Pcr擴增、雜交同步法的製作方法
2023-05-04 18:06:16 1
專利名稱：Pcr擴增、雜交同步法的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種PCR技術，具體地說涉及一種可以把PCR的擴增和產物檢測二步合為一步的方法。
目前在中國市場上所使用的同類TaqmanR技術是一種把PCR擴增和檢測二步合為一的方法，這種方法操作比較簡便，但其靈敏僅104copy/ml，又必需使用可以做「即時法」的PCR儀，約要花60萬人民幣購買此類設備，其配套的易耗物品也比較昂貴，又沒有自主的智慧財產權。為了使PCR技術在商業上的應用能越來越廣泛，發展一種更經濟、有效的方法將適應我國廣大人民的基本需求，並覆蓋普及到全國各地，達到低廉收費、優質服務的目標。
本發明的目的是提供一種可以把PCR擴增和產物檢測二步合為一步的方法。由於本發明具有成本較低、靈敏度高、特異性強、操作簡便等特點，將對臨床檢測、用血安全、抗藥性和單核苷酸多態性(SNP)等方面的測定帶來革命性的變化。
本發明的目的是這樣實現的一種PCR擴增、雜交同步法，它選自於下列方法之一通用捕集測定法或固相引物測定法。
其中通用捕集測定法包括a)將通用捕集探針包被到微孔板上；b)在上述條板中，每孔加入1體積的2×PCR主反應液，再加入1體積的樣品液進行常規PCR反應；c)PCR完成後，加入含接頭分子的變性液5-10μl；d)在同一孔中繼續加入雜交液100μl，37℃保溫1小時；e)洗板、酶聯、第二次洗板、顯色、測定；f)判讀。
其中步驟C中所述接頭液分子為接頭液分子為a)B型肝炎病毒接頭液分子；或b)C型肝炎病毒接頭液分子；或c)丙種球蛋白接頭液分子；或d)愛滋病毒接頭液分子；或e)結核菌接頭液分子；或f)沙眼衣原體接頭液分子；或其它病原體接頭液分子，其接頭液分子的結構為一條單鏈的寡核苷酸，分別由長2 5個鹼基的通用的部分、長5到4毫微米的「空間」部分及約22-26個鹼基的特異性部分構成，其特異性部分為只能與帶有乙型肝為病毒PCR產物起雜交反應的B型肝炎病毒特異性順序、或與帶有C型肝炎病毒PCR產物起雜交反應的C型肝炎病毒特異性順序、或與帶有丙種球蛋白PCR產物起雜交反應的丙種球蛋白特異性順序，或與帶有愛滋病毒PCR產物起雜交反應的愛滋病毒特異性順序、或與帶有結核菌PCR產物起雜交反應的結核菌特異性順序、或與帶有沙眼衣原體PCR產物起雜交反應的沙眼衣原體特異性順序或與任一種待測的特異性順序；上述接頭分子的結構為一條單鏈的寡核苷酸，其長度在50到60個鹼基對左右，通過PE公司的392型DNA合成儀，採用固相亞磷酸三脂法進行DNA合成。它包括三個組成部分(1).通用部分通用部分共長25個鹼基，恰好和固定在磁粉或微量板上的通用探針互補，能很快地與通用探針雜交；(2).「空間」介於通用部分和特異部分之間，為了留出「空間」給二個分子形夾心式的雜交鏈，我們的「空間」長度是5至4nm；(3).特異性部分特異性部分緊接著「空間」，約為22-26個鹼基。它的長短是由它本身的G/C％，Tm是否與通用部分配合所決定的，也決定於它自身是否有二級級構，它的順序是選用在PCR產物，介於一對引物的中間順序，因而只能和PCR的產物雜交而與生物素標記的引物無反應，所以保證了該部分雜交的特異性；接頭液的分子結構 1)其中通用部分長25個鹼基對，其順序或用人為排列的(dA)25或5』-ACg，Acg，gAA，cgA，AAc ggA，Acg，Acgg-3』或從pBlue KS-質粒順序中選取一段順序。pBlue KS-質粒順序已發表在Short，J.et al(1988)NucleicAcids Research 16(15)7583具體順序為3』-CCg，AgA，TAg，ggT，TgA，TTg，TTCC-5』2)空間由二個空間分子(spacer-phosphoramidite)組成，每個空間為18個碳原子組成的一個長臂，可以在DNA合成儀上加入到接頭分子中；
具體結構為 (已發表在Nelson、P、et、(1989)Nucleic Acids Res。177187)3)特異性部分都選自各待測病原體核酸的全序列中，HBV，HCV，HIV，TB，CT，β-globin等都可在「基因文庫」中查找出來。例它們的具體結構為(1)HBV 5』-TAAAGAGAGGTGCGCCCCGTGGTC-3』(2)HCV 5』-AGCCATAGTGGTCTGCGAAC-3』(3)HIV 5』-GTTAAAAGAGACCATCAATGAGGAA-3』(4)TB 5』-GCGCTTTAGCGGTGTGGGATGA-3』(5)CT 5』-GATGAAAGACAGGAAATACGCAGA-3』(6)丙種球蛋白5』-ACTTTCTTGCCATGAGCCTTCACCT-3』其中步驟a所述的通用捕集探針為其通用部分。
其中步驟b)的PCR主反應液氯化鉀200mM、三羥甲基氨基甲烷40mM，Taq DNA聚合酶0.5/10ul，尿嘧啶糖基化酶(UNG)1U/10ul、dNTP0.5mM、引物40μg/ml；樣品液製備過程如下取50μl裂解液加入50μl待測血清，37℃保溫1小時，加入100ul樣品中和液(主要成分Tris)混勻後用樣品稀釋液(主要成分二價Mg離子和魚精DNA載體分子)稀釋5倍。
其中步驟C)的變性液為0.5M NaOH溶液，步驟d的雜交液為0.9MNaCL檸檬酸緩衝液。
其中步驟C)中測定可用可見光、螢光或化學發光進行檢測。
其中固相引物測定法包括a)在耐熱且透明的反應孔表面包被特異於待測病毒體的DNA引物(寡核苷酸，長度為20到30個核苷酸)；b)在上述反應孔中加入1體積(10ul-20ul)的2×PCR主反應液和1體積的樣品液，進行固相引物PCR反應；c)PCR完成後，洗板、酶聯、第二次洗板，顯色測定，測定方法可用可見、螢光或化學發光檢測；d)判讀。
其中步驟b)的PCR主反應液為
KCL 200mM，Tris 40mM，Taq DNA聚合酸0.5單位/10ulHK-UNG 0.1單位/10ul，dUTP 0.5mM，生物素標記的引物400ng/10ul；樣品液的製備如下取50ul裂解液，加入50ul待測血清，37℃保溫1小時，加入100ul樣品中和液(主要成分Tris)混勻後用樣品稀釋液稀釋5倍。
PCR擴增/雜交同步法可以選用下面二種方式之一來實現一.通用捕集法a)在耐熱(可加熱到120℃不變型)且透明的反應孔表面(8×12，96孔微量板，原料可以用納米聚苯乙烯或polycarbonate等)包被通用捕集探針。
b)在上述反應孔中加入1體積(10ul至20ul)2×PCR的主反應液和1體積樣品液進行常規PCR反應；c)PCR反應完成後，加入含接頭分子的變性液5-10ul同時使PCR產物雙鏈DNA分子變性為單鏈分子，d)在同一孔中繼續加入雜交液100ul，37℃保溫1小時，e)洗板、酶聯、第二次洗板、顯色、測定。測定所使用的方法除可見光以外，還可適用於螢光或化學發光檢測。
在上述步驟c)中接頭液分子為a)B型肝炎病毒接頭液分子；或b)C型肝炎病毒接頭液分子；或c)丙種球蛋白接頭液分子；或d)愛滋病毒接頭液分子；或e)結核菌接頭液分子；或f)沙眼衣原體接頭液分子；或其它病原體接頭液分子，其接頭液分子的結構為一條單鏈的寡核苷酸，分別由長25個鹼基的通用的部分、長5到4毫微米的「空間」部分及約22-26個鹼基的特異性部分構成，其特異性部分為只能與帶有乙型肝為病毒PCR產物起雜交反應的B型肝炎病毒特異性順序、或與帶有C型肝炎病毒PCR產物起雜交反應的C型肝炎病毒特異性順序、或與帶有丙種球蛋白PCR產物起雜交反應的丙種球蛋白特異性順序，或與帶有愛滋病毒PCR產物起雜交反應的愛滋病毒特異性順序、或與帶有結核菌PCR產物起雜交反應的結核菌特異性順序、或與帶有沙眼衣原體PCR產物起雜交反應的沙眼衣原體特異性順序或與任一種待測的特異性順序；上述接頭分子的結構為一條單鏈的寡核苷酸，其長度在50到60個鹼基對左右，通過PE公司的392型DNA合成儀，採用固相亞磷酸三脂法進行DNA合成。它包括三個組成部分1.通用部分通用部分共長25個鹼基，恰好和固定在磁粉或微量板上的通用探針互補，能很快地與通用探針雜交。
2.「空間」介於通用部分和特異部分之間，為了留出「空間」給二個分子形夾心式的雜交鏈，我們的「空間」長度是5至4nm。
3.特異性部分特異性部分緊接著「空間」，約為22-26個鹼基。它的長短是由它本身的G/C％，Tm是否與通用部分配合所決定的，也決定於它自身是否有二級級構，它的順序是選用在PCR產物，介於一對引物的中間順序，因而只能和PCR的產物雜交而與生物素標記的引物無反應，所以保證了該部分雜交的特異性。
接頭液的分子結構 1)其中通用部分長25個鹼基對，其順序或用人為排列的(dA)25或5』-ACg，Acg，gAA，cgA，AAc ggA，Acg，Acgg-3』或從pBlue KS-質粒順序中選取一段順序。pBlue KS-質粒順序已發表在Short，J.et al(1988)NucleicAcids Research 16(15)7583具體順序為3』-CCg，AgA，TAg，ggT，TgA，TTg，TTCC-5』2)空間由二個空間分子(spacer-phosphoramidite)組成，每個空間為18個碳原子組成的一個長臂，可以在DNA合成儀上加入到接頭分子中。
具體結構為 (已發表在Nelson、P、et、(1989)Nucleic Acids Res。177187)3)特異性部分都選自各待測病原體核酸的全序列中，HBV，HCV，HIV，TB，CT，β-globin等都可在「基因文庫」中查找出來。例它們的具體結構為(1)HBV 5』-TAAAGAGAGGTGCGCCCCGTGGTC-3』(2)HCV 5』-AGCCATAGTGGTCTGCGAAC-3』(3)HIV 5』-GTTAAAAGAGACCATCAATGAGGAA-3』
(4)TB 5』-GCGCTTTAGCGGTGTGGGATGA-3』(5)CT 5』-GATGAAAGACAGGAAATACGCAGA-3』(6)丙種球蛋白5』-ACTTTCTTGCCATGAGCCTTCACCT-3』通用捕集孔為具有活性基團的聚苯乙烯微孔板，其活性基團與接頭液分子的通用部分(即通用捕集探針)的互補寡核苷酸共價鍵地聯接固下；雜交液為0.9M NaCl檸檬酸緩衝液，使變性後的PCR產物或接頭分子液加入孔中後雜交反應的PH值維持在最適範圍內，它的離子濃度和保持溫度恰好與形成的二種雜交鏈(即通用雜交鏈和特異性雜交鏈)的Tm(融點溫度)配合而使雜交效率維持在一個穩定的水平上；變性液為0.2M NaOH溶液。
步驟a)中的通用捕集探針為接頭分子的通用部分。
固相引物法a)在耐熱且透明的反應孔表面包被特異性的DNA引物(寡核苷酸，長度為20到30個核苷酸)。利用該固相化的引物來進行PCR擴增反應，使PCR產物中的一條鏈直接固化在反應孔壁上。該鏈就可作為被擴增另一條互補鏈的模板。在將PCR產物變性後的條件下，又可作為被擴增另一條互補鏈的捕集探針，例B型肝炎下遊引物5』-ccaataccacatcatccac-3』b)在上述反應孔中加入1體積(10ul-20ul)的2×PCR主反應液和1體積的樣品液，進行固相引物PCR反應(另一個帶生物素的引物存在於PCR主反應液中)，c)PCR完成後，進行洗板、酶聯、洗板、顯色測定與方法一所述相同，但測定用方法除可見光外還適用於螢光或化學發光檢測。
下面結合實施例對本發明作進一步說明。實施例1通用捕集法對HBV PCR定性測定1)包被通用捕集探針到8×12微孔板上2)在上述板中，每孔加入10ul HBV2×PCR主反應液KCl 200mM，Tris 40mM，Taq DNA聚合酶0.5單位/10ul，HK-UNG 0.1單位/10ul，dUTP 0.5mM，HBV引物每種40ug/ml。
再加入10ul樣品液，樣品液製備過程如下取50ul裂解液(主要成份NaOH)加入50ul待測血清，37℃保溫1小時，加入100ul樣品中和液(主要成份Tris)混勻後用樣品稀釋液(主要成份二價Mg離子和魚精DNA載體分子)稀釋5倍，即為製備完成的樣品液。
其中裂解液的製備如下稱取一定量的氫氧化鈉(NaOH)和疊氮鈉(NaN3)，溶於超濾水，氫氧化鈉的終溶度為0.5Mol/L，疊氮鈉的終溶度為0.05％。
樣品中和液的配方的製備如下稱取一定量的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tirs.HCL)和疊氮鈉(NaN3)，溶於超濾水，三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽的終溶度為0.5Mol/L，疊氮鈉的終溶度為0.05％。
樣品稀釋液的配方的製備如下稱取一定量的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tirs.HCL)和疊氮鈉(NaN3)，溶解後量入一定量的DNA，氯化鎂(MgCL2)，三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽的終溶度10nMol/L，疊氮鈉的終溶度為0.05％。DNA終溶度為2微克/毫升，氯化鎂終溶度為2.5mMol/L。
3)PCR完成後加溶入變性液(成份0.5M NaOH溶液)中的HBV接頭液5ul(內含HBV接頭分子20ng)，再加入雜交液100ul(0.9M MaCL檸檬酸緩衝液)37℃保溫1小時。
4)洗板、酶聯、第二次洗板和顯色，測定，測定方法除可見光外還可適用螢光或化學發光法。
5)判讀從待測樣品光密度讀數減去本底，判別檢測結果。步驟(4)中洗板用洗滌液對孔中反應產物進行洗滌5次，每次用量300微升，然後棄去洗滌液；酶聯取50毫微克/毫升的酶聯液100微升加入到上述孔中，37℃保溫15分鐘進行酶聯反應；第二次洗板用洗滌液對孔中反應產物進行洗滌5次，每次用量300微升，然後棄去洗滌液；顯色孔中加入顯色液100微升，25℃保持10分鐘後加入停顯液100微升；測定上述樣品移至在波長450毫微米的酶標儀上測定光密度數。
判別測得光密度數與內對照物光密度數參比，判別檢測結果。
其中洗滌液為0.15MNaCL溶液，其鹽濃度對維護雜交鏈起了保護作用有效地洗去非特異性的吸附，保證了雜交反應的特異性；酶聯液為過氧化酶和親和素的交聯物；顯色液為四甲基聯苯胺與過氧化氫的重量比1∶1混合液。
停顯液為5％硫酸溶液。
本發明中所述的試劑、儀器均由國內生產廠家提供，如上海生工物工程公司、上海浩源生物科技術有限公司及化工化學試劑商店。實施例2 固相引物模式HBV YMDD變異株的測定1)包被PCR下遊引物5』-ccaataccacatcatccac-3』到8×12微孔板上。
2)在上述條板中，每孔加入10ul YMDD2×PCR主反應液(KCL200mM，Tris 40mM，Taq DNA聚合酶0.5單位/10ul，HK-UNG0.1單位/10ul，dUTP 0.5mM，生物素標記的YMDD的上遊引物400ng/10ul)YMDD的上遊引物5』-CCTCAGTCCGTTTCTCA-3』17個鹼基再加入10ul樣品液。
樣品液製備過程如下取50ul裂解液(同實施例1)加入50ul待測血清，37℃保溫1小時，加入100ul樣品中和液(同實施例1)混勻後用樣品稀釋液(同實施例1)稀釋5倍，即為製備完成的樣品液。
混合後進行常規PCR。
3)PCR完成後可直接洗板，再進行酶聯、第二次洗板和顯色、測定，各步步驟及溶液配方和實施例1所述相同，但測定方法除可見光外可適用螢光或化學發光。
4)判讀從待測樣品光密度讀數減去本底，當該數值大於本底2.5倍時可判讀為HBV YMDD變異株陽性結果。
現將上述實施例數據列入下表中
參考文獻
1)蔡劍平、楊振華″人類基因組單核苷酸多態性研究對未來檢驗醫學的影響″臨床檢驗信息導報2000年第4期第3頁。
2)Newton et.al.″Analysis of any point mutation in DNA″TheAmplification Refractroy Mutation Systen(ARMS)Nucleic AcidsRes.1989 17(7)2503-2516.
3)Allen et.al.″Identofication and Characterization ofMutations in Hepatitis B Virus Resistant toLamivudine″Hepatology 1998 27(6)1670-1677.
權利要求
1.一種PCR擴增、雜交同步法，它選自於下列方法之一通用捕集測定法或固相引物測定法。
2.根據權利要求1所述的方法，其中通用捕集測定法包括a)將通用捕集探針包被到微孔板上；b)在上述條板中，每孔加入1體積的2×PCR主反應液，再加入1體積的樣品液進行常規PCR反應；c)PCR完成後，加入含接頭分子的變性液5-10μl；d)在同一孔中繼續加入雜交液100μl，37℃保溫1小時；e)洗板、酶聯、第二次洗板、顯色、測定；f)判讀。
3.根據權利要求1所述的測定法，其中步驟C中所述在含接頭液分子的變性液中接頭液分子為a)B型肝炎病毒接頭液分子；或b)C型肝炎病毒接頭液分子；或c)丙種球蛋白接頭液分子；或d)愛滋病毒接頭液分子；或e)結核菌接頭液分子；或f)沙眼衣原體接頭液分子；或其它病原體接頭液分子，其接頭液分子的結構為一條單鏈的寡核苷酸，分別由長25個鹼基的通用的部分、長5到4毫微米的「空間」部分及約22-26個鹼基的特異性部分構成，其特異性部分為只能與帶有乙型肝為病毒PCR產物起雜交反應的B型肝炎病毒特異性順序、或與帶有C型肝炎病毒PCR產物起雜交反應的C型肝炎病毒特異性順序、或與帶有丙種球蛋白PCR產物起雜交反應的丙種球蛋白特異性順序，或與帶有愛滋病毒PCR產物起雜交反應的愛滋病毒特異性順序、或與帶有結核菌PCR產物起雜交反應的結核菌特異性順序、或與帶有沙眼衣原體PCR產物起雜交反應的沙眼衣原體特異性順序或與任一種待測的特異性順序；上述接頭分子的結構為一條單鏈的寡核苷酸，其長度在50到60個鹼基對左右，通過PE公司的392型DNA合成儀，採用固相亞磷酸三脂法進行DNA合成；它包括三個組成部分(1).通用部分通用部分共長25個鹼基，恰好和固定在磁粉或微量板上的通用探針互補，能很快地與通用探針雜交；(2).「空間」介於通用部分和特異部分之間，為了留出「空間」給二個分子形夾心式的雜交鏈，我們的「空間」長度是5至4nm；(3).特異性部分特異性部分緊接著「空間」，約為22-26個鹼基。它的長短是由它本身的G/C％，Tm是否與通用部分配合所決定的，也決定於它自身是否有二級級構，它的順序是選用在PCR產物，介於一對引物的中間順序，因而只能和PCR的產物雜交而與生物素標記的引物無反應，所以保證了該部分雜交的特異性；接頭液的分子結構 1)其中通用部分長25個鹼基對，其順序或用人為排列的(dA)25或5』-ACg，Acg，gAA，cgA，AAc ggA，Acg，Acgg-3』或從pBlue KS-質粒順序中選取一段順序；pBlue KS-質粒順序已發表在Short，J.et al(1988)NucleicAcids Research 16(15)7583具體順序為3』-CCg，AgA，TAg，ggT，TgA，TTg，TTCC-5』2)空間由二個空間分子(spacer-phosphoramidite)組成，每個空間為18個碳原子組成的一個長臂，可以在DNA合成儀上加入到接頭分子中；具體結構為 (已發表在Nelson、P、et、(1989)Nucleic Acids Res。177187)3)特異性部分都選自各待測病原體核酸的全序列中，HBV，HCV，HIV，TB，CT，β-globin等都可在「基因文庫」中查找出來；例它們的具體結構為(1)HBV 5』-TAAAGAGAGGTGCGCCCCGTGGTC-3』(2)HCV 5』-AGCCATAGTGGTCTGCGAAC-3』(3)HIV 5』-GTTAAAAGAGACCATCAATGAGGAA-3』(4)TB 5』-GCGCTTTAGCGGTGTGGGATGA-3』(5)CT 5』-GATGAAAGACAGGAAATACGCAGA-3』(6)丙種球蛋白5』-ACTTTCTTGCCATGAGCCTTCACCT-3』其中步驟a所述的通用捕集探針為其通用部分。
4.根據權利要求2所述的方法，其中步驟b)的PCR主反應液氯化鉀200mM、三羥甲基氨基甲烷40mM，Taq DNA聚合酶0.5/10ul，尿嘧啶糖基化酶(UNG)1U/10ul、dNTP0.5mM、引物40μg/ml；樣品液(HBV)製備過程如下取50μl裂解液加入50μl待測血清，37℃保溫1小時，加入100ul樣品中和液(主要成分Tris)混勻後用樣品稀釋液(主要成分二價Mg離子和魚精DNA載體分子)稀釋5倍。
5.根據權利要求2所述的方法，其中步驟C)的變性液為0.5M NaOH溶液，步驟d的雜交液為0.9M NaCL檸檬酸緩衝液。
6.根據權利要求2所述的方法，其中步驟C)中測定可用可見光、螢光或化學發光進行檢測。
7.根據權利要求1所述的方法，其中固相引物測定法包括a)在耐熱且透明的反應孔表面包被特異於待測病毒體的DNA引物(寡核苷酸，長度為20到30個核苷酸)；b)在上述反應孔中加入1體積(10ul-20ul)的2×PCR主反應液和1體積的樣品液，進行固相引物PCR反應；c)PCR完成後，洗板、酶聯、第二次洗板，顯色測定，測定方法可用可見、螢光或化學發光檢測；d)判讀。
8.根據權利要求7所述的方法，其中步驟b)的PCR主反應液為KCL 200mM，Tris 40mM，Taq DNA聚合酸0.5單位/10ulHK-UNG 0.1單位/10ul，dUTP 0.5mM，生物素標記的引物400ng/10ul；樣品液(HBV)的製備如下取50ul裂解液，加入50ul待測血清，37℃保溫1小時，加入100ul樣品中和液(主要成分Tris)混勻後用樣品稀釋液稀釋5倍。
全文摘要
本發明公開了一種將PCR對核酸(DNA或RNA)擴增以及擴增產物的檢測合為一步的方法，包括固相化引物的PCR反應技術和洗板、顯色(或螢光)終點測定三個步驟，大大減少了試劑消耗及檢測時間，使整個檢測能在3－4小時內完成，靈敏度也達到10
文檔編號C12Q1/68GK1398984SQ0112350
公開日2003年2月26日 申請日期2001年7月26日 優先權日2001年7月26日
發明者黃道培 申請人:黃道培