高效液相色譜法中分離蠶豆中左旋多巴的流動相的製作方法

2023-05-09 08:03:46

專利名稱：高效液相色譜法中分離蠶豆中左旋多巴的流動相的製作方法
技術領域：
本發明涉及ー種生物中左旋多巴成分含量的測定方法，尤其涉及一種高效液相色譜法中分離蠶豆中左旋多巴的流動相。
背景技術：
左旋多巴(Levodopa，L-D0PA)，即3，4_ ニ羥基苯丙氨酸，是生物體內兒茶酚胺類激素、神經遞質(如去甲腎上腺素、多巴胺)和黑色素的代謝前體，主要用於治療帕金森病(Parkinson s disease),因此測定該藥物製劑和生物樣品中左旋多巴的含量具有重要意義。近年來左旋多巴的體內外分析方法都取得了很大進展，紫外分光光度法、高效液相色譜法在左旋多巴的體內外分析中應用最廣，流動注射自動分析方法和毛細管電泳法等也有廣 泛應用，可見-紫外分光光度檢測器、螢光檢測器、電化學檢測器、化學發光檢測、蒸發光散射檢測器等新型檢測器都有報導。L-DOPA的芳香環和羧基結構決定了該分子具有一定的紫外吸收，因此分光光度法和液相色譜法是可供選擇的定量方法。它的兒茶酚結構可以發生氧化還原反應，為電化學檢測、衍生化檢測和比色法奠定了基礎。中國藥典規定，L-DOPA原料採用非水滴定法，片劑採用紫外分光光度法測定含量，如Nagaraja等用紫外分光光度法測定製劑中兒茶酚胺衍生物多巴胺、左旋多巴、甲基多巴和腎上腺素的含量。該方法穩定，具有良好的靈敏度和準確性，簡便快速，不需複雜的設備。對於單方製劑，在沒有輔料幹擾的情況下，這是可行的；但生物樣品與藥物製劑相比，藥物濃度更低，樣品成分更複雜，因此在測定生物樣品中左旋多巴濃度時，需採用高靈敏度、高解析度的方法。HPLC (高效液相色譜)法和毛細管電泳法成為較為理想的分析方法，其中以RPHPLC-ED (反相高效液相色譜)最為常用。HPLC法靈敏度高，操作簡便、快速、準確，易於定量分析，與紫外分光光度法、薄層掃描法測定的準確性和重現性均有所提高。HPLC法具有良好的分離性能，廣泛應用於食品、保健品和藥品的分析工作中，並以CS、C18反相柱居多，現已成為藥物分析的經典方法。Tait, Wood、陸興毅等均採用高效液相色譜(HPLC)法測定製劑中L-DOPA的含量，但在流動相的選擇和檢測器的選用上則各有不同。除了製劑分析以外，也常見採用HPLC法測定植物資源中左旋多巴含量的報導。如趙永成以甲醇O.Olmol/L KH2PO4緩衝液(25:75，pH3. 0)為流動相，並應用紫外檢測器，在280 nm波長處測定了狗爪豆中左旋多巴的含量；黃海濱等以流動相為甲醇0. lmol/L醋酸溶液(25:75，v/v)測定藜豆中左旋多巴的含量。結果均表明，這些方法準確度高，線性關係好，重現性好。巫世紅等以流動相為0.1 mol/L冰醋酸溶液甲醇(95:5)測定不同採收時期貓豆中左旋多巴的含量，在此條件下，左旋多巴能達到理想的分離效果，保留時間為4. 6min。以上所述的三種流動相測定蠶豆中左旋多巴含量的結果表明，左旋多巴的出峰時間不穩定、分離度低。可能是由於蠶豆中組分複雜，幹擾成分多。因此建立一種高效液相色譜法有效分離蠶豆中左旋多巴的流動相，解決現有流動相組成對蠶豆中左旋多巴分離效果不理想的問題十分必要。隨著紫外檢查器的發展，在280nm處有強烈吸收的一些試劑也可以進行利用，本發明結合高效液相色譜(HPLC)發現多種酸可以代替磷酸/鹽酸等添加劑應用到左旋多巴的檢測，而且與儀器的兼容性非常好。高效液相色譜儀對流動相的吸收波長要求不高，但有腐蝕沉澱作用的流動相對高效液相色譜儀的部件會產生損害作用，如現有流動相中磷酸鹽緩衝液易產生沉澱，造成柱賽杆和密封圈摩擦，損害泵系統。

發明內容
本發明提供ー種從蠶豆中分離左旋多巴效果好的高效液相色譜法中分離蠶豆中左旋多巴的流動相。本發明採用以下技術方案，高效液相色譜法中分離蠶豆中左旋多巴的流動相，其組成成分體積百分比為0. 1%甲酸69%-97%，こ腈2%-30%，0. I mol/L醋酸1%_10%。所述的流動相組成成分體積百分比為0· 1%甲酸90%_97%，こ臆2%_9%，O. I mol/L醋酸1%-6%。 所述的流動相優選組成成分體積百分比為0. 1%甲酸95%，こ腈5%。本發明採用以上技術方案，利用醋酸替換磷酸鹽緩衝液，可以避免沉澱的產生，減少對泵系統造成損害，只需在流動相中加入一定比例的水以提高流動相的PH值。上述的流動相經長期使用，對高效液相色譜儀的泵系統未有任何損害。所述的甲酸在任意比例的こ臆-甲酸-水中能以任意比例完全互溶，不產生任何沉澱，不會對泵系統造成損害，常年使用情況良好，用於等度洗脫時，操作簡單、省時、重現性好、容易重複。該流動相具有以下優點
A. L-DOPA在甲酸中經紫外檢測(280nm)有最大吸收且吸收值較穩定，不受甲酸濃度的影響。B.從試劑應用角度講，本發明流動相的應用基本不受任何限制。C.使用本發明流動相檢測得到的基線穩定，易於定量分析。D.採用該流動相與梯度方法相比，使用單泵即可實現分離檢測；而梯度方法需要多泵或者多元混合器才能實現。E.採用該流動相，除了可以對左旋多巴進行有效分離，還能分離出其他流動相無法分離的未知物質。F.本發明流動相中存在一定比例的水，可提高流動相的PH值，減少有機酸對色譜柱造成的損害。


現結合附圖對本發明做進ー步詳述
圖I是採用本發明實施例I流動相對左旋多巴標準品進行分離檢測所得的HPLC-UV色譜圖； 圖2是採用本發明實施例I流動相對蠶豆花中萃取的左旋多巴進行分離檢測所得的HPLC-UV色譜 圖3是採用本發明實施例2流動相對左旋多巴標準品進行分離檢測所得的HPLC-UV色譜 圖4是採用本發明實施例2流動相對蠶豆花中萃取的左旋多巴進行分離檢測所得的HPLC-UV色譜 圖5是採用本發明實施例3流動相對左旋多巴標準品進行分離檢測所得的HPLC-UV色譜 圖6是採用本發明實施例3流動相對蠶豆花中萃取的左旋多巴進行分離檢測所得的HPLC-UV色譜 圖7是採用本發明實施例4流動相對左旋多巴標準品進行分離檢測所得的HPLC-UV色譜 圖8是採用本發明實施例4流動相對蠶豆花中萃取的左旋多巴進行分離檢測所得的HPLC-UV色譜 圖9是採用本發明實施例5流動相對左旋多巴標準品進行分離檢測所得的HPLC-UV色譜 圖10是採用本發明實施例5流動相對蠶豆花中萃取的左旋多巴進行分離檢測所得的HPLC-UV色譜 圖11是採用本發明實施例6流動相對左旋多巴標準品進行分離檢測所得的HPLC-UV色譜 圖12是採用本發明實施例6流動相對蠶豆花中萃取的左旋多巴進行分離檢測所得的HPLC-UV色譜圖。
具體實施例方式本發明流動相可以米用組成成分體積百分比為0. 1%甲酸69%_97%，こ臆2%_30%，O. I mol/L 醋酸 1%-10%。所述的流動相也可以採用組成成分體積百分比為0. 1%甲酸90%_97%，こ腈2%-9%, O. I mol/L 醋酸 1%_6%。 所述的流動相優選的組成成分體積百分比為0. 1%甲酸95%，こ腈5%。實施例I，如圖I或2所示，採用流動相組成成分體積百分比為0. 1%甲酸95%，乙腈5%，分別對左旋多巴標準品和蠶豆花中萃取的左旋多巴進行分離檢測所得的HPLC-UV色譜圖。色譜柱為資生堂CAPCELL PAK CR色譜柱(150 mmX4. 6 mm, 5 μ m);流動相流速1.0mL/min ;檢測波長280 nm ;柱溫30 V ;進樣量20 μ L，色譜圖中橫坐標是左旋多巴標準品和蠶豆花中萃取的左旋多巴通過色譜柱的保留時間，時間以分鐘為單位，縱坐標是左旋多巴標準品和蠶豆花中萃取的左旋多巴通過色譜柱響應值電壓，該電壓響應值以伏為單位(以下實施例採用色譜柱條件同本實施例)。圖I所示色譜圖，該流動相可將左旋多巴完全基線分離，其峰值4. 915的峰面積與質量間呈良好的線性相關性，而且基線穩定。圖2所示色譜圖，該流動相可將左旋多巴完全基線分離和ー些未知物完全基線分離，其峰值4. 762的峰面積與質量間呈良好的線性相關性，而且基線穩定。
實施例2，如圖3或4所示，採用流動相組成成分體積百分比為0. 1%甲酸90%，乙腈9%，O. I mol/L醋酸1%，分別對左旋多巴標準品和蠶豆花中萃取的左旋多巴進行分離檢測所得的HPLC-UV色譜圖，圖I所示色譜圖，該流動相可將左旋多巴完全基線分離，其峰值4.465的峰面積與質量間呈良好的線性相關性，但基線漂移比較明顯。圖2所示色譜圖，該流動相可將左旋多巴完全基線分離和ー些未知物完全基線分離，其峰值4. 490的峰面積與質量間呈良好的線性相關性，但基線漂移比較明顯。實施例3，如圖5或6所示，採用流動相組成成分體積百分比為0. 1%甲酸97%，乙腈2%，O. I mol/L醋酸1%，分別對左旋多巴標準品和蠶豆花中萃取的左旋多巴進行分離檢測所得的HPLC-UV色譜圖，該流動相對左旋多巴標準品和蠶豆花樣品左旋多巴分離較好，保留時間達到6分鐘多，但兩者基線漂移明顯。實施例4，如圖7或8所示，採用流動相組成成分體積百分比為0. 1%甲酸90%，乙腈4%，O. I mol/L醋酸6%，分別對左旋多巴標準品和蠶豆花中萃取的左旋多巴進行分離檢測所得的HPLC-UV色譜圖，該流動相對標準品和蠶豆花樣品左旋多巴分離良好，基線較穩定。
實施例5，如圖9或10所示，採用流動相組成成分體積百分比為0. 1%甲酸69%，こ腈30%，O. I mol/L醋酸1%，分別對左旋多巴標準品和蠶豆花中萃取的左旋多巴進行分離檢測所得的HPLC-UV色譜圖，該流動相對標準品和蠶豆花樣品的左旋多巴分離較好，但兩者基線漂移較大。實施例6，如圖11或12所示，採用流動相組成成分體積百分比為0. 1%甲酸70%，こ腈20%，O. I mol/L醋酸10%，分別對左旋多巴標準品和蠶豆花中萃取的左旋多巴進行分離檢測所得的HPLC-UV色譜圖，該流動相對標準品和蠶豆花樣品的左旋多巴均可以較好的分離，但蠶豆花樣品的左旋多巴基線明顯漂移。綜上所述，採用本發明以上流動相分別對左旋多巴標準品和蠶豆花中萃取的左旋多巴進行分離，可將左旋多巴完全基線分離，易於定量分析。
權利要求
1.高效液相色譜法中分離蠶豆中左旋多巴的流動相，其特徵在於其組成成分體積百分比為0. 1% 甲酸 69%-97%，こ腈 2%-30%, O. I mol/L 醋酸 1%_10%。
2.根據權利要求I所述的高效液相色譜法中分離蠶豆中左旋多巴的流動相，其特徵在於所述的流動相組成成分體積百分比為0. 1%甲酸90%-97%，こ腈2%-9%，0. I mol/L醋酸.1%-6%。
3.根據權利要求I所述的高效液相色譜法中分離蠶豆中左旋多巴的流動相，其特徵在於所述的流動相優選組成成分體積百分比為0. 1%甲酸95%，こ腈5%。
全文摘要
本發明公開了一種高效液相色譜法中分離蠶豆中左旋多巴的流動相，其組成成分體積百分比為0.1%甲酸69%-97%，乙腈2%-30%，0.1mol/L醋酸1%-10%。利用醋酸替換磷酸鹽緩衝液，可以避免沉澱的產生，減少對泵系統造成損害。上述的流動相經長期使用，對高效液相色譜儀的泵系統未有任何損害。所述的甲酸在任意比例的乙腈-甲酸-水中能以任意比例完全互溶，不產生任何沉澱，不會對泵系統造成損害，常年使用情況良好，用於等度洗脫時，操作簡單、省時、重現性好、容易重複。
文檔編號G01N30/26GK102680616SQ20121017140
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月29日 優先權日2012年5月29日
發明者廖素鳳, 曹奕鴦, 李愛萍, 鄭開斌, 鄭金貴 申請人:福建省農業科學院作物研究所