水產用複合微生態製劑及其製備方法
2023-05-12 23:15:31
專利名稱：水產用複合微生態製劑及其製備方法
技術領域：
本發明涉及飼料添加劑技術領域，具體涉及一種水產用複合微生態添加劑及其製備方法。
背景技術：
微生態製劑又稱為微生態調節劑等，它是從天然環境中篩選出來的微生物菌體，經培養、繁殖後製成的含有大量有益菌的活菌製劑。目前，國內外常用的微生態製劑按用途可分為兩大類一類是腸道微生態改良劑，即通過添加到飼料中以改良養殖動物的胃腸道內微生物群落組成；另一類是水質微生態改良劑，即通過投放到水體中以改良水質，主要有光合細菌、芽孢桿菌、EM菌等，不同種類的微生態製劑其針對性和作用效力不盡相同。養殖水體中的氨氮濃度過高時，對養殖生物有一定的毒害作用，且養殖水體中氨 態氮及硝態氮濃度提高是使魚蝦致病的直接或間接因素。為解決這一問題人們曾先後使用了物理、化學和生物的多種方法。但傳統的物理方法費時費力，化學方法雖見效快，但易形成二次汙染。新興的微生物法利用從自然界中獲得的有益微生物降低氨氮，不但不會造成二次汙染，還可調節養殖水體水質，對養殖水體中的生態平衡起到一定作用。國內外大量研究表明，硝化細菌、光合細菌、芽孢桿菌及諾卡氏菌等均對養殖水體中的氨氮具有較強的去除能力，且光合細菌和硝化細菌已在實踐中取得良好效果。但這兩種菌在分離和培養方面對營養和環境條件均有較高要求，而芽孢桿菌則易分離、易培養，在降低養殖水體氨氮含量和調節水質方面有更好的應用前景。
發明內容
本發明的目的在於提供一種多菌種配合的水產用複合微生態製劑及其製備方法。為了解決上述技術問題，本發明採用的技術方案是一種水產用複合微生態製劑，包括以下四種組分枯草芽孢桿菌CGMCC No. 4628菌粉、巨大芽孢桿菌菌粉、環狀芽孢桿菌菌粉、熱帶假絲酵母菌粉。其所含各種菌的活菌數為枯草芽孢桿菌2X 109CFU/g I X 10nCFU/g、環狀芽孢桿菌2 X 109CFU/g 2 X 10nCFU/g、巨大芽孢桿菌2 X 109CFU/g I X 10nCFU/g、熱帶假絲酵母 2 X 109CFU/g I X 10nCFU/g。所述枯草芽孢桿菌菌粉、巨大芽孢桿菌菌粉、環狀芽孢桿菌菌粉、熱帶假絲酵母菌粉，各成分的重量配比為
枯草芽孢桿菌菌粉O. 20 O. 50份
巨大芽孢桿菌菌粉O. 20 O. 60份
環狀芽孢桿菌菌粉O. 20 O. 50份
熱帶假絲酵母菌粉 O. 05 O. 30份。
所述的水產用複合微生態製劑的菌粉製備方法為(I)在種子罐內的培養基中，按每毫升培養基接種2 3億個活性枯草芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和熱帶假絲酵母四種菌種中的一種，在32 37°C下，培養12-24小時；(2)當種子罐內培養基中每毫升含25 30億以上活性芽孢時，按每IOOml生產罐培養基中接種80 100億個活性芽孢的比例，將種子罐內培養物轉入生產罐內培養基中深層通氣攪拌培養24 48小時，培養基溫度穩定在28 32°C，攪拌次數每分鐘80 150次；
(3)當生產罐內芽孢生產率達到85-95%時，即將培養液轉入高速離心設備收集菌體，收集的菌體為灰白色，菌體與澱粉按照1:3 6的比例混合均勻；經60 80°C乾燥和反覆研磨，過80目篩製成菌粉，然後按質量百分比菌粉30%、葡萄糖10%、澱粉60%的比例製成含活菌數為lX10n-5X10nCFU/g的菌粉。一種上述的水產用複合微生態製劑的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟(I)將枯草芽孢桿菌菌粉、巨大芽孢桿菌菌粉、環狀芽孢桿菌菌粉在40 90°C烘乾，熱帶假絲酵母菌粉在30 70°C烘乾；(2)將上述原料放入混合機中混合均勻，用紙塑及複合鋁箔袋包裝，儲存溫度需小於35°C,儲存環境溼度小於60%。所述混合機為混合均勻度變異係數小於5%的雙軸漿葉式高效混合機。本發明的有益效果是具有製造工藝簡單，菌種易得，成本低的特點，且無毒副作用，無殘留。本發明的複合微生態飼料添加劑應用於水產，即可為一種飼料添加劑，能夠改善飼料品質，提高飼料中粗蛋白的含量，降低飼料中粗纖維的含量，也兼具改善水產養殖水質作用，是一種新型安全可靠、無汙染的純發酵多功能的新型微生態製劑產品。
圖I複合微生態製劑氨氮去除效果圖。圖2添加複合微生態製劑後水中化學需氧量和氨氮含量變化圖。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施方式
對本發明作進一步詳細說明本發明的一種水產用複合微生態製劑，包括以下四種組分枯草芽孢桿菌CGMCCNo. 4628菌粉、巨大芽孢桿菌菌粉、環狀芽孢桿菌菌粉、熱帶假絲酵母菌粉。其所含各種菌的活菌數為枯草芽孢桿菌2X 109CFU/g I X 10nCFU/g、環狀芽孢桿菌2 X 109CFU/g 2 X 10nCFU/g、巨大芽孢桿菌2 X 109CFU/g I X 10nCFU/g、熱帶假絲酵母 2 X 109CFU/g I X 10nCFU/g。所述枯草芽孢桿菌菌粉、巨大芽孢桿菌菌粉、環狀芽孢桿菌菌粉、熱帶假絲酵母菌粉，各成分的重量配比為枯草芽孢桿菌菌粉O. 20 O. 50份
巨大芽孢桿菌菌粉O. 20 O. 60份
環狀芽孢桿菌菌粉O. 20 O. 50份
熱帶假絲酵母菌粉 O. 05 O. 30份。所述的水產用複合微生態製劑的菌粉製備方法為(I)在種子罐內的培養基中，按每毫升培養基接種2 3億個活性枯草芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和熱帶假絲酵母四種菌種中的一種，在32 37°C下，培養12-24小時；
(2)當種子罐內培養基中每毫升含25 30億以上活性芽孢時，按每IOOml生產罐培養基中接種80 100億個活性芽孢的比例，將種子罐內培養物轉入生產罐內培養基中深層通氣攪拌培養24 48小時，培養基溫度穩定在28 32°C，攪拌次數每分鐘80 150次；(3)當生產罐內芽孢生產率達到85-95%時，即將培養液轉入高速離心設備收集菌體，收集的菌體為灰白色，菌體與澱粉按照1:3 6的比例混合均勻；經60 80°C乾燥和反覆研磨，過80目篩製成菌粉，然後按質量百分比菌粉30%、葡萄糖10%、澱粉60%的比例製成含活菌數為IX 10n-5X 10nCFU/g的菌粉。一種上述的水產用複合微生態製劑的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟(I)將枯草芽孢桿菌菌粉、巨大芽孢桿菌菌粉、環狀芽孢桿菌菌粉在40 90°C烘乾，熱帶假絲酵母菌粉在30 70°C烘乾；(2)將上述原料放入混合機中混合均勻，用紙塑及複合鋁箔袋包裝，儲存溫度需小於35°C,儲存環境溼度小於60%。所述混合機為混合均勻度變異係數小於5%的雙軸漿葉式高效混合機。本發明採用的菌種及其特點是I.枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)革蘭氏染色陽性、杆狀、芽孢中生或偏生、孢囊膨大但不明顯，7%氯化鈉生長、pH5. 7生長、葡萄糖( + )、阿拉伯糖(± )、澱粉水解、硝酸鹽還原試驗陽性、大小為O. 7—O. 8X2. O-3. Oum02.環狀芽抱桿菌(Bacillus circulans)G同原群，革蘭氏染色陽性、杆狀、芽孢中生、孢囊不膨大，孢內無羥基丁酸鹽顆粒，V-P反應陰性、V-P液的終ΡΗ5. 5，葡萄糖產酸不產氣，阿拉伯糖不產酸，大小為O. 9X2. 1-3. Ιμπ ο本發明所用的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)為申請人從傳統發酵豆豉中分離得到，其生物學特徵如下菌落表面粗糙，不透明，汙白色，菌落圓形，邊緣呈鋸齒狀，革蘭氏陽性菌；芽孢形態為橢圓到柱狀，位於菌體中央或稍偏，芽孢形成後菌體不膨大。本發明的枯草芽孢桿菌顯著區別於現有的枯草芽孢桿菌，可以耐受pH2.0，l%胃蛋白酶的人工胃液，可以耐受O. 3%的人工膽鹽，可以耐受80°C的制粒溫度，可以抑制致病性大腸桿菌K88，K99和金黃色葡萄球菌，具有較強的產纖維素酶的能力，可以降解纖維素。本發明的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)已於2011年3月2日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCCJia :北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 4628。3.巨大芽抱桿菌(Bacillus megatherium)革蘭氏染色陽性、杆狀、芽孢中生或偏中生，孢囊膨大不明顯，V-P反應陰性、接觸酶陽性、澱粉水解、葡萄糖產酸、甘露醇(±)、阿拉伯糖和木糖產酸、硝酸鹽還原試驗陽性、大小為 I. 2-1. 5X2. 0-5. O μ m。4.熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)是最常見的假絲酵母，在葡萄糖-酵母汁-蛋白腖液體培養基中培養，25°C，3天，細胞呈球形或卵球，多端芽殖生長，有竹節式的假菌絲體，並有少量的細長真菌絲，芽殖孢子輪生，有分枝且有短鏈，可發酵葡萄糖，D-半乳糖以及麥芽糖，大小為4 8 X 6 11 μ m。 環狀芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、熱帶假絲酵母(菌種在《中國菌種目錄》和《中國典型培養物保藏中心培養物目錄》中已公開記載。本發明的複合微生態製劑的製備方法為將枯草芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、熱帶假絲酵母，分別在斜面、一級液體活化培養後，在種子罐進行混合活化培養，再接入大發酵罐中進行混合發酵培養。所述的四種菌種在種子罐活化培養的工藝中，每種菌以基本相同的接種量接種。(I)將原菌種進行活化處理包括固體斜面培養基的製備，種子培養基的製備，其中的芽孢菌接種入固體斜面LB培養基，酵母接種入固體斜面馬鈴薯葡萄糖培養基，37°C下恆溫培養18-24小時；LB培養基胰蛋白腖10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L。馬鈴薯葡萄糖培養基馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、H2O IOOOmL, pH6. 5。(2)種子液製備挑取斜面上活化好的各菌株單菌落分別接種於相應的液體種子培養基，37°C下恆溫培養18-24小時；(3)富集培養將各菌株的種子培養液加入到含3L發酵培養基的5L發酵罐中，37 °C下恆溫培養18-24小時；(4)將菌種按體積比混合後加入液體培養基，即得。發酵培養基(按每升培養基所含克重g/Ι計算):葡萄糖20 30，尿素3 5，酵母浸出汁粉3 6，蛋白腖12 15，玉米漿4 8，酵母膏12 15，用醋酸調節pH至7. O;並在發酵過程中採用連續流加高濃度的營養補充培養基，其組分為(重量百分比克重g/Ι計算)葡萄糖35 45，酵母膏25 35，ρΗ7· O。本發明的具體發酵工藝過程為I.在種子罐內的培養基中，按每毫升培養基接種2 3億個活性枯草芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和熱帶假絲酵母四種菌種中的一種，在32 37°C下，培養12-24小時。2.當種子罐內培養基中每毫升含25 30億以上活性芽孢時，按每IOOml生產罐培養基中接種80 100億個活性芽孢的比例，將種子罐內培養物轉入生產罐內培養基中深層通氣攪拌培養24 48小時，培養基溫度穩定在28 32°C，攪拌次數每分鐘80 150次。生產罐培養基組成及配製方法首先將淨化的自來水放入生產罐中，再按水溶液的重量添加蛋白腖2%、牛肉膏O. 5%、葡萄糖O. 3%、食用鹽O. 5%、pH7. O 7. 2、攪拌均勻，120°C高壓滅菌40 60分鐘，再降溫至28-32°C即可使用。3.當生產罐內芽孢生產率達到85-95%時，即將培養液轉入高速離心設備收集菌體，收集的菌體為灰白色，菌體按照1:3 6的比例混合於澱粉內(也可將培養基液直接與澱粉混合，而不經離心收集菌體工序)；經60 80°C乾燥和反覆研磨，過80目篩製成菌粉，然後按菌粉(30%)、葡萄糖(10%)、澱粉(60%)的比例製成含活菌數為lX10n-5X10nCFU/g的菌粉。本發明得到的複合菌劑在低溫條件下生物活性高、生長速度快且能在低溫條件下處理微汙染水源水，效果明顯，且 出水硝酸鹽與亞硝酸鹽類不積累，不產生N2O,安全可靠。複合菌劑及其發酵製劑作為改善水產養殖水質的複合微生態添加劑和飼用微生態添加劑方面的應用。本發明的創新點在於複合菌劑所涉及四個菌種中的兩個菌種，即環狀芽孢桿菌和熱帶假絲酵母，在國內是首次運用到改善水產養殖水質的作用方面。而對於巨大芽孢桿菌在解決水體汙染的應用效果在本發明中也非常顯著。應用巨大芽孢桿菌的培養物於池塘微鹼性水體後，可降低水體懸浮顆粒中除水溶性吸附態磷外的無機及有機磷含量的10. 83% 24. 92%,水體中可溶性正磷酸鹽的含量可提高140% 260%。巨大芽孢桿菌的適宜用量為I mL/m3，適宜作用時間為3天。研究表明，巨大芽孢桿菌具有一定的解磷功能，可促進水體的磷素循環。本發明的優點在於複合菌劑應用於改善水產養殖水質作用的同時又作為一種飼料添加劑，能夠改善飼料品質，提高飼料中粗蛋白的含量，降低飼料中粗纖維的含量，是一種新型安全可靠、無汙染的純發酵多功能的新型微生態製劑產品。本發明所提供的改善水產養殖水質的複合菌劑主要由芽孢桿菌和酵母構成，它們同時具有耐高溫的特點，因而具有不需要包被，可直接制粒的優點。本發明的改善水產養殖水質的複合菌劑除了安全、無汙染、直接制粒之外，同時具有多種功能且用量少，因此具有大大節約生產成本的優點。本發明的新型改善水產養殖水質複合菌劑的製備方法簡單，操作容易，且不含化學藥劑，不僅防黴效果好，抑菌力強，而且具有改善飼料品質，適口性強的優點。該複合微生態製劑可用於顯著改善水產養殖水質，運行25天時氨氮去除率為運行40天的實驗全程中的最大去除率為81%，平均去除率為69%。實施例I :複合微生態飼料添加劑的生產(I)分別取用液體發酵培養分離後在60 80°C溫度下烘乾的枯草芽孢桿菌，巨大芽孢桿菌，環狀芽孢桿菌菌粉及熱帶假絲酵母菌粉。(2)按重量比例計算，取枯草芽孢桿菌菌粉O. 25Kg，巨大芽孢桿菌菌粉O. 40Kg，環狀芽孢桿菌的菌粉O. 25Kg，熱帶假絲酵母菌粉O. IOKg用混合均勻度變異係數小於5%的雙軸漿葉式高效混合機混合均勻，包裝用紙塑及複合鋁箔袋，儲存溫度小於35°C，儲存環境溼度小於60%。實施例2 :複合微生態飼料添加劑的生產原料同實施例I。原料配比為按重量比例計算，取枯草芽孢桿菌菌粉O. 20Kg,巨大芽孢桿菌菌粉O. 35Kg，環狀芽孢桿菌的菌粉O. 20Kg，熱帶假絲酵母菌粉O. 25Kg.。製法同實施例I製成產品。實施例3 :複合微生態飼料添加劑的生產原料同實施例I。原料配比為按重量比例計算，取枯草芽孢桿菌菌粉O. 30Kg,巨大芽孢桿菌菌粉O. 30Kg,環狀芽孢桿菌的菌粉O. 30Kg,熱帶假絲酵母菌粉O. 10Kg。製法同實施例I製成產品。實施例4 :複合微生態飼料添加劑的生產原料同實施例I。原料配比為按重量比例計算，取枯草芽孢桿菌菌粉O. 30Kg,巨大芽孢桿菌菌粉O. 30Kg,環狀芽孢桿菌的菌粉O. 30Kg,熱帶假絲酵母菌粉O. 10Kg。製法同實施例I製成產品。以下為本發明產品對養殖水質改善效果的實施例。實施例5 :本發明所研製的複合微生態製劑對室內靜態水體改良效果實驗在室內小水池內進行，試驗前每池加入50kg池水，靜止三天後開始試驗。試驗期間水溫為20 25°C，每池加入按照實施例I 4所得到的複合微生態製劑，每池加入O. 5g/m3，平行設置試驗組和空白對照組，每24小時定時採集水樣分析測定，連續分析7天。結果表明7天內使用本複合微生態製劑對室內池水的溶氧、pH無明顯的影響，可明顯降低池水的氨氮濃度、亞硝酸鹽氮、硫化物濃度。氨氮降低了 6. 93% 40. 26%，最大降解峰值出現在第4天；亞硝酸鹽氮降低7. 01% 21. 66%，最大降解峰值出現在第3天。實施例6 :本發明所研製的複合微生態製劑對養殖魚池的水質改良效果按照實施例I 4所得到的複合微生態製劑，用於淨化從北京永定河水域採集的魚類養殖池塘中的養殖水，在20 25°C的條件下經納氏試劑光度法檢測氨氮的含量，結果所示，運行25天時氨氮去除率為運行40天的實驗全程中的最大去除率為81%，平均去除率為69% (圖I和圖2),且出水氨氮濃度為O lmg/L ;且無硝酸鹽和亞硝酸鹽積累，不產生N2O並出水的化學需氧量COD為O 4mg/L，保持在很低的水平。本發明得到的複合飼料添加劑對養殖水質具有明顯的改善作用。
實施例7 :複合微生態製劑與化學複合水質改良劑應用效果對比研究 底層水質改良劑是一種白色顆粒狀化學複合劑，主要成份是過氧化鈣CaO2。6 口魚塘分別投人該化學複合劑和按照實施例I 4所得到的複合微生態製劑並設置對照，7天、15天後水質測定結果如表I。由表I看出，本發明所研製的複合微生態製劑以及化學複合劑都具有良好的水質改善作用，對氨氮和亞硝酸鹽的消除效果非常明顯，但隨著時間的推移，微生態製劑對氨氮和亞硝酸鹽的消除率上升更加明顯，15天後氨氮消除率達50. 29%以上，亞硝酸鹽的降解率達18. 81%以上，而化學複合劑對氨氮和亞硝酸鹽的消除率則趨於穩定分別達到40%和13. 86%，微生態製劑更有利於持續消除水中有害物質，改善水質環境。表I魚塘水質監測結果
權利要求
1.一種水產用複合微生態製劑，其特徵在於，包括以下四種組分枯草芽孢桿菌CGMCCNo. 4628菌粉、巨大芽孢桿菌菌粉、環狀芽孢桿菌菌粉、熱帶假絲酵母菌粉。
2.根據權利要求I所述的水產用複合微生態製劑，其特徵在於，其所含各種菌的活菌數為枯草芽孢桿菌2 X 109CFU/g I X 10nCFU/g、環狀芽孢桿菌2 X 109CFU/g 2X 10nCFU/g、巨大芽孢桿菌2X 109CFU/g I X 10nCFU/g、熱帶假絲酵母2 X 109CFU/g lX10nCFU/g。
3.根據權利要求I或2所述的水產用複合微生態製劑，其特徵在於，所述枯草芽孢桿菌菌粉、巨大芽孢桿菌菌粉、環狀芽孢桿菌菌粉、熱帶假絲酵母菌粉，各成分的重量配比為枯草芽孢桿菌菌粉O. 20 O. 50份巨大芽孢桿菌菌粉O. 20 O. 60份環狀芽孢桿菌菌粉O. 20 O. 50份熱帶假絲酵母菌粉 O. 05 O. 30份。
4.根據權利要求I所述的水產用複合微生態製劑，其特徵在於，所述的菌粉製備方法為 (1)在種子罐內的培養基中，按每毫升培養基接種2 3億個活性枯草芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和熱帶假絲酵母四種菌種中的一種，在32 37°C下，培養12-24小時； (2)當種子罐內培養基中每毫升含25 30億以上活性芽孢時，按每IOOml生產罐培養基中接種80 100億個活性芽孢的比例，將種子罐內培養物轉入生產罐內培養基中深層通氣攪拌培養24 48小時，培養基溫度穩定在28 32°C，攪拌次數每分鐘80 150次； (3)當生產罐內芽孢生產率達到85-95%時，即將培養液轉入高速離心設備收集菌體，收集的菌體為灰白色，菌體與澱粉按照1:3 6的比例混合均勻；經60 80°C乾燥和反覆研磨，過80目篩製成菌粉，然後按質量百分比菌粉30%、葡萄糖10%、澱粉60%的比例製成含活菌數為IX 10n-5X 10nCFU/g的菌粉。
5.—種權利要求1-4任一項所述的水產用複合微生態製劑的製備方法,其特徵在於，包括以下步驟 (1)將枯草芽孢桿菌菌粉、巨大芽孢桿菌菌粉、環狀芽孢桿菌菌粉在40 90°C烘乾，熱帶假絲酵母菌粉在30 70°C烘乾； (2)將上述原料放入混合機中混合均勻，用紙塑及複合鋁箔袋包裝，儲存溫度需小於350C，儲存環境溼度小於60%。
6.根據權利要求5所述的水產用複合微生態製劑的製備方法，其特徵在於，所述混合機為混合均勻度變異係數小於5%的雙軸漿葉式高效混合機。
全文摘要
本發明公開了一種水產用複合微生態製劑及其製備方法，所述的添加劑是一種由四種菌及其發酵產物按照一定比例混合而成的複合微生態製劑，由如下重量組分組成枯草芽孢桿菌菌粉0.20～0.50份，巨大芽孢桿菌菌粉0.20～0.60份，環狀芽孢桿菌菌粉0.20～0.50份，熱帶假絲酵母菌粉0.05～0.30份；本複合微生態飼料添加劑具有製造工藝簡單，菌種易得，成本低的特點，且無毒副作用，無殘留。本發明的複合微生態飼料添加劑應用於水產，即可為一種飼料添加劑，能夠改善飼料品質，提高飼料中粗蛋白的含量，降低飼料中粗纖維的含量，也兼具改善水產養殖水質作用，是一種新型安全可靠、無汙染的純發酵多功能的新型微生態製劑產品。
文檔編號C12N1/20GK102719380SQ20121019796
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月15日 優先權日2012年6月15日
發明者劉瀅, 龐潔, 王安如, 貟桂玲 申請人:北京大北農科技集團股份有限公司, 天津昌農科技有限責任公司