一種去除疫苗中宿主dna的方法
2023-05-05 03:06:06
一種去除疫苗中宿主dna的方法
【專利摘要】本發明公開了一種去除疫苗中宿主DNA的方法，包括調整病毒感染的宿主細胞上清濃縮液的pH值和鹽濃度，使pH值在pH?6~8之間，鹽濃度在0.2~0.5mol/L之間；使調整後的宿主細胞上清濃縮液與陰離子交換介質充分接觸。採用本發明所述方法處理後，病毒量檢測結果顯示細胞培養上清濃縮液中檢測的病毒量至少是處理前的60%，上清濃縮液中DNA的去除率在99%以上，最終的純化病毒液製備凍幹疫苗檢測到宿主DNA殘留量不高於10pg，完全符合疫苗中宿主DNA殘留量標準，具有良好的工業應用前景。
【專利說明】一種去除疫苗中宿主DNA的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物醫藥領域，特別涉及一種疫苗中宿主DNA的去除方法。
【背景技術】
[0002]狂犬病是一種由狂犬病病毒引起的人畜共患疾病，在全球分布廣泛，每年死於狂犬病的人數超過5.5萬人，其中約95%發生在亞洲和非洲。大多數死亡事件均是被狂犬病毒感染的狗咬傷所致，受害者中30%~60%為15歲以下兒童。狂犬病的預防和治療通常採用狂犬病疫苗。
[0003]在狂犬疫苗生產中，經病毒感染的細胞培養上清液中含有目標物狂犬病毒，而且還有宿主細胞碎片和蛋白以及宿主DNA。另外，還有細胞培養基組份。這些雜質都是需要去除的。其中，以傳代細胞製備狂犬疫苗安全性的關鍵是細胞殘餘DNA的含量。中國藥典規定狂犬疫苗(Veix)細胞)的宿主DNA殘留量不得高於IOOpg/劑。
[0004]傳統的狂犬病毒純化路線主要採用超濾濃縮和凝膠過濾色譜法。其中，凝膠過濾色譜法是目前最有效的純化方法，但是該方法的純化效果並不能滿足狂犬疫苗製品新的國家標準IOOpg/劑的要求，主要原因是凝膠過濾色譜法是根據生物分子量大小進行分離的，而病毒與宿主DNA的分子量不相上下，不能在凝膠介質中被有效分離。
[0005]此外，採用在病毒收穫液中添加硫酸魚精蛋白的方法去除DNA，原理是硫酸魚精蛋白可以與DNA結合，結合物容易沉澱，使用離心的方法能有效去除DNA。但是同時魚精蛋白也與病毒結合，病毒損失嚴重，通常回收率只有25-30%。
[0006]此外，在超濾濃縮後加入核酸酶處理步驟，經過酶切以後的DNA變成了小片段，然後再經過凝膠過濾色譜步驟，使大部分DNA和病毒分離開。但是由於核酸酶的作用受環境條件限制，不能完全發揮效果，仍有極小一部分DNA不能和病毒分開，最終DNA殘留量還停留在納克(ng)級水平。結果只是接近國家標準，仍然很難達到合格水平。
[0007]近幾年，在狂犬病毒的純化過程中引入了離子交換色譜步驟，首先是陰離子交換色譜，讓DNA和病毒一起被吸附在介質上，然後控制條件僅對病毒洗脫，能夠使病毒液中DNA的殘留量降低至500pg/ml，但是病毒量的回收率只有大約20%。
[0008]CN102282253A公開了一種狂犬病病毒純化方法，使用一步陽離子交換色譜法能夠使DNA的去除率達到95%以上，而病毒回收率在70%以上。所述的陽離子交換介質是MERCK公司的產品Fractogel EMD S03_，結合後續的核酸酶處理步驟和超速離心純化步驟，最終得到的病毒液配製成的狂犬疫苗，在含有2.5IU有效劑量裡DNA殘留量小於20pg。整個純化過程病毒回收率在50%左右。然而，CN102282253A公開的狂犬病病毒純化工藝過於複雜，生產成本高。
[0009]CN102282253A公開了採用離子交換色譜純化狂犬病病毒的工藝，先將被病毒感染的細胞的培養物的上清液與陽離子交換色譜擔體接觸，以便讓狂犬病毒結合在擔體上，隨後從擔體上洗脫該病毒。這樣的工藝流程主要是為了去除病毒液中的宿主DNA殘留，但是由於病毒先吸附再洗脫的做法使得病毒量損失較大。而且病毒和宿主DNA都吸附在擔體上，先後洗脫病毒和DNA的做法也導致了 DNA去除不徹底的後果。
[0010]因此開發一種既能有效去除DNA殘留從而達到國家藥典標準又能提高病毒回收率的純化工藝非常重要。
【發明內容】
[0011]本發明的目的在於提供一種去除疫苗中宿主DNA的方法，包括:
[0012]步驟I)調整病毒感染的宿主細胞上清濃縮液的pH值和鹽濃度，使pH值在6~8之間，鹽濃度在0.2^0.5mol/L之間；
[0013]步驟2)使調整後的宿主細胞上清濃縮液與陰離子交換介質充分接觸。
[0014]細胞培養上清濃縮液在與介質接觸之前要進行澄清和濃縮，調整後的上清濃縮液pH值在6~8之間，鹽濃度在0.2^0.5mol/L之間。上清濃縮液pH值優選在廣8之間，進一步優選在7~7.8之間；鹽濃度優選0.3~0.5mol/L。
[0015]pH值的區間是狂犬病毒的活性耐受區間，越過這個區間病毒生物活性會受到很大影響。鹽濃度區間則是病毒回收和DNA去除的優選區間，當鹽濃度低於0.2M/L時，病毒的回收率只有8% ;而當鹽濃度高於0.5M/L時，DNA的去除率下降到70%。
[0016]陰離子交換色譜介質選自偶聯二乙胺基乙基(DEAE)、季銨鹽(Q)為配基的瓊脂糖微球或者是其他具有陰離子效果的介質。本發明採用的陰離子交換層析並不需要依賴特定的填料，任何具有陰離子效果的介質都可以運用到本發明的工藝中。
[0017]在本發明的實施例中米用了 Q Sepharose FF和DEAE Sepharose FF這兩種為最普遍的因離子交換色譜介質。Q Sepharose FF為強陰離子交換介質，DEAE Sepharose FF是弱陰離子介質，兩者均可用於本發明的工藝中而且去除宿主DNA效果良好。
[0018]在本發明的【具體實施方式】中，所述宿主細胞為Veix)細胞，所選用疫苗為狂犬疫苗。
[0019]Vero細胞是一種理想的疫苗生產基質:遺傳背景清楚，核型穩定，無外源因子汙染，160代以內沒有致瘤性，適合大規模培養，可用生物反應器生產，保證了疫苗大批量細胞的均質性和安全性。目前用VeiO細胞作為宿主細胞開發、研究和生產的疫苗包括但不限於狂犬疫苗、流感疫苗、出血熱疫苗、A肝疫苗、乙腦疫苗、輪狀病毒疫苗、SARS疫苗等等。
[0020]CHO細胞與VeiO細胞被WHO是經中國藥品監督管理局認可，用於生物製品的生產的傳代細胞。本領域技術人員理解，所述疫苗包括但不限於狂犬疫苗、脊髓灰質炎疫苗、乙腦疫苗、A肝疫苗、出血熱疫苗、流感疫苗、SARS疫苗或輪狀病毒疫苗，所述宿主細胞包括但不限於CHO細胞與VeiO細胞，利用本發明所述方法處理，調整病毒感染的宿主細胞上清濃縮液的PH值和鹽濃度，使pH值在6~8之間，鹽濃度在0.2^0.5mol/L之間；使調整後的宿主細胞上清濃縮液與陰離子交換介質充分接觸，均可達到去除疫苗中宿主DNA的目的。
[0021]採用本發明所述方法處理後，細胞培養上清濃縮液中檢測的病毒量至少是處理前的60%，優選至少是處理前的80%以上，病毒量檢測是採用ELISA方法對病毒的G蛋白組分做的檢測。
[0022]接觸介質後上清濃縮液中DNA的去除率在99%以上，優選99.5%以上，更優選99.9%以上，DNA檢測採用斑點雜交法。
[0023]所述狂犬疫苗宿主DNA的去除方法，在陰離子交換色譜步驟之後優選還包含核酸內切酶處理步驟。核酸內切酶可以選自Benzonase等品牌的內切酶。
[0024]酶切後的病毒液經過凝膠過濾層析純化，收集含有病毒成分的純化吸收峰，凝膠過濾介質是4-6%交聯度的瓊脂糖微球。凝膠過濾層析純化液中檢測的病毒量是層析前的78%以上，有的高達95%以上。凝膠過濾層析純化液中宿主DNA殘留量小於40pg/ml。
[0025]上述方法得到的純化液以單劑量配苗並進行凍幹，檢測到凍幹疫苗宿主DNA殘留量< IOpg/ 劑。
[0026]最終的純化病毒液以單劑量配苗，然後進行凍幹。凍幹疫苗有效劑量為8IU (NIH法檢測)時,用斑點雜交法檢測宿主DNA殘留量不高於10pg。
[0027]本發明提供的更具優勢的狂犬疫苗宿主DNA的去除方法，通過對陰離子交換色譜進行了仔細的實驗摸索，意外的發現狂犬病毒不適合被吸附後再洗脫下來，為此，發明人採用嚴格控制陰離子交換條件的思路，通過調整病毒感染的宿主細胞培養上清濃縮液的PH值和鹽濃度，僅僅使宿主DNA被吸附，而病毒幾乎不受損失，這一思路達到非常好的去除宿主DNA的效果，
[0028]與現有技術相比，本發明具有如下優點:
[0029]I)宿主DNA去除率好，能夠達到99.95%，更優的能達到99.99% ；
[0030]2)病毒損失低，總的病毒回收率在50%以上；
[0031]3)避免使用價格昂貴的耗材和設備，生產成本大大降低；
[0032]4)避免使用操作複雜的技術和方法，使生產過程大大簡化；
[0033]5)全過程各項技術結合緊密，運行流暢，易於放大進行工業化大規模生產。`【專利附圖】
【附圖說明】
[0034]圖1本發明所述方法流程圖。
[0035]圖2為對病毒各組分的Western blot檢測結果。
[0036]圖3為本發明所述方法處理後的狂犬病毒電子顯微鏡照片。
【具體實施方式】
[0037]本發明公開了一種去除疫苗中宿主DNA的方法，本領域技術人員可以借鑑本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
【發明內容】
、精神和範圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。
[0038]在本發明的實施例中，本發明所述方法的具體流程如圖1，下面以VeiO細胞生產狂犬疫苗為例，對本發明所述方法作進一步的詳細說明:
[0039]1.澄清步驟
[0040]採用0.65um孔徑的套筒式濾器對病毒感染的Vero細胞培養收穫液做過濾澄清，去除因細胞被病毒裂解產生的大量細胞碎片和大顆粒物質，病毒顆粒大小在200nm左右，能夠很容易穿透濾器的篩孔，而細胞碎片和大顆粒物質被隔離，使病毒液澄清。
[0041]2.濃縮步驟
[0042]澄清後的病毒液體積大，不利於下一步的純化操作，所以採用超濾方法對澄清病毒液濃縮，濃縮倍數一般在20-30倍，使用的超濾膜包截留分子量在300-1000KD之間。
[0043]3.陰離子交換介質
[0044]與尚子交換介質充分接觸之前,調整病毒濃縮液的pH值在6_8之間，鹽濃度在
0.2-0.5mol/之間，然後進行陰離子交換處理，收集處理後病毒液。所述的陰離子交換介質是耦聯DEAE或Q配基的瓊脂糖微球，或者是其他具有陰離子效果的介質。
[0045]4.二次超濾濃縮
[0046]經過離子交換色譜後，為了減輕下一步操作負擔，同時也為了降低生產成本，對病毒液進行二次超濾濃縮，所用超濾膜包截留分子量300-1000KD。
[0047]5.病毒滅活
[0048]採用β -丙內酯1:4000稀釋對病毒液滅活24小時,37°C水解2小時降解β -丙內酯。
[0049]6.核酸酶 處理
[0050]米用benzonase酶處理病毒液，30_37°C靜置20小時。
[0051]7.凝膠過濾色譜法純化
[0052]酶處理後病毒液經過凝膠過濾柱層析純化，去除雜蛋白、小片段DNA和殘留核酸酶。所述凝膠過濾介質為4-6%交聯度的瓊脂糖微球。
[0053]本發明對最終純化液做了電子顯微鏡觀察病毒顆粒形態，顯示病毒顆粒呈子彈狀，顆粒大小在200nm左右，符合狂犬病毒特徵；同時也對整個工藝的每個環節做了Western blot檢測(圖2)，結果顯示從病毒收穫液到純化液，病毒組分沒有發生改變，見圖3，說明本發明的去除DNA的方法以及後續的純化方法比較好的保持了病毒顆粒的完整性，對病毒沒有造成損害。
[0054]本發明提供的去除狂犬疫苗宿主DNA的方法分別進行了 1200ml、12L、30L規模試驗和300L規模的實驗。在病毒的純化過程中均高效地去除了宿主DNA，DNA去除率達到99.95%以上；並且有效地回收了病毒，總的病毒回收率在50%以上；而且外源蛋白的去除到了目前的檢測限度以下。
[0055]為了使本領域的技術人員更好地理解本發明的技術方案，下面結合具體實施例對本發明作進一步的詳細說明。
[0056]實施例1:
[0057]取1200ml狂犬病毒收穫液，用0.65um孔徑的套筒濾器澄清過濾，超濾濃縮30倍，用磷酸鹽緩衝液調整pH為7.8，鹽摩爾濃度為0.4mol/L，與50ml Q Sepharose FF介質充分接觸15分鐘；然後對介質處理後的病毒液超濾濃縮3倍；用β -丙內酯終濃度1:4000滅活24小時；滅活液37°C水解2小時；用氯化鎂溶液調整Mg2+濃度為l-2mmol/L，加入終濃度為90IU/ml的Benzonase核酸酶，處理20小時；上樣到IL Sepharose 4FF凝膠層析柱中，層析柱緩衝液為PBS，線性流速90cm/h收取病毒洗脫峰，檢測殘留DNA和病毒量，DNA殘留量為80pg/ml，去除率為99.95%，病毒回收率55%。
[0058]
【權利要求】
1.一種去除疫苗中宿主DNA的方法，包括以下步驟: 步驟I)調整病毒感染的宿主細胞上清濃縮液的PH值和鹽濃度，使pH值在6~8之間，鹽濃度在0.2^0.5mol/L之間； 步驟2)使調整後的宿主細胞上清濃縮液與陰離子交換介質充分接觸。
2.根據權利要求1的方法，所述鹽濃度為在0.3^0.5mol/L之間。
3.根據權利要求1的方法，所述上清濃縮液的PH值選自7-8或7-7.8。
4.根據權利要求1-3任一項所述的方法，所述陰離子交換色譜介質選自偶聯二乙胺基乙基或者季銨鹽為配基的瓊脂糖微球。
5.根據權利要求1的方法，所述宿主細胞選自VeiO細胞或CHO細胞。
6.根據權利要求1的方法，所述疫苗選自狂犬疫苗、脊髓灰質炎疫苗、乙腦疫苗、A肝疫苗、出血熱疫苗、流感疫苗、SARS疫苗或輪狀病毒疫苗。
7.根據權利要求1的方法，步驟2)之後還包含核酸內切酶處理步驟。
8.根據權利要求7中所述的方法，所述核酸內切酶為Benzonase。
9.根據權利要求7或8所述的方法，酶切處理後的病毒液經過凝膠過濾層析純化。
10.根據權利要求9的方法 ，所述凝膠過濾介質是4-6%交聯度的瓊脂糖微球。
【文檔編號】C12N7/02GK103571800SQ201210263908
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年7月27日 優先權日:2012年7月27日
【發明者】杜笑寒, 周童, 賈芳苗, 戚鳳春, 何榮 申請人:江蘇先聲藥物研究有限公司, 江蘇先聲衛科生物製藥有限公司