一種基於羧基化多壁碳納米管與Fe3O4CPd構建的乳腺癌標誌物免疫傳感器的製備方法及應用的製作方法
2023-05-17 09:41:51
一種基於羧基化多壁碳納米管與Fe3O4CPd構建的乳腺癌標誌物免疫傳感器的製備方法及應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種基於羧基化多壁碳納米管與Fe3O4CPd構建的乳腺癌標誌物免疫傳感器的製備方法及應用，屬於新型功能材料、生物傳感檢測【技術領域】。基於Fe3O4CPd比表面積大，催化效率高等特點，顯著提高了免疫傳感器的靈敏度和穩定性，對腫瘤的早期診斷具有重要的意義。
【專利說明】—種基於羧基化多壁碳納米管與Fe304@C@Pd構建的乳腺癌標誌物免疫傳感器的製備方法及應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種基於羧基化多壁碳納米管與Fe3O4OOgPd構建的乳腺癌標誌物免疫傳感器。具體是米用核殼Fe3O4OCOPd,製備一種檢測乳腺癌標誌物的夾心型電化學免疫傳感器，屬於新型功能材料與生物傳感檢測【技術領域】。
【背景技術】
[0002]免疫傳感器是將免疫學方法與分析化學方法相結合的一種生物傳感器，通過抗原與抗體之間的特性性結合，使得它具有高靈敏性、高選擇性、分析快速和操作簡便等優點。電化學免疫傳感器具有靈敏度高、選擇性好、結構簡單、操作簡便、易於小型化、可連續、快速自動化檢測分析等優點，因此本發明一種基於羧基化多壁碳納米管與Fe3O4OCIgPd構建的乳腺癌標誌物免疫傳感器，實現了對乳腺癌標誌物的檢測。
[0003]本發明將羧基化多壁碳納米管引入到電化學免疫傳感器的製備中，利用其生物相容性及大的比表面積，實現抗體在電極表面的有效固定；利用其優異的電子傳遞能力，起到增強電化學信號的作用。通過EDC和NHS對羧基的活化作用，實現了抗體在電極表面的固定JfFe3O4OClgPd引入傳感器的製備中，構建了一種超靈敏的夾心型電化學免疫傳感器。在不使用酶的情況下，Fe3O4OClgPd對雙氧水H2O2有良好的催化能力，並在檢測過程中產生良好的電化學信號，有效地降低了傳感器的檢出限，可用於多種乳腺癌標誌物的分析。該方法具有成本低、靈敏度高、特異性好、檢測快速等優點，而且製備過程較為簡單，有效克服了目前乳腺癌標誌物檢測方法的不足。
[0004]申請號為CN200810031756.7的專利涉及到Fe3O4磁性納米顆粒的酶免疫傳感器；CN201110391104.6的專利涉及到Fe3O4磁性納米顆粒電化學發光免疫傳感器；CN201210088850.2的專利涉及到Fe3O4磁性納米顆粒與功能化的多壁碳納米管的複合膜的免疫傳感器；CN201210378644.5的專利涉及到Fe3O4磁性納米顆粒負載金和酶的化學發光免疫傳感器。本發明在Fe3O4磁性納米顆粒表面包覆一層碳後再進行鈀納米粒子的負載，形成一種核殼的結構。本發明在沒有使用酶的情況下，利用鈀納米粒子對H2O2的催化作用實現信號的放大作用。
【發明內容】
[0005]本發明的目的一在於，提供了一種靈敏度高、特異性強、重現性好、操作簡便的免疫傳感器；
本發明的目的二在於實現了對乳腺癌標誌物的靈敏檢測。
[0006]為了實現上述目的，本發明是通過以下措施來實現的。本發明的技術方案，包括以下步驟。
[0007]1.一種基於羧基化多壁碳納米管與Fe304@C@Pd構建的乳腺癌標誌物免疫傳感器的製備方法 (1)將直徑為3?5mm的玻碳電極用Al2O3拋光粉打磨，超純水清洗乾淨；
(2)將4?6μ?,Γ3 mg/mL羧基化多壁碳納米管的殼聚糖溶液滴塗在電極表面，滴加Γ6μ?、含有0.Γ0.4 mo I/L EDC和0.1 mo I/L NHS的混合溶液至電極表面，待電極微幹；
(3)滴加4飛μ?、6?14Pg/mL的乳腺癌標誌物捕獲抗體Ab1溶液至電極表面，超純水衝洗，4 °C冰箱中晾乾；
(4)滴加4飛PL、質量分數為0.19Γ0.3%的牛血清白蛋白BSA溶液至電極表面，以封閉電極表面上非特異性活性位點，超純水衝洗，4 °C冰箱中晾乾；
(5)滴加4飛μ?、0.5 pg/mL"lO ng/mL的一系列不同濃度的乳腺癌標誌物標準溶液至電極表面，超純水衝洗，4 0C冰箱中晾乾；
(6)滴加4飛μ?,Γ3mg/mL的檢測抗體孵化物Fe3O4OClgPd-Ab2溶液至電極表面，置於4 °C冰箱中晾乾，製得一種基於羧基化多壁碳納米管與Fe3O4OOgPd構建的乳腺癌標誌物免疫傳感器。
[0008]2.檢測抗體孵化物Fe3O4OCIgPd-Ab2溶液的製備
(1)羧基化多壁碳納米管的殼聚糖溶液的製備
將廣3 mg羧基化多壁碳納米管加入到I mL、0.1%的殼聚糖溶液中，超聲分散1(Γ20min，將溶液保存在4 °C下備用；所述0.1%的殼聚糖溶液，是將I g的殼聚糖溶於10 mL、0.02 mol/L的稀鹽酸溶液製得；
(2)檢測抗體孵化物Fe3O4OClgPd-Ab2溶液的製備
1)鈀納米顆粒溶液的製備
將0.2(H).30 mmol Na2PdCl4和0.15?0.35 mmol檸檬酸三鈉，溶於20 mL超純水中，立即加入0.6 mL.0.0r0.03 mol/LNaBH4溶液，持續攪拌25?35 S，溶液變為棕黑色，製得鈀納米顆粒溶液；
2)Fe3O4磁性微球的製備
將0.75?1.85 g FeCl3.6H20溶解於75 mL乙二醇中，磁力攪拌0.5?I h，得到亮黃色的溶液，加入2.6?4.6 g的乙酸鈉，攪拌0.5?1 h，將得到的溶液移至200 mL聚四氟乙烯襯裡的高壓反應釜中，在18(Γ220 1:高壓反應釜中密封加熱12?24 h，冷卻至室溫，將製得的黑色磁微球用磁鐵收集，依次用乙醇和超純水衝洗6次，在45飛5 1:真空條件下乾燥12 h，製得Fe3O4磁性微球；
3)Fe3O4OC磁性微球的製備
將0.15?0.25 g的Fe3O4磁性微球加入到150?240 mL、0.08?0.12 mol/L HNO3溶液中，超聲處理1(T15 min,超純水衝洗，處理後的Fe3O4磁性微球與0.4^0.6 mol/L葡萄糖溶液共混，分散並超聲處理1(T15 min，得到的懸浮液轉移至高壓反應釜中，在180 °C下加熱5?7h，冷卻至室溫，用磁鐵分離，超純水衝洗6次，50 1:真空條件下乾燥12 h，製得Fe3O4OC磁性微球；
4)檢測抗體標記物Fe3O4OClgPd磁性微球的製備
將8?12 mg的Fe3O4OC磁微球分散於20 mL、含有1.0X 1(Γ2?3.0X 1(T2 mol/L三羥甲基氨基甲烷和2.ΟΧΙΟ—2 mol/L NaCl的質量分數為0.10%?0.30%聚二烯丙烯基二甲基胺鹽酸鹽I3DDA的水溶液中，攪拌40 min，剩餘的聚二烯丙烯基二甲基胺鹽酸鹽TODA用磁鐵移除；吸收了聚二烯丙烯基二甲基胺鹽酸鹽TODA的微球用超純水衝洗3飛次，將此微球分散於12?18 mL鈀納米顆粒溶液中，攪拌40 min，利用磁鐵將上清液分離，所得固體用超純水衝洗3次，在50 1:真空條件下乾燥12 h，製得檢測抗體標記物Fe3O4OOgPd磁性微球；
5)檢測抗體孵化物Fe3O4OClgPd-Ab2溶液的製備
將I mL、8?12 Pg/mL的乳腺癌標誌物檢測抗體Ab2溶液，加入到2 mg檢測抗體標記物Fe304@C@Pd磁性微球中，4 °C恆溫振蕩培養箱中振蕩孵化12 h ;利用磁鐵分離得到固體，向該固體中加入I mL、pH=7.4磷酸鹽緩衝溶液，製得核殼檢測抗體孵化物Fe3O4OClgPd-Ab2溶液，4 °C下保存備用。
[0009]3.乳腺癌標誌物的檢測
(1)使用電化學工作站以三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲電極為輔助電極，所製備的傳感器為工作電極，在10 mL、pH=5.0?8.5磷酸鹽緩衝溶液中進行測試；
(2)用計時電流法對乳腺癌標誌物進行檢測，輸入電壓為-0.4 V，取樣間隔0.1 S，運行時間250 s ；
(3)當背景電流趨於穩定後，每隔50s向10 mL ρΗ=5.(Γ8.5磷酸鹽緩衝溶液中注入10 yL,5^10 mol/L的雙氧水溶液，記錄電流變化。
[0010]上述所述乳腺癌標誌物選自下列之一:CA153、CEA、CA549、hCG、降鈣素、鐵蛋白。
[0011]本發明的有益成果
(I)本發明採用的基底材料為羧基化多壁碳納米管，其與多壁碳納米管相比較，其保留了多壁碳納米管較大的表面積和較好的導電性，以及良好的生物相容性和穩定性，另外，其表面還有大量的羧基官能團，能夠增加抗體在其表面的負載量和在水中的分散性，增加了傳感器靈敏度和穩定性。
[0012](2)將殼聚糖應用到電化學免疫傳感器的製備當中，利用其優異的成膜性能，防止了羧基化多壁碳納米管從電極表面上脫落，同時利用殼聚糖具有很好的生物相容性和低毒性，有利於抗體在電極表面的固定。
[0013](3 )Fe304@C為立體球狀結構，具有亞微米尺寸，其大的表面積能夠增加鈀在其表面的負載量，進而增加檢測抗體的負載量，使傳感器實現了對腫瘤標誌物的超靈敏檢測。
[0014](4)將Fe304@C@Pd與腫瘤標誌物檢測抗體直接孵化，利用貴金屬優異的生物相容性和較高的催化性能，在檢測抗體的標記中不必使用酶，避免了因酶的失活和洩漏造成的檢測誤差，簡化了檢測抗體標記物的製作步驟，顯著提高了電化學免疫傳感器的重現性和穩定性。
[0015](5)本發明利用抗原、抗體的免疫反應，提高了檢測方法的特異性。
[0016](6)本發明製備的電化學免疫傳感器用於多種腫瘤標誌物的檢測，響應時間短，檢測限低，線性範圍寬，可以實現簡單、快速、高靈敏和特異性檢測，對乳腺癌標誌物檢測限最低可達 0.033 pg/mLo
【具體實施方式】
[0017]實施例1 一種基於羧基化多壁碳納米管與Fe3O4OCIgPd構建的乳腺癌標誌物免疫傳感器的製備方法
(I)將直徑為3?5 mm的玻碳電極用Al2O3拋光粉打磨，超純水清洗乾淨； (2)將4μ?、1 mg/mL羧基化多壁碳納米管的殼聚糖溶液滴塗在電極表面，滴加4 μ?、含有0.1 mol/L EDC和0.1 mol/L NHS的混合溶液至電極表面，待電極微幹；
(3)滴加4μ?、6 Pg/mL的乳腺癌標誌物捕獲抗體Ab1溶液至電極表面，超純水衝洗，4°C冰箱中晾乾；
(4)滴加4PL、質量分數為0.1%的牛血清白蛋白BSA溶液至電極表面，以封閉電極表面上非特異性活性位點，超純水衝洗，4 °C冰箱中晾乾；
(5)滴加4μ?、0.5 pg/mL"lO ng/mL的一系列不同濃度的乳腺癌標誌物標準溶液至電極表面，超純水衝洗，4 °C冰箱中晾乾；
(6)滴加4μ?、1 mg/mL的檢測抗體孵化物Fe3O4OClgPd-Ab2溶液至電極表面，置於4 V冰箱中晾乾，製得一種基於羧基化多壁碳納米管與Fe3O4OOgPd構建的乳腺癌標誌物免疫傳感器。
[0018]實施例2 —種基於羧基化多壁碳納米管與Fe3O4OCIgPd構建的乳腺癌標誌物免疫傳感器的製備方法
(1)將直徑為3?5mm的玻碳電極用Al2O3拋光粉打磨，超純水清洗乾淨；
(2)將5μ?、2 mg/mL羧基化多壁碳納米管的殼聚糖溶液滴塗在電極表面，滴加5 μ?、含有0.2 mol/L EDC和0.1 mol/L NHS的混合溶液至電極表面，待電極微幹；
(3)滴加5μ?、10 Pg/mL的乳腺癌標誌物捕獲抗體Ab1溶液至電極表面，超純水衝洗，4 °C冰箱中晾乾；
(4)滴加5PL、質量分數為0.2%的牛血清白蛋白BSA溶液至電極表面，以封閉電極表面上非特異性活性位點，超純水衝洗，4 °C冰箱中晾乾；
(5)滴加5μ?、0.5 pg/mL"lO ng/mL的一系列不同濃度的乳腺癌標誌物標準溶液至電極表面，超純水衝洗，4 °C冰箱中晾乾；
(6)滴加5μ?、2 mg/mL的檢測抗體孵化物Fe3O4OClgPd-Ab2溶液至電極表面，置於4 V冰箱中晾乾，製得一種基於羧基化多壁碳納米管與Fe3O4OOgPd構建的乳腺癌標誌物免疫傳感器。
[0019]實施例3 —種基於羧基化多壁碳納米管與Fe3O4OCIgPd構建的乳腺癌標誌物免疫傳感器的製備方法
(1)將直徑為3?5mm的玻碳電極用Al2O3拋光粉打磨，超純水清洗乾淨；
(2)將6μ?、3 mg/mL羧基化多壁碳納米管的殼聚糖溶液滴塗在電極表面，滴加6 μ?、含有0.4 mol/L EDC和0.1 mol/L NHS的混合溶液至電極表面，待電極微幹；
(3)滴加6μ?、14 Pg/mL的乳腺癌標誌物捕獲抗體Ab1溶液至電極表面，超純水衝洗，4 °C冰箱中晾乾；
(4)滴加6PL、質量分數為0.3%的牛血清白蛋白BSA溶液至電極表面，以封閉電極表面上非特異性活性位點，超純水衝洗，4 °C冰箱中晾乾；
(5)滴加6μ?、0.5 pg/mL"lO ng/mL的一系列不同濃度的乳腺癌標誌物標準溶液至電極表面，超純水衝洗，4 °C冰箱中晾乾；
(6)滴加6μ?、3 mg/mL的檢測抗體孵化物Fe3O4OClgPd-Ab2溶液至電極表面，置於4 V冰箱中晾乾，製得一種基於羧基化多壁碳納米管與Fe3O4OOgPd構建的乳腺癌標誌物免疫傳感器。
[0020]實施例4檢測抗體孵化物Fe3O4OCIgPd-Ab2溶液的製備
(1)羧基化多壁碳納米管的殼聚糖溶液的製備
將I mg羧基化多壁碳納米管加入到I mL、0.1%的殼聚糖溶液中，超聲分散10 min，將溶液保存在4 °C下備用；所述0.1%的殼聚糖溶液，是將I g的殼聚糖溶於10 mL、0.02 mo I/L的稀鹽酸溶液製得；
(2)檢測抗體孵化物Fe3O4OClgPd-Ab2溶液的製備
1)鈀納米顆粒溶液的製備
將0.20 mmol Na2PdCl4和0.15mmoI檸檬酸三鈉，溶於20 mL超純水中，立即加入0.6mL、0.0lmoVLNaBH4溶液，持續攪拌25s，溶液變為棕黑色，製得鈀納米顆粒溶液；
2)Fe3O4磁性微球的製備
將0.75 g FeCl3.6H20溶解於75 mL乙二醇中，磁力攪拌0.5 h，得到亮黃色的溶液，加入2.6g的乙酸鈉，攪拌0.5 h，將得到的溶液移至200 mL聚四氟乙烯襯裡的高壓反應釜中，在180°C高壓反應釜中密封加熱12 h，冷卻至室溫，將製得的黑色磁微球用磁鐵收集，依次用乙醇和超純水衝洗6次，在45°C真空條件下乾燥12 h，製得Fe3O4磁性微球；
3)Fe3O4OC磁性微球的製備
將0.15g的Fe3O4磁性微球加入到150 mL、0.08 mol/L HNO3溶液中，超聲處理10 min,超純水衝洗，處理後的Fe3O4磁性微球與0.4 mol/L葡萄糖溶液共混，分散並超聲處理10min，得到的懸浮液轉移至高壓反應釜中，在180 °C下加熱5h，冷卻至室溫，用磁鐵分離，超純水衝洗6次，50 1:真空條件下乾燥12 h，製得Fe3O4OC磁性微球；
4)檢測抗體標記物Fe3O4OClgPd磁性微球的製備
將8 mg的Fe3O4OC磁微球分散於20 mL、含有1.0X 10_2 mol/L三羥甲基氨基甲烷和2.0X10—2 mol/L NaCl的質量分數為0.10%聚二烯丙烯基二甲基胺鹽酸鹽TODA的水溶液中，攪拌40 min，剩餘的聚二烯丙烯基二甲基胺鹽酸鹽TODA用磁鐵移除；吸收了聚二烯丙烯基二甲基胺鹽酸鹽I3DDA的微球用超純水衝洗3次，將此微球分散於12 mL鈀納米顆粒溶液中，攪拌40 min,利用磁鐵將上清液分離，所得固體用超純水衝洗3次，在50 1:真空條件下乾燥12 h,製得檢測抗體標記物Fe304@C@Pd磁性微球；
5)檢測抗體孵化物Fe3O4OClgPd-Ab2溶液的製備
將I mL、8Pg/mL的乳腺癌標誌物檢測抗體Ab2溶液，加入到2 mg檢測抗體標記物Fe304@C@Pd磁性微球中，4 °C恆溫振蕩培養箱中振蕩孵化12 h ;利用磁鐵分離得到固體，向該固體中加入I mL、pH=7.4磷酸鹽緩衝溶液，製得核殼檢測抗體孵化物Fe3O4OClgPd-Ab2溶液，4 °C下保存備用。
[0021]實施例5檢測抗體孵化物Fe3O4OCIgPd-Ab2溶液的製備
(1)羧基化多壁碳納米管的殼聚糖溶液的製備
將2 mg羧基化多壁碳納米管加入到I mL、0.1%的殼聚糖溶液中，超聲分散15min，將溶液保存在4 °C下備用；所述0.1%的殼聚糖溶液，是將I g的殼聚糖溶於10 mL、0.02 mol/L的稀鹽酸溶液製得；
(2)檢測抗體孵化物Fe3O4OClgPd-Ab2溶液的製備
I)鈀納米顆粒溶液的製備
將0.25 mmol Na2PdCl4和0.25 mmol檸檬酸三鈉，溶於20 mL超純水中，立即加入0.6mL、0.02 mol/LNaBH4溶液，持續攪拌30 s，溶液變為棕黑色，製得鈀納米顆粒溶液；
2)Fe3O4磁性微球的製備
將1.50 g FeCl3.6H20溶解於75 mL乙二醇中，磁力攪拌0.75 h，得到亮黃色的溶液，加入3.6 g的乙酸鈉，攪拌0.8 h，將得到的溶液移至200 mL聚四氟乙烯襯裡的高壓反應釜中，在200°C高壓反應釜中密封加熱18 h，冷卻至室溫，將製得的黑色磁微球用磁鐵收集，依次用乙醇和超純水衝洗6次，在50 1:真空條件下乾燥12 h，製得Fe3O4磁性微球；
3)Fe3O4OC磁性微球的製備
將0.20 g的Fe3O4磁性微球加入到200 mL、0.10 mol/L HNO3溶液中，超聲處理12min，超純水衝洗，處理後的Fe3O4磁性微球與0.5 mol/L葡萄糖溶液共混，分散並超聲處理12min，得到的懸浮液轉移至高壓反應釜中，在180 °C下加熱6 h，冷卻至室溫，用磁鐵分離，超純水衝洗6次，50 1:真空條件下乾燥12 h，製得Fe3O4OC磁性微球；
4)檢測抗體標記物Fe3O4OClgPd磁性微球的製備
將10 mg的Fe3O4OC磁微球分散於20 mL、含有2.0X 10_2 mol/L三羥甲基氨基甲烷和2.0X 10_2 mol/L NaCl的質量分數為0.20%聚二烯丙烯基二甲基胺鹽酸鹽I3DDA的水溶液中，攪拌40 min，剩餘的聚二烯丙烯基二甲基胺鹽酸鹽TODA用磁鐵移除；吸收了聚二烯丙烯基二甲基胺鹽酸鹽I3DDA的微球用超純水衝洗4次，將此微球分散於15mL鈀納米顆粒溶液中，攪拌40 min,利用磁鐵將上清液分離，所得固體用超純水衝洗3次，在50 1:真空條件下乾燥12 h,製得檢測抗體標記物Fe304@C@Pd磁性微球；
5)檢測抗體孵化物Fe3O4OClgPd-Ab2溶液的製備
將I mUlOPg/mL的乳腺癌標誌物檢測抗體Ab2溶液，加入到2 mg檢測抗體標記物Fe304@C@Pd磁性微球中，4 °C恆溫振蕩培養箱中振蕩孵化12 h ;利用磁鐵分離得到固體，向該固體中加入I mL、pH=7.4磷酸鹽緩衝溶液，製得核殼檢測抗體孵化物Fe3O4OClgPd-Ab2溶液，4 °C下保存備用。
[0022]實施例6檢測抗體孵化物Fe3O4OCIgPd-Ab2溶液的製備
(1)羧基化多壁碳納米管的殼聚糖溶液的製備
將3 mg羧基化多壁碳納米管加入到I mL、0.1%的殼聚糖溶液中，超聲分散20 min，將溶液保存在4 °C下備用；所述0.1%的殼聚糖溶液，是將I g的殼聚糖溶於10 mL、0.02 mol/L的稀鹽酸溶液製得；
(2)檢測抗體孵化物Fe3O4OClgPd-Ab2溶液的製備
1)鈀納米顆粒溶液的製備
將0.30 mmol Na2PdCl4和0.35 mmol檸檬酸三鈉，溶於20 mL超純水中，立即加入0.6mL、0.03 mol/LNaBH4溶液，持續攪拌35 S，溶液變為棕黑色，製得鈀納米顆粒溶液；
2)Fe3O4磁性微球的製備
將1.85 g FeCl3.6H20溶解於75 mL乙二醇中，磁力攪拌I h，得到亮黃色的溶液，力口入4.6 g的乙酸鈉，攪拌I h，將得到的溶液移至200 mL聚四氟乙烯襯裡的高壓反應釜中，在220 1:高壓反應釜中密封加熱24 h，冷卻至室溫，將製得的黑色磁微球用磁鐵收集，依次用乙醇和超純水衝洗6次，在55 1:真空條件下乾燥12 h，製得Fe3O4磁性微球；
3)Fe3O4OC磁性微球的製備
將0.25 g的Fe3O4磁性微球加入到240 mL、0.12 mol/L HNO3溶液中，超聲處理15 min,超純水衝洗，處理後的Fe3O4磁性微球與0.6 mol/L葡萄糖溶液共混,分散並超聲處理15min，得到的懸浮液轉移至高壓反應釜中，在180 °C下加熱7 h，冷卻至室溫，用磁鐵分離，超純水衝洗6次，50 1:真空條件下乾燥12 h，製得Fe3O4OC磁性微球；
4)檢測抗體標記物Fe3O4OClgPd磁性微球的製備
將12 mg的Fe3O4OC磁微球分散於20 mL、含有3.0X 10_2 mol/L三羥甲基氨基甲烷和2.0X 10_2 mol/L NaCl的質量分數為0.30%聚二烯丙烯基二甲基胺鹽酸鹽I3DDA的水溶液中，攪拌40 min，剩餘的聚二烯丙烯基二甲基胺鹽酸鹽TODA用磁鐵移除；吸收了聚二烯丙烯基二甲基胺鹽酸鹽I3DDA的微球用超純水衝洗6次，將此微球分散於18 mL鈀納米顆粒溶液中，攪拌40 min,利用磁鐵將上清液分離，所得固體用超純水衝洗3次，在50 1:真空條件下乾燥12 h,製得檢測抗體標記物Fe304@C@Pd磁性微球；
5)檢測抗體孵化物Fe3O4OClgPd-Ab2溶液的製備
將I mL、12 Pg/mL的乳腺癌標誌物檢測抗體Ab2溶液，加入到2 mg檢測抗體標記物Fe304@C@Pd磁性微球中，4 °C恆溫振蕩培養箱中振蕩孵化12 h ;利用磁鐵分離得到固體，向該固體中加入I mL、pH=7.4磷酸鹽緩衝溶液，製得核殼檢測抗體孵化物Fe3O4OClgPd-Ab2溶液，4 °C下保存備用。
[0023]實施例7 CEA的檢測步驟
(1)使用電化學工作站以三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲電極為輔助電極，所製備的傳感器為工作電極，在10 mL、pH=5.0?8.5磷酸鹽緩衝溶液中進行測試；
(2)用計時電流法對CEA進行檢測，輸入電壓為-0.4 V，取樣間隔0.1 S，運行時間250
s ；
(3)當背景電流趨於穩定後，每隔50s向10 mL ρΗ=5.(Γ8.5磷酸鹽緩衝溶液中注入10 yL,5^10 mol/L的雙氧水溶液，記錄電流變化；
(4)線性範圍為0.50 pg/mL?10 ng/mL ;對CA153檢測限可達0.16 pg/mL。
[0024]實施例8 CA153的檢測步驟
按照實施例7 (I)?(3)的步驟進行測定，得到CA153的線性範圍為0.45 pg/mL?10ng/mL ;對 CA153 檢測限可達 0.12 pg/mL。
[0025]實施例9CA549的檢測步驟
按照實施例7 (I)?(3)的步驟進行測定，得到CA549的線性範圍為0.30 pg/mL?10ng/mL ；CA549 檢測限可達 0.11 pg/mL。
[0026]實施例10 hCG的檢測步驟
按照實施例7 (1Γ (3)的步驟進行測定，得到hCG的線性範圍為0.10 pg/πιΠθ ng/mL ;hCG 檢測限可達 0.033 pg/mL。
[0027]實施例11降鈣素的檢測步驟
按照實施例7 (I)?(3)的步驟進行測定，得到降鈣素的線性範圍為0.50 pg/πιΠθng/mL ;降|丐素檢測限可達0.15 pg/mL。
[0028]實施例12鐵蛋白的檢測步驟
按照實施例7 (I)?(3)的步驟進行測定，得到鐵蛋白的線性範圍為0.50 pg/πιΠθng/mL ;鐵蛋白檢測限可達0.16 pg/mL。
【權利要求】
1.一種基於羧基化多壁碳納米管與Fe304@C@Pd構建的乳腺癌標誌物免疫傳感器的製備方法，其特徵在於，步驟如下: (1)將直徑為3?5mm的玻碳電極用A1203拋光粉打磨，超純水清洗乾淨； (2)將4?6μ?,Γ3 mg/mL羧基化多壁碳納米管的殼聚糖溶液滴塗在電極表面，滴加Γ6μ?、含有0.Γ0.4 mol/L EDC和0.1 mol/L NHS的混合溶液至電極表面，待電極微幹； (3)滴加4飛μ?、6?14Pg/mL的乳腺癌標誌物捕獲抗體溶液至電極表面，超純水衝洗，4 °C冰箱中晾乾； (4)滴加4飛PL、質量分數為0.19Γ0.3%的牛血清白蛋白BSA溶液至電極表面，以封閉電極表面上非特異性活性位點，超純水衝洗，4 °C冰箱中晾乾； (5)滴加4飛μ?、0.5 pg/mL"lO ng/mL的一系列不同濃度的乳腺癌標誌物標準溶液至電極表面，超純水衝洗，4 °C冰箱中晾乾； (6)滴加4飛μ?,Γ3mg/mL的檢測抗體孵化物Fe304@C(gPd-Ab2溶液至電極表面，置於4 °C冰箱中晾乾，製得一種基於羧基化多壁碳納米管與Fe304@C(gPd構建的乳腺癌標誌物免疫傳感器。
2.如權利要求1所述的一種基於羧基化多壁碳納米管與Fe304@C@Pd構建的乳腺癌標誌物免疫傳感器的製備方法，所述檢測抗體孵化物Fe304@C@Pd-Ab2溶液，其特徵在於，製備步驟如下: (1)羧基化多壁碳納米管的殼聚糖溶液的製備 將廣3 mg羧基化多壁碳納米管加入到1 mL、0.1%的殼聚糖溶液中，超聲分散1(Γ20min，將溶液保存在4 °C下備用；所述0.1%的殼聚糖溶液，是將1 g的殼聚糖溶於10 mL、0.02 mol/L的稀鹽酸溶液製得； (2)檢測抗體孵化物Fe304@C@Pd-Ab2溶液的製備 1)鈀納米顆粒溶液的製備 將0.2(H).30 mmol Na2PdCl4和0.15?0.35 mmol檸檬酸三鈉，溶於20 mL超純水中，立即加入0.6 mL.0.0r0.03 mol/LNaBH4溶液，持續攪拌25?35 s，溶液變為棕黑色，製得鈀納米顆粒溶液； 2)Fe304磁性微球的製備 將0.75?1.85 g FeCl3.6H20溶解於75 mL乙二醇中，磁力攪拌0.5?1 h，得到亮黃色的溶液，加入2.6?4.6 g的乙酸鈉，攪拌0.5?1 h，將得到的溶液移至200 mL聚四氟乙烯襯裡的高壓反應釜中，在18(Γ220 1:高壓反應釜中密封加熱12?24 h，冷卻至室溫，將製得的黑色磁微球用磁鐵收集，依次用乙醇和超純水衝洗6次，在45飛5 1:真空條件下乾燥12 h，製得Fe304磁性微球； 3)Fe304iC磁性微球的製備 將0.15?0.25 g的Fe304磁性微球加入到150?240 mL、0.08?0.12 mol/L ΗΝ03溶液中，超聲處理1(T15 min,超純水衝洗，處理後的Fe304磁性微球與0.4^0.6 mol/L葡萄糖溶液共混，分散並超聲處理1(T15 min，得到的懸浮液轉移至高壓反應釜中，在180 °C下加熱5?7h，冷卻至室溫，用磁鐵分離，超純水衝洗6次，50 1:真空條件下乾燥12 h，製得Fe304@C磁性微球； 4)檢測抗體標記物Fe304@C@Pd磁性微球的製備 將8?12 mg的Fe304@C磁微球分散於20 mL、含有1.0X 1(Γ2?3.0X 1(T2 mol/L三羥甲基氨基甲烷和2.ΟΧΙΟ—2 mol/L NaCl的質量分數為0.10%?0.30%聚二烯丙烯基二甲基胺鹽酸鹽TODA的水溶液中，攪拌40 min，剩餘的聚二烯丙烯基二甲基胺鹽酸鹽TODA用磁鐵移除；吸收了聚二烯丙烯基二甲基胺鹽酸鹽TODA的微球用超純水衝洗3飛次，將此微球分散於12?18 mL鈀納米顆粒溶液中，攪拌40 min，利用磁鐵將上清液分離，所得固體用超純水衝洗3次，在50 1:真空條件下乾燥12 h，製得檢測抗體標記物Fe304@C(gPd磁性微球； 5)檢測抗體孵化物Fe304@C(gPd-Ab2溶液的製備 將1 mL、8?12 Pg/mL的乳腺癌標誌物檢測抗體Ab2溶液，加入到2 mg檢測抗體標記物Fe304@C@Pd磁性微球中，4 °C恆溫振蕩培養箱中振蕩孵化12 h ;利用磁鐵分離得到固體，向該固體中加入1 mL、pH=7.4磷酸鹽緩衝溶液，製得核殼檢測抗體孵化物Fe304@C(gPd-Ab2溶液，4 °C下保存備用。
3.如權利要求1所述的製備方法製備的一種基於羧基化多壁碳納米管與Fe304@C@Pd構建的乳腺癌標誌物免疫傳感器，其特徵在於，用於乳腺癌標誌物的檢測，檢測步驟如下: (1)使用電化學工作站以三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲電極為輔助電極，所製備的傳感器為工作電極，在10 mL、pH=5.0?8.5磷酸鹽緩衝溶液中進行測試； (2)用計時電流法對乳腺癌標誌物進行檢測，輸入電壓為-0.4V，取樣間隔0.1 s，運行時間250 s ； (3)當背景電流趨於穩定後，每隔50s向10 mL ρΗ=5.(Γ8.5磷酸鹽緩衝溶液中注入10 yL,5^10 mol/L的雙氧水溶液，記錄電流變化。
4.如權利要求1?3所述的一種基於羧基化多壁碳納米管與Fe304@C(gPd構建的乳腺癌標誌物免疫傳感器的製備方法，其特徵在於，所述乳腺癌標誌物選自下列之一:CA153、CEA、CA549、hCG、降鈣素、鐵蛋白。
【文檔編號】G01N33/543GK104407141SQ201410742743
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年12月9日 優先權日:2014年12月9日
【發明者】紀磊, 杜斌, 閆濤, 王曉東, 魏琴, 李月雲, 馬洪敏, 曹偉, 龐雪輝, 吳丹, 範大偉, 胡麗華 申請人:濟南大學