LactobacillusplantarumZJ316、產生的抗菌肽及其製備與應用的製作方法

2023-05-25 00:11:36

專利名稱：：LactobacillusplantarumZJ316、產生的抗菌肽及其製備與應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一才朱新的植物乳桿菌菌才朱--丄actok)fcz7/wp/a"tonw7ZJ316，以及由其發酵產生的抗菌肽——植物乳桿菌素ZJ316(p/朋tonW"ZJ316)及其製備與應用。(二)
背景技術：
：1928年AlexanderFleming的青黴素的發現4免救了成千上萬人的生命。但近年抗生素抗性問題日益嚴重，給人們的生命健康帶來新的危險。研究和開發新的抗生素變得非常緊迫。研究人員正努力尋找合適的抗菌肽來代替抗生素。乳酸菌是目前FDA認定的安全的食品級的微生物(GRAS)，乳酸菌抗菌肽將作為天然安全的食品保存劑和醫藥製品來研究和開發。乳酸菌抗菌肽以其獨特的抗菌作用和潛在的應用價值一直受到國內外研究人員的青睞。到目前為止，已在8個不同屬的乳酸菌中發現了多種抗菌肽。一些分離純化乳酸菌抗菌肽包括nisin(Rayman"a/.，1981)、lactococcin(Dufourda/"1991)、lacticin481(PiardeM/，1992)、lactococcinA和G(Holoaa/,1991;Nissen-Meyer""/，1992)、acidocinLF221A和B(Majhenica/,2004)、plantaricinTF711(Hernandeza/,2005)、plantaricinA(Zhaoa/,2006)、lacticinQ(Fujita"a/，2007)等的生化遺傳特性及作用機制相繼揭示。我國乳酸菌資源非常豐富，但對乳酸菌抗菌肽的研究起步較晚，相應的基礎研究知識還有待積累。當前，十分必要加快抗菌肽的研究工作，為開發新型天然安全的抗菌肽打下基礎。nisin是目前唯一廣泛使用的乳酸菌抗菌肽，但現在發現反芻動物的腸道菌能降解nisin而對nisin高度容忍。Russell研究小組從鏈球菌(5Vre;tococcwsZov〖sstrainHC5)分離到#元菌肽bovicinHC5,7十nisin#元性菌有4艮強的抗性(MantovaniWa/,2002)。最近的研究發現一些新分離的分子量更小的lantibiotics類乳酸菌抗菌肽對抗生素有抗性的微生物如MRSA(methicillin-resistantiSto//7^7ococcwsawrews)和萬古黴素抗性菌VRE(vancomycin-resistant五"feracoccws)有抑制作用，顯示了其在食品防腐和生物抗炎方面的應用潛力(Galvinda/.,1999)。lantibiotics類抗菌肽被認為是最具潛力的乳酸菌抗菌肽之一。成熟lantibiotics分子中包含了多個由羊毛硫氨酸(Lan)或P-甲基羊毛硫氨酸(MeLan)殘基形成的硫醚鍵型的分子內環，該結構的完整性對抗菌肽的抗菌活性至關重要(Klaenhammere,"/.,1993;NesWa/"1996)。對新發現的乳酸菌抗菌肽結構和作用機制的研究，將成為該類研究的重點。研究表明，細菌細胞壁的先導物lipidII是plantaricinC(—類lantibiotics)的活性耙點，這已在體外的細胞壁生物合成實驗中證明(Wiedemannda/.，2006)。plantaricinC牢固地束縛lipidII從而幹擾其合成細胞壁。最近，Hasper在Science報告了lantibiotic家族殺死革蘭氏陽性菌的一個新的機制從細胞隔膜移去lipidII而阻斷細胞壁的合成(Hasper"a/.，2006)。這些研究結果的耳又得，為應用開發新的候選抗生素打下紮實的基礎。
發明內容本發明目的是提供一種可發酵生產抗菌肽的新菌株——Zacto6ac/〃wp/朋tarawZJ316,以及由其發酵產生的抗菌肽——"植物乳桿菌素ZJ316(;/a"tonWwZJ316)及其製備與應用。本發明採用的技術方案是丄acto^c/〃wp/""ton/mZJ316，保藏於中國典型培養物保藏中心，地址中國武漢武漢大學，保藏編號CCTCCNo:M208077,保藏曰期2008年5月23日。菌種來源所述的丄a"o&c/〃w//朋tanwzZJ316，來源於嬰兒糞1"更，分離出丄acto6ac/〃wp/awton/wZJ316的方法是用無菌4聶子夾取少許嬰兒糞便(由浙江大學兒童醫院提供)培養在MRS液體培養基中，在37°C恆溫培養箱中增菌培養24小時。再取增菌液一滴於MRS固體培養基的平皿中，塗布均勻，在37。C厭氧培養箱中培養48小時。取樣品進行平板分區劃線，在37。C厭氧培養箱中培養24小時，挑取單菌落。丄acto6a"'〃uyp/"wtorwwZJ316的生長4爭'l"生丄ac/o6ac/〃ws//awtan/wZJ316為厭氧菌，菌落乳白色、表面光滑，最適生長溫度是37。C，生長速度較快，48小時以後長出全緣、圓形、凸起、乳白色的菌落；在液體培養基內，該細菌在液體中底部生長，形成擴散的、乳白色的濁狀菌體。能在MRS培養基和APT培養生長。丄actoZ)ac〃/wsp/朋toramZJ316的形態革蘭氏陽性，菌體細長形，單個或短鏈狀排列。在MRS液體培養基中，細菌革蘭染色呈短杆狀。如圖1所示。丄acto6ac/〃wsp/朋ton/wZJ316的生化特性採用微量鑑定管及相應的化學方法來進行生化特性鑑定。乳酸菌L.p/朋torwmZJ316經過澱4分水解、油脂水解、明膠水解和尿素試驗後，反應均為陰性。該乳酸菌在代謝過程中不能夠分泌產生澱粉酶、脂肪酶、明膠酶和尿素酶來降解大分子物質，如澱粉、脂肪和明膠等。乳酸菌丄.；/a"torawZJ316在經過吲哚試驗、M.R試驗、V.P試驗和硫化氫試驗之後，反應也均呈陰性，而糖發酵試驗則大多數呈陽性。見表l,此結果基本符合乳桿菌的理化特性。丄actokc/〃wsp/朋torwmZJ316的16SrRNA特性用細菌的16SrRNA的序列可比4交4青確地鑑定細菌的屬和種。將丄Wo6ac/〃ws//a"torwwZJ316的16SrRNA的PCR產物的序列與基因庫NCBI中的16SrRNA序列比對，發現與丄actokc/〃usp/朋tonwzWCFS1有99%的同源性，但不冗全相同,丄acto6ac/〃ws//awtorwmWCFS1不產菌肽。丄acto6ac/〃wp/awtonw7ZJ316的功能該植物乳桿菌能產抗菌物質，經生化特性如溫度的穩定性、對pH的耐受性以及對酶的敏感性。該抗菌物質為一類耐高溫的抗菌肽，命名為p/a"tor/c/"ZJ316。本發明還涉及由所述丄"ctoZ^c/〃wsp/a"torwwZJ316發酵產生的抗菌肽——植物乳桿菌素ZJ316(p/a"ton'c/"ZJ316)，分子量為2366Da,N端序列為SLPQN。實驗結果發現該抗菌肽具有以下特點(l)具有良好的熱穩定性，即使在121。C下處理30min仍具有較好的抑菌活性；(2)只有在酸性條件(pH<4)下，才具有抑菌活性；(3)對胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K以及溶菌酶均敏感，但對過氧化氫酶敏感性較弱。採用雙層瓊脂牛津杯法對抗菌肽p/a"ton'c/"ZJ316進行抑菌語測定。結果顯示該抗菌肽對26個指示菌中的18個菌抹有抑制作用，見表2，該抗菌肽對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、銅綠假單胞菌、單增李斯特氏菌等具有強抑制作用。其中大腸桿菌、沙門氏菌、銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌均屬革蘭氏陰性菌。大部分乳酸菌源的抗菌肽只對革蘭氏陽性菌有抑菌作用，只有少數抗菌肽對部分革蘭氏陰性菌有抑制作用。本發明發現的該植物乳桿菌素不僅對革蘭氏陽性菌有抑制作用，而且對很多革蘭氏陰性菌也有抑制作用，具有廣譜的抗菌性。p/a"ton'c/wZJ316與目前報導的乳酸菌產生的抗菌肽相比，具有明顯的差異，該抗菌肽具有抑菌譜廣和熱穩定性高(在12rC下處理30min仍具有4艮好的抑菌活性)等特性。抗菌肽；/a"ton'c^ZJ316的分子量及N端序列測定。採用質譜MALDI-TOF-MS精確測定該抗菌肽分子量為2366Da,為一小分子量的肽，而nisin的分子量3510Da;經N端序列分析，結果顯示該細菌素N端含有以下5個胺基酸——S(絲氨酸)、L(亮氨酸)、P(脯氨酸)、Q(穀氨醯胺)、N(天冬氨酸)。隨後N端成環封閉，由於成環封閉，測序較為困難，一時難以測出全部的胺基酸序列，只能才艮據分子量(2366Da)推測該抗菌肽含大約22個胺基酸殘基，這表明該抗菌肽為翻譯後修飾肽，很有可能是一類新的lantibiotics。而成熟lantibiotics分子中包含羊毛硫氨酸(Lan)和P-曱基羊毛硫氨酸(MeLan)殘基。與蛋白質資料庫的序列比對，該抗菌肽尚未^皮鑑定發布，p/^ton'"'wZJ316為一新發現的小分子量乳酸菌抗菌肽。本發明還涉及所述的抗菌肽的製備方法，所述方法包括丄acto^c/〃wp/""torwwZJ316接種至適用於乳桿菌的培養基中，3538。C下發酵培養18~24h，得到發酵液離心，取上清，分離純化得到所述的抗菌肽ZJ316。所述適用於乳桿菌的培養基可選用本領域常見用於乳桿菌培養的培養基，本發明中優選為MRS培養基，所述乳桿菌可先用MRS固體培養基劃線培養得到單菌落，再用MRS液體培養基進行發酵培養。每lOOOmLMRS液體培養基可按如下組成配製蛋白腖10g，牛肉膏10g,酵母提取物6g,磷酸氫二鉀2g,檸檬酸三胺2g，乙酸鈉5g,葡萄糖20g，七水碗酸鎂0.2g,四水硫酸錳0.05g,吐溫lmL,pH6.26.4，去離子水補足至1000mL。MRS固體培養基為MRS液體培養基添加瓊脂得到，瓊脂添加量為每1升MRS液體培養基添加15-20g瓊脂。所述分離純化方法可按本領域常規純化蛋白質的方法進行，本發明中抗菌肽分離純化方法如下硫酸銨梯度沉澱(硫酸銨由飽和度45%升至60%),收集沉澱，水溶，超濾濃縮，釆用SephacrylS-100HR填料柱在Purifier100蛋白質純化系統上進行凝膠過濾，收集有抑菌活性的組分，得到所述抗菌肽。p/a"toWc/"ZJ316為一新發現的高效的乳酸菌抗菌肽，由於分子量小，很難橫跨脂雙分子層而形成小孔的複合體而有別於nisin的作用模式，但其同樣具有高效的殺菌能力，可以用做新型抗菌肽作用模式的研究。所述抗菌肽可用於製備祠料添加劑，抗菌肽不僅具有與抗生素飼料添加劑相似的有益作用，而且無毒、無副作用、無殘留、無抗藥性，同時也不汙染環境。抗菌肽在飼料中的應用主要有兩個方面的作用(l)防止飼料本身被沙門氏菌等致病菌汙染；(2)作為飼料添加劑，防止致病菌對動物腸道的危害。丄acto&c/〃w//朋torwwZJ316是動物腸道中的益生菌，其產生的抗菌肽可以對宿主動物胃腸道進行生態調節。所述抗菌肽還可用於製備食品防腐劑，經長期的研究發現一些合成防腐劑有誘癌性、致畸性和易引起食物中毒等問題。目前在食品保藏中，使用的主要還是添加化學防腐劑。Nisin是目前在食品行業得到應用天然防腐劑。//awtan'c^ZJ316是一類小分子的熱穩定多肽，適合用作為廣譜、高效、穩定、安全的天然食品防腐劑的開發。所述抗菌肽還可應用於製備抗生素的替代藥物，近年來廣譜抗生素的過量服用和隨之而來的抗生素耐藥性的發現，逐漸引起了人們的擔憂，許多腐敗菌逐漸產生了對抗生素的抵抗性，由此對將來如何控制這些菌有很大的顧慮。由於抗菌肽是一類蛋白類物質，可以被蛋白酶所降解，因此具有較高的安全性。目前乳酸菌抗菌肽是被普遍認為抗生素最有效的替代物。因此p/朋ton'c/"ZJ316可作為抗生素的替代藥物來預防、治療疾病。本發明的有益效果主要體現在提供了一種從嬰兒糞便中分離到的植4勿孝L才幹菌--丄acto6"c/〃wsp/awtorwwZJ316，能產#元菌肽(p/a"toWc/"ZJ316)，p/awton'c/"ZJ316為一新發現的高效的小分子量乳酸菌抗菌肽，該抗菌肽具有廣譜的抑菌作用，由於分子量小，很難橫跨脂雙分子層而形成小孔的複合體而有別於nisin的作用模式，但其同樣具有高效的殺菌能力，是一個具有很高的應用開發潛力的lantibiotic類抗菌肽，可應用於製備飼料添加劑、食品防腐劑、抗生素的替代藥物等等。圖1為分離提取到的丄acto6""7/us//a"torwmZJ316經過擴增後用革蘭氏染液染色結果圖2為pH值對抗菌肽plantaricinZJ316抑菌活性的影響；圖3為溫度對該抗菌肽plantaricinZJ316抑菌活性的影響；圖4為不同酶對抗菌肽plantaricinZJ316抑菌活性的影響；S:原上清液；Cl:過氧化氫酶處理；C2:蛋白酶K處理；C3:胰蛋白酶處理；C4:溶菌酶處理；C5:胃蛋白酶處理。圖5為超濾濃縮液經蛋白質純化儀分離純化plantaricinZJ316(流動相水)；圖6為蛋白純化物各組分的抑菌活性試驗；圖7為蛋白純化物活性組分的HPLC分析；圖8為抗菌肽plantaricinZJ316質i普圖；圖9為N端胺基酸序列分析。具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護範圍並不僅限於此實施例1:丄acto6ac/〃ws//awtoramZJ316的分離用無菌鑷子夾取少許嬰兒糞便(由浙江大學兒童醫院提供)培養在MRS液體培養基(按如下配方配製蛋白腖10g,牛肉膏10g，酵母提取物6g,磷酸氫二鉀2g,檸檬酸三胺2g,乙酸鈉5g，葡萄糖20g，七水硫酸鎂0.2g,四水硫酸錳0.05g,吐溫lmL，pH6.3,去離子水補足至1000mL)中，在37。C恆溫培養箱中增菌培養24小時。再:f又增菌液一滴於MRS固體培養基(取前述1000mLMRS液體培養基加入18g瓊脂)的平皿中，塗布均勻，在37。C厭氧培養箱中培養48小時。取^樣品進行平板分區劃線，在37。C厭氧培養箱中培養24小時，挑取單菌落。丄acto6ac〃/wsp/a"torwwZJ316的鑑定(l)用革蘭氏染色將經過擴增後細菌丄actokc/〃wsp/(3wton/mZJ316用革蘭氏染液染色，呈革蘭氏陽性(染色結果見圖1)。(2)微量鑑定管及相應的化學方法來進行生化特性鑑定，結果見表1，結果表明丄actok^'〃wp/朋toramZJ316具有乳桿菌的理化特性，但與所知的乳桿菌屬中的菌種均有不同，這說明丄acto6aa7/wp/a"torwwZJ316為一種新的菌種。表1:經典微生物生化糹全驗分析;/""torwwZJ316結果(-表示陰性；+表示陽性)tableseeoriginaldocumentpage11(3)丄acto6ac/〃wsp/a"ton/附ZJ316的16SrRNA測序取實施例1中丄actoZ)"c/〃ws//a"torwwZJ316,^是取DNA，用PCR法鬥全測其中的16SrRNA。引物序列如下，(正向引物5'-ATCATGATTTACATTTGAGTG-3'反向引物5'隱CGACGACCATGAACCACCTGT-3')。PCR條件95。C下變性4min，95。C下變性30s，51。C退火30s,72。C延伸1min，循環35次，72。C延伸10min,最後4。Coo(35次循環結束後保持溫度在4。C)。然後用瓊脂糖凝膠電泳分析950bp左右的16SrRNA的PCR產物，並對此PCR產物進行測序。測得丄acto6ac/〃wsp/a"tonw2ZJ316的16SrRNA的部分核普酸序列如下丄"c/oZ)"c/〃w;/朋torwwZJ316的16SrRNA片斷，與乳桿菌屬中的一些細菌有高度同源性，^f旦不完全相同，也說明丄"ctoZn3c/〃w//""torwwZJ316為一種新的菌種。實施例2:丄acto6ac/〃ws//awtonw7ZJ316發酵製備4元菌肽plantaricinZJ316MRS液體培養基配製蛋白腖10g,牛肉膏10g，酵母提取物6g，磷酸氫二鉀2g,檸檬酸三胺2g,乙酸鈉5g，葡萄糖20g,七水碌u酸4美0.2g,四7JC硫酸錳0.05g,吐溫1mL,前述混合物溶於960mL去離子水中，用1mol/LNaOH調節pH至6.4,加去離子水至總體積1L，高壓下蒸汽滅菌20min。MRS固體培養基配製取1升前述配製的MRS液體培養基，加熱攪拌下加15g瓊脂粉，冷凝得MRS固體培養基。培養條件乂人-20。C取出保存的丄actokzc/〃wsp/awtora附ZJ316菌才朱，於MRS固體培養基上劃線接種，37。C厭氧培養24h。挑單菌落接種於MRS液體培養基中，37。C培養18h，發酵產物離心，取上清用於後續抗菌肽的分離及鑑定。實施例3:丄(3cto6ac/〃ws//awton/mZJ316中抗菌肽plantaricinZJ316的分離及功能鑑定1、對pH的耐受性用1mol/L的HC1和1mol/L的NaOH調節發酵上清液pH為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0,做牛津杯實驗，以藤黃微球菌為指示菌，以lmol/L的HCl做對照，觀察抑菌圈大小的變化。經試驗，對照lmol/L的HCl對指示菌並沒有抑制作用。由此證明，具有抑菌作用的是該;f直物乳桿菌素plantaricionZJ316，且在酸性環境中才具有抑菌活性，在pH〉4的條件下即失活；且酸性越高，活性越強(圖2)。2、對溫度的穩定性將發酵上清液分別在-20。C、4°C、37°C、60°C、90°C、100°C、121°C下處理30min，調節pH至3.0,做牛津杯實驗，以藤黃微球菌為指示菌，觀察抑菌圏大小的變化。溫度對細菌素plantaricinZJ316的活性基本無影響，甚至在12rC條件下處理30min仍具有明顯的抑菌活性(圖3)。3、對酶的專文感性(1)酶的種類過氧化氫酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶k、溶菌酶(2)酵液的閨己制將20mg酵力口入到20mL滅菌過的超純水中，配製成lmg/mL，同時調節pH:胰蛋白酶(5.4)、胃蛋白酶(2.0)、蛋白酶K(7.5)、溶菌酶(5.0)、過氧化氫酶(7.3),均保存於-20°C,備用。(3)酶反應將發酵上清液與酶液等體積混合，置於37。C下反應30min。調節pH至3.0，做牛津杯對照實驗，以藤黃微球菌為指示菌，觀察抑菌圏大小的變化。由實驗結果可得(見圖4),植物乳桿菌素plantaricinZJ316對蛋白酶K、胰蛋白酶、溶菌酶、胃蛋白酶均敏感，但對過氧化氫酶的敏感性則較低。^r測結果說明plantaricinZJ316為一類在酸性條件下具有抑菌活性的熱穩定抗菌肽。實施例4:丄actoZj"c/〃wsp/a"torwmZJ316中抗菌肽plantaricinZJ316的分離和抑菌譜硫酸銨梯度沉澱(硫酸銨由飽和度45%升至60%),收集沉澱，水溶，超濾濃縮，並採用SephacrylS-IOOHR填料柱在PurifierIOO蛋白質純化系統上進行凝膠過濾，收集有抑菌活性的組分，用純水作為流動相，經檢測發現在2025min之內的組分(Bl)有抑菌活性(圖5),Cl(10~15min)、C2(1520min)、C3(2530min)、C4(3035min)和C5(3540min)均無抑菌活性。(如圖6所示，其中B1、Cl、C2、C3、C4和C5分別為吸收峰對應的組分，對照為1.0mol/LHC1)。圖7為HPLC檢測Bl組份的純度(檢測波長280nm)，表明Bl組分的蛋白純度很高，已達到質譜分析的要求。採用雙層瓊脂牛津杯法對抗菌肽plantaricinZJ316進行抑菌譜測定。結果顯示該抗菌肽對26個指示菌中的18個菌林有抑制作用(見表2)。_表2:plantaricinZJ316的抗菌語tableseeoriginaldocumentpage15實施例5:丄acto6ac/〃ws;/awton/mZJ316中抗菌肽plantaricinZJ316分子量測定實施例4中經HPLC檢測後的純化樣品進行質譜MALDI-TOF-MS分析(AutoFlexMALDI-TOF-TOF畫MS,Bruker)。主要測試參數(1)檢測條件N2雷射源，波長337nm;(2)離子類型正離子；(3)檢測方式反射方式(飛行管長2.7M,加速電壓20KV,反射電壓23KV);(4)基質CCA。結果如圖8,圖中顯示該細菌素的分子量為2366Da。實施例6:丄(3cto6ac/〃twp/朋torwmZJ316中抗菌肽plantaricinZJ316的N端序列分析實施例4中經HPLC檢測後的純化樣品用Edman降解法進行胺基酸序列分析(胺基酸測序儀ABI491A)。結果見圖9，為測出的N端5個胺基酸——S(絲氨酸)、L(亮氨酸)、P(脯氨酸)、Q(穀氨醯胺)、N(天冬氨酸)。序列表—ST25SEQUENCELISTING<110〉浙江工商大學<120〉LactobacillusplantarumZJ316、產生的抗菌肽及其製備與應用<130〉3Patentlnversion3.41<211〉21<212〉DNA<213〉Unknown<220〉<223〉人工序列<400〉1atcatgatttacatttgagtg21<210〉2<211〉21DNAUnknown<220〉<223〉人工序列<400〉2cgacgaccatgaaccacctg213927DNA3ctagtacgtctatctcttagatttgcatagtatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgt60agcttcg33tgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagt120ttcagccttgcggccgtactccccaggcggeieitgctt朋tgcgttagctgcagcactgaa180gggcggei犯cCCtCC33C3Cttagcattcatcgtttacggtatggactaccagggtatct240aatcctgtttgctacccatactttcgagcctcagcgtcagttacagaccagacagccgcc300"ttcgccactggtgttcttccgcatttcaccgctacacatggagttccact360gtcctcttctgcactcaagtttcccagtttccgatgcacttcttcggttgagccgaaggc420tttcacatcaga_cttaaaa8accgcctgcgctcgctttacgcccaataaatccggacaac480gcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggtta540aataccgtca3t6lCCtg33Cagttactctcag3t3tgttcttctttaacaacagagtttt600acgagccgaaacccttct"tcactcacgcggcgttgctccatcagactttcgtccattgtg660gaagattccctactgctgcctcccgtaggagtUgggccgtgtctcagtcccaatgtggc720cgattaccctctcaggtcggctacgtatcattgccatggtgagccgttaccccaccatct780agctaatacgccgcgggaccatccaaaagtgatagccgaagccatctttcaaactcggac840catgcggtccaagttgttatgcggtattagcatctgtttccaggtg"ttatcccccgcttc■tgggcaggttcccacgttatC3t8g3g92權利要求1.LactobacillusplantarumZJ316，保藏於中國典型培養物保藏中心，地址中國武漢武漢大學，保藏編號CCTCCNoM208077，保藏日期2008年5月23日。2.由權利要求1所述的￡acto6flc/〃Mp/朋torwmZJ316發酵產生的抗菌肽p/anton'c/"ZJ316,分子量為2366Da,N端序列為SLPQN,所述抗菌肽ZJ316的製備方法包括丄acto6"c/〃wp/a"tarwmZJ316才妄種至適用於乳桿菌的發酵培養基中，3538。C下發酵培養1824h,得到發酵液離心，取上清，分離純化得到所述的抗菌肽ZJ316。3.製備如權利要求3所述抗菌肽的方法，其特徵在於所述的方法包括丄actokzc/〃wsp/a"tonwZJ316接種至適用於乳桿菌的發酵培養基中，3538。C下發酵培養1824h,得到發酵液離心，取上清，所述的上清用石危酸銨梯度沉澱，收集沉澱，用水溶解、超濾濃縮，採用SephacrylS-100HR填料柱在Purifier100蛋白質純化系統上進行凝膠過濾，收集有抑菌活性的組分，得到所述抗菌肽。4.如權利要求4所述的方法，其特徵在於所述適用於乳桿菌的發酵培養基為MRS液體培養基，每1000mLMRS液體培養基按如下組成配製蛋白腖10g,牛肉膏10g，酵母提取物6g,磷酸氫二鉀2g,檸檬酸三胺2g,乙酸鈉5g,葡萄糖20g,七水硫酸鎂0.2g,四水硫酸錳0.05g,吐溫lmL,pH6.26.4,去離子水補足至1000mL。5.如權利要求2所述的抗菌肽plantaricinZJ316在製備飼料添加劑中的應用。6.如權利要求2所述的抗菌肽plantaricinZJ316在製備食品防腐劑中的應用。7.如4又利要求2所述的抗菌肽plantaricinZJ316在製備替^抗生素藥物中的應用。全文摘要本發明提供了一株從嬰兒糞便中分離到的植物乳桿菌——LactobacillusplantarumZJ316，以及由其發酵產生的抗菌肽——植物乳桿菌素ZJ316(plantaricinZJ316)及其製備與應用；plantaricinZJ316為一新發現的高效的小分子量乳酸菌抗菌肽，該抗菌肽具有廣譜的抑菌作用，由於分子量小，很難橫跨脂雙分子層而形成小孔的複合體而有別於nisin的作用模式，但其同樣具有高效的殺菌能力，是一個具有很高的應用開發潛力的lantibiotic類抗菌肽，可應用於製備飼料添加劑、食品防腐劑、抗生素的替代藥物等等。文檔編號C07K14/195GK101353633SQ20081006252公開日2009年1月28日申請日期2008年6月13日優先權日2008年6月13日發明者青顧申請人:浙江工商大學