一種與唇顎裂易感性診斷相關的SNP標誌物及其應用的製作方法
2023-05-05 18:07:56
本發明屬於生物醫學領域，涉及一種與唇顎裂易感性診斷相關的snp標誌物及其在製備唇顎裂易感性診斷試劑盒中的用途。
背景技術：
唇顎裂是人類最常見的先天發育畸形之一，大約佔新出生兒的1:700～4:1000。唇顎裂患兒終生深受疾病困擾、進食苦難、發音障礙等等。儘管有多學科聯合治療的措施，但仍給家庭和社會帶來沉重的負擔。2016年，最新的調查顯示平均每個患兒的經濟影響可達5510～50634美元。我國每500～600個新生兒就有一個唇顎裂患者，位居新生兒常見病第三位。唇顎裂的發病機制尚未完全闡明，但病因學研究已經表明，以往的研究證實唇顎裂是遺傳和環境因素等因素共同致病的複雜過程。儘管研究已表明環境因素如：吸菸、x線等對於唇顎裂的重要性，然而接觸相同的環境危險因素卻只有極少數個體發生唇顎裂，說明個體遺傳特徵決定了對唇顎裂的易感性。因此，對唇顎裂易感因素進行研究，以尋找唇顎裂高風險基因或位點，對於實現唇顎裂早期診斷和預防具有重要的臨床意義。
基因多態性是指在一個生物群體中，同時和經常存在兩種或多種不連續的變異型或基因型(genotype)或等位基因(allele)，亦稱遺傳多態性(geneticpolymorphism)或基因多態性。在已識別的遺傳變異中，單核苷酸多態性(singlenucleotidepolymorphisms，snps)是最為常見的變異類型，主要是指由於單個核苷酸的變異所引起的基因組dna序列的變化。snp一般只涉及到單個鹼基的變異，這種變異可由單個鹼基的轉換(transition)、顛換(transversion)或缺失等所引起，佔所有已知多態性的90％以上。snp在人類基因組中廣泛存在，估計其總數超過300萬個。
不同個體對環境危險因素的反應不同，唇顎裂的易感性也不同，這種易感性被認為與個體自身的遺傳因素密切相關，其中大部分也是由snps引起。因此，探尋snps與唇顎裂的關聯來進一步尋找其易感標誌物，具有潛在的生物意義和臨床意義。
技術實現要素：
本發明提供了rs2262251位點g等位基因與唇顎裂的相關性，並據此開發了其在唇顎裂易感性的診斷試劑盒中的應用。
本發明的目的之一是提出一種與唇顎裂易感性輔助診斷相關的snp標誌物。
本發明的目的之二是提供檢測上述snp標誌物的特異性引物對。
本發明的目的之三是提供上述snp標誌物在製備唇顎裂易感性診斷試劑盒中的應用。
本發明的目的之四是提供上述特異性引物對在製備檢測rs2262251位點基因型試劑盒或唇顎裂易感性診斷試劑盒中的應用。
本發明的目的之五是提供唇顎裂易感性輔助診斷試劑盒。
發明人通過提供一組與唇顎裂易感性高度相關的snp位點，並研製出可便於臨床應用的唇顎裂易感性輔助診斷試劑盒，為唇顎裂易感性的篩查和診斷提供數據支持。
本發明的目的是通過下列技術方案實現的：
一方面本發明提供了一種與唇顎裂易感性輔助診斷相關的snp標誌物rs2262251，存在g/c多態性，當其基因型為gg時，判斷個體為唇顎裂易感性個體。
另一方面，本發明提供了用於檢測snp位點基因型的試劑，所述試劑可以是採用本領域已知的任何技術檢測snp的試劑，只要其能夠檢測樣本中rs2262251位點基因型即可。
本發明提供了一種檢測rs2262251位點的方法，所述檢測方法步驟如下：
(1)提取基因組dna；
(2)使用taqman檢測法檢測rs2262251位點基因型。使用用於擴增snp位點在內的核苷酸序列的引物。
本發明還提供檢測所述snp標誌物的特異性引物對：正向引物序列如seqidno.1所示；反向引物序列如seqidno.2所示。
本發明還提供檢測所述snp標誌物的探針：探針fam序列如seqidno.3所示，探針vic序列如seqidno.4所示。在本發明的一個具體實施方案中，檢測snp位點基因型的試劑包括使用tanman檢測snp位點基因型所需的試劑，包括：使用taqman檢測snp位點基因型所需的試劑包括用於擴增snp位點在內的核苷酸序列的引物，如下所示：探針fam為5』-tacagggccccgcc-3』(如seqidno.3所示)，探針vic為5』-ttacaggggcccgc-3』(如seqidno.4所示)，正向引物為5』-tgatctctgctcctgcaacct-3』(如seqidno.1所示)，反向引物為5』-gaaaccccatctctactgaaaataaca-3』(如seqidno.2所示)。
本發明還提供了所述snp標誌物對在製備唇顎裂易感性輔助診斷試劑盒中的應用。
本發明還提供了所述snp標誌物的特異性引物對在製備檢測rs2262251位點基因型試劑盒或唇顎裂易感性輔助診斷試劑盒中的應用。
本發明還提供了所述snp標誌物的探針在製備檢測rs2262251位點基因型試劑盒或唇顎裂易感性輔助診斷試劑盒中的應用。
本發明還提供了檢測rs2262251位點基因型的試劑在製備檢測snp位點基因型的試劑盒中的用途，所述試劑盒可以包括採用本領域已知的任何技術檢測snp的試劑，只要其能夠檢測樣本中rs2262251位點基因型即可。在本發明的一個具體的實施方案中，用於檢測rs2262251位點基因型的試劑盒包括用於擴增snp位點在內的核苷酸序列的引物。引物序列探針fam為5』-tacagggccccgcc-3』，探針vic為5』-ttacaggggcccgc-3』，正向引物為5』-tgatctctgctcctgcaacct-3』，反向引物為5』-gaaaccccatctctactgaaaataaca-3』。
本發明還提供了用於檢測rs2262251位點基因型的試劑在製備用於診斷唇顎裂易感性的試劑盒中應用，所述試劑盒可以為採用本領域已知的任何技術檢測snp的試劑，只要其能夠檢測樣本中rs2262251位點基因型即可。在本發明的一個具體實施方案中，用於檢測rs2262251位點基因型的試劑盒包括用於擴增snp位點在內的核苷酸序列的引物。引物探針fam為5』-tacagggccccgcc-3』，探針vic為5』-ttacaggggcccgc-3』，正向引物為5』-tgatctctgctcctgcaacct-3』，反向引物為5』-gaaaccccatctctactgaaaataaca-3』。
又一方面，本發明提供了一種唇顎裂易感性輔助診斷試劑盒，該試劑盒用於檢測外周血dna中的rs2262251。
本發明所述的用於診斷唇顎裂易感性的試劑盒，該試劑盒可以包括採用本領域已知的任何技術檢測snp的試劑，只要其能夠檢測樣本中rs2262251位點基因型即可。
優選地，所述的診斷試劑盒，該試劑盒還含有上述snp標誌物的特異性擴增引物。
優選地，所述的診斷試劑盒，該試劑盒還含有上述snp標誌物的探針。在本發明的一個具體實施方案中，用於診斷唇顎裂易感性的試劑盒包括用於snp位點在內的核苷酸序列的引物，如下所示：探針fam為5』-tacagggccccgcc-3』，探針vic為5』-ttacaggggcccgc-3』，正向引物為5』-tgatctctgctcctgcaacct-3』，反向引物為5』-gaaaccccatctctactgaaaataaca-3』。
優選地，本發明用於檢測rs2262251位點基因型的試劑盒或用於診斷唇顎裂易感性的試劑盒還可以包括dna提取常用試劑，如苯酚、氯仿、異戊醇或乙醇等。
本發明提供的snp標誌物作為唇顎裂易感性輔助診斷的標誌物的優越性在於：
(1)snp是一種新型基因生物標誌物，區別於傳統生物標誌物，穩定、微創、易於檢測，將大大提高疾病診斷的敏感性和特異性；
(2)snp試劑盒是一種系統、全面的診斷試劑盒，可用於唇顎裂易感性的輔助診斷，有助於反映患者的疾病狀態，為臨床醫生快速準確掌握患者病情、及時採取更具個性化的防治方案提供支持；
(3)通過snp生物標誌物和診斷試劑盒的研製和應用，可使得唇顎裂易感性的診斷更加方便易行，為臨床醫生快速準確掌握患者病情，為臨床治療效果評價奠定基礎，並為發現具有潛在治療價值的新型小分子藥物靶標提供幫助。
附圖說明
圖1表示taqman基因分型樣本處理步驟示意圖；
圖2表示taqman基因分型結果示意圖。
具體實施方式
以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。在不背離本發明精神和本質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬於本發明的範圍。
本發明人群驗證採用tanqman基因分型平臺。
taqman等位基因分型技術是美國abi公司研發的snp分型技術，是目前較為公認的基因分型的標準之一。主要原理在pcr反應時加入一對兩端有不同螢光標記的特異探針來識別不同的等位基因，探針序列的5』端為報告螢光基團(reporter),3』端為淬滅螢光基團(quencher)。在pcr過程中，兩個探針能與模版等位基因序列特異的退火互補結合。此時探針序列完整，報告螢光基團被淬滅螢光基團抑制而無信號發出。當子鏈複製到探針與模版結合處時淬滅作用從而發出螢光。兩個探針的5』端標有不同的螢光(fam，vic或hex)，3』端標有mgb淬滅基團結合體。根據檢測到的不同螢光，可以判斷相應的樣本的snp等位基因型。
實施例1rs2262251與唇顎裂易感性相關性研究
1.研究對象
發明人於2001年開始至2012年從南京醫科大學附屬醫院收集了大量的中國漢族唇顎裂患者及正常人群的血標本，通過對樣品資料的整理，發明人從中選擇了符合下列樣本進行taqman分型實驗樣品：
(1)診斷明確的無家族史散髮型唇顎裂患者1398例；
(2)無唇顎裂家族史的健康對照1424例；
並系統採集了這些樣本的人口學資料和臨床資料等情況。
2.實驗步驟
2.1血標本的收集及基因組dna的提取
全部研究對象均採用真空edta抗凝採血管採集外周靜脈血3ml，3000rpm/min離心6min，分離血漿、白細胞層和紅細胞，將血漿分離之後，混合剩餘血液，分別裝於1.5ml凍存管，置-80℃冷凍儲存備用，詳細步驟見圖1所示。
採用酚-氯仿法和qiagen試劑盒提取基因組dna，採用紫外分光光度法(260/280比值)確定dna純度，od260測定dna濃度，統一標化後-20℃貯存備用，採用酚-氯仿法提取基因組dna具體步驟如下：
(1)將細胞懸液移入5ml離心管，加入溶血試劑，振蕩混勻後4000rpm/min離心10min，棄上清，重複此過程一次；
(2)沉澱中加入1ml抽提液，混勻後加入8μl蛋白酶k，37℃水浴過夜；
(3)取出後稍冷卻，加入1mltris-飽和酚，上下顛倒混勻15min，4000rpm/min離心10min；
(4)小心吸取上清，加入3mph5.0的醋酸鈉60μl，再加入與上清液等體積的異戊醇，輕搖後可見白色絮狀沉澱物，10000rpm/min離心2min；
(5)沉澱中加入75％乙醇約1ml，8000rpm/min離心2min，棄上清；
(6)沉澱中加入無水乙醇約1ml，8000rpm/min離心2min，棄上清後乾燥；
(7)乾燥產物加入te緩衝液100μl溶解；
(8)測定所提dna濃度；
(9)放入-80℃保存。
qiagen試劑盒提取基因組dna具體步驟如下：
(1)在裝有400μl血的1.5mlep管中加40μlqiagenprotease，渦旋混勻使其充分反應，簡要離心；
(2)加400μlbufferal至血樣中，上下震蕩，渦旋至顏色出現黃綠色；
(3)置於56℃烘箱15-20min後取出，簡要離心；
(4)加400μl無水乙醇至血樣中，渦旋15s，混勻後簡要離心；
(5)將試劑盒中配有的離心柱擺好，混合液小心移至離心柱中，不要浸漬邊緣，蓋緊蓋子，離心，8000r/min，2min；
(6)將柱移至一個新的2ml收集管；
(7)打開柱，加入500μlbufferaw1，蓋緊蓋子，離心，8000r/min，2min，移至新的2ml收集管；(如有必要，重複此步驟)
(8)加入500μlbufferaw2，蓋緊蓋子，離心，13000-14000r/min，5min；
(9)移至新的2ml收集管，離心，13000-14000r/min，2min；
(10)柱放入1.5mlep管，打開柱，加入100μlbufferae，室溫孵化15min；
(11)測定所提dna濃度。
(12)放入-80℃保存。
2.2taqman基因分型
2.2.1探針與引物
探針及引物由南京驥驁生物公司合成。探針fam：5』-tacagggccccgcc-3』,探針vic：5』-ttacaggggcccgc-3』；引物序列為f：5』-tgatctctgctcctgcaacct-3』，r：5』-gaaaccccatctctactgaaaataaca-3』。
2.2.2實時定量pcr擴增
使用abi7900ht型螢光定量pcr儀進行基因分型。每個384孔反應平板中5μl反應體系，含有mastermix2.0μl,正反向引物各0.25μl，taqman探針各0.125μl，dna樣本0.3-0.5μl，去離子水1.25μl。採用高度透光度蓋膜覆蓋384板，短暫離心去泡，放入abi7900ht螢光定量pcr儀上進行分型檢測。反應程序為：
50℃，2min儀器啟動預熱；95℃，10min使dna聚合酶活化；95℃，15sec使dna變性，60℃，1min使引物和探針退火及延伸，共40個循環。
擴增循環結束後，讀取擴增後螢光信號，運用sds2.0軟體進行基因型判讀，分型結果如圖2(其中：gg野生型，·gc雜合型，◆cc突變型)和表1所示。
3.結果
表1關聯性研究
aor,比值比；ci.可信區間。
根據檢測結果，病例組中三種基因型cc、gc、gg分布頻率為9.51％、44.35％和46.14％，與對照組的基因型分布存在統計學差異。隱性模型發現，gg基因型與gc/cc基因型相比，能顯著增加唇顎裂易感性的患病風險(or＝0.82，95％ci＝0.70-0.96)。相加模型顯示，g等位基因與唇顎裂的發病風險相關(or＝0.83，95％ci＝0.74-0.93)。從而證實位點rs2262251突變能夠顯著增加中國漢族人群唇顎裂的患病風險，該位點的檢測可用於對個體罹患唇顎裂風險的預測。
上述實施例的說明只是用於理解本發明的方法及其核心思想。應當指出，對於本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以對本發明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也將落入本發明權利要求的保護範圍內。
序列表
南京醫科大學附屬口腔醫院
一種與唇顎裂易感性診斷相關的snp標誌物及其應用
2017
4
1
21
dna
人工合成序列
1
tgatctctgctcctgcaacct21
2
27
dna
人工合成序列
2
gaaaccccatctctactgaaaataaca27
3
14
dna
人工合成序列
3
tacagggccccgcc14
4
14
dna
人工合成序列
4
ttacaggggcccgc14