一種檢測有機磷農藥的化學發光方法

2023-05-05 14:07:51

專利名稱：一種檢測有機磷農藥的化學發光方法
技術領域：
本發明屬於農藥殘留分析領域和化學發光分析技術領域，具體涉及一種檢測有機
磷農藥的化學發光方法。
背景技術：
有機磷農藥是含有C-P鍵，或C-O-P，或C-S-P，或C-N-P鍵的有機化合物。1938 年德國發現有機磷有強大的殺蟲效果後，開始廣泛應用於農業。我國從1956年開始研製 生產有機磷農藥，現已能生產出40多個品種以供應國內市場，已成為世界農藥生產大國之 一。自1983年我國開始禁用了六六六和滴滴涕等有機氯農藥後，有機磷農藥成為我國使用 量最大的農藥。目前，我國農藥市場上的農藥品種主要有有機磷農藥、氨基甲酸酯類農藥、 擬除蟲菊酯類農藥和生物農藥。由於價格和使用習慣等各種因素，有機磷農藥仍是主要的 農藥品種。 由於有機磷農藥的廣泛應用，導致食品發生了不同程度的農藥殘留汙染。 有機磷農藥對人的毒性屬於神經毒，可經過皮膚、呼吸道和腸胃道吸收中毒，特別
是脂溶性有機磷農藥溶液經皮膚吸收更快。主要作用是抑制體內的膽鹼酯酶，使在神經連
接點為實現神經傳遞而產生的乙醯膽鹼不能水解為乙醯膽鹼，從而造成因乙醯膽鹼在體內
大量堆積而引起乙醯膽鹼中毒。引起人體神經功能的紊亂，導致副交感、交感及神經系統的
抑制及副交感節後神經的興奮。此外，有機磷農藥在生物體內往往會氧化成比原來毒性大
的化合物。例如甲拌磷、乙拌磷等農藥代謝為甲碸和乙碸，毒性比原體物更大。 目前為止，國內外用於檢測有機磷農藥殘留的方法主要有氣相色譜法、液相色譜
法、免疫分析法、酶抑制法、生物傳感器法等。 1、氣相色譜法因其高選擇性、高效能、高靈敏度、速度快、應用廣、樣品用量少、能 同時分離分析多組分混合物、易於自動化等特點，在有機磷農藥殘留量分析中的應用最為 廣泛，方法成熟；但是對於沸點高或熱穩定性差的農藥不能直接進行分離檢測，需進行衍生 化處理。這樣就不可避免地增加了樣品前處理的難度，不利於農藥檢測的靈活應用和快速 掌握；同時GC在農藥殘留分析中的通用性也比較差。 2、高效液相色譜法雖有高分離效能、高靈敏度等優點。但與氣相色譜法一樣其設 備都比較大型、昂貴，成本較高。加之流動相多數是用有毒的溶劑，如乙腈、甲醇等，對實驗 室人員和環境也造成了一定的危害。而且高效液相色譜所需分析時間長，需要對樣品進行 前處理，樣品的前處理過程往往比較複雜，不利於快速檢測。 3、利用免疫分析法檢測有機磷農藥的前提和關鍵是製備好特異性的抗體，有機磷 農藥屬於小分子物質，必須與大分子物質(如蛋白質)聯結，才能用作免疫原。而免疫原的 製作複雜，不易得到，因此免疫分析法在測定有機磷農藥應用上具有一定的局限性。
4、利用生物傳感器測定有機磷農藥雖然簡便、快速、靈敏，但是以乙醯膽鹼酯酶對
同一類的有機磷農藥具有同樣的抑制作用，因此這類傳感器選擇性不高。並且酶很不穩定， 存在失活現象，有機磷農藥對酶的抑制是不可逆的，酶電極不能重複使用，成本極高。酶抑制法靈敏度低， 一般只適用於定性和半定量檢測。 現有技術方法由於檢測靈敏度低和分析操作複雜性、儀器昂貴等不利因素受到很 大的限制，所以急需尋找一種能檢測有機磷農藥的快速、簡便、靈敏度高、可靠、低成本的方法。 化學發光(Chemiluminescence，簡稱CL)，即化學發光物質經催化劑的催化或氧 化劑的氧化後，形成一個激發態的中間體，當這種激發態中間體回到穩定的基態時，同時發 射出光子，可以利用發光測量儀測量光量子產額。由於具有靈敏、簡便、快速、低成本等優 點，近年來，化學發光分析法在農藥殘留分析上的研究應用備受關注。化學發光法檢測有機 磷農藥是以發光物質魯米諾(Luminol)、光澤精(Lucigenin)等與有機磷農藥進行一些特 殊的化學反應，反應的中間體或反應產物吸收了反應所釋放出的化學能而躍到激發態，當 重新回到基態時，放出光子，光子通過光電倍增管和放大器後，轉變為電流，並被放大，在一 定條件下，電流大小與有機磷農藥的濃度成正比。 中國發明專利公開號1664567A的專利申請中公開了一種化學發光有機磷農藥殘 留分析儀及其檢測方法。該檢測方法用過硫酸鉀在二氧化鈦納米粒子和紫外光催化下將蔬 菜或水果上有機磷農藥殘留分解為磷酸鹽，磷酸鹽與鉬酸鹽和釩酸鹽形成磷鉬釩雜多酸， 氧化魯米諾溶液，產生化學發光，根據化學發光強度進行定量，測得蔬菜或水果上有機磷農 藥殘留的總量。但該專利存在以下缺陷專利宣稱的可用於對蔬菜或水果上有機磷農藥殘 留總量的測定，但有機磷農藥的種類繁多，該專利只是提供對敵百蟲、敵敵畏、氧樂果的化 學發光檢測，並不能確定是否一定可以檢測其他化學結構結構不同的有機磷農藥，因此不 能以偏概全的認為可以檢測殘留總量。

發明內容
本發明的目的在於克服現有技術存在的缺點和不足，提供一種檢測有機磷農藥的 化學發光方法。 本發明的目的是這樣實現的 首次採用NaCl作為體系的增敏劑，選取含有.〉f—。R基團的有機磷農藥為研究對 象，提供一種對結構相似的有機磷農藥通用的化學發光檢測方法。 首先通過大量實驗，對辛硫磷、毒死蜱、殺螟硫磷在不同的化學發光體系中的發光 信號進行篩選，以選擇最佳的化學發光體系；在確定最佳反應體系魯米諾_過氧化氫體系 後，基於辛硫磷、毒死蜱、殺螟硫磷在體系中的增敏信號較微弱，為了增加反應的靈敏度，實
驗中考察五種無機鹽離子(KBr、 NaBr、 NaCl、 KI、 KC1)和六種表面活性劑[三種非離子型 表面活性劑吐溫-80、聚乙二醇-400、 Triton X-IOO， 一種陽離子型表面活性劑溴代十六烷 基三甲基胺(CTMAB)，兩種陰離子表面活性劑十二烷基苯磺酸鈉(SDBS)、十二烷基硫酸鈉 (SDS)]對體系的增敏強弱，最終確定NaCl為最佳的增敏劑；通過單因素和正交實驗比較 了 luminol濃度、HA濃度、NaCl濃度和pH對辛硫磷、毒死蜱、殺螟硫磷化學發光強度的影 響，在優化工藝下測定線性範圍，做幹擾實驗驗證方法的選擇性，同時對樣品進行分析並做 回收率實驗。此外從體系的動力學曲線、螢光光譜分析、紫外光譜分析及化學發光反應的 實驗事實四個方面對化學發光機理進行初步探索，並提出辛硫磷、毒死蜱、殺螟硫磷與魯米諾_過氧化氫反應的可能機理。同時，提出農藥的化學結構與化學發光之間的關係。
具體地說，本發明包括下列步驟
①化學發光體系的選擇考察了有機磷農藥在三種化學發光體系KMn04體系、魯米諾_KMn04體系和魯米諾_H202體系中的化學發光行為，確定最佳的化學發光體系為魯米諾_H202體系；
②增敏劑的選擇考察在增敏劑KBr、 NaBr、 NaCl 、 KI 、 KC1 、吐溫-80、聚乙二醇-400、 Triton X-100、CTMAB、 SDBS和SDS存在下，有機磷農藥在魯米諾_H202體系中化學發光信號的強度，確定NaCl為最佳的增敏劑；
③單因素實驗和正交實驗 通過單因素和正交實驗比較確定體系的最佳反應條件 魯米諾濃度為1 X 10—5mol/L 1 X 10—3mol/L， H202濃度為0. 05mol/L 0. 5mol/L， NaCl濃度為0. 5mol/L 5mol/L， pH為ll 13.5; 幹擾實驗 在步驟③所確定的條件下對實際樣品中可能存在的離子或化合物進行幹擾實驗； ⑤標準曲線的繪製 在步驟③所確定的條件下繪製標準曲線，以有機磷農藥的濃度為橫坐標，以有機磷農藥在體系中的化學發光強度為縱坐標繪製曲線，化學發光強度與農藥在濃度1X10—8g/mL IX 10—6g/mL範圍內呈現良好的線性關係；
⑥樣品分析 等量稱取樣品兩份於250mL的燒杯中，其中一份加蒸餾水浸泡1小時並洗滌，取洗滌液作為樣品a ;將配置的一定濃度的有機磷農藥噴灑到另一份樣品上，放置2小時後用蒸餾水洗滌，取洗滌液作為樣品b，測定樣品a和樣品b ;
⑦化學發光機理的探討 採用RF-5301PC型螢光分光光度計和UV-1700紫外可見分光光度計分別測定體系的螢光光譜和紫外光譜，加之體系的動力學曲線和反應的實驗事實四個方面對化學發光機理進行初步探索，提出有機磷農藥與魯米諾_H202反應的可能機理；
⑧農藥的結構與化學發光之間的關係 對辛硫磷、毒死蜱、殺螟硫磷、倍硫磷、敵敵畏、磷胺、對硫磷、久效磷、三唑磷、甲基對硫磷、馬拉硫磷等有機磷農藥的化學發光反應的研究，探討含有
>|—。R 〉i-SK基團的有機磷農藥的結構與化學發光之間的關係。 本發明具有下列優點和積極效果 1、操作簡單、快速，線性範圍寬，成本低； 2、首次提出了以無機鹽NaCl作為體系的增敏劑，增加了體系的靈敏度。 3、適用於對具有相似結構的有機磷農藥殘留的檢測。


圖1是魯米諾濃度與有機磷農藥化學發光強度A I之間的關係圖； 圖2是H202濃度與有機磷農藥化學發光強度A I之間的關係圖； 圖3是NaCl濃度與有機磷農藥化學發光強度A I之間的關係圖； 圖4是pH與有機磷農藥化學發光強度A I之間的關係圖； 圖5是辛硫磷標準色譜圖； 圖6是樣品小白菜空白色譜圖； 圖7是樣品小白菜回收率色譜圖。
具體實施例方式
下面結合附圖和實施例詳細說明 一、實驗試劑
在下面的實施例中如果沒有特別說明，試驗所用的試劑均來自下面註明的信息和
廠商

制

廠















魯米諾 辛硫磷標準f
高錳酸鉀 過氧化氫 氯化鈉
分析純 實驗試
分析純 分析純 分析純
溴化鈉 分析純
碘化鉀 分析純
氯化鉀 分析純
溴化鉀 分析純
硫酸鈷 分析純
硫酸鉀 分析純
硫酸銅 分析純
硝酸鉀 分析純
磷酸三鈉 分析純
十二烷基苯磺酸鈉 化學純
吐溫-80 分析純
十六烷基三甲基溴化銨 分析純
聚乙二醇-400 分析純
十二烷基硫酸鈉 分析純
Triton X-100 分析純 二、實驗過程
為了驗證本發明，採用本方法與氣相色譜法對
sigma公司
劑農業部環境保護科研監測所研
武漢市江北化學試劑廠 天津市博迪化工有限公司 焦作鑫安科技股份有限公司試劑
天津市光復精細化工研究所
國藥集團化學試劑有限公司
國藥集團化學試劑有限公司
廣州化學試劑廠
湖南湘中化學試劑採供站
上海科昌精細化學品公司
上海綠源精細化工廠
上海科昌精細化學品公司
天津市博迪化工有限公司
上海化學試劑分裝廠
Amresco公司
武漢亞法生物技術有限公司
廣東西隴化工廠
廣東順德化學生物研究所
sigma公司
蔬菜中有機磷農藥殘留的含量進行了對比檢測。 1、化學發光反應條件的確定 如圖1、2、3、4，初步實驗表明辛硫磷在鹼性魯米諾_H202體系中能產生微弱的 化學發光信號。為提高反應的靈敏度，考察了三種非離子型表面活性劑Triton X-IOO、 Tween-80、 PEG-400,—種陽離子型表面活性劑CTMAB，兩種陰離子表面活性劑SDBS、 SDS和 無機鹽KBr、NaBr、NaCl、KI、KC1等對反應發光強度的增強效果。通過研究發現，考察的11種 增敏劑中，當NaCl作為增敏劑時，背景信號最小，發光強度最大，綜合考慮，最終選擇NaCl 作為體系的增敏劑。通過單因素和正交實驗比較魯米諾濃度(1 X 10—6mol/L 1 X 10—3mol/ L) 、!1202濃度(0. 05mol/L 0. 5mol/L) 、NaCl濃度(0. 5mol/L 5mol/L)和pH(pH11 13. 5) 對辛硫磷化學發光強度的影響，實驗最終確定反應的最佳條件為魯米諾濃度5X 10—4mol/ L、 NaCl濃度4mol/L、 H202濃度0. 3mol/L、 pH13。
2、幹擾實驗 按照本發明檢測方法，實驗了樣品中可能有的共存物對實驗的影響。在優化條件 下，對於濃度為5X10—7g/mL的辛硫磷標準溶液，在相對誤差不超過水平為5%的情況，可 允許下列共存物的存在1000倍的C1—、 K+不幹擾測定；500倍的Na+不幹擾測定；100倍的 5042—、N03—不幹擾測定；10倍的A13+、C032—、P043—不幹擾測定；5倍的Pb2+不幹擾測定；0. 1倍 的Mg2+不幹擾測定；0. 001倍的Cu2+、 Co2+不幹擾測定。
3、標準曲線的繪製 在選定的最佳條件下，辛硫磷在1 X 10—8g/mL 1 X 10—6g/mL的濃度範圍內與發 光強度呈線性關係，其回歸方程為y = 1214. 3x+95232，相關係數R為0.9959。對濃度為 5X 10—7g/mL的辛硫磷連續進行11次平行測定的相對標準偏差為4. 2% 。根據IUPAC建議， 計算得該方法檢出限為5. 4X 10—9g/mL。
4、樣品的製備及分析 (1)稱取10. 0g的小白菜樣品於250mL的燒杯中，用lOOmL蒸餾水洗滌並浸泡1小 時，取洗滌液作為樣品a;將洗滌後的lOg小白菜晾乾，噴灑一定量已知濃度的辛硫磷，放置 2小時後用lOOmL蒸餾水洗滌，取洗滌液作為樣品b ;取適量樣品a和樣品b定容，按實驗方 法做化學發光測定，即做樣品實驗和回收率實驗。 (2)取剩餘的樣品a和樣品b各25mL，分別置於150mL分液漏鬥中，加入等體積的
二氯甲烷萃取，棄去水層，將二氯甲烷層經活性炭脫色和無水硫酸鈉乾燥後，旋轉蒸發濃縮
近幹，以二氯甲烷定容至2mL，按下述色譜條件做GC分析(對照實驗)。 由圖5、6、7可知，辛硫磷標準品的保留時間為6. 152min，氣相色譜法測定小白菜
空白樣品中不含農藥辛硫磷，而回收率樣品辛硫磷組分的保留時間與辛硫磷標準品的保留
時間吻合。 兩種方法的測定結果見表1。
表1小白菜中辛硫磷含量測定結果分析方法 化學發光法 氣相色譜法
辛硫磷含量(l^g/g)未檢出未檢出
加入量Og/g)0. 01 0.11.00. 01 0. 11.0
測出量(Pg/g)0.0106 0.1010. 860. 0085 0. 0890. 93
回收率(％)106 皿8685 8993
相對標準偏差RSD，4. 2 2. 23. 05. 6 4. 86.8
n=7(%) 表1反映出兩種方法所測樣品和回收率實驗結果基本一致。 由此驗證了化學發光新方法的可信性。 附氣相色譜條件 Agilent 6890N氣相色譜儀附火焰光度(FPD)檢測器； DB-1701彈性石英毛細柱(30mX0. 53mmXl. Oil m); 柱溫(程序升溫)200。C (5min)_￡QZmin_+ 250°C (10 min); 進樣口溫度220。C; 檢測室溫度25(TC ; N2 :5mL/min ; H2 :75mL/min ; 空氣100mL/min ; 無分流進樣，進樣量為1 y L，峰面積外標法定量。
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權利要求
一種檢測有機磷農藥的化學發光方法，其特徵在於包括下列步驟①化學發光體系的選擇確定最佳的化學發光體系為魯米諾-H2O2體系；②增敏劑的選擇確定NaCl為最佳的增敏劑；③單因素實驗和正交實驗通過單因素和正交實驗比較確定體系的最佳反應條件魯米諾濃度為1×10-5mol/L～1×10-3mol/L，H2O2濃度為0.05mol/L～0.5mol/L，NaCl濃度為0.5mol/L～5mol/L，pH為11～13.5；④幹擾實驗在步驟③所確定的條件下對實際樣品中可能存在的離子或化合物進行幹擾實驗；⑤標準曲線的繪製以有機磷農藥的濃度為橫坐標，以有機磷農藥在體系中的化學發光強度為縱坐標繪製曲線，化學發光強度與農藥在濃度1×10-8g/mL～1×10-6g/mL範圍內呈現良好的線性關係；⑥樣品分析等量稱取樣品兩份於250mL的燒杯中，其中一份加蒸餾水浸泡1小時並洗滌，取洗滌液作為樣品a；將配置的一定濃度的有機磷農藥噴灑到另一份樣品上，放置2小時後用蒸餾水洗滌，取洗滌液作為樣品b，測定樣品a和樣品b；⑦化學發光機理的探討採用RF-5301PC型螢光分光光度計和UV-1700紫外可見分光光度計分別測定體系的螢光光譜和紫外光譜，加之體系的動力學曲線和反應的實驗事實四個方面對化學發光機理進行初步探索，提出有機磷農藥與魯米諾-H2O2反應的可能機理；⑧農藥的結構與化學發光之間的關係對辛硫磷、毒死蜱、殺螟硫磷、倍硫磷、敵敵畏、磷胺、對硫磷、久效磷、三唑磷、甲基對硫磷、馬拉硫磷等有機磷農藥的化學發光反應的研究，探討含有基團的有機磷農藥的結構與化學發光之間的關係。F2009100626442C0000021.tif
全文摘要
本發明公開了一種檢測有機磷農藥的化學發光方法，屬於農藥殘留分析領域和化學發光分析技術領域。本發明包括下列步驟①化學發光體系的選擇；②增敏劑的選擇；③單因素實驗和正交實驗；④幹擾實驗；⑤標準曲線的繪製；⑥樣品分析；⑦化學發光機理的探討；⑧農藥的結構與化學發光之間的關係。本發明操作簡單、快速，線性範圍寬，成本低；首次提出了以無機鹽NaCl作為體系的增敏劑，增加了體系的靈敏度；適用於對具有相似結構的有機磷農藥殘留的檢測。
文檔編號C07F9/18GK101706431SQ20091006264
公開日2010年5月12日 申請日期2009年6月9日 優先權日2009年6月9日
發明者任紅敏, 劉曉宇, 李愛芳, 胡浩宇, 邱朝坤, 陳翊平 申請人:華中農業大學