互花米草種群的snp標記的分型方法
2023-05-05 23:23:31 1
專利名稱：互花米草種群的snp標記的分型方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及一種基於SNP標記的互花米草分子標記篩選技術。
背景技術：
互花米草(Spartina alterniflora)是一種原產北美大西洋沿岸的多年生草本植物。因其促淤造陸和消浪護堤作用顯著而被許多國家引種。1979年，南京大學從美國東南部的北卡羅萊納、喬治亞和佛羅裡達引種了 3種不同生態型互花米草至福建羅源灣，隨後擴大分布至我國海岸潮間帶遼寧丹東以南的廣大區域，並取得了一定的生態和經濟效益。但作為外來物種，其強大的繁殖能力和高大密集的種群特徵，對我國沿海灘涂地區的生態系統、生物多樣性和水產養殖產生了較大的負面影響，2003年被環保總局列入我國第一批16種外來入侵物種名單。如今中國已成為全球遭受外來物種入侵危害最嚴重的國家之一，已發現外來入侵物種488種，其中50餘種位列世界自然保護聯盟公布的全球100種最具威脅外來物種，每年造成的直接經濟損失達1200億元，治理投入更是難以估算。近年來入侵我國的外來生物更是呈現出傳入數量增多、傳入頻率加快、蔓延範圍擴大、發生危害加劇、經濟損失加重等趨勢。因此，生物入侵問題越來越受到世人的關注，包括其成因、危害及控制技術等諸多方面。但目前，大部分的研究主要集中在競爭性排斥、生態位替代、生物學特性、化感、捕食、寄生等生態過程，缺乏對其種群溯源、快速適應與進化模式、快速入侵與擴張動力等入侵機制方面的理解。SNP標記是美國學者Lander E於1996年提出的第三代DNA遺傳標記。SNP是指同一位點的不同等位基因之間僅有個別核苷酸的差異或只有小的插入、缺失等。從分子水平上對單個核苷酸的差異進行檢測，SNP標記可幫助區分兩個個體遺傳物質的差異。組成DNA的鹼基雖然有4種，但SNP —般只有兩種鹼基組成，所以它是一種二態的標記，即二等位基因(biallelic)。由於SNP的二態性，非此即彼，在基因組篩選中SNPs往往只需+/_的分析，而不用分析片段的長度，這就利於發展自動化技術篩選或檢測SNPs。從分子水平上對單個核苷酸的差異進行檢測，SNP標記可幫助區分個體間遺傳物質的差異。隨著SNP標記技術的成熟及其在分子生態學中的廣泛應用，外來物種種群溯源、入侵機理日益成為國際上研究的重點。大量的研究表明外來入侵種能在如此短的時間內迅速地做出適應性的進化，可 能與其自身的遺傳結構密切相關。因而，在外來入侵物種上，亟需一種能夠有效揭示外來入侵物種遺傳本質的方法。本發明以互花米草為對象，在整個基因組內批量尋找多態性位點，全面評估互花米草的多樣性，建立一種基於SNP標記的互花米草種群溯源方法，為進一步研究和控制互花米草等相關物種提供有力的技術支持。
發明內容
本發明的目的是提供一種基於SNP標記的互花米草種群溯源方法，能夠在基因組序列信息較少的情況下，獲得大量的核苷酸多態性標記，發現引入的不同互花米草種群之間存在的遺傳變異，為揭示其遺傳本質和入侵機制，進一步研究和控制互花米草提供有力的技術支持。本發明的目的是通過以下技術方案實現的:一種鑑定外來入侵物種互花米草種群的DNA分子標記方法，步驟如下:1)種群調查及取樣；2) DNA 提取；3)測序；4)篩選目標基因R71;5)根據目標基因R71設計引物，正向引物如序列表中SEQ ID NO:1所示；反向引物如序列表中SEQ IDNO:2所示；6) PCR 擴增；7)測序；8)序列拼接、比對，鑑定記錄單核苷酸多態性位點。進一步地，所述目標基因R71是通過高通量轉錄組測序後篩選得到。進一步地，所述PCR擴增的反應條件為:94°C預變性3min，94°C 30s、54°C 30s、72°C 1.5min,39 個循環，72°C延伸 IOmin0進一步地，所述目標基因R71在互花米草種群中有8個SNP位點，目標基因R71基因片段如序列表中SEQ ID勵:3所示，其中8個5冊位點分別位於73、117、135、179、224、230、254、616。進一步地，高通量轉錄組測序的方法:提取樣本總RNA，用Oligo(dT)的磁珠富集分離mRNA,合成雙鏈cDNA,構建轉錄組測序文庫,插入片段長度約為500bp,在illuminaHiSeq2000測序儀上進行高通量測序，使用Trinity軟體對測序片段進行拼接，從而得到基因序列。本發明的有益效果:包括互花米草在內的許多物種為非模式植物，基因組龐大，很多物種缺少全基因組數據，在進行傳統的各種傳統分子標記分析時，如RAPD、SSR、AFLP,發現實驗結果的一致性較差，假陽性率偏高。而且，傳統分子標記一次實驗只能找到少量多態性位點信息，如果需要高精度的解析度，需要多次實驗。本發明在一次實驗中，即可得到8個SNP位點，提供豐富的多態性信息。同時，本發明的實驗條件簡單，成功率高，可重複性好。在實施過程中，實驗成功率在98%以上，實驗結果可重複性更達到100%。本發明採用的8個SNP位點，單倍體基因型理論上可以達到2的8次方，即256，能夠提供非常豐富的多態性信息，使結果更加準確。SNP標記遺傳穩定、操作簡便，適合用物種溯源。
具體實施方式
:下面結合具體樣本對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。1.種群調查及取樣選擇上海崇明島和天津塘沽海河沿岸為採樣點，選取生長良好、無蟲害的葉片，採下後立刻放入事先準備好的裝有約半袋矽膠的自封袋裡，混勻使葉片與矽膠充分混合，以便快速脫水。帶回實驗室後根據實際情況更換已經變色的矽膠，乾燥之後待提取DNA用。每一採樣點隨機取樣30株左右，個體間的間距不小於50米，以儘可能避免重複採集同一克隆，記錄每一樣本的編號、生境、地理參數(經緯度)、樣品高度，樣品直徑等詳細信息。2.DNA 提取使用BioFlux公司的Biospin植物基因組DNA提取試劑盒進行DNA提取，具體步驟稍作調整:(I)稱取0.07-0.1g幹葉，用剪刀剪碎；用液氮冷凍研缽、研棒，將材料倒入盛有液氮的研缽中，用力磨成粉末，在研磨過程中注意不要讓材料反覆凍融。(2)將研磨好的粉末用勺小心地轉移至預先加入450uL LP Buffer的2.0ml離心管中，混合均勻。(3)65°C金屬浴中溫浴30-60分鐘(溫浴過程中間隔振蕩2_3次)，然後移出。(4)加入150uL DA Buffer，混合均勻後於冰浴中放置5分鐘。(5)於13，OOOrpm離心10分鐘，再將上清液轉移至Shredder spin column中,13, OOOrpm離心I分鐘。(6)將濾液轉移到一個新的1.5ml離心管中。(7)加入濾液體積1.5倍的P Binding Buffer,輕柔的混合均勻，管中出現絮狀沉澱，13, OOOrpm離心10分鐘。(8)將上清液轉移至Spin column。於7，500rpm離心一分鐘,並棄去接液管中液 體。(9)向 Spin column 中加入 500uL 的 G Binding Buffer。12, OOOrpm 離心 30 秒，
並棄去接液管中液體。(10)向 Spin column 中加入 600uL 的 Wash Buffer。12, OOOrpm 離心 30 秒，並棄去接液管中液體。(11)重複步驟10，一次。(12)再次將 Spin column 於 12，OOOrpm 離心 I 分鐘，並將 Spin column 轉移至一個新的1.5ml離心管。(13)向Spin column中加入IOOuL至200uL65°C溫浴的去離子水，並於室溫溫浴2-3分鐘。(14)於12, OOOrpm離心I分鐘，並棄去Spin column。DNA存在於1.5ml離心管液體中，-20°C保存備用。3.高通量轉錄組測序包括互花米草在內的許多外來入侵物種為非模式植物，基因組龐大，很多物種缺少全基因組數據，在進行AFLP分子標記與錨定PCR實驗的過程中，發現實驗結果的一致性較差，假陽性率偏高。因此，我們選擇使用高通量轉錄組測序技術，高通量轉錄組測序不需要了解物種基因信息，能夠對任意物種進行轉錄組分析，並能測定每個轉錄本的片段序列，精確到單核苷酸的解析度；能夠同時鑑定和定量稀有轉錄本和正常轉錄本，以及檢測基因家族中相似基因和可變剪接造成的不同轉錄本的表達。高通量測序的步驟是:提取樣本總RNA,用Oligo (dT)的磁珠富集分離mRNA，合成雙鏈cDNA，構建轉錄組測序文庫，插入片段長度約為500bp，在illuminaHiSeq2000測序儀上進行高通量測序，使用Trinity軟體對測序片段進行拼接，從而得到基因序列。4.篩選目標基因對得到的轉錄組數據進行行篩選，去除多拷貝及重複基因，找到易於擴增的片段R71。R71基因片段序列如SEQ ID NO:3所示。5.根據目標基因設計引物，引物的序列為:正向引物如SEQ ID NO:1 所不:catccgttca cactacagtc ac反向引物如SEQ ID NO:2 所不:gtgttgtacc acctaactcc ac6.PCR 擴增設計50ul PCR 擴增體系，具體的組成為:34uldH20,5ul 10 X Buffer (Mg2+) ,4uldNTP Mixture (2.5mM)、0.5ul Trans T-Taq(5U/μ I)2.5ul Template DNA (20_40ng/μ L)2ul正向引物(10yM)、2ul反向引物(10 μ Μ)。PCR 反應條件為:94°C 3min 預變性，94°C 30s、54°C 30s,72°C 1.5min39 個循環，72°C延伸 lOmin。7.測序PCR擴增產物經1%瓊脂糖電泳檢測，確定為目的條帶且無雜帶幹擾。使用上海捷倍思基因技術有限公司的PCR clea-upKit直接清潔PCR產物，PCR產物濃度達到測序要求後，R71片段使用引物R71 正向測序，得到長約750bp的序列。8.序列拼接、比對和分析所得的序列用Sequencher軟體進行拼接並根據峰圖進行手工校正，然後利用Mega軟體進行比對排列，經比對，兩端切齊後長度725bp。R71片段測序質量高，峰型清晰，無雜峰。可以通過測序峰形清晰鑑定SNP。9.對上海崇明島和天津塘沽海河沿岸的互花米草種群進行鑑定記錄SNP位點。SNP位點標記互花米草DNA溯源。表I上海崇明島和天津塘沽海河沿岸的互花米草種群SNP位點
權利要求
1.一種互花米草種群的SNP標記的分型方法，其特徵在於， 步驟如下: 1)種群調查及取樣； 2)DNA提取； 3)測序； 4)篩選種群的目標基因R71； 5)根據目標基因R71設計引物，正向引物如序列表中SEQID NO:1所示；反向引物如序列表中SEQ IDNO:2所示； 6)PCR擴增； 7)測序； 8)序列拼接、比對，鑑定記錄單核苷酸多態性位點。
2.根據權利要求1所述的鑑定外來入侵物種互花米草種群的DNA分子標記方法，其特徵在於，所述目標基因R71是通過高通量轉錄組測序後篩選得到。
3.根據權利要求1所述的鑑定外來入侵物種互花米草種群的DNA分子標記方法，其特徵在於，所述PCR擴增的反應條件為:941:預變性31^11，941: 30s、54°C 30s,72°C 1.5min，39個循環，72°C延伸IOmin。
4.根據權利要求1所述的鑑定外來入侵物種互花米草種群的DNA分子標記方法，其特徵在於，所述目標基因R71在互花米草種群中有8個SNP位點，目標基因R71基因片段如序列表中 SEQ ID NO:3 所示，其中 8 個 SNP 位點分別位於 73、117、135、179、224、230、254、616。
5.根據權利要求2所述的鑑定外來入侵物種互花米草種群的DNA分子標記方法，其特徵在於，高通量轉錄組測序的方法:提取樣本總RNA,用Oligo (dT)的磁珠富集分離mRNA,合成雙鏈cDNA，構建轉錄組測序文庫，插入片段長度約為500bp，在illumina HiSeq2000測序儀上進行高通量測序，使用Trinity軟體對測序片段進行拼接，從而得到基因序列。
全文摘要
本發明涉及一種互花米草種群的SNP標記的分型方法，本方法根據高通量轉錄組測序篩選得到目標基因，通過PCR反應、PCR產物測序得到多個SNP位點。再由所有有效的SNP位點組成單倍體型用於分子標記以達到遺傳分型。本發明在一次實驗中，即可得到豐富的多態性信息。SNP標記遺傳穩定、操作簡便，適合用物種溯源。
文檔編號C12Q1/68GK103146817SQ201310046929
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月5日 優先權日2013年2月5日
發明者陳建群, 丁靜, 王強, 許穎, 吳娟子 申請人:南京大學