癌的檢測方法及識別胰臟特異性的核糖核酸酶1的抗體的製作方法

2023-05-09 01:46:51 3

癌的檢測方法及識別胰臟特異性的核糖核酸酶1的抗體的製作方法
【專利摘要】製備在胰臟特異性的RNase 1的能夠進行N型糖鏈修飾的部位沒有結合糖鏈的情況下與該部位結合、在結合有N型糖鏈的情況下與該部位的結合被阻礙的單克隆抗體；另外，製備能夠與該抗體同時地與相同胰臟特異性的RNase 1結合的單克隆抗體，使用它們，求出A與B的比，由此檢測胰腺癌。A＝胰臟特異性的RNase 1的能夠進行N型糖鏈修飾的部位的、結合有N型糖鏈的部位或沒有結合N型糖鏈的部位的量。B＝胰臟特異性的RNase 1的能夠進行N型糖鏈修飾的部位的量。
【專利說明】癌的檢測方法及識別胰臟特異性的核糖核酸酶1的抗體

【技術領域】
[0001] 本發明涉及癌的檢測方法及識別胰臟特異性的核糖核酸酶1的抗體。更詳細而言 涉及，通過測定糖蛋白的能夠進行N型糖鏈修飾的部位是否結合糖鏈而進行癌的檢測的方 法。

【背景技術】
[0002] 作為診斷初期階段的癌的檢測方法，優選將非侵入的來源於生物的試樣例如血 液、尿等比較容易採集的體液作為被檢體。作為現在的胰腺癌的診斷時所使用的血清標記 物，有：CA19-9、DUPAN-2等。然而，存在如下缺點：這些標記物的臟器特異性低、從遺傳的理 由出發有該標記物不反應的情況等、不能成為決定性的確定診斷。
[0003] 作為核糖核酸酶家族之一的胰臟特異性的核糖核酸酶1 (以下，將核糖核酸酶1稱 為"RNase 1"）為胰臟特異性地表達、並且被分泌至細胞外的體液中的糖蛋白。該蛋白質是 被翻譯成包含156個胺基酸的肽（序列號1)，在分泌信號的去除、接受糖鏈修飾之後，成為 具有128個胺基酸的肽序列（序列號2)的成熟糖蛋白，從而被分泌至細胞外。能夠進行N 型糖鏈修飾的部位、即有可能接受N型糖鏈修飾的胺基酸殘基為序列號2中的第34位、第 76位、第88位的天冬醯胺殘基。
[0004] 一直以來都在研究胰臟特異性的RNase 1，雖然報告了癌的表達、活性的變化等， 但沒有實際臨床應用的例子。1980年Doran等人報告了胰腺癌患者血清中的核糖核酸酶活 性增加（非專利文獻1)，只有活性的記載，對於核糖核酸酶的分子種類沒有限定。關於胰臟 特異性的RNase 1的糖鏈修飾，1994年報告了由健康人得到的核糖核酸酶，對於3處能夠進 行糖鏈修飾的部位的各自的糖鏈附加的程度有所報告，但是對於與胰腺癌的關聯性沒有報 告（非專利文獻2)。2000年，Fernandez-Salas等人報告了由源自胰腺癌的培養細胞分泌 的胰臟特異性的RNase 1的分子量大於由正常的胰臟得到的RNase 1的分子量，作為其理 由之一，指出了糖鏈修飾量的增加（非專利文獻3)。進而，同一研究組在2003年和2007年， 發表了關於胰臟特異性的RNase 1的糖鏈修飾的報告，其中指出了由胰腺癌（Pancreatic cancer)患者的血清得到的胰臟特異性的RNase 1的N型糖鏈結構有變化，特別是明確了被 核心巖藻糖化的2條支鏈複合型糖鏈增加，胰臟特異性的RNase 1的分子量增加起因於附 加的糖鏈結構自身的分子量增加（非專利文獻4、5)。然而，至今並沒有將糖蛋白的能夠進 行N型糖鏈修飾的部位的有無結合糖鏈與癌關聯的報告。
[0005] 現有技術文獻
[0006] 非專利文獻
[0007] 非專利文獻 I J. Clin. Pathol. 33,1212-13 (1980)
[0008] 非專利文獻 2 :Biol. Chem. Hoppe Seyler 375, 357-63 (1994)
[0009] 非專利文獻 3 :Eur J Biochem. 267,1484-1494(2000)
[0010] 非專利文獻 4 :Glycobiology 13,227-244(2003)
[0011] 非專利文獻 5 :Glycobiology 17,388-400(2007)


【發明內容】

[0012] 發明要解決的問是頁
[0013] 本發明著眼於糖蛋白的能夠進行N型糖鏈修飾的部位，目的在於提供癌的檢測方 法和識別胰臟特異性的RNase 1的抗體。
[0014] 用於解決問題的方案
[0015] 本發明人等為了解決上述問題而進行了深入研究，結果發現：癌患者與健康人相 t匕，在胰臟特異性的RNase 1的能夠進行N型糖鏈修飾的部位結合有糖鏈的情況增加，至此 完成了本發明。另外，本發明人等發現了與胰臟特異性的RNase 1特異地結合的抗體，即將 胰臟特異性的RNase 1的能夠進行N型糖鏈修飾的部位作為抗原識別位點的一部分，在N 型糖鏈修飾的部位結合有糖鏈的情況下與胰臟特異性的RNase 1的結合被阻礙的抗體，至 此完成了本發明。
[0016] SP，本發明如下。
[0017] (1) 一種癌的檢測方法，其特徵在於，測定糖蛋白的能夠進行N型糖鏈修飾的部位 的、結合有N型糖鏈的部位或沒有結合N型糖鏈的部位的量。
[0018] (2)根據⑴所述的方法，其中，癌為胰腺癌。
[0019] (3)根據⑴或⑵所述的方法，其中，糖蛋白為胰臟特異性的RNase 1。
[0020] (4)根據⑵或⑶所述的方法，其中，胰腺癌患者與健康人相比，結合有N型糖鏈 的部位的量增加。
[0021] (5) -種癌的檢測方法，其特徵在於，求出下述A、B中的A與B的比。
[0022] A =糖蛋白的能夠進行N型糖鏈修飾的部位的、結合有N型糖鏈的部位或沒有結合 N型糖鏈的部位的量
[0023] B =糖蛋白的能夠進行N型糖鏈修飾的部位的量
[0024] (6)根據（5)所述的方法，其中，癌為胰腺癌。
[0025] (7)根據（5)或（6)所述的方法，其中，糖蛋白為胰臟特異性的RNase 1。
[0026] (8)根據上述（6)或（7)所述的方法，其為A=沒有結合N型糖鏈的部位的量，胰 腺癌患者與健康人相比A/B的值減小的方法。
[0027] (9)根據上述（6)或（7)所述的方法，其為A=結合有N型糖鏈的部位的量，胰腺 癌患者與健康人相比A/B的值增大的方法。
[0028] (10)根據上述（7)?（9)中的任一項所述的方法，其為求出胰臟特異性的RNase 1的量、換算該值作為B的值的方法。
[0029] (11)根據⑴?（10)中的任一項所述的方法，其中，能夠進行N型糖鏈修飾的部 位為選自序列號2所示的序列的第34位、第76位和第88位的1個以上的天冬醯胺殘基。
[0030] (12)根據（11)所述的方法，其中，能夠進行N型糖鏈修飾的部位為序列號2所示 的序列的第88位的天冬醯胺殘基。
[0031] (13)根據（11)所述的方法，其中，能夠進行N型糖鏈修飾的部位為序列號2所示 的序列的第76位的天冬醯胺殘基。
[0032] (14)根據（11)所述的方法，其中，能夠進行N型糖鏈修飾的部位為序列號2所示 的序列的第34位的天冬醯胺殘基。
[0033] (15) -種單克隆抗體或其片段，其將胰臟特異性的RNase 1的能夠進行N型糖鏈 修飾的部位作為抗原識別位點的一部分。
[0034] (16)根據（15)所述的單克隆抗體或其片段，其中，在胰臟特異性的RNasel的能夠 進行N型糖鏈修飾的部位沒有結合糖鏈的情況下，單克隆抗體或其片段與該部位結合；在 胰臟特異性的RNase 1的能夠進行N型糖鏈修飾的部位結合有N型糖鏈的情況下，單克隆 抗體或其片段與該部位的結合被阻礙。
[0035] (17)根據（15)或（16)所述的單克隆抗體或其片段，其中，抗原識別位點為包含序 列號2所示的序列的第88位的天冬醯胺殘基的區域。
[0036] (18) -種單克隆抗體或其片段，其特徵在於，能夠與上述（15)?（17)中的任一項 所述的單克隆抗體或其片段同時地結合於胰臟特異性的RNase 1。
[0037] (19)根據上述⑴?（14)中的任一項所述的方法，其中，使（a)上述的（15)? (17)中的任一項所述的單克隆抗體或其片段與試樣接觸，測定與（a)的單克隆抗體或其片 段形成了複合體的胰臟特異性的RNase 1。
[0038] (20)根據上述（19)所述的方法，其中，進一步使（b)上述（18)所述的單克隆抗體 或其片段與試樣接觸，測定與（a)和（b)的兩種單克隆抗體或抗體片段形成了複合體的胰 髒特異性的RNase 1。
[0039] (21)根據上述（20)所述的方法，其包括：使試樣與（a)或（b)的一者接觸的第一 接觸工序；和使第一接觸工序中得到的物質與（a)或（b)的另一者接觸的第二接觸工序。
[0040] (22) -種藥品，其特徵在於，含有上述（15)?（17)中的任一項所述的單克隆抗體 或其片段。
[0041] (23)根據（1)?（14)中的任一項所述的方法，其中，通過質譜分析法求出糖蛋白 的能夠進行N型糖鏈修飾的部位的、結合有N型糖鏈的部位或沒有結合N型糖鏈的部位的 量。
[0042] (24)根據上述（23)所述的方法，其為通過質譜分析法測定糖蛋白的肽片段和/或 糖肽片段的質量的方法。
[0043] 以下，更詳細地說明本發明。本發明為通過測定糖蛋白的能夠進行N型糖鏈修飾 的部位的、結合有N型糖鏈的部位或沒有結合N型糖鏈的部位的量從而檢測癌的發明。此 時，測定糖蛋白的能夠進行N型糖鏈修飾的部位的、結合有N型糖鏈的"部位"的量或沒有 結合N型糖鏈的"部位"的量，而並非測定與能夠進行N型糖鏈修飾的部位結合的"糖鏈"的 量。作為癌，沒有特別的限定，特別是能夠檢測胰腺癌。
[0044] 對於作為測定對象的糖蛋白，沒有特別的限定，優選為胰臟特異性的RNase 1。另 夕卜，其優選為來源於人的生物試樣。通過將糖蛋白作為測定對象，能夠特異地檢測人的胰腺 癌。此時，胰腺癌患者與健康人相比，在能夠進行N型糖鏈修飾的部位結合有N型糖鏈的情 況多，能夠進行N型糖鏈修飾的部位中，結合有N型糖鏈的部位增加，因此能夠將其作為指 標而檢測胰腺癌。
[0045] 另外，本發明為一種癌的檢測方法，其特徵在於，求出下述A、B中的A與B的比。
[0046] A =糖蛋白的能夠進行N型糖鏈修飾的部位的、結合有N型糖鏈的部位或沒有結合 N型糖鏈的部位的量
[0047] B =糖蛋白的能夠進行N型糖鏈修飾的部位的量
[0048] 作為癌，沒有特別的限定，特別是能夠檢測胰腺癌。對於作為測定對象的糖蛋白， 沒有特別的限定，優選為胰臟特異性的RNase 1。
[0049] 另外，優選為A =沒有結合N型糖鏈的部位的量，胰腺癌患者與健康人相比A/B值 減小的方法。另外，優選為A =結合有N型糖鏈部位的量，胰腺癌患者與健康人相比A/B值 增大的方法。
[0050] B =胰臟特異性的RNase 1的能夠進行N型糖鏈修飾的部位的量的情況下，對於 其求出方法沒有特別的限定，例如，可以求出胰臟特異性的RNase 1的量，換算該值而作為 B的值。具體而言，胰臟特異性的RNase 1，如前所述，具有3個能夠進行N型糖鏈修飾的部 位（序列號2的第34位，第76位，第88位的天冬醯胺殘基），所以測定作為測定對象的其 任一個或2個部位或者所有的部位的量時，與其相應地，B =胰臟特異性的RNase 1的能夠 進行N型糖鏈修飾的部位的量也可以分別換算成胰臟特異性的RNase 1的量的1倍、2倍或 3倍。需要說明的是，胰臟特異性的RNase 1的量例如可以通過使用免疫學的測定法、質譜 分析的方法而求出。
[0051] 需要說明的是，胰臟特異性的RNase 1如前所述具有3個能夠進行N型糖鏈修飾 的部位（序列號2的第34位，第76位，第88位的天冬醯胺殘基）。其任一個或兩個部位或 者所有的部位中，可以通過測定結合有N型糖鏈的部位的量或沒有結合N型糖鏈的部位的 量，或者可以通過求出該量與胰臟特異性的RNase 1的能夠進行N型糖鏈修飾的部位的量 的比而檢測癌。特別是，作為能夠進行N型糖鏈修飾的部位，如果對於序列號2的第88位 的天冬醯胺殘基測定上述的量，則可見癌患者與健康人的這些值存在顯著的差異，所以作 為癌的檢測方法而優選。同樣地，也優選針對序列號2的第76位或第34位的天冬醯胺殘 基測定上述的量。
[0052] 另外，本發明為一種單克隆抗體或其片段，其將胰臟特異性的RNase 1的能夠進 行N型糖鏈修飾的部位作為抗原識別位點的一部分。對於這樣的單克隆抗體，例如，可以 將胰臟特異性的RNase 1或包含其能夠進行N型糖鏈修飾的部位的附近的肽序列作為免 疫原，按照常規方法進行製作。另外，抗體的抗原特異性可以使用標準分析例如，ELISA或 FACS分析確定該抗體與抗原決定基的結合。另外，作為單克隆抗體的片段，可列舉出：用各 種各樣的酶將全部抗體消化而得到的Fab或F(ab'） 2片段等。這樣的單克隆抗體或其片段 中，本發明中，特別優選在胰臟特異性的RNase 1的能夠進行N型糖鏈修飾的部位沒有結合 糖鏈的情況下與該部位結合，在結合有N型糖鏈的情況下與該部位的結合被阻礙。
[0053] 進而，這樣的單克隆抗體或其片段中，本發明中，抗原識別位點優選為包含序列號 2所示的序列的第88位的天冬醯胺殘基的區域。特別優選為將胰臟特異性的RNase 1的能 夠進行糖鏈修飾的部位中位於羧基最末端側的部位的胺基酸序列（序列號3)包含於識別 位點的一部分的單克隆抗體或其片段。作為這樣的單克隆抗體，可列舉出：本發明中製作的 抗人胰臟特異性的RNase 1單克隆抗體RrhRN0723。該單克隆抗體RrhRN0723的胰臟特異 性的RNase 1的能夠進行N型糖鏈修飾的部位中，序列號2的第88位的天冬醯胺殘基結合 有N型糖鏈的情況下，與胰臟特異性的RNase 1的結合被阻礙。
[0054] 另外，本發明為一種單克隆抗體或其片段，其特徵在於，能夠與將胰臟特異性的 RNase 1的能夠進行N型糖鏈修飾的部位作為抗原識別位點的一部分的單克隆抗體或其片 段同時地結合於胰臟特異性的RNase 1。這樣的單克隆抗體例如篩選如下的單克隆抗體即 可：將胰臟特異性的RNase 1作為免疫原、按照常規方法製作的、能夠與識別上述的胰臟特 異性的RNase 1的能夠進行N型糖鏈修飾的部位的單克隆抗體或其片段同時地結合於胰臟 特異性的RNase。另外，單克隆抗體的片段，可列舉出例如，用各種各樣的酶將全部抗體消化 而得到的Fab或F(ab'） 2片段等。作為這樣的單克隆抗體，可列舉出：本發明中製作的抗人 胰臟特異性的RNase 1單克隆抗體MrhRN0614。該單克隆抗體MrhRN0614能夠與前述的單 克隆抗體RrhRN0723同時地結合於胰臟特異性的RNase 1。
[0055] 本發明中，這樣的單克隆抗體或其片段可以用鹼性磷酸酶、過氧化物酶、生物素、 異硫氰酸螢光素等標記。
[0056] 另外，本發明為一種癌的檢測方法，使（a)將胰臟特異性的RNase 1的能夠進行N 型糖鏈修飾的部位作為抗原識別位點的一部分的單克隆抗體或其片段與試樣接觸，測定與 (a)的單克隆抗體或其片段形成複合體的胰臟特異性的RNase 1。作為這樣的方法，可列舉 出例如：競爭法、抗體晶片法（antibody array method)。
[0057] 另外，本發明為一種癌的檢測方法，在上述（a)的單克隆抗體或其片段的基礎上， 使作為（b)的能夠與（a)同時地結合於胰臟特異性的RNase 1的單克隆抗體或其片段與 試樣接觸，測定與（a)和（b)的2種單克隆抗體或抗體片段形成複合體的、胰臟特異性的 RNase 1的能夠進行糖鏈修飾的、結合有N型糖鏈的部位或沒有結合的部位的量。此時，（a) 和（b)的單克隆抗體或其片段可以同時地與試樣接觸，但優選依次使之接觸。依次使之接 觸的情況下，包括：使試樣與（a)或（b)的一者接觸的第一接觸工序；和，接著使第一接觸 工序中得到的物質與（a)或（b)的另一者接觸的第二接觸工序。此時，優選在第一接觸工序 中使試樣與（b)接觸，接著在第二接觸工序中使其與（a)接觸。作為（a)、(b)，可以使用前 述的本發明的單克隆抗體或其片段；特別是，作為（a)進而優選使用單克隆抗體RrhRN0723 或其片段，作為（b)進而優選使用單克隆抗體MrhRN0614或其片段。作為這樣的方法，例如， 除了 ELISA法、EIA法之外，還可以通過液相色譜法、高效液相色譜法、免疫層析法等，分離 並測定形成的免疫複合體。
[0058] 這樣，將胰臟特異性的RNase 1的能夠進行N型糖鏈修飾的部位作為抗原識別位 點的一部分的單克隆抗體或其片段可以作為診斷藥物等藥品使用。
[0059] 本發明中，作為求出糖蛋白的能夠進行N型糖鏈修飾的、結合有N型糖鏈的部位或 沒有結合N型糖鏈的部位的量的方法，沒有特別的限定，可以為使用了如上述的免疫分析 的方法，也可以通過質譜分析法而求出。通過質譜分析法求出的情況下，例如用酶等分解 糖蛋白，用質譜分析器等測定得到的肽片段和/或糖肽片段的質量，由此能夠求出糖蛋白 的能夠進行N型糖鏈修飾的、結合有N型糖鏈的部位或沒有結合N型糖鏈的部位的量。使 用質譜分析器的方法中，作為由糖蛋白得到肽片段的方法，可列舉出例如：如J. Pr〇teome Res. 3, 556-566 (2004)所報告那樣，利用糖苷酶的一系列去除糖鏈的處理和利用內切型肽 酶的蛋白質的肽骨架的片段化。如果列舉利用糖苷酶的一系列去除糖鏈的處理的一例，則 有如下方法：使用選自作為外切型糖苷酶的唾液酸酶、半乳糖苷酶、氨基己糖苷酶、甘露糖 苷酶、巖藻糖苷酶中的一種以上的酶、以及對於N型糖鏈的主幹結構部分的殼二糖結構起 作用的內切型糖苷酶例如內切糖苷酶H等，使N-乙醯基葡萄糖胺的單糖結構殘留於能夠進 行N型糖鏈修飾的部位的天冬醯胺殘基上。該方法中，由於N-乙醯基葡萄糖胺的單糖結構 殘留於蛋白質的肽骨架上，所以通過任意的內切型肽酶處理而得到的片段中，由胺基酸序 列通過計算求出的推定分子量檢測與N-乙醯基葡萄糖胺的分子量相應地質量增加了的糖 肽片段，由此能夠判斷特定的能夠進行N型糖鏈修飾的部位中的糖鏈的附加狀態。通過以 上所列舉的方法分析胰臟特異性的RNase 1，由此能夠通過質譜分析法確認糖鏈附加狀態 的有無。
[0060] 發明的效果
[0061] 通過本發明，能夠進行癌的檢測、特別是胰腺癌的檢測。另外，通過本發明，能夠提 供將胰臟特異性的RNase 1的能夠進行N型糖鏈修飾的部位作為抗原識別位點的一部分的 單克隆抗體、及能夠與該單克隆抗體同時地結合於胰臟特異性的RNase 1的單克隆抗體。 使用這2種抗體，能夠進行前述的癌的檢測。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0062] 圖1為表示實施例2中測定抗人胰臟特異性的RNase 1抗體對於導入糖鏈修飾缺 失突變的抗原的結合性的結果的圖。
[0063] 圖2為表不實施例2中測定抗人胰臟特異性的RNase 1抗體對於導入胺基酸置換 突變的抗原的結合性的結果的圖。
[0064] 圖3為表不實施例2中對於導入糖鏈修飾缺失突變的抗原mOOl的糖鏈結合狀態 進行分析的結果的圖。
[0065] 圖4為表示實施例2中對於各組分中的α -甲基甘露糖苷的濃度、與抗人胰臟特 異性的RNase 1抗體的結合性進行測定的結果的圖。
[0066] 圖5為表示實施例3中測定被檢體中的糖鏈修飾胰臟特異性的RNase 1的結果的 圖。
[0067] 圖6為表示實施例3中胰腺癌與非胰腺癌的測定值的分布和2組間的顯著性差異 的圖。
[0068] 圖7為表不實施例3中胰腺癌與非胰腺癌的ROC統計分析的結果的圖。
[0069] 圖8為表示實施例4中，用免疫印跡法（Western blot)研究抗人胰臟特異性的 RNase 1肽抗體的抗原識別性能的結果的圖。
[0070] 圖9為表示實施例4中，通過使用了抗人胰臟特異性的RNase 1肽抗體的免疫印 跡法，考察定健康人血清和胰腺癌患者血清中的胰臟特異性的RNasel的Asn88中有無糖鏈 結合的結果的圖。
[0071] 圖10為表示實施例5中，抗人胰臟特異性的RNase 1抗體RrhRNllll對於導入糖 鏈修飾缺失突變的抗原的結合性的結果的圖。
[0072] 圖11為表示實施例5中，由健康人和胰腺癌的RNase 1的測定值求出F3/t值和 G3/t值的結果的圖。
[0073] 圖12為表示實施例6中，通過使用了 RrhRN0723抗體的抗原固相競爭法測定競爭 抗原的稀釋系列的結果的圖。

【具體實施方式】
[0074] 實施例1
[0075] 實施例1抗體的製備
[0076] 免疫原的調製
[0077] 為了取得包含人胰臟特異性的RNase 1全長的多肽，在昆蟲細胞中能夠表達的 質粒載體中插入編碼成熟型人胰臟特異性的RNase 1(序列號2)的基因序列，從而制 備表達質粒。詳細地說，在昆蟲細胞重組蛋白質表達用質粒即pIZ/V5His vector(Life Technologies Japan Ltd.)的多克隆位點從5'上遊側起依序插入編碼人免疫球蛋白κ 鏈（kappa chain)的基因序列、編碼His標記的基因序列、編碼FLAG標記的基因序列、編 碼人胰臟特異性的RNase 1的基因序列（序列號1)中去除了相當於作為信號肽的氨基 酸第1位至第28為止的84個核酸殘基的基因的區域（序列號2)。對於所製備的表達 質粒pIZ-KFH-hRNase 1確認到重組體人胰臟特異性的RNase 1被分泌至培養基中，所 述重組體人胰臟特異性的RNase 1是通過對昆蟲細胞株Sf9使用Cellfectin II (Life Technologies Japan Ltd.)實施基因導入而在N末端側附加有人免疫球蛋白κ鏈而成的。 從培養上清中將被分泌至培養基中的蛋白質通過使用了抗人免疫球蛋白κ輕鏈抗體的親 和純化進行濃縮純化，製成為免疫原。
[0078] 對免疫動物的免疫
[0079] 使用上述的免疫原對小鼠和大鼠實施免疫。詳細而言,為對小鼠進行免疫的情況 下，將IOOyg的免疫原與弗氏完全佐劑（Complete Freund's adjuvant) -起，對6周齡 Balb/c雌小鼠腹腔進行給予,作為初次免疫。之後,在7天後、14天後、21天後、28天後、35 天后將免疫原100 μ g與弗氏不完全佐劑（incomplete Freund's adjuvant) -起進行腹腔 給予，作為追加免疫。進而，在42天後,將免疫原100 μ g與生理鹽水一起進行腹腔給予,作 為最終免疫。對大鼠進行免疫的情況下，將100 μ g的免疫原與弗氏完全佐劑一起，對6周 齡WHY雌大鼠兩後肢足墊進行給予,作為初次免疫。之後,在28天後將免疫原IOOyg與生 理鹽水一起對後肢足墊進行給予，作為最終免疫。
[0080] 抗體產生雜交瘤的製備
[0081] 最終免疫3天後，由小鼠摘除脾臟，回收脾臟細胞。由大鼠摘除髂淋巴結（iliac lymph nodes)和鼠腹股溝淋巴結（inguinal lymph nodes),得到淋巴結細胞。使小鼠脾臟 細胞和大鼠淋巴結細胞分別與小鼠骨髓瘤細胞株通過電細胞融合法融合之後，用添加了次 黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷的GIT培養基（和光純藥工業株式會社）接種至細胞培 養用96孔板，由此選擇融合細胞。
[0082] 小鼠抗人胰臟特異性的RNase 1抗體產生融合細胞株的選定
[0083] 小鼠抗人胰臟特異性的RNase 1抗體產生融合細胞株如下選擇：以融合細胞在培 養基中分泌的抗體對於重組體人胰臟特異性的RNase 1的反應性作為指標，利用ELISA法 進行篩選，從而選擇。篩選中所使用的ELISA如下。向96孔微量滴定板（Greiner bio-one 制）的各孔中加入包含25ng的山羊抗人免疫球蛋白κ鏈抗體（Sigma-Aldrich Japan K.K.制）的磷酸緩衝液（50mM磷酸鈉、150mM NaCl、pH7. 4)5(^1，在4°〇下固定16小時。 將這些孔用300μ 1的洗滌液（20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7. 4)洗滌3次之後，加入包 含3%85六的封閉溶液（3%85六，20禮1^8-!1(：1，15〇1111恥(：14!17.4)20(^1，在室溫下放 置2小時進行封閉（抗人免疫球蛋白κ鏈抗體固相化板）。將各孔用300 μ 1的洗滌液洗 滌 3 次之後，加入用稀釋液（l%BSA、20mM Tris-HCl，150mM NaCl、0. 05%Tween-20、pH7. 4) 以0. 5 μ g/ml的方式稀釋的重組體人胰臟特異性的RNase 1，在室溫下放置I小時。將各 孔用包含30(^1的表面活性劑的洗滌液（20禮1^8-!1(：1，1501111恥(：1、0.05%了￥6611-20、 pH7. 4)洗滌3次之後，加入50 μ 1的融合細胞培養上清，在室溫下放置1小時。接著，將各 孔用300 μ 1的包含表面活性劑的洗滌液洗滌3次之後，加入包含0. 01 μ g的用辣根過氧化 物酶（HRP)標記過的抗小鼠 IgG抗體（Rockland公司制）的稀釋液50 μ 1，在室溫下放置1 小時。最後，將各孔用300 μ 1的包含表面活性劑的洗滌液洗滌3次之後，添加50 μ 1的四 甲基聯苯胺（TMB)溶液（KPL公司制），使之顯色15分鐘之後，添加 IM的磷酸溶液而停止反 應，測定450nm的吸光度。根據篩選的結果，得到產生對胰臟特異性的RNase 1表現出強的 親和性的抗體的融合細胞。得到的融合細胞通過有限稀釋法被單克隆化，得到單克隆抗體 MrhRN0614〇
[0084] 大鼠抗人胰臟特異性的RNase 1抗體產生融合細胞株的選定
[0085] 對於大鼠抗人胰臟特異性的RNase 1抗體產生融合細胞株，以融合細胞在培養基 中分泌的抗體對於來源於人胰腺癌細胞（Capanl)的胰臟特異性的RNase 1的反應性作為 指標，通過ELISA法進行篩選，從而選擇。篩選中所使用的ELISA如下。向96孔微量滴定 板（Greiner bio-one制）的各孔中加入包含25ng的小鼠抗人胰臟特異性的RNase 1抗 體（MrhRN0614)的磷酸緩衝液（50mM磷酸鈉、150mMNaCl、pH7. 4)50μ 1，在4°C下固定16小 時。將這些孔用300μ 1的洗滌液（20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7. 4)洗滌3次之後，力口 入包含 3%BSA 的封閉溶液（3%BSA，20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7.4)200yl，在室溫 下放置2小時進行封閉（抗人胰臟特異性的RNase 1抗體固相化板）。將各孔用300 μ 1的 洗滌液（20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7. 4)洗滌 3 次之後，加入用稀釋液（1% BSA、20mM Tris-HCl，150mM NaCl、0. 05 % Tween-20、ρΗ7· 4)稀釋至 2 倍的人胰腺癌細胞（Capanl) 的培養上清，在室溫下放置1小時。將各孔用300 μ 1的包含表面活性劑的洗滌液（20mM Tris-HCl，150mM NaCl、0. 05% Tween-20、ρΗ7· 4)洗滌 3 次之後，加入 50μ 1 的融合細胞培 養上清，在室溫下放置1小時。接著，將各孔用300 μ 1的包含表面活性劑的洗滌液洗滌3次 之後，加入包含0.01 μ g的被HRP標記過的抗大鼠 IgG抗體（American Qualex Antibodies 公司制）的稀釋液50 μ 1，在室溫下放置1小時。最後，將各孔用300 μ 1的包含表面活性劑 的洗滌液洗滌3次之後，添加50 μ 1的TMB溶液使之顯色15分鐘之後，添加 IM的磷酸溶液 而停止反應，測定450nm處的吸光度。根據篩選的結果，得到產生對胰臟特異性的RNase 1 表現出強的親和性的抗體的融合細胞。得到的融合細胞通過有限稀釋法被單克隆化，得到 單克隆抗體RrhRN0723。
[0086] 實施例2抗體的特異性測定
[0087] 利用哺乳動物表達系統的重組體人胰臟特異性的RNase 1的調製
[0088] 為了在哺乳動物細胞中取得包含人胰臟特異性的RNase 1全長的多肽，在 pcDNA3.1_mycHis載體（Life Technologies Japan Ltd.)中插入編碼人胰臟特異性的 RNase 1的基因序列（序列號2)，製備表達載體。更詳細而言，將用於免疫原的調製而制 備的昆蟲細胞表達用質粒（pIZ-KFH-hRNase 1)的編碼重組體蛋白質的基因序列部分通過 分子生物學的手法插入至pcDNA3. InycHis載體（Life Technologies Japan Ltd.)中， 從而製備pcDNA-KFH-hRNase 1。對於所製備的哺乳動物細胞用表達質粒確認到有重組體 人胰臟特異性的RNasel被分泌至培養基中；所述重組體人胰臟特異性的RNase 1是通過 對來源於中國倉鼠卵巢的培養細胞株（以下、CH0-K1株）使用Lipofectamine 2000 (Life Technologies Japan Ltd.)實施基因導入而在N末端側附加有人免疫球蛋白κ鏈而成的。 從培養上清中將被分泌至培養基中的蛋白質通過使用了抗人免疫球蛋白κ輕鏈抗體的親 和純化進行濃縮純化，得到重組體人胰臟特異性的RNasel。被純化的重組體人胰臟特異性 的RNase 1供於用於明確抗體的特異性的實驗中。
[0089] 糖鏈修飾缺失突變抗原的調製
[0090] 將前項製備的表達載體（pcDNA-KFH-hRNase 1)作為模板，用PCR突變導入法重複 導入胺基酸置換突變，製備表達導入了糖鏈修飾缺失突變的抗原的質粒。PCR突變導入法 中，使用 PrimeSTAR Mutagenesis Basal Kit(TAKARA BIO INC.)，按照附加的說明書進行實 施。詳細而言，通過將能夠進行N型糖鏈修飾的部位的共有序列（Asn-Xaa-Ser/Thr、Xaa是 指脯氨酸以外的胺基酸殘基）的第3位的胺基酸殘基置換成絲氨酸殘基或蘇氨酸殘基以外 的胺基酸，從而製備表達糖鏈修飾缺失突變重組體人胰臟特異性的RNase 1的質粒（表1)。 對於所製備的導入了糖鏈修飾缺失突變的表達質粒，確認到有糖鏈修飾缺失突變重組體人 胰臟特異性的RNase 1被分泌至培養基中，所述糖鏈修飾缺失突變重組體人胰臟特異性的 RNase 1 是通過對 CH0-K1 株使用 Lipofectamine2000 (Life Technologies Japan Ltd.)實 施基因導入而在N末端側附加有人免疫球蛋白κ鏈而成的。被分泌至培養基中的糖鏈修 飾缺失突變重組體人胰臟特異性的RNase 1供於用於明確抗體的特異性的實驗中。
[0091] [表 1]
[0092]

【權利要求】
1. 一種癌的檢測方法，其特徵在於，測定糖蛋白的能夠進行N型糖鏈修飾的部位的、結 合有N型糖鏈的部位或沒有結合N型糖鏈的部位的量。
2. 根據權利要求1所述的方法，其中，癌為胰腺癌。
3. 根據權利要求1或2所述的方法，其中，糖蛋白為胰臟特異性的核糖核酸酶1。
4. 根據權利要求2或3所述的方法，其中，胰腺癌患者與健康人相比，結合有N型糖鏈 的部位的量增加。
5. -種癌的檢測方法，其特徵在於，求出下述A、B中的A與B的比： A =糖蛋白的能夠進行N型糖鏈修飾的部位的、結合有N型糖鏈的部位或沒有結合N型 糖鏈的部位的量， B =糖蛋白的能夠進行N型糖鏈修飾的部位的量。
6. 根據權利要求5所述的方法，其中，癌為胰腺癌。
7. 根據權利要求5或6所述的方法，其中，糖蛋白為胰臟特異性的核糖核酸酶1。
8. 根據權利要求6或7所述的方法，其為A =沒有結合N型糖鏈的部位的量，胰腺癌患 者與健康人相比A/B的值減小的方法。
9. 根據權利要求6或7所述的方法，其為A =結合有N型糖鏈的部位的量，胰腺癌患者 與健康人相比A/B的值增大的方法。
10. 根據權利要求7?9中的任一項所述的方法，其為求出胰臟特異性的核糖核酸酶1 的量、換算該值作為B的值的方法。
11. 根據權利要求1?10中的任一項所述的方法，其中，能夠進行N型糖鏈修飾的部位 為選自序列號2所示的序列的第34位、第76位和第88位的1個以上的天冬醯胺殘基。
12. 根據權利要求11所述的方法，其中，能夠進行N型糖鏈修飾的部位為序列號2所示 的序列的第88位的天冬醯胺殘基。
13. 根據權利要求11所述的方法，其中，能夠進行N型糖鏈修飾的部位為序列號2所示 的序列的第76位的天冬醯胺殘基。
14. 根據權利要求11所述的方法，其中，能夠進行N型糖鏈修飾的部位為序列號2所示 的序列的第34位的天冬醯胺殘基。
15. -種單克隆抗體或其片段，其將胰臟特異性的核糖核酸酶1的能夠進行N型糖鏈修 飾的部位作為抗原識別位點的一部分。
16. 根據權利要求15所述的單克隆抗體或其片段，其中，在胰臟特異性的核糖核酸酶1 的能夠進行N型糖鏈修飾的部位沒有結合糖鏈的情況下，單克隆抗體或其片段與該部位結 合，在胰臟特異性的核糖核酸酶1的能夠進行N型糖鏈修飾的部位結合有N型糖鏈的情況 下，單克隆抗體或其片段與該部位的結合被阻礙。
17. 根據權利要求15或16所述的單克隆抗體或其片段，其中，抗原識別位點為包含序 列號2所示的序列的第88位的天冬醯胺殘基的區域。
18. -種單克隆抗體或其片段，其特徵在於，能夠與權利要求15?17中的任一項所述 的單克隆抗體或其片段同時地結合於胰臟特異性的核糖核酸酶1。
19. 根據權利要求1?14中的任一項所述的方法，其中，使（a)權利要求15?17中的 任一項所述的單克隆抗體或其片段與試樣接觸，測定與（a)的單克隆抗體或其片段形成了 複合體的胰臟特異性的核糖核酸酶1。
20. 根據權利要求19所述的方法，其中，進一步使（b)權利要求18所述的單克隆抗體 或其片段與試樣接觸，測定與（a)和（b)的兩種單克隆抗體或抗體片段形成了複合體的胰 髒特異性的核糖核酸酶1。
21. 根據權利要求20所述的方法，其包括：使試樣與（a)或（b)的一者接觸的第一接 觸工序；和使第一接觸工序中得到的物質與（a)或（b)的另一者接觸的第二接觸工序。
22. -種藥品，其特徵在於，含有權利要求15?17中的任一項所述的單克隆抗體或其 片段。
23. 根據權利要求1?14中的任一項所述的方法，其中，通過質譜分析法求出糖蛋白的 能夠進行N型糖鏈修飾的部位的、結合有N型糖鏈的部位或沒有結合N型糖鏈的部位的量。
24. 根據權利要求23所述的方法，其為通過質譜分析法測定糖蛋白的肽片段和/或糖 肽片段的質量的方法。
【文檔編號】A61K39/395GK104364374SQ201380030868
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2013年6月10日 優先權日:2012年6月11日
【發明者】仲田大輔 申請人:東曹株式會社