穀氨酸濃度的測定方法及穀氨酸診斷試劑盒的製作方法
2023-04-22 22:41:56 2
專利名稱：穀氨酸濃度的測定方法及穀氨酸診斷試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥、食品、環境等領域內對穀氨酸濃度的檢測，尤其涉及利用酶比色法測定穀氨酸濃度的方法，以及由此製得的穀氨酸診斷試劑盒，屬於穀氨酸濃度分析檢測技術領域。
背景技術：
中國GB5009-2003味精衛生標準分析方法有①旋光計法，②甲醛滴定法，③凱氏定氮法。味精係指以糧食及製品為原料經發酵提純的穀氨酸鈉。
酶法分析是國際上公認的穀氨酸鹽的分析方法，已被多個國際權威組織或機構採納如IFU(國際果汁生產者協會)，AIJN(歐盟果蔬汁及飲料生產者聯盟)，及MEBAK、OICC、VDLUFA等組織廣為推崇，並確定為標準檢測方法。已被寫入澳大利亞，荷蘭，德國，瑞士等多個國家的食品法。國內也有數家果汁、酒類加工企業使用酶法試劑盒作為檢測標準。
生物體內存在分解骨質的破骨細胞和形成骨骼的成骨細胞，正常情況下兩種細胞的作用保持著良好的平衡。如果平衡被打破、破骨細胞過於活躍，就會導致骨質疏鬆。破骨細胞中含有穀氨酸，而一種名為「穀氨酸轉運體」的蛋白可以將穀氨酸排出破骨細胞，被「釋放」的穀氨酸會和細胞表面的受體結合，激活細胞內的酶，抑制破骨細胞分解骨質的作用。
發明內容
本發明的目的是提供一種測定穀氨酸濃度的方法，以及應用該方法配製而成的穀氨酸診斷試劑盒。
為實現本發明的目的，一種酶比色法測定穀氨酸濃度的方法，利用穀氨酸脫氫酶為作用酶和顯色酶，對待測樣品中的穀氨酸進行檢測，採用以下步驟進行首先，將測定的樣品與含有輔酶、穀氨酸脫氫酶及水的試劑混勻，使之發生以下反應，
然後，將最終反應物置於紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，測算出穀氨酸的濃度大小。
實現本發明穀氨酸診斷試劑盒可以是單劑，由以下成分組成緩衝液 20～500mmol/L，穩定劑 1～4000mmol/L，輔酶1～6mmol/L，穀氨酸脫氫酶1000～80000U/L。
試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液體試劑，直接使用。
也可以將以上單劑中的各種成分進行組合配製成雙劑，比如
雙劑的配方不僅僅限於上述表中所列，其中試劑I的成分輔酶可以放在試劑II；試劑II中的穀氨酸脫氫酶也可以放到試劑I，如此可以形成多種配方，不再一一列舉。試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液體試劑，直接使用。
此外，為減少各試劑成分之間的交叉影響、保持試劑的穩定性，以便長期儲存，以上單劑、雙劑的試劑I/試劑II當中通常加入穩定劑，濃度在1～4000mmol/L或0.1％～100％體積比範圍之內。
無論是單劑還是雙劑，輔酶可以是NADP+、NAD+或thio-NAD+中的一種。
用作穩定劑的物質可以是硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)中的至少一種。
研究表明，從測定結果的準確性和配製成本的經濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑還是雙劑，如下配方成分關係的診斷/檢測試劑盒較為理想，也是本發明的優選方案緩衝液 100mmol/L，穩定劑 500mmol/L輔酶3mmol/L，穀氨酸脫氫酶18000U/L。
利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)技術，計量/連續監測還原型煙醯胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定穀氨酸濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的穀氨酸診斷/測定試劑盒，採用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行穀氨酸濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。
本發明技術方案的突出的實質性特點和顯著的進步主要表現在(1)本發明完全利用酶比色法測定穀氨酸濃度，測試結果準確；(2)參與反應的成分都是外加的，不受內、外源物質的汙染，測試過程精確度高；(3)該方法簡便、易操作，可快速得到檢測結果，而且反應是在緩衝液條件下進行，不會汙染環境；(4)該方法在普通紫外/可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀上便可快速檢測，不需要特殊或額外儀器，測試成本低廉，便於行業內推廣應用；(5)應用本發明提供的測定方法可以製成液態試劑、乾粉試劑等多種形式的試劑，用於測定各種樣品中穀氨酸濃度的大小；(6)本發明提供的液態穀氨酸診斷/檢測試劑盒，穩定性好，很好地保證了應用測試效果。配成雙劑以後，能夠進一步降低各種成分之間的交叉影響，檢測結果更加可信，試劑更為穩定，可以長時間儲存。
具體實施例方式
本發明一種酶比色法測定穀氨酸濃度的方法及穀氨酸診斷試劑盒，運用穀氨酸脫氫酶(Glutamate dehydrogenase；EC 1.4.1.2；EC 1.4.1.3)酶促反應速率比色法/終點法。穀氨酸脫氫酶酶解穀氨酸，同時將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度/速度，通過測量340nm處吸光度上升的程度/速度，可以測算穀氨酸的濃度大小。
下面結合具體實施例對本發明技術方案作進一步說明。這些例子僅是一些應用範例，不能理解為對本發明權利要求保護範圍的一種限制。
實施例一(單劑)按以下成分和用量配製穀氨酸診斷試劑盒三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩衝液100mmol/L，硫酸銨 500mmol/L，NADP+3mmol/L，穀氨酸脫氫酶 18000U/L；
試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，進行冷凍乾燥，製成乾粉試劑；使用前，加入純淨水，復溶後使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37℃，反應時間10分鐘，起始吸光度≤0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測穀氨酸樣品與試劑的體積比例為1∶25，反應方向為正反應(上升反應)，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出穀氨酸的濃度大小。
實施例二(雙劑)按以下成分和用量配製穀氨酸診斷試劑盒試劑I——三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩衝液100mmol/L，甘油 50mmol/L，NAD+3mmol/L；試劑II——三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩衝液100mmol/L，乙二醇 500mmol/L，穀氨酸脫氫酶 18000U/L；試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，製成液體雙試劑，可以直接使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37℃，反應時間10分鐘，起始吸光度≤0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測穀氨酸樣品與試劑I、試劑II的體積比例為2∶20∶5，反應方向為正反應(上升反應)，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出穀氨酸的濃度大小。
總之，實驗證明，採用本發明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所需的測定結果，並且靈敏度高、精確度好、不受內外源物質的汙染，便於推廣應用。
權利要求
1.穀氨酸濃度的測定方法，其特徵在於包括以下步驟2)將最終反應物置於紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，測算出穀氨酸的濃度大小。
2.穀氨酸診斷試劑盒，盒中試劑由以下成分組成緩衝液 20～500mmol/L，穩定劑 1～4000mmol/L，輔酶1～6mmol/L，穀氨酸脫氫酶1000～80000U/L。
3.根據權利要求2所述的穀氨酸診斷試劑盒，其特徵在於所述穩定劑為硫酸銨、甘油、丙二醇、乙二醇中的至少一種。
4.根據權利要求2所述的穀氨酸診斷試劑盒，其特徵在於所述輔酶是NADP+、NAD+或thio-NAD+中的一種。
5.權利要求2～4中任意一種穀氨酸診斷試劑盒，其特徵在於所述試劑配成單劑或者雙劑。
6.權利要求2～4中任意一種穀氨酸診斷試劑盒，其特徵在於所述試劑盒為乾粉試劑盒或液體試劑盒。
全文摘要
本發明涉及一種酶比色法測定穀氨酸濃度的方法及穀氨酸診斷試劑盒，運用穀氨酸脫氫酶酶促反應速率比色法/終點法。穀氨酸脫氫酶酶解穀氨酸，同時將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度/速度，通過測量340nm處吸光度上升的程度/速度，可以測算穀氨酸的濃度大小。該方法特異性高，不受內、外源物質的汙染，測試結果精確、準確性好。將診斷試劑盒製成雙劑可減少各成分的交叉影響，保持試劑的穩定性。本發明完全可以通過紫外/可見光分析儀器得出所需的測定結果，便於推廣應用。
文檔編號G01N33/50GK101082572SQ20071002476
公開日2007年12月5日 申請日期2007年6月28日 優先權日2007年6月28日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾傑生物科技有限公司