用於鑑定軟骨細胞表型穩定性以及篩選軟骨形成影響因子的標記基因的製作方法

2023-05-04 18:09:06

專利名稱：：用於鑑定軟骨細胞表型穩定性以及篩選軟骨形成影響因子的標記基因的製作方法用於鑑定軟骨細胞表型穩定性以及篩選軟骨形成影響因子的標記基因發明領域本發明涉及用於確定軟骨細胞表型穩定性的方法和工具以及用於鑑定可用於治療軟骨缺損及軟骨相關疾病的化合物的篩選系統。
背景技術：
：修復軟骨缺損主要通過手術方法完成，例如骨髓刺激技術或植入軟骨形成細胞(軟骨細胞，軟骨祖細胞和前體細胞，或可形成軟骨的幹細胞)。因此，鑑定能夠對體內軟骨形成有正面影響的因子是有益的。比較理想的是鑑定出能夠對缺損部位內或其鄰近部位存在的局部細胞介導的軟骨形成有正面影響的手術過程或治療方法或化合物。另外，對於以細胞為基礎的治療措施來說，鑑定出能夠對已在體外擴增或傳代的分離細胞群在體內穩定形成軟骨的能力有正面影響的因子或處理方法也是有益的。文獻已經報導過多種不同的方法，其中參與軟骨形成的基因的表達被用作篩選化合物的參數。US2002061514描述了一種方法，其中報告基因可對轉錄因子SOX9產生反應。SOX9是一種高遷移率組(HMG)域轉錄因子，表達於軟骨細胞、軟骨祖細胞和其他組織，已被證實是軟骨細胞分化和軟骨形成所必須的。其他方法是以參與軟骨代謝和骨軟骨缺損的各個基因[如，WO02081745所述的骨質疏鬆症相關基因]的表達水平而建立的。篩選方法在文獻中也有描述，這些方法的基礎在於細胞在體外向軟骨的分化。但是，研究發現，這些模型的預測價值是有限的，這些分析方法需要大量的細胞，並且十分費時。WO200466723提供了一種體內模型，其中在斑馬魚體內評價了化合物對骨和軟骨形成的效應。用於評價細胞穩定形成軟骨的能力的一種最可靠方法是將細胞植入到裸鼠的肌肉內，然後通過組織學分析方法評價產生的植入物。利用這種裸鼠模型可以避免採用WO0124833所述的技術，但是這種方5法本身也是十分費時的，並且不適於高通量的篩選。本專利申請描述了根據軟骨形成的裸鼠模型鑑定出的分子標誌物在評價用於移植目的的擴增或傳代細胞的軟骨形成潛能中的應用。同樣，US2003235813描述了一組用於評價軟骨細胞表型穩定性的合適標誌物。然而，儘管這些標誌物的鑑定為能在體內產生穩定透明軟骨的細胞群的鑑定提供了基礎，但是依然有進一步改進的需要。發明概述本發明的基礎在於提供一種特異性標誌物模式的新概念，這種特異性標誌物模式可作為任何給定環境內軟骨形成的指示因子，即，對細胞來說無論是天然的或者是誘導的環境，都被認為是可鑑定軟骨形成影響因子的靶模式。相應的，本發明提供了一組標誌物，該組標誌物可用於可靠地預測一群細胞的軟骨形成潛能。這些標誌物的表達水平可用於預測細胞群，例如，在體外或在體內，在被植入到體內時或者被刺激時是否能夠生成軟骨。這組標誌物還提供了一種可靠的工具，用於確定一個給定處理對一群植入前的細胞的軟骨細胞表型穩定性的效應。另外，本發明還提供了組合治療方案，該方案包括給予關節內的幹細胞或骨軟骨細胞以及給予能影響所給予細胞群的軟骨形成潛能的藥物。根據本發明，細胞群在體外的表型穩定性被用於篩選試驗中以鑑定能影響體外和/或體內軟骨細胞表型穩定性的因子。本發明提供了一組能指示軟骨細胞表型穩定性的標誌物，這些標誌物的表達被用於預測化合物和/或條件對細胞群在體內生成軟骨的能力的體外或體內效應。在篩選試驗中使用這些標誌物可以使我們無需太長的時間和繁重的動物實驗就能夠篩選大量的作用於軟骨細胞的化合物和/或條件在一個方面，本發明提供了確定一個細胞群穩定生成透明軟骨的能力的方法。更具體地說，本發明提供了在體外確定一個細胞群在體內穩定生成透明軟骨的能力的方法。在具體實施方式中，該方法包括確定細胞群表達一組至少三個標誌物基因的水平，這一組標誌物基因包括FRZB、ALK1以及選自PEDF、COLll、COL2、FGFR3、OPN、BMP-2或RASF-PLA的一個或多個標誌物基因。在本發明提供的方法的具體實施方式中，細胞群與化合物或條件接觸。在具體實施方式中，本發明提供的方法包括使一群細胞與化合物或條件接觸以及確定一組至少三個標誌物基因在這群細胞內的表達水平的步驟，其中這一組標誌物基因包括FRZB、ALK1以及選自PEDF、COLll、COL2、FGFR3、OPN、BMP-2或RASF-PLA的一個或多個標誌物基因。在這些方法中，一組至少三個標誌物的表達水平可作為細胞在體內穩定生成透明軟骨的能力的指示因子，例如，在被植入到患者體內時。本文所述方法的其他實施方式包括以下步驟在細胞群與化合物或條件接觸前確定這組至少三個標誌物基因在這群細胞內的表達水平，以及在接觸步驟後，確定化合物或條件的存在是否能夠影響這組至少三個標誌物基因中的一個或多個基因的表達。更具體的是，本發明提供的方法包括根據化合物或條件存在時對這組至少三個標誌物基因在細胞群內的表達水平的影響，確定化合物或條件對細胞群在體內穩定生成透明軟骨的能力的效應。在本文所述方法的具體實施方式中，能增強選自FRZB、COLll、COL2、FGFR3、OPN、BMP-2或RASF-PLA的一個或多個正標誌物基因的表達水平的化合物或條件被鑑定為對軟骨形成有正面影響，能增強PEDF和/或ALK-1表達水平的化合物被鑑定為對軟骨形成有負面影響，特別是對細胞在體內穩定生成透明軟骨的能力有負面影響。在本文所述方法的其他具體實施方式中，這組標誌物是包括至少4、5或6個標誌物基因的一組，其中包含FRZB、ALK1以及選自PEDF、COLU、COL2或FGFR3的2、3和4個標誌物基因。本文所述更具體的方法實施方式涉及的方法中，這組標誌物基因是一組包含FRZB、ALK1、PEDF、COL11、COL2和FGFR3的至少6個標誌物基因。在本文所述方法的具體實施方式中，化合物或條件影響軟骨形成的能力根據化合物或條件對這組至少三個標誌物基因的表達的累積效應而定。更具體的是，化合物或條件對選自FRZB、COLll、COL2、FGFR3、OPN、BMP-2或RASF-PLA的一組的正標誌物基因表達的累積效應以及化合物或條件對負標誌物基因PEDF和/或ALK-1表達的累積效應可作為化合物或條件影響細胞群軟骨細胞表型穩定性的指示因子。在本文所述方法的具體實施方式中，細胞群獲自關節。細胞群獲自健康供者或獲自患骨軟骨缺損的個體。在特殊試驗中分析了化合物或條件對兩類細胞的效應。在本文所述方法的具體實施方式中，利用定量方法確定一個或多個標誌物的表達水平。本發明的再一方面涉及一組標誌物在鑑定能夠影響細胞，特別是軟骨細胞或軟骨前體細胞，在體內生成軟骨的能力的化合物中的應用。在具體實施方式中，所述應用的特徵在於，這組標誌物包含一組至少三個標誌物基因，其中包括FRZB、ALK1以及選自PEDF、COLll、COL2、FGFR3、OPN、BMP-2或RASF-PLA的一個或多個標誌物。在具體實施方式中，所述應用涉及至少6個標誌物基因，其中包括FRZB、ALK1、PEDF、COLll、COL2禾口FGFR3。本發明的再一方面提供了試劑盒，該試劑盒包含用於檢測一組基因在軟骨形成細胞內的表達水平的探針，其中這組基因包括由FRZB、ALK1以及選自PEDF、COLll、COL2、FGFR3、OPN、BMP-2或RASF-PLA的一個或多個標誌物組成的一組至少三個標誌物基因。在具體實施方式中，本發明提供了試劑盒，其中這組標誌物基因是包括FRZB、ALK1、PEDF、COLll、COL2和FGFR3的一組至少6個標誌物基因。本文所述試劑盒的具體實施方式是試劑盒，其中探針是能夠與mRNA雜交的寡核苷酸，其中探針是抗體和/或其中探針是待測標誌物特異性的PCR引物對。本發明的試劑盒包含不同類型的探針。在試劑盒的其他具體實施方式中，提供了標記探針。本發明的另一方面提供了用於檢測一組基因在細胞內，更具體的是通常能生成軟骨的細胞，的表達水平的裝置。在這種裝置的具體實施方式中，提供了下列一種或多種組分檢測標誌物基因表達水平的單元，以及由FRZB、ALK1和選自PEDF、COLll、COL2、FGFR3、OPN、BMP-2或RASF-PLA的一個或多個標誌物組成的一組至少三個標誌物基因的探針。本文所述裝置的具體實施方式是特別適用於檢測一個細胞群所表達的一組標誌物基因的裝置，其中這組標誌物基因是包含FRZB、ALK1、PEDF、COLll、COL2和FGFR3的一組至少6個標誌物基因。發明詳述定乂術語"軟骨形成的"在用於細胞或細胞群時是指在合適的環境中該細胞或細胞群具有生成軟骨或刺激軟骨生長的固有能力。在本文中，"軟骨形成化合物"是指能誘導穩定軟骨細胞表型和/或促進軟骨形成的化合物。術語"軟骨細胞表型穩定性"或"軟骨形成潛能"在用於指細胞群時是指細胞群在體內生成軟骨的能力。這種能力可通過如下過程檢測(異位)注射一部分細胞群(至少約l-20xlS細胞)到哺乳動物內(體內)，如免疫缺陷鼠，以及確定(在約3周的時間範圍內)軟骨植入物沒有出現血管侵入的跡象、礦化或被骨或纖維組織替代。另外，一部分細胞群(至少約1-20x1(^細胞/cm2)接種到或包裹進生物相容性基質，然後植入到皮下，約6-8周後確定軟骨植入物穩定發育，並且沒有血管侵入或軟骨內骨化的跡象。根據本發明，一群能在體內生成穩定透明軟骨的細胞的特徵是存在本文所述的表型穩定性標誌物的特異性組合。在傳代過程中，成熟軟骨細胞的軟骨表型穩定性逐漸喪失。在本文中，術語"新鮮分離的細胞"(FI)是指活檢組織經過組織消化後得到的細胞群。因此，在本文中，術語"新鮮分離的軟骨細胞"是指直接獲自含軟骨細胞的組織如軟骨經過消化而未傳代的細胞群。術語"擴增的，，用於指獲自組織如軟骨的細胞群時，是指已置於使細胞通過增殖因而數目增加的條件下的細胞群。在其最簡單的版本中，擴增是通過在含合適培養基的培養容器內提供細胞群而完成的，任選直到匯合為止。作為擴增新鮮分離細胞的結果而得到細胞群被稱作P0。術語"傳代的"是指己經擴增的細胞，擴增以後利用酶消化的、化學的和/或物理的方法從培養容器內收穫細胞，然後以較低的密度接種到另一培養容器內。傳代的細胞是指其在培養基內所傳的代數(P1、P2等)，或者是指其群體倍增的次數(PD1、PD2等)。在本文中。術語"軟骨缺損"是指軟骨丟失或損傷導致的任何疾病或任何患病的軟骨部分。術語"標誌物評分"用於指本發明標誌物表達水平的數值。"累積的標誌物評分"是指本發明標誌物組的不同標誌物的標誌物評分組合。可以是總和各個標誌物得到的結果。另外，累積標誌物評分考慮到了每一個標誌物在預測軟骨細胞表型穩定性中的能力的差異，相應的要根據較複雜的數學公式計算。術語"組織學評分"是指根據組織學分析而得到的賦予軟骨的定性或半定性值(例如，非軟骨、纖維軟骨、透明軟骨)。在本申請中，基因所用的縮寫如下FRZB:巻曲相關蛋白1[QMIM605083，GenbankU91903]ALK1:II型活化素A受體樣激酶1[OMIM601284，GenbankZ22533]PEDF:色素上皮衍生因子[OMIM172860，GenbankM76979]COLll:XI型膠原Al[OMIM120280，GenbankJ04177]COL2:II型膠原al[OMIM120140，GenbankLI0347]FGFR3:成纖維細胞生長因子受體3[OMIM134934，GenbankM58051]BMP-2:骨形態發生蛋白2[OMIM112261，GenbankM22489]RASF-PLA2:磷脂酶A2，IIA族[OMIM172411，GenbankM22430]OPN:骨橋蛋白[OMIM166490，GenbankXI3694]本發明的基礎在於己經鑑定出一組特異性標誌物基因，研究證明這些基因的表達水平是細胞在體內形成軟骨的能力的指示因子。更具體的是，已經證明，通過賦予這些基因中的每一個基因以數值，其累積數值可表示為累積標誌物評分，反映了細胞群在體內生成表型穩定的軟骨的能力。本發明所鑑定的用於評價細胞群形成軟骨的能力的標誌物基因選自包括正標誌物基因FRZB、COLll、COL2、FGFR3、BMP-2、RASF-PLA2或OPN以及負標誌物基因ALK1和PEDF的一組。其他標誌物也可以包括在該組中，例如，作為對照。因此，根據本發明，已經鑑定出一組9個標誌物，其中既包括正標誌物也包括負標誌物。能在體內生成穩定透明軟骨的細胞群高表達正標誌物，而能生成穩定透明軟骨的細胞群低水平表達或不表達負標誌物。根據本發明，不表達負標誌物可以被當作正標誌物。但是，在本發明的上下文中，不表達這種標誌物是軟骨細胞表型穩定性的能力的指示因子，在本文中被稱作負標誌物。本發明的標誌物基因的表達是細胞群的一個性能特徵，該細胞群通常包含約0.2xl05-1.0xl6個細胞。確定基因表達的各種方法是本領域所熟知的。根據本發明，最常見的是，從一部分細胞群(一般含0.2xlOS-1.0xlS個細胞，優選0.2xl0、lxl0"中分離RNA，通過反轉錄PCR擴增RNA。這種擴增可以半定量的方式完成，擴增片段電泳，其相對密度值與看家基因如P肌動蛋白的相對密度值比較。然而，利用核苷酸擴增技術可以分析較低數量的細胞甚至單個細胞的表達水平。另外，利用，例如，Taqman技術，可以定量的方式測定DNA的量。技術人員根據標誌物基因的已知序列可以很容易地鑑定適於本申請所述的標誌物的引物。另外，可在蛋白質水平上測定標誌物的表達。利用免疫學方法如蛋白質印跡或ELISA可以確定蛋白質水平。在本發明的具體實施方式中，可以通過比較對照組和試驗組內標誌物的表達水平來評價標誌物的表達，例如通過微晶片技術或一維或二維蛋白電泳後的分析方法。在這當中，標誌物蛋白在凝膠內按照其Mr(—維的)和其等電點(IEP)(二維的)遷移。蛋白質水平上表達的差異可通過檢測蛋白質在其Mr和/或IEP相應位置上存在的量來測定。考馬斯亮藍染色或類似染色後可定量測定蛋白質，或者通過摻入放射性代謝標記物(例如，35s甲硫氨酸)定量測定蛋白質。根據所使甩的技術，可以用，例如，發色基團或磁性或放射性標記物，標記抗體、寡核苷酸探針或蛋白質探針(如抗體)以檢測表達。在具體實施方式中，本發明涉及通過不同技術檢測不同標誌物。例如，利用ELISA可檢測多種標誌物，而通過PCR可檢測其他標誌物。本發明另一方面提供了適於檢測本發明標誌物的裝置。在具體實施方式中，這種裝置包括用於直接或間接檢測本發明的標誌物(例如在DNA、RNA或蛋白質水平)的單元。該單元可基於RNA、DNA雜交或基於免疫學檢測。這種單元可以是(定量)PCR裝置，用於完成免疫學分析的裝置或用於測定蛋白質的裝置(例如，HPLC、質譜、電泳裝置)，但是也可以是(一次性的)微矩陣裝置或晶片。在使用時，這種單元可配備用於檢測本發明的標誌物基因或蛋白的探針或抗體。任選這種裝置還可以包括細胞培養單元，其中兩個或多個細胞群可在相同或不同條件(例如，密度、傳代次數、培養基組成)下培養。另外，本發明的裝置可包括用於將一種或多種待測化合物轉移到細胞培養單元內的單元(轉移量或轉移時間表可根據情況而變化)。最後，裝置可包括用於收集細胞以及分離細胞材料(DNA、RNA、蛋白質)的單元。另外，本發明還提供了一次性藥筒，其中包含本文所述的標誌物所用的探針或特異性試劑，可用於分析這些標誌物的表達以便於快速而有效地確定細胞群的狀態。相應的，本發明提供了自動裝置，該裝置任選與一次性藥筒組合，以便於有效質控體內或體外應用中所使用的細胞。根據本發明的具體實施方式，本發明提供了標誌物基因亞組，該亞組標誌物基因可以使我們更可靠地評價細胞群的軟骨細胞表型穩定性，或者化合物或條件影響細胞群在體內形成軟骨的能力。最特殊的是，適宜的標誌物基因亞組包含至少3個、更具體的是至少4個、更具體的是至少5個、以及最特殊的是至少6個已鑑定的標誌物基因。根據一個實施方式，標誌物基因亞組包含至少一個正標誌物基因和一個負標誌物基因。一般而言，考慮進去的標誌物基因數越少，測量誤差和一個特定標誌物的潛在異常表達的影響就越大。不同的標誌物還反映了不同的過程(例如，合成代謝過程，分解代謝過程等)和參與軟骨細胞代謝的不同通路(信號通路，受體和配基，基質組分，處理酶)，每一種過程對軟骨細胞的表型穩定性都有其各自的影響。因此，考慮到的標誌物基因越多，試驗就越能代表確保軟骨穩定形成的完整環境。另一方面，分析的標誌物基因越多，試驗的技術複雜程度就越高，也就越不適合用於高通量篩選。另外，為了維持每一個標誌物基因的貢獻與整體評價的相關性，標誌物基因數應保持在IO個以下。確實，在一大組標誌物基因內單個標誌物基因表達的變化對標誌物基因的總表達評分的影響很小。根據這些參數和所觀察到的不同基因的相對貢獻，研究證實3到9個標誌物比較適於確定細胞群的軟骨細胞表型穩定性，或適於評價化合物或條件對細胞群軟骨細胞表型穩定性的影響。根據一個實施方式，包含5、6或7個標誌物的一組是最佳的折中方案，可以兼顧到這組標誌物所得評分的精確度和進行高通量分析的實際可行性之間的平衡。因此，本發明的一個方面提供了包含至少三個代表軟骨形成的標誌物的一組標誌物，其中的標誌物選自由正標誌物基因FRZB、COLll、COL2、FGFR3、BMP-2、RASF-PLA2和OPN以及負標誌物基因ALK1和PEDF組成的一組。根據本發明的一個具體實施方式，組成軟骨形成潛在標誌物的一組至少三個標誌物，即，代表軟骨形成，包括FRZB、ALK1以及選自PEDF、C0LU、C0L2、FGFR3、BMP-2、RASF-PLA2或OPN的一個標誌物基因。更具體的是，代表軟骨形成的一組至少三個標誌物，包括FRZB、ALK1以及選自PEDF、COLll、COL2和FGFR3的一個標誌物基因。本發明的其他實施方式涉及至少包含4、5或6個標誌物基因的組，其中包括FRZB、ALK1以及選自PEDF、COLll、C0L2、FGFR3、BMP-2、RASF-PLA2或OPN的2、3和4個標誌物。更具體的是，至少包含4、5或6個標誌物基因的組包括FRZB、ALK1以及選自PEDF、COLll、COL2或FGFR3的2、3和4個標誌物。根據一個具體實施方式，一組6個標誌物基因被用於評價在體內生成穩定軟骨的能力，該組由FRZB、ALK1、PEDF、COLll、COL2禾卩FGFR3組成。在實施例1中被稱為"ChondroCelectTM標誌物，，(CC標誌物)的這組標誌物基因的累積評分在本文中也被稱為"ChondroCelectTM評分"。另夕卜，這組標誌物包括這組軟骨形成潛在標誌物的變體，其中PEDF、COLll、COL2和FGFR3中的一個可被選自RASF-PLA2、OPN和BMP-2的一個標誌物替代。更具體的是，這組標誌物包括上述軟骨形成潛在標誌物的變體，其中正標誌物COLll、COL2中的一個被RASF-PLA、OPN或BMP-2替代。本文的實施例部分證明，根據軟骨細胞群所表達的本文所述的標誌物組的水平而計算出的標誌物評分可用於可靠地預測細胞群所生成的軟骨的特性(如組織學分析所確定的)。根據另一方面，本發明提供了確定細胞群的軟骨細胞表型穩定性的方法。更具體的是，本發明提供了本文所述的這組標誌物基因作為一個工具在評價細胞群的軟骨細胞表型穩定性中的應用。這一點是非常重要的，例如，對於軟骨缺損治療中細胞移植所用的細胞群的質控來說。這些方法的特徵在於，它們包括確定一組本文所述的標誌物基因在細胞群內的表達水平的步驟。更具體的是，本發明的一組標誌物基因的表達水平，任選表示為累積標誌物評分，更具體的是表示為軟骨形成潛能評分，可用作用於移植目的的細胞群質量的指示因子。一般來說，細胞群的質量評價利用標準方法如本文所述的那些方法在試驗室完成，評價結果以報告的形式產生，或者總結在質控表中。細胞群可以是獲自人或動物組織的細胞群的P0或任一代。根據一個實施方式，細胞群是P2到P6之間的獲自人軟骨活檢組織的細胞群。另外，可以考慮細胞群的群體倍增次數。對於本發明上下文所述的大多數細胞群來說，每一代包括2-3次群體倍增。相應的在本發明的上下文中，細胞群在經過一次或兩次群體倍增(PO)後進行評價。任選的是，細胞群是一個活檢組織或不同活檢組織來源的不同代次(任選包括PO)細胞的組合。細胞如果打算進行自體移植，那麼獲自一個特殊患者的一個或多個活檢組織的細胞任選組合在一起，然後檢測其軟骨細胞表型穩定性(在組合前和/或後)。一般來說，質量評價在特定時間點進行，即，植入前(以細胞或者放入支架或基質內的二維或三維組織的形式)、儲存前(例如，冷凍)和/或儲存後取出、在對細胞群進行特殊處理和/或置於特殊條件下之前和/或之後。本發明一個方面的目的確實是在直接植入前，或者接種到或包裹進生物相容性基質然後植入前，確定細胞群在體內生成穩定透明軟骨的能力。標誌物評分是細胞群或細胞能形成軟骨植入物而不發生血管侵入或軟骨內骨化跡象的指示因子。一般而言，根據本發明，用於計算標記物評分的標誌物表達水平可以細胞群作為一個整體來進行，其中利用代表性的樣品來確定被研究的細胞群是否表達標誌物，例如，通過本文所述的那些方法。另外，可以利用本領域熟知的細胞特異性方法檢測單個細胞內特殊基因的表達。根據另一方面，本發明提供了用於確定化合物或條件對軟骨形成細胞在體內生成穩定透明軟骨的能力的影響的方法，該方法可用作篩選工具。這些方法包括步驟使軟骨形成細胞群與化合物或條件接觸，以及確定該細胞群內本發明所述的一組標誌物基因的表達水平。相應的，本發明提供了用於鑑定能夠影響一群細胞的軟骨形成能力的化合物或條件的方法和試驗。根據一個實施方式，該方法被用於鑑定適於培養、儲存和/或給予細胞群的合適條件，其中的細胞群可用於治療軟骨缺損。在這種方法中，軟骨形成細胞群被施加以特殊條件，然後測定標誌物基因的表達水平。常見的條件包括特殊培養基、培養溫度、培養時間、培養密度等，以及與其他類型細胞的組合。另外，方法和試驗被用於鑑定能夠影響軟骨形成細胞的軟骨細胞表型穩定性的分子因子。這種因子包括生長因子、絲裂原、添加物、小化學分子等。篩選的目的可以是鑑定可用於培養、儲存或給予用於移植以治療軟骨缺損的細胞群的因子。一般來說，感興趣的因子是能夠對細胞群的軟骨細胞表型穩定性產生正面影響的因子，和/或對細胞的其他特性(例如，細胞數、穩定性等)產生正面影響的因子，和/或對細胞群的軟骨細胞表型穩定性沒有負面影響的培養條件參數(例如，儲存時間，可用的傳代次數等)。另外或擇一地，本發明的試驗或方法可用於篩選和鑑定對軟骨形成細胞在體內形成軟骨有潛在效應的化合物。本發明涉及篩選方法在鑑定化合物中的應用，其中化合物可影響被治療患者體內的局部細胞生成軟骨和/或細胞移植所用細胞生成軟骨。篩選方法可用於鑑定和/或評價能夠抵消病理狀態下所產生的因子或狀況的化合物。例如，在添加能夠潛在抵消這種效應的化合物前用IL-1刺激細胞(刺激炎症狀態、增強代謝通路以及抑制分解代謝過程)。在本發明的範圍內還涉及標誌物基因在評價治療性化合物對軟骨形成細胞在體內生成軟骨的能力的潛在副作用中的應用，其中包括用於軟骨修復之外的那些化合物。本發明的方法有可能用於直接鑑定化合物對骨形成的效應，當在體內直接檢驗時，可能需要較長的時間才能觀察到這種效應。本發明涉及化合物篩選的方法一般包括步驟使軟骨形成細胞與一種或多種目的化合物接觸，以及確定本文所述的一組標誌物基因在軟骨形成細胞群內的表達水平。本發明的方法可用於高通量篩選，例如，化學化合物文庫、肽文庫、表達文庫等。根據一個實施方式，本發明的方法包括步驟比較已添加一種或多種化合物/已經過特定條件處理的一個細胞群與未經過這種化合物或條件處理的相同或不同細胞群內本發明所述的一組標誌物基因的表達水平。在一個典型實施方式中，(a)來源於同一細胞群的不同組分用不同條件和/或化合物處理以彼此比較和/或與陽性和/或陰性對照比較。陰性對照可以是空白或已知不影響軟骨細胞表型穩定性的化合物。陽性對照可以是已知可(正面或負面)影響細胞群表型穩定性的化合物或條件。在本發明的篩選方法中，評價了不同參數。以不同的密度將細胞接種到不同的容器內或者接種到多孔培養板內。在添加化合物/因子或施加條件或二者同時進行之前培養細胞以不同的時間。不同方案以及化合物和培養條件的組合可以結合使用。化合物/因子以不同的濃度添加，與細胞接觸以不同的時間。培養條件同樣適用。本發明的基礎在於我們觀察到，在植入前，根據特殊基因(標誌物基因)在一個細胞群內的體外表達水平可以預測該細胞群在植入到體內後生成透明軟骨的能力。因此，標誌物基因的表達水平可用於監測細胞在植入前的軟骨形成"質量"以及化合物和條件對其的效應。如下文所詳細描述的，基因的表達水平可表示為標誌物評分，其中不同標誌物基因的(相對)表達水平累加起來就得到了一個數值，該數值可與最佳值(即，所選擇的所有正標誌物都高表達，所有負標誌物都低表達)比較。另外，篩選試驗也可把化合物或條件影響該組基因內的任何一個標誌物的能力考慮進去。本發明的標誌物基因的表達可基於絕對值或相對值來評價。一般而言，採用標誌物基因的表達水平與看家基因的表達水平進行比較。例如與本文所述的肌動蛋白基因比較。由於不同看家基因的表達水平是不同的，技術人員應當理解，對於每一個所使用的看家基因來說，需要預先在具有軟骨細胞表型穩定性的細胞群內確立標誌物基因與所選擇的看家基因之間的相對表達。根據本發明，由所選標誌物表達水平得到的綜合信息可作為細胞是否能在體內形成軟骨的指示因子。本發明涉及本文所述的標誌物組合在評價一個給定細胞群的質量以及評價因子/條件對細胞在植入到體內後生成透明軟骨的能力的影響中的應用。當一組標誌物被用於確定化合物、細胞或條件對細胞群在體內生成透明軟骨的能力的影響時，效應可以確定為本發明標誌物的表達水平相對於對照或相對於細胞群與化合物或條件接觸前的表達水平"升高"或"下降"。因此，能夠提高一個或多個本發明的正標誌物基因的表達水平和/或降低一個或多個本發明的負標誌物基因的表達水平的化合物、細胞或條件被認為能夠對軟骨形成產生正面影響。能夠降低一個或多個本發明的正標誌物基因的表達水平和/或提高一個或多個本發明的負標誌物基因的表達水平的化合物、細胞或條件被認為能夠對軟骨形成產生消極影響。根據本發明的一個方面，細胞群內一組標誌物中不同標誌物基因的表達水平可表示為"累積標誌物評分"，該評分與細胞群的軟骨細胞表型穩定性相關，並且是細胞群的軟骨細胞表型穩定性的指示因子。累積標誌物評分可用於定性和/或定量闡釋本發明的方法和試驗所得到的結果。本發明涉及不同類型的標誌物評分。一組標誌物的表達水平可表示為該標誌物組中每一個基因產物的絕對表達水平之和相應的數值。在進行定量檢測標誌物基因的表達水平時，如通過定量PCR或ELISA，可以使用這種計算方法。另外，標誌物組中每一個基因的表達水平可以比例的形式表示，即，一個基因的表達水平與另一個基因如看家基因的表達水平之比，後者被認為無論細胞是否經過處理其表達水平都是相同的，或者其表達被認為是相對穩定的，與細胞生成穩定透明軟骨的能力無關。這樣可以使不同標誌物的表達水平數值更具有可比性(最常見的是在0.001到10的範圍內)。相應的，累積標誌物評分可以是每一個標誌物基因的比例之和。但是，根據本發明的一個具體實施方式，累積標誌物評分不是根據每一個標誌物基因表達水平的絕對值或相對值計算出來的，而是根據該表達的定性分析得出的。根據本發明的一個具體實施方式，主觀地給標誌物基因的定性分析結果賦予一個數值，例如，"1"。更具體的是，根據本發明，正標誌物的表達升高/高表達被賦予數值"l"，負標誌物不表達也被賦予數值'T'。最特殊的是，根據本發明，軟骨細胞表型穩定性的正標誌物基因表達水平和負標誌物表達水平都被定義一個表達水平範圍(或表達水平之比)，其中表達水平處於預先設定的範圍內時被賦予一個數值。根據另一實施方式，表達水平值處於正標誌物基因和/或負標誌物基因的預先設定的表達水平範圍之外時(例如，當正標誌物基因的表達水平很低或負標誌物基因的表達水平很高時)也被賦予一個數值。在確定每一個標誌物基因在累積標誌物評分中的相對影響力時，每一個基因的表達都具有相同的權重。另外，一個或多個基因的表達水平可以被認為對軟骨細胞表型穩定性的影響比其他基因更強，這一點在計算標誌物基因對累積標誌物評分的相對影響力時也要考慮進去。根據本發明的一個具體實施方式，不同標誌物的相對影響力可以是相同的，當處於預先設定的表達水平(或表達比)的範圍內時被賦予數值"l"，而當處於該範圍之外(正標誌物和負標誌物的表達水平分別低於或高於預先設定的範圍)被賦予數值"-l"。任選的是，處於某一範圍之內的表達水平被認為相當於數值"O"，該數值相對應的是正標誌物或負標誌物基因的表達水平對細胞的軟骨細胞表型穩定性既沒有正面影響也沒有消極影響。在本文所述的實施例部分描述了本發明的另一個具體實施方式。代表穩定軟骨表型的累積標誌物評分根據最多包含6個標誌物的一組標誌物確定，其中每一個標誌都具有同等重要的作用。定量測定每一個標誌物的表達水平，所採用的記分方法是根據標誌物基因相對應的表達水平來計算的。在這個具體實施方式中，根據這些標誌物計算出的評分被稱為"軟骨形成潛能評分"，即，反映包含6個軟骨表型穩定性標誌物的一個給定標誌物組的總體表達水平的累積標誌物評分。根據本發明的這個實施方式，利用半定量方法確定每一個基因的表達水平，得到的數值通過與參照基因(例如P肌動蛋白)比較進行標準化。因此，表達水平為1是指與肌動蛋白表達水平相同的表達，表達水平低於1是指比肌動蛋白表達水平低的表達(O.l相對應的表達水平比卩肌動蛋白的表達水平低10倍)，表達水平高於1是指比肌動蛋白表達水平高的表達水平。在本發明的這個具體實施方式中，每一個標誌物基因的表達水平都對應於三個可能的評分中的一個。對於正標誌物(FRZ、COLll、COL2、FGFR3)來說，評分-1代表極低的表達水平(O-O.l)，評分0代表低表達水平(0.1-1)，評分+1代表高表達(〉1)。與此相反，對於負標誌物(ALK1，PEDF)來說，評分+1代表極低的表達水平(O-O.l)，評分0代表低表達水平(0.1-1)，評分-l代表高表達(>1)。所有這些單個評分的和代表一組標誌物作為一個整體的表達水平。因此，對於含6個標誌物的一組來說，評分的範圍可以從-6(所有正標誌物的表達水平都低於參照基因，所有負標誌物的表達水平都高於參照基因)到+6(所有正標誌物的表達水平都高於參照基因，所有負標誌物的表達水平都低於參照基因)。如果這個評分是根據標誌物FRZB、COLll、COL2、FGFR3、ALK1和PEDF在細胞群內的表達水平而計算出來的，那麼這個評分在本文中就被稱為ChondrocelectTM評分。如本發明的實施例所示，一組標誌物的表達水平以及從中計算出的累積標誌物評分可能是與軟骨細胞群的軟骨細胞穩定性相關的。相應的，檢測一組特定標誌物的表達水平或計算軟骨形成細胞群在接觸某些化合物後的(累積)標誌物評分可用於評價化合物影響細胞的軟骨細胞表型穩定性的能力和/或細胞在體內形成軟骨的能力。更具體的是，實施例已經證實將特定化合物添加到擴增的軟骨細胞群中可以提高軟骨形成潛能評分以及改善該細胞群的表型。負對照，例如，添加可促進骨形成的化合物，可降低軟骨形成潛能評分。相應的，本發明提供了可用於以細胞為基礎的篩選試驗以評價任一因子或條件對軟骨形成細胞群在體內生成穩定軟骨的能力的影響的累積標誌物評分。考慮到在體外確定的細胞群軟骨表型穩定性可代表細胞在體內的活性的事實，因此該分析能夠可靠地用於鑑定化合物，其中化合物能夠影響局部軟骨形成細胞在給予軟骨缺損時的軟骨形成。重要的是，本發明所公開的試驗和標誌物分析不需要進行隨後的或平行的體外或體內軟骨形成試驗來驗證其結果，這將大大縮短和簡化化合物大規模篩選試驗。根據本發明，累積標誌物評分是一個可靠而有效的工具，可用於評價細胞群的軟骨細胞表型穩定性和/或評價條件或化合物對軟骨形成細胞的軟骨細胞表型穩定性的影響。評分的可靠性一方面取決於正評分和體內生成表型穩定性軟骨能力之間的關係以及負評分和細胞不能在體內生成表型穩定性軟骨的事實之間的關係。對可靠的累積標誌物評分的其他理想要求是其效率，g口，其有效區分能夠和不能在體內生成表型穩定性軟骨的細胞群的能力。例如，當標誌物的數目是6，評分系統在上述+6到-6之間變化時，通常會有一個"灰色區"(以累積標誌物評分範圍在+6到-6之間為特徵的細胞群)，其累積標誌物評分是不明確的，當進行檢測時會發現其中既包含能生成穩定透明軟骨的細胞群，也包含不能生成穩定軟骨的細胞群。比較理想的是，標誌物評分可使處於該灰色區的細胞群數目最少，但是又可以最有效地將細胞群分類為"正的"或"負的"。更具體的是，在確定移植所用的細胞群的軟骨細胞表型穩定性時，累積標誌物評分的可靠性和效率都是非常重要的，這樣才能直接而正確地確定細胞群的命運。確實，使用相對較低預測值的累積標誌物評分來確定用於移植的細胞群的特徵，其價值有限，因為無法確定是否能夠植入。在這種情況下，使用本發明的軟骨形成潛能評分作為記分工具被認為是特別合適的，這是因為其具有較高的可靠性和效率。但是，在用於篩選時，預測值的效率可能不是太重要。如上所述，本發明的篩選試驗的潛在目的是鑑定能影響，更具體的是能改善，細胞群的軟骨細胞表型穩定性的藥用化合物。因此，在這種篩選方法中，軟骨細胞表型穩定性的相對改善被認為是關鍵要求，而不是化合物誘導或維持軟骨細胞良好表型穩定性的能力。例如，可以預計通過篩選試驗以後，能將低質量細胞(植入後不能生成軟骨)轉化成中等質量軟骨(其評分不能用於準確預測植入後的結果的細胞)的化合物也被認為是本發明感興趣的化合物。可用於本發明的方法和試驗的細胞群包括被認為能夠生成軟骨或能發育成軟骨生成細胞的任何細胞。一般而言，細胞是骨軟骨細胞，如獲自關節軟骨、關節液或滑膜液的軟骨細胞及其前體細胞或祖細胞。根據一個實施方式，本發明所用的細胞是WO01/25402所述的前體細胞。在某些實施方式中，細胞群是獲自其他組織如骨髓或脂肪的前體細胞或幹細胞，以及能誘導分化成骨軟骨細胞系的前體細胞或幹細胞。本發明的試驗可用於確定這些細胞是否屬於骨軟骨細胞系。用於本發明的方法和試驗的細胞可以是新鮮分離的、擴增的或者傳代一次或多次的。細胞可以細胞培養物的形式存在於培養瓶中或者存在於基質或支架上。基質上的細胞所表達的標誌物組的水平可通過溶解基質並測定細胞的表達來確定。細胞可以是人的或動物的。已被用於軟骨研究的動物的例子包括非洲爪蟾、斑馬魚、雞、小鼠、大鼠、兔、綿羊和山羊。本發明的方法和試驗可用細胞進行，其中細胞本來就具有穩定的軟骨細胞表型，和/或經過培養條件的誘導後產生了穩定的軟骨細胞表型。這種細胞特別適用於確定一個給定化合物、治療或條件的效應的試驗。根據另一實施方式，本發明的方法和試驗用不具有穩定的軟骨細胞表型或丟失了軟骨細胞穩定表型的細胞完成，其中不具有或丟失軟骨細胞穩定表型是其固有的和/或由培養條件誘導的。本文中的例子是經過多次傳代的軟骨細胞和幹細胞。另外，合適的細胞可以是獲自具有骨軟骨缺損如(由此導致的)骨關節炎或風溼性關節炎的個體來源的軟骨細胞，或者是基於其基因構成而進行預處理使其產生骨軟骨損傷的個體來源的軟骨細胞。其他合適的細胞可以是軟骨腫瘤細胞或軟骨肉瘤細胞。不具有軟骨細胞表型穩定性的細胞特別適用於本發明的方法來篩選能夠改善或恢復細胞的穩定軟骨表型，或者能夠將某些細胞群如幹細胞轉化成具有穩定軟骨表型的細胞的化合物或條件。本發明涉及本發明的方法或試驗在多種不同應用中的應用。如上所述，本發明的方法和試驗使檢測細胞的培養條件如細胞密度、傳代次數、培養基組成、在二維或三維基質上培養、氧濃度、氣壓、切應力是否適用於ACT成為可能。試驗特別適用於檢測培養基組合物對軟骨細胞表型穩定性的影響。其中對軟骨細胞表型穩定性具有潛在影響的因子包括而不限於血清的類型和批次、合成的無血清培養基的不同劑型以及各種激素、生長因子、維生素、蛋白質和已知可影響軟骨細胞表型穩定性的有機化合物。本發明的方法和試驗的一個應用是篩選化合物或條件，這些化合物或條件可誘導前體細胞或幹細胞分化成骨軟骨細胞，更具體的是分化成軟骨形成細胞系。另一個應用是篩選能夠恢復或維持健康細胞的軟骨細胞表型穩定性的化合物或條件，其中為了獲得足夠的細胞數健康細胞已傳代多次或正在傳代。另一個應用是篩選能夠誘導細胞的軟骨細胞表型穩定性的化合物或條件，其中細胞獲自已患有或易患軟骨缺損的個體。在另一個應用中，試驗用於評價基質、支架、凝膠或其組成的影響，這些細胞通常被用於移植過程。本發明的方法和試驗還適於篩選經典肽文庫、反義文庫或化合物文庫。組成這些文庫的化合物包括而不限於生物製品和有機或無機化合物，這些化合物可以通過合成製備，或者獲自天然資源。在本文中可以使用的例子是化合物文庫，如抗體片段文庫、肽噬菌體展示文庫、肽文庫(例如，LOPAP弁，西格瑪公司(SigmaAldrich))、脂質文庫(拜膜公司(BioMol))、合成的化合物文庫(例如，LOPAC@，西格瑪公司)或天然化合物文庫(Specs，TT公司(TimTec))。本文所述的篩選方法和試驗特別適用於鑑定先導化合物，其中的先導化合物可用於製備骨軟骨疾病治療藥物。在本發明的篩選方法中，本發明感興趣的骨軟骨缺損包括而不限於關節所發生的缺損，例如而不限於膝關節、肘關節、踝關節，通常被稱為關節軟骨缺損。軟骨缺損也可以按骨端命名，如股骨髁的缺損、肱骨髁的缺損等。可用於篩選本發明感興趣的能影響軟骨細胞表型穩定性的化合物的常見軟骨疾病包括骨關節炎、風溼性關節炎、關節軟骨損傷、軟骨軟化、脊椎關節病。附圖簡述下面的實施例用於闡釋本發明，並不意味著將本發明限制於其中所述的具體實施方式。這些實施例利用下圖闡釋，其中，圖1顯示的是組織學評分對軟骨形成潛能評分的散點圖(為了避免點發生重疊，在距離和方向上每一個點都被隨機移動了一些)。圖2顯示的是利用實時定量PCR確定的化合物A對累積標誌物評分的效應(如實施例1所確定的CC評分)，其中PCR是用從P0培養到P0的人軟骨細胞單層培養物完成的。結果代表相對於對照(DMSO)的平均累積標誌物評分。承與DMS0對照比較時pO.05(『4)。圖3顯示的是化合物A對分子標誌物COL2(A)、COLll(B)、FRZB(C)和FGFR3(D)表達的影響，其中分子標誌物的表達水平與以單層培養的人P3軟骨細胞的軟骨形成潛能正相關，如實時定量PCR所測定的。結果代表相對於DMSO對照的根據2—de"ade't^計算出的耙基因表達水平。*與DMSO對照比較時p0.05(1^4)。圖4顯示的是化合物A對分子標誌物PEDF(A)和ALK1(B)表達的影響，其中分子標誌物的表達水平與以單層培養的人P3軟骨細胞的軟骨形成潛能負相關，如實時定量PCR所測定的。結果代表相對於DMSO對照的根據2-dehadehaCT計算出的靶基因表達水平。*與DMSO對照比較時p<0.05(n=4)。實施例方法學軟骨細胞培養從成人關節軟骨中分離軟骨細胞，利用Dell'Accio等((2001)，」wAn'toZ/^"m.44,1608-1619)所述的標準條件在體外擴增。體內試驗利用一組48個軟骨細胞樣品驗證本發明的標誌物，其中軟骨細胞樣品獲自不同的人，是新鮮分離的或者已經傳代1到5次。一部分軟骨細胞用於標誌物分析(參見實施例3)，而另一部分用於體內分析以驗證每一個樣品的軟骨形成能力。將約5百萬個人細胞肌內注射到雌性NMRInu/nu小鼠體內(大腿後部)。2周後收集植入物。[Lipman等(1983)Cato/77^"e/",.35,767-772;Ostrowski等(1975)Som油'cCe〃1，391-395]。從肌肉中切下軟骨植入物，通過蘇木精-伊紅、甲苯胺藍和番紅O染色進行組織學分析。將1到3的組織學評分分別賦予染色後的植入物。組織學評分為3是指含有高度硫酸化蛋白聚糖，甲苯胺藍和番紅O強染色的透明樣軟骨。組織學評分為2代表良好分化的透明樣軟骨，甲苯胺藍強染色，而番紅O弱染色。組織學評分為1是指"纖維軟骨"，未分化的纖維組織，甲苯胺藍不染色或弱染色。組織學評分為0是指為回收到植入物的試驗。組織學評分為2或3的軟骨代表了成果的植入。而組織學評分為0或1的軟骨代表失敗的植入。實施例1:標誌物分析一部分注射的細胞用於基因表達分析。利用WO0124832所述的方法進行RNA分離、反轉錄和PCR。這些標誌物的PCR引物列於表1中。表l:擴增標誌物基因所用的引物tableseeoriginaldocumentpage24通過測定PCR產物電泳後的光亮度來確定標誌物的表達水平。然後將所有數值與DNA分子量標準的600bp的條帶進行比較，得到數值。一個數值代表一個標誌物的濃度。對於正標誌物(COLll、C0L2、FGFR3)來說，-1代表極低表達(O-O.l)，0代表低表達(0.1-1)，+1代表高表達。與此相反，對於負標誌物(ALK1、PEDF)來說，+1代表極低表達(O-O.l)，0代表低表達(0.1-1)，-1代表高表達。所以這些單個標誌物的總和(定義為軟骨形成潛能評分)代表整個一組標誌物的表達水平。這個數值可以是-6到+6。每一個標誌物的各自數據，其軟骨形成潛能評分和組織學評分列於表2中。表2:分別在軟骨植入物和注射的軟骨細胞上測得的組織學評分和軟骨形成潛能評分概述。樣品編碼是指患者編碼、傳代次數和最終的細胞匯合。tableseeoriginaldocumentpage25tableseeoriginaldocumentpage26實施例2:數據分析表3和圖1描述了實施例1所確定的軟骨形成潛能評分和組織學評分之間的關係。軟骨形成潛能評分與組織學評分之間的相關係數為0.78，具有統計學意義(pO.OOOl)。軟骨形成潛能評分S-3的樣品會形成纖維軟骨，或者根本不能形成軟骨。軟骨形成潛能評分S2的樣品總能形成透明軟骨。軟骨形成潛能評分為1的6個樣品中有1個形成了透明軟骨。作為一個標準，軟骨形成潛能評分20的樣品被認為適於植入。根據本發明的數據集，可以預測77%(37/48)的移植結果是能夠高度確定的，其中64%無誤差。根據這個數據集，當軟骨形成潛能評分2O時可以批准軟骨細胞培養物用於ACI過程。總之，只有利用軟骨形成潛能20的細胞才能獲得穩定的透明樣軟骨。根本不能形成軟骨的細胞的評分為負。進一步分析各個基因有助於進一步改進這個模型。a)軟骨形成潛能評分與組織學評分的關係圖1和表3描述了軟骨形成潛能評分和組織學評分之間的關係。表3:利用統計學方法總結出的組織學評分頻率表tableseeoriginaldocumentpage27除了頻率表以外，表3還顯示了軟骨形成潛能評分每一個數值的平均組織學評分。這個平均值在軟骨形成潛能評分-1到0之間明顯升高(從1.0到2.7)。這說明軟骨形成潛能評分^0的樣品被認為適於ACI。b)利用分類尺度進行數據分析"順序分類尺度"是指被賦予數值的類別只表示其次序的尺度被賦予的實際數字沒有其他意義。例如，本文的組織學尺度採用數值O、1、2、3。以順序分類尺度解釋這一數值意味著1好於0，但是並未說明好多少。然而，對於間隔尺度來說，實際數字被認為是有意義的，其中1好於0與2好於1的程度相同，等等。在計算表3所示的平均值時，已經作出了暗示性的假設，S卩，組織學評分可以按間隔尺度妥當地處理。尺度上的刻度越多，這種尺度就約容易被認為是間隔尺度。由13個數據點所代表的軟骨形成潛能評分相應地被作為間隔尺度處理。其他分析被列於表3的最後一列中，在此處組織學評分是按順序分類尺度處理的。在本文中，評分被合併成兩類，0或l(無軟骨或低纖維軟骨)和2或3(透明軟骨)，數據代表了觀察到組織學評分為2或3的可能性。在表3的最後兩列，題頭為"觀察到的"一列顯示的是這一類中樣品的每一個軟骨形成潛能評分的實際值(以及百評分)。在軟骨潛能評分-1到0之間這個數值也是升高的，說明了閾值切割點。對於這個分析來說，軟骨形成潛能評分被認為是順序分類尺度。c)利用間隔尺度進行數據分析當軟骨形成潛能評分按間隔尺度處理時，利用對數分析處理可以使觀察到的反應更平滑。該方法可預測處於理想分類(2或3)中的可能性。擬合值不會落到合理的範圍(0-100%)之外。這些擬合的數值顯示在表3的最後一列，說明了平滑後的效果。這些擬合的估值被認為可以提供更可靠的預測，與其他方法相比，任何一個給定的軟骨形成潛能評分更有機會得到2或3的組織學評分。對於-1的軟骨形成潛能評分來說，特別要注意的是擬合模型預測得到2或3的機會是41.5%，因此，這就提出了一個疑問，即，評分-l是否應該被接受。實施例3:各個標誌物的影響通過從新計算一組標誌物中5個標誌物而不是6個標誌物的表達模式來評估各個標誌物的影響，其中在實施例1中該組標誌物用於確定軟骨形成潛能評分。應用相同的評分系統，其中現在的評分範圍為-5至ij+5。數據列於表4到9中。表4:無標誌物COLll的組織學評分的頻率表tableseeoriginaldocumentpage29表5:無標誌物COL2的組織學評分的頻率表tableseeoriginaldocumentpage29tableseeoriginaldocumentpage30tableseeoriginaldocumentpage31下面表10的A部分說明了上述表4到9所列的每一個數據集、標誌物評分的閾值、有多少樣品可被明確地分類為可以形成低質量軟骨(在表10中，組織學評分0或1對應於"-")或高質量軟骨(組織學評分2或3對應於表10中的"+"0.標誌物評分與組織學評分之間無關的樣品被分類為""樣品。這些數據說明當省略COLll、C0L2或C0L11而只用含5個標誌物的一組時，可以獲得相同甚至更好的結果(即，被稱為""的樣品更少)。在表10的B部分中，甄別閾值很少受到限制。當一個標誌物評分處於所示範圍內時，6個樣品中至少有5個表現出標誌物評分和軟骨質量之間的相關性，標誌物評分的範圍假設是可以預測的。利用這種方法，省略COLll可以使結果更佳，而省略其他任何標誌物都會使結果變差，尤其是從實施例1的標誌物組中省去Co12或FGFR3。表10:包含5個標誌物的標誌物組的預測值tableseeoriginaldocumentpage32根據本發明的數據集及對數據的闡釋，好像一組標誌物的表達模式在預測體內軟骨形成中的能力在不含COL11時也可以獲得，無論如何闡釋。另一方面，省略ALK1或FRZB會導致標誌物的預測能力下降，無論如何闡釋本發明的數據集。實施例4:標誌物評分在篩選試驗中的應用利用累積標誌物評分進行軟骨細胞表現穩定性的評價在篩選試驗中加以驗證以鑑定能影響細胞在體內生成穩定軟骨的能力的化合物以及確定這種化合物對細胞的效應的性質。篩選試驗在96孔板上進行，其中接種10000到100000個獲自軟骨活檢組織的軟骨細胞(從P0到P5代細胞中新鮮分離)。待測化合物以不同的濃度和不同的時間加入。孵育以後收穫軟骨細胞，分離RNA並用反轉錄酶處理。按照TaqMan方法的指導進行定量PCR，按照實施例1所述的方法(CC評分)確定細胞的軟骨形成潛能評分。1.檢測能抵消單層培養物內的軟骨細胞去分化的分子化合物A是一個候選化合物，據預測具有軟骨保護效應和對軟骨細胞表型的穩定效應。測定累積標誌物評分，更具體的是實施例1的軟骨形成潛能評分，可用於確定這種化合物對軟骨細胞單層培養物的軟骨細胞表型穩定性的效應。a)軟骨細胞單層培養物軟骨細胞以4xl0"細胞/ml的濃度在T25培養瓶中進行單層培養。接種後將化合物A直接加到細胞上。完全培養基(DMEM+10%FBS)總體積為5ml。每一種條件(l或10pM化合物A，DMSO對照)用三個培養瓶。培養基和化合物每周更換一次。當細胞匯合後，用胰酶消化O代軟骨細胞(PO)，計數，重新接種2xlS細胞，為P1培養物。剩餘細胞放入裂解介質中提取RNA。Pl、P2和P3軟骨細胞培養物進行同樣的處理。TaqManRT-PCR用於確定軟骨細胞形成標誌物的表達。b)RNA分離，cDNA合成得單層培養物的軟骨細胞用PBS洗滌，用含1%巰基乙醇(恰根公司(Qiagen))的RLT緩衝液裂解。裂解的細胞儲存在-80。C備用。按照廠家的說明書用RNeasy微型試劑盒(恰根公司)純化mRNA。根據廠家(因維曲根公司(Invitrogen))的說明書用隨機六聚體引物合成cDNA。c)TaqMan實時聚合酶鏈式反應(RT-PCR)利用ABIprism7700序列檢測系統進行實時定量PCR(RT-PCR)。按照廠家的說明書利用MastermixqPCR試劑盒(尤金科技公司(Eurogentec))進行RT-PCR。用於TaqMan分析的引物和探針購自應用生物系統公司(AppliedBiosystems)或尤金科技公司。利用2顛^taCT(2DDCT)計算實時PCR數據，這些數據定義為根據內源性參照G3肌動蛋白)進行標準化後相對於校正標準的靶基因的量，在這種情況下校正標準是所選基因在對照條件(DMSO)下的表達水平。d)結果化合物A可影響幾個作為軟骨細胞的軟骨形成能力、表型穩定性和內穩態指示因子的分子標誌物的表達，能夠抵消單層培養物內的軟骨細胞在擴增期間軟骨形成潛能評分的下降(參見圖2)。因此，在lpM和l(^M的濃度下，PO和P3代軟骨細胞的軟骨形成潛能評分與未經化合物處理的軟骨細胞相當，甚至更高。在後一種情況下，P3與P0軟骨細胞相比累積標誌物評分下降。化合物A對軟骨細胞幾種細胞外基質組分的基因表達有正面影響。在較低濃度(lpM)而不是較高濃度(10pM)時，化合物A可誘導Co12和Colli基因轉錄子的表達(圖3)。化合物還可增強FGFR-3標誌物的表達，儘管這種升高沒有統計學意義。另外，兩種測試濃度的化合物A都可明顯抑制PDEF的表達(圖4)。在10pM時，添加化合物也能導致ALK1表達的下降(圖4)。在表達上調時，兩個標誌物與細胞的軟骨形成能力呈負相關關係，說明化合物A對軟骨細胞的軟骨形成潛能有正性的刺激效應，因而對軟骨形成也有正性刺激效應。2.篩選分子介導3D培養物中去分化的軟骨細胞再分化的能力篩選14種化合物增強藻酸鹽培養物內去分化的軟骨細胞再分化的能力。測定分子對不同分子標誌物表達的效應以及對累積標誌物評分(如實施例1所確定的軟骨形成潛能評分)的效應，用於評價化合物影響3D培養物中細胞的軟骨形成表型恢復的能力。a)藻酸鹽培養物內軟骨細胞的去分化單層培養物在完全培養基內擴增以後，用胰酶處理以釋放處於3代(P3)的取自5個OA患者(50-65歲)膝部的人軟骨細胞，計數並通過臺盼藍排出試驗測定其活力。軟骨細胞懸浮到2%藻酸鹽內，添加等量的HBSS。細胞懸液吸到10ml注射器內，然後通過24號針頭滴加到氯化鈣溶液中(每孔5滴，每孔的總細胞數為250000個)。用氯化鈉溶液洗滌，加入新鮮的完整培養基(DMEM+10%FBS)。培養4天以後，去掉上清液，加入含10pM化合物的新鮮培養基。在加入化合物4天後，去掉上清液，通過裂解將細胞釋放出來。製備mRNA禾口cDNA，利用TaqManRT-PCR測定COL2、COLll、FGR3、FRZB、ALK1、PEDF的表達，如實施例所述。b)結果表11總結了化合物對在藻酸鹽中培養的軟骨細胞內標誌物基因表達的相對上調或下調效應。效應與未用分子處理(但是含有對照DMSO)的軟骨細胞比較。結果代表相對於對照(軟骨細胞加DMSO)的平均表達水平(5個OA患者的平均值)。NS=無統計學意義；-=抑制；+=增強；#=與對照DMSO相比時p0.05。化合物的使用濃度為10pM。有幾種分子能以正性或負性方式影響各種標誌物基因的表達。只有兩種化合物(Cpd8和Cpd14)對累積標誌物評分(CC評分)有正面影響，說明這些化合物可增強/介導軟骨細胞的再分化。但是，只有Cpd14具有對每一個標誌物的理想效應，對BMP2或ALK1基因的表達沒有影響。這種化合物可用於在重新植入前刺激軟骨細胞在體外去分化，因此可誘導平衡向關節透明軟骨體內合成傾斜。表11.待測化合物對藻酸鹽培養物中生長的去分化的軟骨細胞表型調節因子表達的效應。tableseeoriginaldocumentpage35實施例5.檢測軟骨保護性化合物的體內效應對於實施例4中那些能明顯影響軟骨形成潛能評分的化合物來說，還要檢測其在體內對細胞的軟骨細胞表型穩定性的效應。為達到此目的，將細胞群與待測化合物或緩衝液接觸，孵育以後注射到裸鼠模型體內(參見上文)。評價每一個細胞群生成穩定透明軟骨的能力。結果顯示化合物對軟骨形成潛能評分的影響與對細胞群的軟骨形成潛能的影響相關。權利要求1.一種確定細胞群在體內生成穩定透明軟骨的能力的體外方法，該方法包括確定所述群體表達一組至少三個標誌物基因的水平，所述標誌物基因包括FRZB、ALK1以及選自下組的一個或多個標誌物基因PEDF、COL11、COL2、FGFR3、OPN、BMP-2和RASF-PLA。2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述細胞群與化合物或條件接觸。3.如權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，該方法包括以下步驟-使細胞群與化合物或條件接觸，以及-確定所述細胞群表達一組至少三個標誌物基因的水平，其中這一組標誌物基因包括FRZB、ALK1以及選自下組的一個或多個標誌物基因PEDF、COLll、COL2、FGFR3、OPN、BMP誦2和RASF-PLA。4.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，該方法包括以下步驟-在所述接觸步驟前確定所述這組至少三個標誌物基因在所述細胞群內的表達水平，以及-在所述接觸步驟後，確定化合物或條件是否能夠影響所述這組至少三個標誌物基因中的一個或多個的表達。5.如權利要求1-4中任一項所述的方法，其特徵在於，所述至少三個標誌物的一組是至少4、5或6個標誌物基因的一組，其中包含FRZB、ALK1以及選自下組的2、3和4個標誌物基因PEDF、COLll、COL2禾QFGFR3。6.如權利要求1-5中任一項所述的方法，其特徵在於，所述至少三個標誌物的一組是包括FRZB、ALK1、PEDF、COLll、COL2和FGFR3在內的至少6個標誌物基因的一組。7.如權利要求3或4所述的方法，其特徵在於，該方法還包括根據化合物的存在對一組至少三個標誌物基因的表達的影響來確定化合物對細胞群在體內生成穩定透明軟骨的能力的影響能力。8.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，能增強選自FRZB、COLll、COL2、FGFR3、OPN、BMP-2或RASF-PLA中一個或多個正標誌物基因的表達的化合物被鑑定為對軟骨形成有正面影響，能增強PEDF和/或ALK-1表達水平的化合物被鑑定為對軟骨形成有負面影響。9.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，化合物或條件影響軟骨形成的能力根據化合物或條件對選自FRZB、COLll、COL2、FGFR3、OPN、BMP-2或RASF-PLA的一個或多個正標誌物基因以及負標誌物基因PEDF和/或ALK-1的表達的累積效應而定。10.如權利要求1-9中任一項所述的方法，其特徵在於，所述細胞群獲自關節。11.如權利要求1-10中任一項所述的方法，其特徵在於，所述細胞群獲自健康供者。12.如權利要求1-10中任一項所述的方法，其特徵在於，所述細胞群獲自患有骨軟骨缺損的個體。13.如權利要求1-12中任一項所述的方法，其特徵在於，其中一組標誌物中標誌物的表達水平利用定量方法確定。14.一組標誌物在鑑定能夠影響細胞在體外生成軟骨的能力的化合物中的應用，其特徵在於，這組標誌物包含一組至少三個標誌物基因，其中包括FRZB、ALK1以及選自PEDF、COLll、COL2、FGFR3、OPN、BMP-2或RASF國PLA的一個或多個標誌物。15.如權利要求14所述的應用，其特徵在於，所述標誌物組包含至少6個標誌物，其中包括FRZB、ALK1、PEDF、COLll、COL2禾口FGFR3。16.—種試劑盒，該試劑盒包含用於檢測一組基因在軟骨形成細胞內的表達的探針，所述這組基因包括一組至少三個標誌物基因，其中包括FRZB、ALK1以及選自PEDF、COLll、COL2、FGFR3、OPN、BMP-2或RASF-PLA的一個或多個標誌物。17.如權利要求16所述的試劑盒，其特徵在於，所述一組至少三個標誌物基因包括FRZB、ALK1、PEDF、COLll、COL2和FGFR3。18.如權利要求16所述的試劑盒，其特徵在於，所述用於檢測至少一個標誌物基因的探針是與mRNA雜交的寡核苷酸。19.如權利要求16所述的試劑盒，其特徵在於，所述用於檢測至少一個標誌物基因的探針是抗體。20.如權利要求16所述的試劑盒，其特徵在於，所述用於檢測至少一個標誌物基因的探針是PCR引物組。21.如權利要求16-20中任一項所述的試劑盒，其特徵在於，所述探針是經過標記的。22.—種用於檢測一組基因在軟骨形成細胞內的表達的裝置，所述裝置包括用於檢測標誌物基因表達的一個或多個下列單元，標誌物基因包括一組至少三個標誌物基因，其中包括FRZB、ALK1以及選自PEDF、COLll、COL2、FGFR3、OPN、BMP-2或RASF-PLA的一個或多個標誌物。全文摘要本發明涉及可用於預測細胞群在植入到體內時形成軟骨的潛能的一組基因。標誌物組尤其被用於細胞的質量控制以及用於評價化合物和條件對細胞軟骨形成能力的影響的篩選試驗。文檔編號A61K49/00GK101616693SQ200780043440公開日2009年12月30日申請日期2007年11月23日優先權日2006年11月24日發明者C·德巴裡,F·盧伊頓,F·德裡'阿斯科申請人:泰根尼克斯股份有限公司