號C12N15/113GK102174515SQ201010624540
公開日2011年9月7日 申請日期2006年9月5日 優先權日2005年9月8日
發明者五味康行, 山西弘一, 森康子, 武本真清, 福家功, 高橋理明 申請人:財團法人阪大微生物病研究會