一種在哺乳動物細胞中生產dha的方法

2023-05-09 01:19:26 2

專利名稱：一種在哺乳動物細胞中生產dha的方法
技術領域：
本發明涉及w-3多不飽和脂肪酸DHA在哺乳動物細胞中的生物合成方法。
背景技術：
多不飽和脂肪酸(PUFAs)是ー類被廣泛研究和關注的脂肪酸。PUFAs主要包括Co-6和《-3PUFAS兩種類型，每ー種類型都包括多個從短碳鏈(18C)到長碳鏈(22C)的、且含有多個不飽和鍵的脂肪酸。越來越多的研究證明，PUFAs具有廣泛的生物學功能，它們參與細胞膜的構成並作為許多細胞應答過程中的信號分子，與人類的多種疾病的發生緊密相關，其適宜的含量對於人類及其他哺乳動物的正常發育和保持良好的健康狀況極其重要。
-6PUFAs從總體上來說對人體意義不大，其過量的攝入反而危害人體健康。《 -3PUFAs已經被證實在預防和治療心血管疾病、關節炎、癌症等多種疾病方面有著重要作用。其中特別是二十ニ碳六烯酸(docosahexaenoic acid ；DHA)和二十碳五烯酸(eicosapentaenoicacid, EPA),對人體健康具有重要的積極意義。DHA可促進腦、視網膜形成和延緩腦的衰老。英國腦營養化學研究所的Michael教授在首屆國際DHA學術討論會上提出「DHA不僅可以促進人腦活動，還使頭腦聰明」。後來的研究證實=DHA是人腦的主要組成物質之一，約佔人腦脂肪的10%左右。主要以磷脂的形式存在於中樞神經系統細胞如大腦突觸體細胞和視網膜細胞如視網膜光感受器細胞的膜磷酯醯こ醇胺中。動物實驗則從反面證實，若神經系統和視網膜中DHA積累不足，可以導致視網膜電流圖波形改變及視覺靈敏度下降。G. J. An-derson研究了 EPA對小雞腦發育的影響。他發現，EPA能迅速在腦中合成DHA並蓄積，這說明DHA是真正對腦的發育起重要作用的物質。因此，在腦的早期形成過程中，適時、適量、持續補充人體必需的多不飽和脂肪酸是重要的和必要的。DHA對維持腦的功能、延緩腦的衰老也起重要作用。如果缺乏DHA，已形成的腦的突起會逐漸萎縮，腦細胞間的信息傳遞能力就會下降，同時還會使感觀功能衰退。日本研究證實，DHA在一定程度上可以提高腦的柔軟性，抑制腦的老化，有益健腦。DHA能改善心腦血管功能和大腦供能狀況，使大腦的自我營養體系得到完善，因而對因年齡等萎縮死亡的腦細胞起明顯的修復作用。所以，給大腦補充DHA在一定程度上能達到預防、治療老年性痴呆的目的。DHA可起到降血脂、預防和治療動脈粥樣硬化的功能。動脈粥樣硬化(AS)是中老年人的常見病和多發病，也是世界上死亡率最高的疾病之一。高血脂是致病的重要因素。大量的實驗表明富含EPA和DHA的魚油能有效地降低血液中的中性脂質、總膽固醇、低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白和升高高密度脂蛋白。DHA降膽固醇的作用較EPA強。DHA可抑制腫瘤生長。流行病學調查發現，以海產物為主食的愛斯基摩婦女，因患 乳腺癌而死亡的人非常少。成澤富雄報導魚油中DHA和EPA均具有抑制直腸癌的作用，而且DHA的抑制效果更強。Dustin等發現DHA能抑制巨噬細胞的激活及具有殺傷腫瘤細胞的活性。DHA還可降低治療胃癌、膀胱癌、子宮癌等抗腫瘤藥物的耐藥性，並且高純度DHA可抑制大腸黏膜上產生異常腺窩及抑制異常腺窩的生長。在濃度為2. 0mg/ml吋，DHA和EPA都能使PC-3細胞生長減少65%。DHA可起到抗炎、抑制過敏反應的作用。愛斯基摩人患喘息性氣管炎、風溼性關節炎、紅斑狼瘡等以自身免疫異常為原因的慢性炎症性疾病的發病率明顯低於當地的白種人。大量從海魚、海獸中攝取DHA、EPA無疑是ー個重要的原因。同時實驗發現，飼餵EPA的動物，其實驗性炎症的水腫程度降低。DHA和EPA在陸地動物中含量甚微或根本沒有。但在高等動物的腦組織、眼角膜、肇丸及精液中，都含有較高的DHA。DHA屬於《3系列長碳鏈多不飽和脂肪酸，它們和《6系列的脂肪酸在動物體內是不能相互轉化的。在人體中，能將從植物中攝取的a-亞麻酸微量地轉化為EPA和DHA，能滿足一般人的健康需要。但是老年人、幼兒及糖尿病人則不能將a -亞麻酸有效地轉化為EPA和DHA。這些 人需要從食物中直接攝取EPA和DHA。由於哺乳動物及人類自身都不能合成的《_3PUFAs (也不能合成《-6PUFAs)，因此人體對它們的需要必須依靠從食物來源獲取。由於自然界《-6PUFAs豐富而《-3PUFAs極少，從而使人體中《-6PUFAs的攝入過多而《_3PUFAs仍然嚴重不足，人體中《-6/ -3的比率高達16以上。因此，人體増加其攝入量成為合理利用脂肪酸的關鍵。由於DHA對維持健康的重要性，以及良好的療效和很小的副作用等優點，使它ー躍而成為ー種新型的營養品、保健品和療效食品。廣泛被用於保健膠囊、食品、飼料等產品中。日本已把高含量DHA魚油確定為21世紀的智能食品加以開發應用。我國自「九五」規划起也把DHA/EPA作為「海洋藍色工程」的重要項目之一來進行實施開發。我國衛生部也批准了不少魚油EPA、DHA方面的保健食品。如何獲取到豐富的DHA是當今世界範圍內人們所關心的ー個問題。目前的主要來源是海產魚油。魚油中DHA和EPA的含量並不穩定，受魚的品種、季節及產地的影響。魚油中二者的含量在4% 40%之間，由於所用的原材料大都很貴，產品價格昂貴。另外魚油有魚腥味，使得應用受到一定的限制，重金屬汞汙染也是ー個限制應用因素。另外一條途徑是利用真菌和藻類生物合成DHA，可克服魚油資源的限制，產品也沒有腥臭味。研究表明，ー些微生物具有合成EPA、DHA的能力。主要有真菌和藻類。水黴目的破囊壺菌Thraustochytrium和裂埴壺菌Schizochytri-um能產生有意義含量的DHA,金藻中的DHA含量約為10%;甲藻也含有高含量的DHA。隨著一系列《3脂肪酸去飽和酶基因的發現和功能驗證，通過基因工程技術來生產《-3PUFAs已經逐步成為科學家們所努力的方向。《_3脂肪酸去飽和酶基因是 -3PUFAs合成的關鍵基因，它們利用《-6PUFAs為底物在脂肪酸碳鏈甲基端第三個碳催化生成ー個不飽和鍵(烯鍵)而合成相應的《-3PUFAs。近年來，各國的科學家克隆了多個《_3脂肪酸去飽和酶基因，但其中大部分基因只能合成18C的《-3PUFAs，開發利用價值不大。雖然也有報導能夠合成更長鏈的《_3PUFAs基因，如真菌Saprolegnia diclina的w_3脂肪酸去飽和酶能夠合成20C的co_3PUFAs,另一種真菌Mortierella alpina 1S-4不但能夠合成20C的《-3PUFAs，還能合成18C的《_3PUFAs。但直到目前尚未見這些基因被用於基因工程技術以及轉基因動物手段來生產《_3PUFAs。真正被用於此類研究的基因是來自於線蟲C. elegans的《 _3脂肪酸去飽和酶基因fat_l。該基因被轉入哺乳動物細胞以及小鼠中能使從18C到22C的《-3PUFAs的含量増加，顯示出來很大的可開發利用價值。但美中不足的是所合成的《_3PUFAs中價值更大的22C的DHA的水平仍然很低。
自1978年Dyerberg發表有關愛斯基摩人的流行病學調查以來，對EPA和DHA的生理和藥理作用的研究已取得顯著成就，研究範圍從原來的基礎研究，藥理和臨床研究，逐步擴大到作為醫藥品、高級營養品的應用研究。由於EPA和DHA是理想的療效食品或營養品，極少的毒副作用，可以期待在我國也為大眾所接受和歡迎。所以，培養富含EPA和DHA的陸生哺乳動物如豬等，必將有ー個光明的前途。

發明內容
本發明的目的是ー種在哺乳動物細胞中生產DHA的方法及其專用試劑盒本發明所提供的在哺乳動物細胞中生產DHA的試劑盒，包括《_3脂肪酸去飽和酶基因、哺乳動物脂肪酸延長酶基因和哺乳動物脂肪酸去飽和酶基因。所述《-3脂肪酸去飽和酶基因為線蟲(Caenorhabditis briggssae)的《_3脂肪酸去飽和酶基因，優選為sfatl基因，所述sfatl基因的核苷酸序列為序列表中序列I ;所述哺乳動物脂肪酸延長酶基因為小鼠脂肪酸延長酶基因，優選為小鼠elovl2基因，所述 小鼠elovl2基因的核苷酸序列為序列表中序列2;所述哺乳動物脂肪酸去飽和酶基因為小鼠脂肪酸去飽和酶基因，優選為小鼠A6desaturase基因，所述小鼠A 6desaturase基因的核苷酸序列為序列表中序列3。所述試劑盒中還包括真核表達載體，所述真核表達載體為pCAGGS，真核表達載體pCAGGS購自Addgene，其序列已經由該公司公布；所述試劑盒還包括抗性篩選標記基因；所述抗性篩選標記基因包括zeocin抗性基因、neomycin抗性基因和hygro抗性基因；所述zeocin抗性基因的核苷酸序列是自序列表中序列4的5'端第564-938位核苷酸，優選為序列表中序列4的5'端第52-941位核苷酸！neomycin抗性基因的核苷酸序列是自序列表中序列5的5'端第567-1370位核苷酸，優選序列表中序列5 ；hygro抗性基因的核苷酸序列是自序列表中序列6的5'端第178-1203位核苷酸序列，優選自序列表中序列6的5'端第114-1206位核苷酸。本發明還提供一種製備DHA生產能力提高的哺乳動物轉基因細胞系的方法。所述製備DHA生產能力提高的哺乳動物轉基因細胞系的方法是利用上述試劑盒製備哺乳動物轉基因細胞系，具體是將《_3脂肪酸去飽和酶基因、哺乳動物脂肪酸延長酶基因、哺乳動物脂肪酸去飽和酶基因導入哺乳動物細胞中，篩選獲得穩定整合及表達《_3脂肪酸去飽和酶基因、哺乳動物脂肪酸延長酶基因、哺乳動物脂肪酸去飽和酶基因的哺乳動物轉基因細胞系。所述《-3脂肪酸去飽和酶基因為線蟲(Caenorhabditis briggssae)的《_3脂肪酸去飽和酶基因，優選為sfatl基因，所述sfatl基因的核苷酸序列為序列表中序列I ;所述哺乳動物脂肪酸延長酶基因為鼠脂肪酸延長酶基因，優選為小鼠elovl2基因，所述小鼠elovl2基因的核苷酸序列為序列表中序列2 ;所述哺乳動物脂肪酸去飽和酶基因為鼠脂肪酸去飽和酶基因，優選為小鼠A 6desaturase基因，所述小鼠A6desaturase基因的核苷酸序列為序列表中序列3 ;所述哺乳動物細胞為鼠細胞，優選為中國倉鼠卵巢細胞Kl(CH0-K1)。所述co-3脂肪酸去飽和酶基因、哺乳動物脂肪酸延長酶基因和哺乳動物脂肪酸去飽和酶基因先分別以真核表達載體為出發載體，分別構建得到表達《_3脂肪酸去飽和酶基因的重組表達載體、表達哺乳動物脂肪酸延長酶基因的重組表達載體和表達哺乳動物脂肪酸去飽和酶基因的重組表達載體，然後三個重組表達載體共轉染哺乳動物細胞系，篩選得到所述哺乳動物轉基因細胞系；所述真核表達載體為pCAGGS，pCAGGS購自addgene公司，其序列已由該公司公布。所述重組表達載體是以真核表達載體為出發載體，將所述真核表達載體先插入抗性篩選標記基因，構建具有抗性篩選標記的重組表達載體，然後插入所述《_3脂肪酸去飽和酶基因、哺乳動物脂肪酸延長酶基因或哺乳動物脂肪酸去飽和酶基因，獲得表達《_3脂肪酸去飽和酶基因的重組表達載體、表達哺乳動物脂肪酸延長酶基因的重組表達載體或表達哺乳動物脂肪酸去飽和酶基因的重組表達載體；所述抗性篩選標記基因zeocin抗性基因、neomycin抗性基因或hygro抗性基因；所述zeocin抗性基因的核苷酸序列是自序列表中序列4的5,端第564-938位核苷酸，優選為自序列表中序列4的5'端第52-941位核苷酸；neomycin抗性基因的核苷酸序列是自序列表中序列5的5'端第567-1370位核 苷酸，優選序列表中序列5 ；hygro抗性基因的核苷酸序列是自序列表中序列6的5'端第178-1203位核苷酸序列，優選自序列表中序列6的5'端第114-1206位核苷酸。上述方法製備的哺乳動物轉基因細胞系也屬於本發明的保護範圍本發明所提供的促進哺乳動物細胞生產DHA的方法，是利用上述試劑盒製備哺乳動物轉基因細胞系，促進該轉基因細胞系生產DHA，具體步驟包括I)利用上述試劑盒按照上述的方法製備DHA生產能力提高的哺乳動物轉基因細胞系；2)以花生四烯酸為底物培養步驟I)所述的哺乳動物轉基因細胞系，獲得細胞內DHA積累量提高的哺乳動物細胞。所述培養哺乳動物轉基因細胞系所用的培養基為添加花生四烯酸的動物細胞培養基，所述動物細胞培養基為添加終濃度為10% (體積百分含量)小牛血清，L-穀氨醯胺，非必需胺基酸的DMEM培養基；所述花生四烯酸在所述添加花生四烯酸的動物細胞培養基中的終濃度為25-75umol/L，優選50umol/L。所述方法還包括提取培養後的哺乳動物細胞的脂肪酸，獲得DHA含量提高的脂肪酸。上述L-穀氨醯胺的添加量為2mM ;非必需胺基酸的添カロ量為 L-Alanine 15mg/L, L-Asparagine H208. 9mg/L L-Aspartic acid 13. 30mg/L, L-Glutamic acid 14. 70mg/L, Glycine7. 50mg/L, L-Proline 11. 50mg/L, L-Serine10.50mg/L。所述方法中，所述培養時間為48-96小時，優選72小時。本發明所提供的試劑盒可以用於製備DHA生產能力提高的哺乳動物轉基因細胞系，或者轉入哺乳動物體內(使用顯微注射方法及體細胞克隆方法獲得上述試劑盒中的三種基因在動物染色體上穩定整合及表達的轉基因動物)提高動物體內DHA含量。本發明促進哺乳動物細胞生產DHA的方法將所述試劑盒中的線蟲(Caenorhabditis briggssae)的 _3脂肪酸去飽和酶基因如(如sfat-1)與哺乳動物脂肪酸延長酶基因(如elovl2)及哺乳動物脂肪酸去飽和酶基因(如A6desaturase)三者共同轉入哺乳動物細胞，獲得轉基因的哺乳動物細胞系，將該細胞系以花生四烯酸為底物進行培養，在轉基因的哺乳動物細胞中生成豐富的DHA。原理是將線蟲C. briggssae的《_3脂肪酸去飽和酶基因sfat_l、哺乳動物脂肪酸延長酶基因elovl2、哺乳動物脂肪酸去飽和酶基因A6desaturase在哺乳動物細胞中共表達，以花生四烯酸為出發原料，經sfatl轉化成EPA，再經elovl2和A 6desaturase進行碳鏈的延伸和去飽和作用，生成DHA。在這個過程中，通過供給充足的底物，經過轉入的三個基因的共同作用，使細胞內的反應方向由底物向產物方向進行，從而在哺乳動物細胞中或轉基因動物體內生成豐富的DHA。通過對CHO-kl細胞的實驗證明，該方法促進哺乳動物細胞DHA的生成，使細胞脂肪酸中的DHA產量大大增加，由佔細胞總脂肪酸的I. 02%增加到7. 31%。


圖I為陸生哺乳動物從植物中攝取18碳的a -亞麻酸微量地轉化為EPA和DHA 的過程示意2為pCAGGS-sfatl-zeo表達載體示意3為pCAGGS-sfatl-zeo表達載體NcoI酶切鑑定4為pCAGGS-elovl2_neo表達載體示意5為pCAGGS-elovl2_neo表達載體EcoRI和KpnI雙酶切酶切鑑定6 為 pCAGGS- A 6desaturase_hygro 表達載體不意7 為 pCAGGS- A 6desaturase_hygro 表達載體 EcoRI、NcoI、PvuI 單酶切酶切鑑定8 為 A 6desaturase (通過表達載體 pCAGGS-A 6desaturase_hygro)、elovl2 (通過表達載體 pCAGGS-elovl2_neo)、sfatl (通過表達載體 pCAGGS-sfatl-zeo)三基因共轉CHO-Kl細胞的陽性單細胞克隆的RT-PCR鑑定。圖8中，1-4 :無模板對照，5_8 :轉染三種空載體的CHO-Kl單細胞克隆，9-12和13-16 :轉染三種表達載體的陽性單克隆13號和 28 號。1、5、9、13 擴增 A6desaturase 基因，2、6、10、14 擴增 elovl2 基因，3、7、11、15 擴增sfatl基因，4、8、12、16擴增內參GAPDH基因。圖9為轉染單個sfatl表達載體和共轉染三基因表達載體的CHO-Kl單克隆細胞的氣相色譜-質譜(GC-MS)脂肪酸測定圖；3 :單轉染sfatl的CHO-Kl單克隆的脂肪酸測定。DHA峰出現在27. 13的位置，含量佔總脂肪酸的I. 02% ；2 :轉染三種基因的CHO-Kl單克隆的脂肪酸測定。DHA峰出現在27. 22的位置。與對照相比，轉染三種基因的CHO-Kl細胞中生成了更為豐富的DHA，含量佔總脂肪酸的7. 31%。
具體實施例方式我們研究組克隆了來自於線蟲(Caenorhabditis briggssae)的w-3脂肪酸去飽和酶基因sfat-Usimilar to fat_l)，研究表明該基因在哺乳動物細胞和轉基因豬中均能有效地把《 -6多不飽和脂肪酸(《 -6PUFAS)轉變成《 -3多不飽和脂肪酸(《 -3PUFAs)，在我們製備的sfat-1轉基因豬肌肉組織中，生成的20碳的EPA約佔總脂肪酸含量的16%，DHA約佔總脂肪酸含量的4%。sfat-1和fat_l基因功能的研究提示我們，來自於線蟲的這兩個基因在哺乳動物細胞中最適合轉化生成20碳的EPA，而DHA的生成量依然遠低於EPA。很有意思的是，在我們的轉基因豬肌肉組織的脂肪酸測定結果中，我們發現20碳的EPA的確是來源於20碳的花生四烯酸，即20碳的花生四烯酸在sfatl基因產物的催化下，去飽和生成了 20碳的EPA，從結果中可以看到花生四烯酸的大幅度減少和EPA的大幅度生成，兩者之間存在明確的此消彼長關係。而DHA儘管也達到了佔總脂肪酸4%的含量，但是在GC-MS圖上並看不到上述此消彼長的現象，事實上，生成DHA的22碳的《 6脂肪酸底物原料在豬肌肉中本來就含量極少，不足以作為底物支持4%的DHA產出。因此，我們推測4%的DHA的產出並不是以22碳的《6脂肪酸為原料而生成的，而應該是豬利用內源性的轉化系統，以生成的豐富的EPA為原料，經過延長和去飽和兩步作用，而生成了 4%的DHA。據此我們推測，如果能夠強化這種內源性的延長和去飽和作用，就能夠以「接力棒式」的轉化方法，把sfat-1基因生成的豐富的EPA轉化成DHA，將可能在陸生哺乳動物如豬等體內生成豐富的、具有更高營養價值的DHA。陸生哺乳動物雖然不能自身合成《_3PUFAs，但是可以從植物中攝取18碳的a -亞麻酸微量地轉化為EPA和DHA(見圖I)，這個過程中包括碳鏈的延長、去飽和、P -氧化三種步驟。其中碳鏈的延長和去飽和為限速步驟。在哺乳動物體內，EPA向DHA轉化的兩個關鍵酶分別是負責脂肪酸碳鏈延長的延長酶和負責脂肪酸去飽和的△ 6去飽和酶。在上述研究基礎的啟迪下，發明人發明了一種生產DHA的方法，將我們克隆的線蟲(Caenorhabditis briggssae)的w-3脂肪酸去飽和酶基因sfat_l與哺乳動物脂肪酸 延長酶基因elovl2及脂肪酸去飽和酶基因A6desaturase三者共同轉入哺乳動物細胞或哺乳動物體內，有可能在轉基因的哺乳動物細胞或哺乳動物自身體內生成豐富的DHA。其中轉入的sfat-1基因負責生成豐富的EPA，而後兩者在強化表達的情況下，增強EPA向DHA轉化的效率，從而把前者生成的豐富的EPA轉化成豐富的DHA。從而在哺乳動物細胞或哺乳動物體內形成一條DHA生產的高效代謝鏈。本發明使用三種基因共同聯合作用，以花生四烯酸為出發原料，在轉基因動物細胞或轉基因動物體內生成豐富的DHA。下面以中國倉鼠卵巢細胞K1(CH0-K1細胞)為例，闡明本發明的技術方案。以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。內切酶、分子生物學方面的試劑購於Promega公司；其他試劑購自sigma公司；peasy-T 載體購自 promega 公司。elovl2 基因、A 6desaturase 基因購自 openbiosystems公司。中國倉鼠卵巢細胞Kl (CHO-Kl)細胞購自協和醫科大學。下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質量百分含量下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。實施例I、利用sfatl、elovl2、A 6desaturase三基因共同轉染在CH0-K1細胞中生成豐富DHA的方法。一、pCAGGS-sfatl-zeo、pCAGGS- A 6desaturase-hygro> pCAGGS-elovl2_neo 三種高效表達載體的構建。I、pCAGGS-sfatl-zeo 表達載體的構建I)篩選標記zeocin抗性基因的獲得質粒pVgRXR(購自invitrogen公司，該公司已公布了其序列)上面帶有zeocin抗性基因，我們在zeocin抗性基因cDNA上遊設計上遊引物P 1(P I :5』 CGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAG3』 ；P I引物擴增的下遊序列中帶有ー個天然Stu I位點)，在zeocin抗性基因cDNA下遊設計下遊引物P2 (P2 :5』GAaggcctTCAGTCCTGCTCCTCGGCCACG 3』 ；帶有Stu I位點)，利用上述引物，通過PCR從質粒pVgRXR上擴增獲得目的片段，PCR 條件為94°C 4min ；94°C 30sec ；65°C 45sec ；72°C Imin ；30 循環；72°C IOmin ;4°C保存；PCR獲得的片段其大小為946bp，其核苷酸序列為序列表中的序列4，自序列表中序列4的5'端第486-563位核苷酸為Em7pix)m0ter ；自序列表中序列4的5'端第564-938位核苷酸為zeocin抗性基因cDNA。然後將PCR獲得的片段克隆到peasy-T載體上，獲得帶有zeocin抗性基因cDNA的重組載體命名為peasy_T_zeo。2)pCAGGS_zeo載體的構建使用stul酶切peasy-T-zeo,割下890bp (自序列表中序列4的5'端第52-941位核苷酸)的帶有zeocin抗性基因的片段，然後克隆到表達載體pCAGGS (addgene公司購買,該公司已公布了其序列)的stul位點中。pCAGGS stul位點的上遊有sv40啟動子,下遊有sv40polyA,可用於插入的zeocin抗性基因的轉錄表達。3) pCAGGS-sfatl-zeo的構建sfatl基因(Sfatl序列是序列表中序列I所不的序列)由北京中美泰和公司全基因人工合成，合成的sfatl基因克隆在peasy-T載體上，合成的基因兩頭分別各設計了ー個EcoRI酶切位點。從中美泰和公司獲得的peasyT-sfatl載體上，使用EcoRI切出I. 2Kb的線蟲的《_3脂肪酸去飽和酶基因sfat_l，使用EcoRI切開上述的pCAGGS-zeo載體，將I. 2Kb的sfatl基因克隆進pCAGGS-zeo載體，最終獲得pCAGGS-sfatl-zeo表達載體(載體結構示意圖如圖2所示)。使用NcoI對最終 獲得的pCAGGS-sfatl-zeo表達載體進行酶切鑑定，應獲得2901bp，1805bp, 1578bp，600bp4個片段，酶切結果與設想的完全一致，具體的酶切鑑定圖如圖3所示，證明最終獲得的表達載體是正確的，序列測定結果也證實了表達載體構建的正確性。圖3中，泳道1-5為pCAGGS-sfatl-zeo的酶切結果，泳道MIV為分子量marker。2> pCAGGS-elovl2-neo 表達載體的構建l)pCAGGS-neo 載體的構建質粒 peasyfiox(購自 addgene 公司，addgene 公司已公布了其序列)上帶有完整的篩選標記neomycin抗性基因表達框架，neomycin抗性基因表達框架在neomycin抗性基因的上遊有pGK啟動子，下遊有bGH polyA。我們使用XhoI和BamHI雙酶切,切下2. IKb的neomycin抗性基因表達框架,該neomycin抗性基因表達框架的核苷酸序列為序列表中的序列5 (自序列表中序列5的5'端第7-566位核苷酸為pGK啟動子，自序列表中序列5的5'端第567-1370位核苷酸為neomycin抗性基因，自序列表中序列5的5'端第1371-2107位核苷酸為bGH polyA序列)，末端平頭化後，連接到pCAGGS的stul位點中，可表達neomycin抗性基因的重組載體,命名為pCAGGS_neo載體。2) elovl2基因的克隆小鼠elovl2基因購買自openbiosystems公司，其序列為序列表中序列2所示的序列，根據其序列設計ー對引物P3和P4，P3 (5』CGgaattcATGGAGCAGCTGAAGGCCITTGA3』)帶有ー個 EcoRI 位點，P4(5』GGggtaccTTAITGAGCCTTCTTGTCCGTC3』)帶有ー個KpnI位點，以購買的小鼠elovl2基因為模板，進行PCR擴增，擴增條件94°C 4min ；94°C 30sec ；62°C 45sec ；72°C Imin ;30 循環；72°C IOmin ;4°C保存。擴增出大小為 879bp 的elovl2基因，將該擴增得到的基因克隆入peasy-T載體中，得到表達elovl2的重組載體，命名為 peasy_T_elovl2 載體。3)使用 EcoRI 和 KpnI 從 peasy_T_elovl2 載體中切下 879bp 的 elovl2 基因，克隆入pCAGGS-neo載體的EcoRI和KpnI位點中，最終得到pCAGGS-elovl2_neo表達載體(載體結構示意圖如圖4所示)。使用EcoRI和KpnI對最終獲得的pCAGGS-elovl2_neo表達載體進行酶切鑑定，應切出879bp和6717bp兩個片段，酶切結果與設想的完全一致，具體酶切結果如圖5所示，證明最終獲得的表達elovl2基因的pCAGGS-el0V12-ne0表達載體是正確的，序列測定結果也證實了表達載體構建的正確性。pCAGGS-el0V12-ne0中的elovl2序列為序列表中序列2所示的序列。圖5中，泳道MIV為分子量marker。3、pCAGGS- A 6desaturase-hygro 表達載體的構建I)篩選標記hygro抗性基因的獲得質粒pcDNA3. 1/hygro (購自invitrogen公司，該公司已公布了該載體的序列)上帶有hygro基因，我們在hygro cDNA上遊設計上遊引物P5 (5，AGTTCCGCCCATTCTC3，)，引物P5下遊有天然的stul酶切位點。在hygrocDNA 下遊設計下遊引物 P6 (5，GAaggcctCTAITCCTTTGCCCTCGG3』 ；帶有 Stu I 位點)，以質粒pcDNA3. 1/hygro為模板，利用P5和P6為引物，通過PCR擴增獲得目的片段hygro，其大小為1209bp，其核苷酸序列為序列表中序列6(自序列6的5'端第1-124位核苷酸為SV40promoter/ori,自序列表中序列6的5'端第178-1203位核苷酸為hygro抗性基因)PCR 條件為94で 4min ；94°C 30sec ；52°C 45sec ；72°C Imin ;30 循環；72で IOmin ;4で保存。將獲得的PCR產物克隆到peasy-T載體上，獲得序列中含有hygro序列的重組載體，命名為peasy-T-hygrOo2)pCAGGS-hygro載體的構建利用引物兩頭自帶的stul位點，使用stul酶切peasy-T-hygro,割下1093bp(自序列表中序列6的5'端第114-1206位核苷酸)的含有hygro基因的片段,然後將hygro克隆到表達載體pCAGGS的stul位點中獲得重組表達載體。pCAGGS stul位點的上遊有sv40啟動子,下遊有sv40polyA,可用於插入的hygro基因的轉錄表達。將驗證正確的可表達hygro基因的重組表達載體命名為pCAGGS-hygro。3) A 6desaturase 基因的克隆小鼠 A 6desaturase 基因(A 6desaturase 序列為序列表中序列3所示的序列)購買自openbiosystems公司，設計ー對引物P7和P8,P7 (5』CGgaattcATGGGGAAGGGAGGTAACCAG 3，)帶有ー個 EcoRI 位點，P8 (5，CCGgagctcTCAITTATGGAGGTAAGCATCCAG3』)帶有ー個SacI位點，以小鼠A 6desaturase基因為模板，以P7和P8為引物進行 PCR 擴增，PCR 條件為94°C 4min ；94°C 30sec ；62°C 45sec ；72°C Imin ;30 循環；72V IOmin ;4°C保存。擴增出大小為1335bp的A 6desaturase基因，克隆入peasy-T載體中，得到序列中含有小鼠A 6desaturase基因的重組表達載體，將驗證正確的載體命名為peasy-T- A 6desaturase 載體。4)使用 EcoRI 和 SacI 從 peasy-T-A 6desaturase 載體中切下 I33Sbp 的A 6desaturase基因，克隆入pCAGGS-hygro載體的EcoRI和SacI位點中，最終得到pCAGGS-elovl2_neo表達載體(載體結構示意圖如圖6所示)。使用EcoR I、Nco I、Pvu I對最終獲得的pCAGGS-A6desaturase_hygro表達載體進行酶切鑑定,EcoR I應切出2569bp,4659bp兩個片段；Nco I應切出3518bp，320Ibp，509bp三個片段；Pvu I應切出2261bp，4967bp兩個片段，酶切結果與設想的完全一致，具體結果如圖7所示，結果證明最終獲得的表達載體pCAGGS-A 6desaturase_hygro是正確的可表達A6desaturase的重組載體，序列測定結果也證實了表達載體構建的正確性。pCAGGS-A 6desaturase_hygro載體中的A6desaturase序列為序列表中序列3所示的序列。圖7中，泳道MII和MIV均為分子量markeroニ、共轉染表達sfatl、elovl2以及A 6desaturase的表達載體的陽性CH0-K1轉基因細胞系的構建
I、CH0-K1細胞的培養將CH0-K1細胞解凍，放入6孔板中培養。使用動物細胞培養基(添加終濃度為10% (體積百分含量)FBS(小牛血清，購自hyclone公司，貨號SH30084. 03), I X L-glutamine (100 X L-穀氨醯胺，200mM,使用時稀釋100倍即為I XL-glutamine ；購自 hyclone 公司，貨號 SH30034. 01), I XNon-Essential AA(100X非必需胺基酸，使用時稀釋100倍即為I XNon-Essential AA ;購自hyclone公司，貨號 SH30238. 01 ；100X 非必需胺基酸的組分為L-Alaninel500mg/L, L-Asparagine H2O890mg/L L-Aspartic acid 1330mg/L, L-Glutamic acidl470mg/L, Glycine 750mg/L,L-Proline 1150mg/L, L-Serine 1050mg/L)的 DMEM 培養基(購自 hyclone 公司，貨號SH30022. OlB))，於37°C，5% CO2培養箱中培養CHO-Kl細胞。待細胞生長到約90%的匯合度時，用於下述轉染步驟。2、CHO-Kl細胞的轉染第一步先使用pCAGGS-sfat l-zeo表達載體進行轉染，在獲得sfatl基因穩定整合的單細胞克隆的基礎上，再進行第二步的轉染，即使用後兩種表達載體pCAGGS-elovl2_neo表達載體和pCAGGS- A 6desaturase-hygro表達載體進行共轉染。具體轉染的方法如下所述轉染前使用QIAGEN的質粒大提試劑盒提取上述三種表達載體，三種質粒均使用AhdI酶切進行線性化，按照每個6孔細胞使用4ug的DNA量進行轉染實驗,取5ul DNA混合液與IOul脂質體Iipptectamine 2000混勻進行轉染,轉染6小時後更換新鮮培養基，24小時後以I : 10(或更高的稀釋比)傳代，再24h後添加抗性素(G418、博萊黴素或潮黴素)的動物細胞培養基進行篩選，使用的G418 (篩選轉染pCAGGS-sfatl-zeo的細胞)篩選濃度為800iig/ml，博萊黴素(篩選轉染pCAGGS-el0V12-ne0的細胞)濃度為600 ii g/ml,潮黴素(篩選轉染 pCAGGS-A 6desaturase_hygro 的細胞)濃度為 350 ii g/ml。在添加上述濃度的抗生素的動物細胞培養基的抗性壓力下培養7-10d後進行單克隆細胞的篩選，將細胞分散到96孔板中，每個孔只有一個細胞，期間一直用抗性培養基培養細胞，培養時間為2個月，得到穩定的轉染pCAGGS-sfatl-zeo、pCAGGS_A6 desaturase-hygro和pCAGGS-elovl2-neo的陽性CH0-K1轉基因單細胞克隆。同時將pCAGGS-zeo、pCAGGS_neo和pCAGGS-hygro分別按照上述轉染方法轉入CH0-K1細胞中，獲得轉pCAGGS-zeo、pCAGGS-neo和pCAGGS-hygro三種空載體的單細胞克隆作為轉空載體對照。3、陽性CH0-K1單克隆細胞的鑑定使用RT-PCR的方法鑑定步驟2獲得的轉染了 pCAGGS-sfatl-zeo、pCAGGS-A6desaturase_hygro 和 pCAGGS-elovl2_neo 的陽性 CH0-K1 轉基因單細胞克隆。設計引物 P9 (5，CTCTGACTGACCGCGTTACTCCCAC 3』 )，位於 pCAGGS 中的雞 a -actin 第一外顯子的上。引物 P10(5』 CCAGTCCCGGTAGTGATCAAGATC 3』)，位於 A 6desaturase 基因內部；引物 Pll (5，CCTTCTTGTCCGTCATGCCATTAG 3』)，位於 elovl2 基因內部；引物 P12(5』 GTTGGTGAAAGCGTGGTGAAGITTG3』)位於 sfatl 基因內部。引物 P13 (5，CTGGCCAAGGTCATCCATGACAACC3』 )和 P14(5』 CTGTTGCTGTAGCCGTATTCATTGTC3 )位於內源性參照基因 GAPDH 內部。使用Trizol方法提取CH0-K1單克隆細胞中的總mRNA，使用oligo-dT反轉錄後，反應條件為30°C IOmin ；42°C 60min ；1個循環；4°C保存。三個基因的轉錄分別進行RT-PCR鑑定，其中P9和PlO用於A6desaturase基因轉錄的鑑定，PCR條件為94°C 4min ；94°C 30sec ；58°C45sec ；72°C Imin ;30循環；72°C IOmin ;4°C保存。陽性細胞克隆應該擴增出IlOObp片段。P9和 Pll 用於 elovl2基因轉錄的鑑定，PCR條件為MV 4min ；94°C 30sec ；58°C45sec ；72°C Imin ;30循環；72°C IOmin ;4°C保存。陽性細胞克隆應該擴增出950bp片段。P9和P12用於 sfatl 基因轉錄的鑑定，PCR條件為94°C 4min ；94°C 30sec ；65°C 45sec ；72°C Imin ；30循環；72°C IOmin ;4°C保存。陽性細胞克隆應該擴增出571bp片段。P13和P14用於內源性參照GAPDH基因轉錄的鑑定，PCR條件為94°C4min ；94°C 30sec ；58°C45sec ；72°C Imin ;30循環；72°C IOmin ；4°C soak。應擴增出500bp的片段，作為內源性參照。以上述轉pCAGGS-zeo、pCAGGS-neo和pCAGGS-hygro三種空載體的單細胞克隆作為轉空載體對照。結果如圖8所示，結果顯示我們獲得了 6株共轉染有三個基因的CHO-Kl單克隆細胞株，三個基因都穩定整合在CHO-Kl細胞染色體上，且三個基因都能高效地進行轉錄表達。圖8中僅給出陽性單克隆13號和28號為例。三、CHO-Kl細胞中的脂肪酸測定I. CHO-Kl轉基因細胞系的培養 挑選I株三基因共轉的CHO-Kl單克隆細胞(陽性單克隆13號)進行脂肪酸的測定，以單轉有sfatl的CHO-Kl單克隆細胞株為對照。將所獲得的單克隆細胞按小於10%的比例傳代培養至150 X 150mm的大培養皿，每皿加入30mL無抗性動物細胞培養基(添加終濃度為10% (體積百分含量)FBS (小牛血清，購自hyclone公司，貨號SH30084. 03)，I XL-glutamine (L-穀氨酸胺，購自 hyclone 公司，貨號 SH30034. 01)，I XNon-EssentialAA (非必需胺基酸，購自hyclone公司，貨號SH30238. 01)的DMEM培養基(購自hyclone公司，貨號SH30022. 01B))，以50umol/L的終濃度在培養基中加入花生四烯酸。加入動物細胞培養基和底物72h內不做任何處理，靜態觀察細胞的生長狀況。72h後收集細胞進行脂肪酸的抽提。2. CH0-K1細胞脂肪酸抽提及甲酯化用胰酶消化，離心收集2個大培養皿中的細胞(轉染)。加入氯仿和甲醇(氯仿和甲醇體積比為I : I) 4mL混勻，搖勻至細胞均勻散開。加入3. 5mL蒸餾水搖勻，3500r/min，室溫離心5min，分層後吸取下層氯仿(含全部脂肪酸)。殘液中再次加氯仿3mL抽提，再次3500r/min，室溫離心5min後吸取下層氯仿層。將兩次收集的液體3500r/min，室溫(25°C )離心5min，吸取下層液體，用氮氣將其吹乾。向其加入ImL氯仿重溶後再次用氮氣吹乾。加入Iml 2. 5%硫酸/甲醇溶液(在甲醇中加入2. 5ml的硫酸,用甲醇定容到IOOml))混勻，70°C加熱I小時，期間輕搖不要晃到管壁。冷卻到室溫，加入ImL去離子水和ImL正己烷，用カ振搖晃勻，2500r/min,室溫離心5min,小心吸取上清(正己燒層)。在殘液中加入ImL正己烷再次抽提，2500r/min,室溫離心5min，再次吸取上清(正己烷層)。將兩次的上清液混在一起用氮氣吹乾得到脂肪酸。3.脂肪酸的氣相色譜-質譜測定將步驟2獲得的脂肪酸用ImL正己烷吹打衝洗後裝入I. 5mL離心管，吸取上清(0. 8mL)經氮氣吹乾後用於GC-MS分析，使用儀器為GC-TOF高分辨氣質聯用儀。分析條件氣相色譜儀(GC) :HP6890 ;色譜柱DB-5，30mX0. 25mmX0. 25ii L ;恆流進樣；進樣體積 Iu し進樣ロ溫度 260°C ;升溫程序為 50°C— 160°C (30°C /min) — 240°C (8°C /min) 280°C (30°C /min)載氣He,流速lmL/min。外標法校正儀器。EI+離子源，源溫180°C，質譜轟擊電子能量為70eV，質量掃描範圍20 800U.譜庫檢索=MassLynx和NIST。CH0-K1細胞脂肪酸的氣相色譜-質譜結果顯示與只轉入表達sfatl的CH0-K1細胞對照相比，共轉染並表達sfatl、elovl2、A6desaturase三種外源基因的CH0-K1細胞中生成了更為豐富的DHA，單轉染sfatl的CH0-K1細胞中DHA的含量佔總脂肪酸的比例為1. 02%，而共轉染並表達三種外源基因的CHO-Kl細胞中DHA的含量佔總脂肪酸的比例達到了 7. 31 %， 效果非常明顯，顯示動物細胞培養基中添加的花生四烯酸被更有效地轉化成DHA。
權利要求
1.一種促進哺乳動物細胞生產DHA的試劑盒,包括線蟲(Caenorhabditis briggssae) -3脂肪酸去飽和酶基因、哺乳動物脂肪酸延長酶基因和哺乳動物脂肪酸去飽和酶基因。
2.根據權利要求I所述的試劑盒，其特徵在於所述線蟲(Caenorhabditis briggssae)的w-3脂肪酸去飽和酶基因為sfatl基因，所述sfatl基因的核苷酸序列為序列表中序列I ;所述哺乳動物脂肪酸延長酶基因為小鼠脂肪酸延長酶基因，優選為小鼠elovl2基因，所述小鼠elovl2基因的核苷酸序列為序列表中序列2 ;所述哺乳動物脂肪酸去飽和酶基因為小鼠脂肪酸去飽和酶基因，優選為小鼠Aedesaturase基因，所述小鼠A6desaturase基因的核苷酸序列為序列表中序列3。
3.根據權利要求I或2所述的試劑盒，其特徵在於所述試劑盒中還包括真核表達載體，所述真核表達載體為pCAGGS ;所述試劑盒還包括抗性篩選標記基因；所述抗性篩選標記基因包括zeocin抗性基因、neomycin抗性基因或hygro抗性基因；所述zeocin抗性基因的核苷酸序列是自序列表中序列4的5'端第564-938位核苷酸，優選為自序列表中序列4的5'端第52-941位核苷酸；neomycin抗性基因的核苷酸序列是自序列表中序列5的5'端第567-1370位核苷酸，優選序列表中序列5 ；hygro抗性基因的核苷酸序列是自序列表中序列6的5'端第178-1203位核苷酸序列，優選自序列表中序列6的5'端第114-1206位核苷酸。
4.一種製備DHA生產能力提高的哺乳動物轉基因細胞系的方法，是將線蟲(Caenorhabditis briggssae) w-3脂肪酸去飽和酶基因、哺乳動物脂肪酸延長酶基因、哺乳動物脂肪酸去飽和酶基因導入離體的哺乳動物細胞中，篩選獲得穩定整合及表達《_3脂肪酸去飽和酶基因、哺乳動物脂肪酸延長酶基因、哺乳動物脂肪酸去飽和酶基因的哺乳動物轉基因細胞系，即為DHA生產能力提高的哺乳動物轉基因細胞系。
5.根據權利要求4所述的方法,其特徵在於所述線蟲(Caenorhabditisbriggssae)的《_3脂肪酸去飽和酶基因為sfatl基因，所述sfatl基因的核苷酸序列為序列表中序列I;所述哺乳動物脂肪酸延長酶基因為鼠脂肪酸延長酶基因，優選為小鼠elovl2基因，所述小鼠elovl2基因的核苷酸序列為序列表中序列2 ;所述哺乳動物脂肪酸去飽和酶基因為鼠脂肪酸去飽和酶基因，優選為小鼠A6desaturase基因,所述小鼠A 6desaturase基因的核苷酸序列為序列表中序列3 ;所述哺乳動物細胞為鼠細胞，優選為中國倉鼠卵巢細胞K1。
6.根據權利要求4或5所述的方法，其特徵在於所述《_3脂肪酸去飽和酶基因、哺乳動物脂肪酸延長酶基因和哺乳動物脂肪酸去飽和酶基因先分別以真核表達載體為出發載體，分別構建得到表達Co-3脂肪酸去飽和酶基因的重組表達載體、表達哺乳動物脂肪酸延長酶基因的重組表達載體和表達哺乳動物脂肪酸去飽和酶基因的重組表達載體，然後三個重組表達載體共轉染哺乳動物細胞系，篩選得到所述哺乳動物轉基因細胞系；所述真核表達載體為pCAGGS。
7.根據權利要求6中任意一項所述的方法，其特徵在於所述重組表達載體是以真核表達載體為出發載體，將所述真核表達載體先插入抗性篩選標記基因，構建具有抗性篩選標記的重組表達載體，然後插入所述《_3脂肪酸去飽和酶基因、哺乳動物脂肪酸延長酶基因或哺乳動物脂肪酸去飽和酶基因，獲得表達《_3脂肪酸去飽和酶基因的重組表達載體、表達哺乳動物脂肪酸延長酶基因的重組表達載體或表達哺乳動物脂肪酸去飽和酶基因的重組表達載體；所述抗性篩選標記基因為zeocin抗性基因、neomycin抗性基因或hygro抗性基因；所述zeocin抗性基因的核苷酸序列是自序列表中序列4的5'端第564-938位核苷酸，優選為自序列表中序列4的5'端第52-941位核苷酸；neomycin抗性基因的核苷酸序列是自序列表中序列5的5'端第567-1370位核苷酸，優選序列表中序列5 ；hygro抗性基因的核苷酸序列是自序列表中序列6的5'端第178-1203位核苷酸序列，優選自序列表中序列6的5'端第114-1206位核苷酸。
8.權利要求4-8中任意一項所述方法製備的哺乳動物轉基因細胞系。
9.一種促進哺乳動物細胞生產DHA的方法，包括下述步驟 1)按照權利要求4-8中任意一項所述的方法製備哺乳動物轉基因細胞系； 2)以花生四烯酸為底物培養所述的哺乳動物轉基因細胞系，獲得細胞內DHA積累量提高的哺乳動物細胞。
10.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於所述培養權利要求8所述的哺乳動物轉基因細胞系所用的培養基為添加花生四烯酸的動物細胞培養基，所述動物細胞培養基為添加終濃度為10% (體積百分含量)小牛血清，L-穀氨醯胺，非必需胺基酸的DMEM培養基；所述花生四烯酸在所述添加花生四烯酸的動物細胞培養基中的終濃度為25-75umol/L，優選50umol/L ;所述方法還包括提取培養後的哺乳動物細胞的脂肪酸，獲得DHA含量提高的脂肪酸。
全文摘要
本發明公開了一種促進哺乳動物細胞生產DHA的方法。該方法下述步驟1)製備DHA生產能力提高的哺乳動物轉基因細胞系；2)以花生四烯酸為底物培養所述的哺乳動物轉基因細胞系，獲得細胞內DHA積累量提高的哺乳動物細胞。其中製備DHA生產能力提高的哺乳動物轉基因細胞系的方法，是將ω-3脂肪酸去飽和酶基因、哺乳動物脂肪酸延長酶基因、哺乳動物脂肪酸去飽和酶基因導入哺乳動物細胞中，篩選獲得表達三種基因的哺乳動物轉基因細胞系。
文檔編號C12N15/85GK102660576SQ20121010702
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月12日 優先權日2012年4月12日
發明者吳曉潔, 周顏榮, 孫曉燕, 左珊珊, 林豔麗, 熊富銀, 陳紅星 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所