保護植物免受致病真菌侵害的方法
2023-05-17 06:41:36 2
專利名稱：：保護植物免受致病真菌侵害的方法
技術領域：
：本發明涉及通過使用具有抗真菌活性的多肽和編碼這些多肽的核酸序列保護植物免受真菌病原體侵害的方法.本發明的方法利用這些多肽和核酸序列控制植物真菌病原體並增強植物對真菌病原體的抗性.本發明還包括轉基因植物和種子.背景抹術植物中的疾病由生物的和非生物的原因引起.細胞內過程的宿主使得植物能夠防禦由致病劑引起的疾病.這些過程明顯地形成了完整的一套抗性機制，該機制由初始感染激活並隨後限制入侵的致病生物體的進一步擴散，在識別了植物病原體之後，植物可以激活一系列生化應答.一般地，植物通過在感染位點周圍迅速地誘導細胞內的一些局部反應產生應答。在非宿主和種(race)特異性相互作用中觀察到的最常見的抗性應答被稱作"過敏應答"(HR).在過敏應答中，病原體接觸的細胞以及通常鄰近的細胞迅速地崩塌(collapse)和乾燥形成壞死斑點(necroticfleck)。其它應答包括胼胝質的沉積，由木質化引起細胞壁的物理增厚，以及各種抗生素小分子和蛋白質的合成.在宿主和病原體中的遣傳因子決定了這些局部應答的專一性，這在限制感染擴散中非常有效.傳統上，植物疾病的發生已通過農藝手段得到控制，這些手段包括輪作、農用化學品的使用和常規的培育技術。但是將化學品用於控制植物病原體增加了農民的成本並對生態系統造成有害的影響.消費者和政府管理者等正越來越關注與用於保護植物免受病原體侵害的合成農用化學品的生產和使用相關的環境危害.由於這些關注，管理者們已經禁止或限制了一些最危險的化學品的使用.通過培育抗性農作物，真菌疾病的發生已經得到了一定程度的控制.但是，傳統的培育方法是耗時的，並且隨著病原體進化，需要持續的努力以維持疾病抗性.見例如GroverandGowthaman(2003)Cm/t.Sci'.84:330-340,因此，對於控制植物病原體的新型替代法存在著明顯的需求，這些替代法具有更低的汙染和環境危害的風險(而這些風險正是典型的基於農用化學品的傳統方法的特徵)，並且比傳統的培育技術更簡便.最近，農業科學家已通過遺傳改造植物以表達抗致病原體蛋白，開發出了具有提高的病原體抗性的農作物植物.例如經遣傳改造從而產生抗真菌內切幾丁質醉蛋白的馬鈴茅和菸草植物顯示出對葉真菌病原體和土壤傳播的真菌病原體呈現出增強的抗性.見LoritoWa/.(1998)屍wc.7Va".4cflrf.5，c/.95:7860-7865,此外，也已經開發了對稈鏽菌具有抗性的轉基因大麥.見Horvath""/.(2003)iVoc.7Vfl汰爿carf.5W.100:364-369.識別抗致病劑和遣傳改造疾病抗性植物的持續的努力還在繼續.，已經嘗試了各種病原體控制方法，包括生物體的使用，這些生物體典型地是希望被控制的物種的"天然捕食者".這些捕食者可包括其它昆蟲、真菌和細菌(例如蘇雲金芽杆苗(5ad//"sr/r/7>ig&its&)).可替換地，有害昆蟲的大型群落已被封閉飼養、絕育並被釋放到環境中，希望絕育昆蟲和多產的野生昆蟲之間進行的交配能減少昆蟲的數量.儘管這些方法已經取得了一些成功，它們需要相當高的費用並具有一些主要的困難，例如，將生物體應用到大面積上以及使這些活生物體在延長的時間內維持在被處理區域或被處理植物物種上都是困難的.捕食昆蟲可以遷移，真菌或細菌可以被雨水從植物上衝下或從被處理區域衝走.因此，儘管這些生物學控制的應用具有人們需要的特性且已經獲得了一些成功，但實踐中這些方法還不能實現控制病原體對農作物的侵害的目標.生物技術的進步已經為通過遣傳工程控制病原體帶來了新的機遇.特別地，植物遺傳學的進步伴隨對天然生成的植物防禦化合物或試劑的鑑定，提供了製造轉基因農作物植物的機會，所述植物能夠生成這些防禦試刑並因此保護植物免遭疾病.很多植物疾病，包括但不限於玉米稈腐病和穗腐病，可由多種病原體引起。例如，稈腐病是最具破壞性和廣泛傳播的玉米疾病之一.該疾病由在接近植物成熟時攻擊和降解稈的真菌和細菌的聯合體引起.由於弱化的稈的形成以及未成熟植物的死亡，可發生顯著的產量減少.玉米稈腐病典型地由多於一種的真菌引起，但由玉蜀黍赤黴wne)引起的赤審菌稈腐病(Gibberellastalkrot)、由輪狀鐮刀菌(F"sa〃'"mve/"rt'ci'肌wV/es)、串珠鐮刀菌(F./rdy^m似m)或FjM6g/M""a附引起的鐮刀菌稈腐病(Fusarhimstalkrot)、以及由禾生炭疽菌(G>//e^//7'cAmg/vi/m7ii'co/fl)引起的炭疽稈腐病(Anthracnosestalkrot)是最常被報導的(SmithandWhite(1988);Diseasesofcorn,pp.701-766inCornandCornImprovement,AgronomySeries#18(3rded.)，Sprague，C.F.andDudley,J.W.，eds.Madison,WI).鑑於植物疾病可由病原體的聯合體引起的亊實，需要廣讒抗性以有效調節疾病控制.因此，對靶向多種稈腐病和穗腐病致病病原體的抗真菌組合物存在顯因此，鑑於植物真菌病原體對農作物產量和質量的巨大影響，人們需要用於保護植物免受這些病原體侵害的新方法.
發明內容本發明的具體實施方式提供了對真菌病原體具有提高的抗性的轉基因植物，每種植物都包含編碼下述多肽的多核苷酸，所述多肽包含與SEQIDNOs:l、2、4、5、7或8至少95%相同的胺基酸序列，其中所述植物對至少一種植物致病真菌具有提高的抗性.該植物可以是單子葉植物或雙子葉植物.本發明還提供了這些轉基因植物的種子.類似地，具體實施方式提供了對真菌病原體具有提高的抗性的單子葉或雙子葉轉基因植物和種子，其中該植物包含與SEQIDNOs:3、6或9至少95%相同的多核苷酸序列，其中所述植物對至少一種植物致病真菌具有提高的抗性.在轉基因植物中表達的多肽可以包含或不包含信號序列，本發明的具體實施方式還提供了提高植物對真菌病原體抗性的方法，該方法包括將下述表達盒引入植物細胞，所述表達盒包含與啟動子可操作性連接的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列與SEQIDNOs:3、6或9具有至少95%的一致性，或其中所述核苷酸編碼下述多肽，所述多肽包含與SEQIDNOs:l、2、4、5、7或8相同或高度相同的胺基酸序列，且其中所述多肽對至少一種植物致病真菌具有活性.植物細胞被用於再生轉化的植物，其中在經轉化的植物中，真菌病原體抗性水平與不包含所述表達盒的植物相比被提高.這些具體實施方式的多肽可包含或不包含信號肽.具體實施方式的表達盒中使用的啟動子選自組成型、組織特異性、根特異性、可誘導和病原體誘導啟動子.在某些具體實施方式中，對植物真菌病原體具有活性的多肽包含信號序列.在某些具體實施方式中，多肽缺乏信號序列.在某些具體實施方式中，信號序列是分泌信號序列，而在其它具體實施方式中，信號序列是細胞器和/或質體信號序列.具體實施方式本發明的具體實施方式提供了用於提高植物真菌病原體抗性的組合物和方法，具體實施方式提供了編碼抗真菌多肽的胺基酸序列的多核苷酸.特別地，本發明提供了具有SEQIDNOs:1、2、4、5、7和8所示的胺基酸序列的抗真菌多肽以及它們的變體和片段.本發明還提供了經分離的核酸分子以及它們的變體和片段，這些分子包含編碼SEQIDNOs:l、2、4、5、7和8中所示胺基酸序列的核苷酸序列，本發明提供了編碼SEQIDNOs:l、2、4、5、7和8的多肽的核苷酸序列.這些核苷酸序列示於SEQIDNOs:3、6和9中.已針對在大腸桿菌(E.coli)中的表達對這些核苷酸序列中的一些進行了優化.本文也公開了包含下述核苷酸序列的植物、植物細胞、種子和微生物，所述核苷酸序列編碼具體實施方式的抗真菌多肽.本發明還提供了包含經分離的抗真菌多肽的抗真菌組合物或表達具體實施方式中的多舦的微生物.具體實施方式的組合物在生成真菌抗性植物和保護植物免受植物致病真菌侵害中發揮作用.本文公開的多肽對廣泛的植物致病真菌呈現出抗真菌活性，所述真菌例如爿to7i肌Vi6ra柳Wco/a、Fiwar/M/wve/t/ci7/iWto、g/Yi/mVti'co/a、F"sa/7'wm狄yspofM附和Fe/*""7//"mdttWeie.這些抗真菌多肽的來源的物種為植物物種.特別地，多肽SEQIDNOs:l和2的來源是中國辣椒(Cfl/wi'CM附cWwe附e).SEQIDNOs:4、5、7和8的多肽的來源是西紅神(L^co!persicwi(yco/em'C0W)."抗真菌組合物"或"抗真菌多肽"意在表示具體實施方式的組合物或多肽具有抗真菌活性，且因此能夠遏制、控制和/或殺死入侵真菌.具體實施方式的抗真菌多肽能將由真菌感染引起的疾病症狀減少至少大約5%至大約50%、至少大約10%至大約60%、至少大約30%至大約70%、至少大約40%至大約80%、至少大約50%至大約90%或更大程度.因此，具體實施方式的方法可被用於保護植物免受致病真菌的侵害.具體實施方式的多核苷酸和多肽可用於在植物中誘導真菌病原體抗性的方法.因此，本文公開的組合物和方法可用於保護植物免受致病真菌的侵害."真菌病原體抗性"意在表示植物避免由於植物-真菌相互作用產生的疾病症狀.具有"提高的真菌病原體抗性"或"增強的真菌病原體抗性"的植物意在表示已經過具體實施方式的核酸分子轉化且表達具體實施方式的多肽的植物，較之不包含所述核酸分子的植物例如野生型植物，其呈現出對真菌病原體增強水平的抗性或耐受性.也就是說，在經轉化的植物中，真菌被阻止引起植物疾病和相關疾病症狀，或可替換地，由真菌引起的疾病症狀被最小化或被減弱，例如脅迫和相關的產量損失的減輕.抗性可以在下述範圍內變化從對真菌病原體作用的耐受力的微弱增強到完全抗性，由此植物不受到真菌病原體存在的影響.對特定真菌或對更廣譜的真菌的提高的抗性水平可以構成抗真菌活性和提高的真菌抗性.具體實施方式的植物與未經轉化的植物相比呈現了至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少卯％、至少95%、或直至100%的提高.這樣的提高可以通過本領域已知的任何合適的方法加以測量，例如但不限於對植物上的真菌傷口計數、測量真菌生物量、比較植物產量和在以下段落中描述的其它方法.測量抗真菌活性的實驗是本領域普遍已知的，在真菌病原體感染後對植物的疾病抗性定量的方法同樣如此.見例如，美國專利號5,614,395，通過引用將其併入本文.這些技術包括在一段時間中測量平均傷口直徑、病原體生物量以及腐爛植物組織的總百分比.例如，和沒有暴露於抗真菌組合物的對照植物相比，表達抗真菌多肽或其表面被施加抗真菌組合物的植物在真菌病原體感染後顯示出組織壞死(即傷口直徑)的減少或植物死亡的減少.可替換地，可以通過真菌生物量的降低來測量抗真菌活性.例如，用感興趣的真菌病原體感染表達抗真菌多肽或暴露於抗真菌組合物的植物.在一段時間中，獲取來自真菌病原體接種組織的組織樣品並提取RNA.特異的真菌病原體RNA轉錄本相比於植物特異轉錄本水平的百分比可以確定真菌生物量的水平.見，例如ThommaCa/.(1998)屍/"W95:15107-15111,其通過引用併入本文.此外，體外抗真菌實驗包括例如將不同濃度的抗真菌組合物添加至紙盤上並將所述的盤放在含有感興趣的真菌病原體懸浮液的瓊脂上.在培養後，在含有有效濃度的抗真菌多肽的盤周圍生成明顯的抑制區(LiuWfl/.(1994)屍/朋r所o/o砂91:1888-1892，其通過引用併入本文).此外，可以使用顯微分光光度分析測量組合物的體外抗真菌性質(HuWtf/.(1997)戶/fl擬M"34:949-959和CamueCa/.(1992)義所"0^肌267:2228-2233，兩文獻均被在此參考引用).專門測量抗真菌活性的實驗也是本領域公知的.見例如DuvickWa/.(1992)/.醜!V/.C/te267:18814-18820;LacadenaWa/.(1995)rcA.oc/reA^.324:273-281;XuWfl/.(1997)屍/a"fMo/.所o/.34:949-959;Lee"a/.(1999)i》cAewt價V/^".Owim.263:646-651;Vila"a/.(2001)/flWM/cr由/"te,W,14:1327-1331;Moreno"a/.(2003)一/;a^/.93:1344-1353;Kaiserer"a/.(2003)JrcA.180:204-210;和美國專利號6,015,941.具體實施方式公開了用編碼抗真菌蛋白的核酸分子轉化的植物.組合物可用於在植物中誘導真菌病原體的抗性和保護植物免受真菌侵害的方法.本領域技術人員將認同本文公開的組合物和方法可與本領域可獲得的用於保護植物免受真菌病原體攻擊的其它組合物和方法組合使用，在特定方面，用於在植物中誘導真菌抗性的方法包括將至少一種表達盒引入植物中，其中所述表達盒包含編碼具體實施方式的抗真菌多肽的核苷酸序列，該序列與能在植物中驅動表達的啟動子可操作性連接。植物表達該多肽，由此在攻擊位點將真菌暴露於多肽.具體實施方式的多肽的表達可被把向特定的植物組織，其中在這些組織真菌抗性特別重要，例如根、葉或莖，這樣的組織偏好表達可通過根偏好、葉偏好、雄管組織偏好、莖偏好或種子偏好的啟動子來實現，此外，具體實施方式的多肽還可被靶向至植物細胞中的特定亞細胞位點，或可替換地，從細胞中分泌，如下文所述.正如具體實施方式的多肽的表達可通過使用合適的啟動子被靶向至特定的植物組織或細胞類型一樣，通過靶向信息或"靶向標記"的使用，多肽的表達也可被定位至細胞內的不同位點.與在轉錄水平發揮作用的啟動子不同，這樣的靶向信息是初始翻譯產物的一部分.取決於真苗病原體感染的模式或組織或細胞類型的代謝功能，蛋白在細胞的不同區室的定位可使其對給定的病原體更有效或使其更少地幹擾細胞功能.例如，通過在構建體(即表達盒)中包括進編碼信號肽的序列(這樣的序列也可被稱作"信號序列")，人們可以製備由信號肽引導的蛋白，信號肽將翻譯產物導向內質網.使用的信號序列可以是例如與編碼多肽的基因相連的序列，或該序列可來自另一基因.在文獻中描述了很多信號肽，且它們在很大程度上可以相互交換(RaikhelandChrispeels，"Proteinsortingandvesicletraffic"inBuchananWa/.，eds，(2000)醜/oc/ieym's^vawdAfoZeci^arB/o/ogy/Vfl/i紐(AmericanSocietyofPlantPhysiologists,Rockville，MD)，其通過引用併入本文).信號肽的添加將導致轉錄產物進入內質網(在該過程中信號肽本身被從多肽上去除)，但蛋白最終的胞內定位取決於其它因子，可以對這些因子加以操縱，從而產生對真菌病原體和細胞類型最合適的定位.默認通路，即如果沒有包括其它靶向標記的情況下多肽所採用的通路，導致多肽穿過細胞膜向質外體(apoplast)中分泌(RaikhelandChrispeels，同上).質外體是胞質膜系統外的區域，其包括細胞壁、胞間間咪和木質部導管，木質部導管形成連續的透過性系統，水和溶質可在其中移動.這通常將成為合適的位點.通過將肽定位在細胞內而非細胞膜外可更有效地對抗其它真菌病原體.通過例如將內質網留置(retention)信號編碼序列添加到基因序列上可以實現這一點，用於完成該操作的方法和序列在上文RaikhelandChrispeels中有所描述；例如，將按順序編碼胺基酸K、D、E和L的序列或在文獻中描述的其變體添加到多肽的蛋白質編碼部分的末端將實現這一點.ER留置序列是本領域公知的.見例如DeneckeWa/.(1992).五MffO乂11:2345-2355;Wandelte"/.(1992)iVaW2:181-192;Denecke"a/.(1993)/.Jjcp.BW.44:213-221;Vitale等(1993)/五jcp.Bo"44:1417-1444;GomordWfl/.(1996)屍/fl"/屍/y^》/.34:165-181;Lehmanne,a/.(2001)iVaW127(2):436-449,當在本文中使用時，"核酸"包括指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖然核苷酸重要性質的類似物(例如肽核酸)，因為它們能以與天然發生的核苷酸相似的方式與單鏈核酸雜交.術語"多肽"、"肽"和"蛋白質"在本文中可互換使用，用於指胺基酸殘基的聚合物.這些術語用於下述胺基酸聚合物，這些聚合物中一或多個胺基酸殘基是相應的天然發生的胺基酸的人造化學類似物，這些術語也用於天然發生的4^基酸聚合物.具體實施方式的多肽可從本文公開的核酸分子製備，或通過使用標準的分子生物學技術製備.例如，具體實施方式的截短蛋白質可通過在合適的宿主細胞中表達具體實施方式的重組核酸分子來製備，或可替換地，通過離體(exvivo)步驟(例如蛋白酶消化和純化)的組合來製備.當在本文中使用時，當用於特定的核酸分子的上下文中時，術語"編碼"或"被編碼"指核酸分子包含引導核苷酸序列翻譯成特定蛋白質的必要信息.編碼蛋白質的信息通過密碼子的使用加以確定.編碼蛋白質的核酸分子可在核酸序列的翻譯區內包含非翻譯序列(例如內含子)或可缺乏這樣的插入(intervening)非翻譯序列(例如在cDNA中)，術語"胺基酸"指天然發生的和合成的胺基酸，以及以與天然發生胺基酸相似的方式行使功能的胺基酸類似物和胺基酸模擬物.天然發生的胺基酸是那些由遺傳密碼編碼的胺基酸以及那些隨後被修飾的胺基酸，例如羥脯氨酸、Y-羧基穀氨酸和O-轔酸絲氨酸.胺基酸在本文中可由IUPAC-IUB生物化學命名委員會推薦的通常所知的單字母符號或三字母符號表示.同樣地，核苷酸可通過通常被接受的它們的單字母代碼表示.具體實施方式包括使用經分離的或高度純化的多核苷酸或蛋白質組合物的方法。"經分離的"或"純化的"多核苷酸或蛋白質或它們的生物學活性部分與下述組分實質性或基本分離，這些組分是被發現在天然發生的環境中通常與多核苦酸或蛋白質相隨或相互作用的.因此，由重組技術製備時，經分離的或純化的多核苷酸或蛋白質高度去除了其它細胞物質或培養基，當化學合成時高度去除了化學前體或其，且除非另外限定，其包括已知的具有天它化學藥品，最優地，"經分離的"多核苷酸不含有在從中獲取該多核苷酸的生物體的基因組DNA中天然側翼於所述多核苷酸的序列(即位於多核苷酸5，和3，端的序列)(最優地，蛋白編碼序列).例如，在多種具體實施方式中，經分離的多核苷酸可包含在從中獲取該多核苷酸的細胞的基因組DNA中天然側翼於該多核苷酸的少於大約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb、O.lkb的核苷酸序列.高度去除了細胞物質的蛋白質包括含有少於大約30%、20%、10%、5%或1%(乾重)的汙染蛋白的蛋白質制刑.當具體實施方式的蛋白質或其生物活性部分是重組製備的時候，最優地，培養基具有少於大約30%、20%、10%、5%或1%(乾重)的化學前體或非感興趣的蛋白質的化學藥品.公開的核苷酸序列和由其編碼的蛋白質的片段和變體也被具體實施方式包含。"片段"意在表示核苷酸序列的一部分或由核苷酸編碼的胺基酸序列和蛋白質的一部分.核苷酸片段可編碼保持了天然蛋白質生物學活性且因此具有抗真菌活性的蛋白質片段.可替換地，可用作雜交探針的核苷酸序列片段通常不編碼保持生物學活性的片段蛋白質.因此，核苷酸序列的片段可從至少大約20個核苷酸、大約50個核苷酸、大約100個核苷酸變化直至編碼具體實施方式的多肽的全長核苷酸序列.編碼具體實施方式的抗真菌多肽的生物學活性部分的核苷酸序列片段將編碼存在於具體實施方式的全長抗真菌多肽中的至少15、25、30、40、50、60、70、80、90或100個連續胺基酸或直至全部數量的胺基酸(例如，SEQIDNO:1中的107個胺基酸).用作雜交探針或PCR引物的核苷酸序列的片段通常不需要編碼抗真菌蛋白質的生物學活性部分.當在本文提到特定多核苷酸時，"全長序列"用於表示具有天然序列的整個核酸序列."天然序列"意在表示內源性序列，即在生物體基因組中發現的非工程改造序列，因此，具體實施方式的核苷酸序列的片段可編碼抗真菌多肽的生物學活性部分，或其可以是下述片段，所述片段使用下文公開的方法可被用作雜交探針或PCR引物.可以通過分離具體實施方式的核苷酸序列之一的一部分、表達抗真菌蛋白質的編碼部分(例如通過體外重組表達)、並評估抗真菌蛋白編碼部分的活性，來製備抗真菌多肽的生物學活性部分.是具體實施方式的核苷酸序列片段的核酸分子包含至少15、20、50、75、IOO或150個連續核普酸，或直至存在於本文公開的全長核苷酸序列中的核苷酸的數目."變體"意在表示高度相似的序列.對於多核苷酸，變體包含在天然多核苷酸內的一或多個內部位點的一或多個核苷酸的刪除和/或添加和/或在天然多核苷酸的一或多個位點的一或多個核苷酸的取代.當在本文中使用時，"天然的"多核苷酸或多肽分別包含天然發生的核普酸序列或胺基酸序列.本領域技術人員將認識到具體實施方式的核酸序列的變體將以使得開放閱讀框得以保持的方式被構建.對於多核苷酸，保守變體包括由於遣傳密碼的簡併性，編碼具體實施方式的抗真菌多肽之一的氦基酸序列的那些序列.可使用公知的分子生物學技術(例如下文概述的聚合酶鏈反應(PCR)和雜交技術)來鑑定諸如這些的天然發生的等位變體.變體多核普酸還包括通過合成獲得的多核苷酸，例如通過定點誘變生成的但仍然編碼具體實施方式的抗真菌蛋白質的多核苷酸.一般而言，具體實施方式的特定多核苷酸的變體與該特定多核苷酸將具有至少大約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列一致性，所述一致性是如本文其它地方說明的序列比對程序和參數所確定的.也可以通過比較由變體多核苷酸編碼的多肽和由參照多核苷酸編碼的多肽之間的百分比序列一致性，對具體實施方式的特定多核苷酸(即參照多核苷酸)的變體進行評價.因此，例如，公開了編碼與SEQIDNOs:1、3、5、7和9的多肽具有給定的百分比序列一致性的多肽的經分離多核苷酸.任何兩條多肽之間的百分比序列一致性可以通過使用在本文其它地方說明的序列比對程序和參數計算得出.在通過比較多核苷酸編碼的兩條多肽之間的百分比序列一致性來對具體實施方式的任何給定的多核苷酸對進行評價時，兩條被編碼的多肽之間的百分比序列一致性是至少大約40%、45°/。、50°/。、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列一致性."變體"蛋白意在表示通過在天然蛋白的一或多個內部位點的一或多個胺基酸的刪除或添加和/或在天然蛋白的一或多個位點的一或多個胺基酸的取代、從天然蛋白獲得的蛋白質.具體實施方式包含的變體蛋白是有生物學活性的，也就是說它們仍然具有人們想要的天然蛋白的生物學活性，即在此所述的抗真菌活性，這些變體可因為例如遺傳多態性或或因為人為搮縱產生.如通過在本文其它地方說明的序列比對程序和參數所確定的，具體實施方式的天然抗真菌蛋白的生物學活性變體將具有與天然蛋白的胺基酸序列至少大約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、910/"92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列一致性.具體實施方式的蛋白質的生物學活性變體與該蛋白質的區別將少至1-15個胺基酸殘基、少至1-10個例如6-10個、少至5個、少至4個、少至3個、少至2個或甚至少至1個胺基酸殘基.具體實施方式的蛋白質將通過多種方式被改變，包括胺基酸取代、刪除、截短和插入.這些處理的方法是本領域普遍已知的.例如，可以通過在DNA中的突變製備抗真菌蛋白質的胺基酸序列變體和片段。誘變和多核苷酸改變的方法是本領域公知的.見例如Kimkel(1985)iVaf/.爿c(w/.Sc/.82:488-492;Kunkel"d/.(1987)MW/^rfs,Vt五"zymo/.154:367-382;美國專利號4,873,192;WalkerandGaastra，eds.(1983)recA/t/《Me^fVtMo/ecw/ar(MacMillanPublishingCompany,NewYork)以及其中引用的參考文獻，關於不影響感興趣的蛋白質的生物學活性的合適的胺基酸取代的指導，可見DayhoffWa/.(1978)y^/as屍rWeiVijS^《Mewcefl/irf5^rwc似"(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.)的模型，該文獻通過引用併入本文.保守取代，例如將一個胺基酸與另一個具有相似性質的胺基酸交換，是最優的."經保守修飾的變體"用於胺基酸和核酸序列.對於特定的核酸序列，經保守修飾的變體指編碼相同或基本相同胺基酸序列的那些核酸，或當核酸不編碼胺基酸序列時，指基本相同的序列，由於遺傳密碼的簡併性，大量功能相同的核酸編碼任意給定的蛋白質.例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼胺基酸丙氨酸.因此，在丙氨酸由密碼子確定的每一個位點，密碼子可以變化成任何所述的相應的密碼子而不改變編碼的多肽.這樣的核酸變異是"沉默變異"，它們是一類經保守修飾的變異.本文中編碼多肽的每種核酸序列也描述核酸的每種可能的沉默變異.技術人員將認識到核酸中的每種密碼子(除了AUG,該密碼子通常是甲硫氨酸的唯一密碼子)都可被修飾，而能生成功能相同的分子.因此，編碼多肽的核酸的每種沉默變異都包含在各所述序列中.關於胺基酸序列，技術人員將認識到當改變導致胺基酸被化學相似的胺基酸取代時，在核酸、肽、多肽或蛋白質序列中改變被編碼序列中的單個胺基酸或一小部分胺基酸的各種取代是"經保守修飾的變異".提供功能相似胺基酸的保守取代表是本領域公知的.以下六組每組都包含相互之間為保守取代的胺基酸1)丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T);2)天冬氨酸(D)、穀氨酸(E);3)天冬醯胺(N)、穀氨醯胺(Q);4)精氨酸(R)、賴氨酸(K);5)異亮氨酸(1)、亮氨酸(L)、甲硪氨酸(M)、纈氨酸(V);以及6)苯丙氨酸(F)、輅氨酸(Y)、色氨酸(W).(見例如Creighton，/VWei'附(1984)).因此，具體實施方式的基因和多核苷酸包括天然發生序列和突變體形式.同樣地，具體實施方式的蛋白質包括天然發生的蛋白質及其變體和經修飾形式.這些變體將仍然具有人們想要的抗真菌活性.明顯地，將在編碼變體的DNA中進行的突變應當不會將序列置於閱讀框之外，且最優地將不會產生能夠形成mRNA二級結構的互補區域.見例如EP專利號0075444.在自然界中，一些多肽作為複合前體被生成，除了靶向標記(例如在本申請中其它地方討論的信號肽)之外，這些前體還包含其它的肽片段，這些片段在蛋白質成熟過程中的某些點被去除(被加工)，產生與初始翻譯產物不同的多肽的成熟形式(除了信號肽的去除)."成熟蛋白"指經翻譯後加工的蛋白；即任何存在於初始翻譯產物中的前肽(prep印tide)或肽原(prop印tide)已被去除的蛋白."前體蛋白"或"前肽原(prepropeptide)"或"前蛋白原(prepeoprotein)"均指mRNA的翻譯初始產物；即前肽和肽原仍然存在.前肽和肽原可包括但不限於胞內定位信號.在本命名法中的"前(pre)"通常指信號肽.僅信號肽被去除但還沒有進一步加工的翻譯產物的形式被稱作"肽原"或"蛋白原(proprotein)".將被去除的片段或片斷本身也可被稱作"肽原".因此蛋白原或肽原已將信號肽去除，但含有肽原(在此稱為肽原部分)和將形成成熟蛋白的部分.取決於將在其中表達蛋白的物種以及所需要的胞內定位，技術人員能夠確定通過使用僅編碼蛋白成熟形式的基因構建體、編碼具有信號肽的成熟形式的基因構建體或編碼具有信號肽的蛋白原(即包含肽原的形式)的基因構建體是否可以獲得更高的表達水平.為了在植物或真菌中進行最優表達，前肽或肽原序列可能是需^"的.肽原片斷可能在幫助正確的肽摺疊中發揮作用.本文中包含的蛋白序列的刪除、插入以及取代預期不對蛋白特性產生劇烈變化.但是，當在進行取代、刪除或插入前難以預計這麼做的準確效果時，本領域技術人員將知道:將可以通過常規篩選實驗對該效果加以評估.即，可以通過測量抗真菌活性的實驗對活性進行評價，例如抗真菌板實驗和在本公開文本中其它地方說明的其它方法.見，例如Duvicke"/.(1992)丄5/"267:18841-18820,其通過引用併入本文.變體多核苷酸和蛋白還包含通過誘變和重組步稞(例如DNA重排(shuffling))獲得的序列和蛋白質.使用這樣的步稞，一或多種不同的抗真菌蛋白編碼序列可被搮縱，以製造出具有理想性質的新的抗真菌蛋白.通過該方法，從一組相關的序列多核苷酸生成重組多核苷酸文庫，這些多核苷酸包含具有相當的序列一致性且能夠在體外或體內同源重組的序列區域.例如，使用該方法，編碼感興趣的結構域的序列基元(motif)可以在編碼具體實施方式的抗真菌蛋白的基因和其它已知的編碼抗真菌蛋白的基因之間重排，以獲得編碼下述蛋白的新基因，所述蛋白具有改良的感興趣的性質，例如提高的抗真菌活性.這些DNA重排的策略是本領域已知的，見例如Stemmer(1994)Pwc.7Vfl".5W.f/A491:10747-10751;Stemmer(1994)iVfl似re370:389-391;CrameriWa/.(1997);Vfl似re15:436-438;MooreWa/,(1997)乂Mo/.所o/.272:336-347;Zhang"a/.(7997)7Va汰^cwf.fASL494:4504-4509;CrameriWa/.(1998)iVa似re391:288-291;以及美國專利號5,605,793和5，837，458.具體實施方式的多核苷酸可被用於從其它生物體特別是其它植物中分離相應的序列.在該方式中，例如PCR、雜交等方法可被用於鑑定這樣的序列，所述鑑定基於它們與本文示出的序列的序列同源性.基於它們與本文示出的完整序列或其變體和片段的序列同源性分離的序列包含在具體實施方式中.這些序列包括是公開序列的直系同源基因(ortholog)的序列."直系同源基因"意在表示下迷基因，它們來自共同的祖先基因，且由於物種形成(speciation)在不同的物種中被發現.當它們的核苷酸序列和/或它們所編碼的蛋白質序列具有至少60%、70%、75%、80%、85%、卯％、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列一致性時，在不同物種中發現的基因被認為是直系同源基因.直系同源基因的功能在物種間常常是高度保守的.因此，編碼抗真菌蛋白且在嚴格條件下與本文公開的序列或其變體或片段雜交的經分離的多核苷酸包含在具體實施方式中.在PCR方法中，可以設計寡核苷酸引物用於PCR反應，以從由任何感興趣的生物體中提取的cDNA或基因組DNA擴增相應DNA序列。設計PCR引物和PCR克隆的方法是本領域普遍已知的且在Sambrooke,a/.(1989)Mo/mi/a/*C7owi'"g..41fl6or她/^Mawua/(2ded.，ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview，NewYork)中公開，也見Innis""/.，eds.(1990)PC及iVotocofo:^似M"A油朋rf々p/f'cWo附(AcademicPress，NewYork);InnisandGelfand，eds.(1995)PC及Ara^fes(AcademicPress,NewYork);以及InnisandGelfand，eds.(1999)PC及^f"Ao必il/a"a/(AcademicPress,NewYork),已知的PCR方法包括但不限於使用成對引物、嵌套引物、單一特異性引物、簡併引物、基因特異性引物、栽體特異性引物、部分錯配引物等的方法.在雜交技術中，已知的多核苷酸的全部或部分被用作探針，該探針能與存在於來自選定生物體的經克隆的基因組DNA片段或cDNA片段群(即基因組或cDNA文庫)中的、其它下述相應的多核普酸選擇性雜交.雜交探針可以是基因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，且可用可檢測基團例如32P或任何其它可檢測標記對其進行標記.因此，例如，可通過對基於具體實施方式的多核苷酸的合成寡核苷酸進行標記，來製備雜交探針.製備雜交探針和構建cDNA和基因組文庫的方法是本領域普遍已知的且在SambrookWfl/.(1989)Mo/ec/arC7ow/wg.'^Lfl6orflto/yMflwwa/(2ded.，ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview，NewYork)中公開，例如，本文公開的完整多核苷酸或其一或多個部分可被用作為能夠與相應的多核苷酸和信使RNAs特異性雜交的探針.為了在各種條件下實現特異性雜交，此類探針包含在抗真菌多核苷酸序列中特有的、且最優至少有大約IO個核苷酸的長度的序列，最最優地具有至少大約20個核苷酸的長度.這樣的探針可被用於通過PCR從選定的生物體擴增相應的多核苷酸.該技術可被用於從理想的生物體中分離其它的編碼序列或被用作診斷實驗以確定編碼序列在生物體中的存在，雜交4支術包括鋪盤DNA文庫(platedDNAlibrary)的雜交篩選(噬菌斑(plaque)或菌落；見例如Sambrook"a/.，見上)，這些序列的雜交可在嚴格條件下進行."嚴格條件"或"嚴格雜交條件"意在表示下述條件在該條件下探針將和其靶向序列以相比於其它序列可觀測的更高的水平雜交(例如，至少是背景的2倍).嚴格條件是序列依賴性的且在不同環境下將不同.通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴格性，可以鑑定出與探針100%互補的靶序列(同源探測)，可替換地，可以調節嚴格條件從而允許序列的一些錯配由此檢測到更低的相似度(異源探測).通常，探針小於大約1000個核苷酸長度，優選地小於500個核苷酸長度.典型地，嚴格條件將是這樣的條件，其中鹽濃度小於大約1.5MNa離子，典型地大約0.01至l.OMNa離子濃度(或其它鹽)，pH7.0至8.3，且溫度對於短探針(例如10至50個多核普酸)為至少大約30TC,對長探針(例如大於50個核苷酸)為至少大約601C.嚴格條件也可以通過添加去穩定劑(例如甲醯胺)來實現.示例性的低度嚴格條件包括在30至35%甲耽胺、1MNaCl、1%SDS(十二烷基橫酸鈉)的緩衝液中於37t:雜交，並在1x至2xSSC(20xSSC=3.0MNaCl/0.3M檸檬酸鈉)中於50至55TC洗滌.示例性的中度嚴格條件包括在40至45%甲醯胺、l.OMNaCl、1%SDS中於37"C雜交，並在0.5x至lxSSC中在55至60t;中洗滌.示例性的高度嚴格條件包括在50%甲醯胺、1MNaCl、1%SDS中於37n雜交，並在0,1xSSC中於60至651C洗滌至少30分鐘。可選地，洗滌緩衝液可包含大約0.1%至大約1%SDS.雜交持續時間通常少於大約24小時，通常為大約4至大約12小時.洗滌持續時間將至少為足夠達到平衡的時間長度.典型地，特異性是雜交後洗滌的函數，關鍵因子是最終洗滌溶液的離子強度和溫度.對於DNA-DNA雜交體而言，熱融解點(Tm)可從MeinkothandWahl(1984)/i"a/.所ocAe附.138:267-284的方程Tm-81,51C+16.6(logM)+0.41(%GC)-0.61(%form)-500/L來估算;其中M是單價陽離子的摩爾濃度，。/。GC是DNA中烏苷和胞嘧啶的百分比，％form是雜交溶液中甲醯胺的百分比，L是雜交體的鹼基對的長度.Tm是50%的互補把序列與完全配對的探針雜交的溫度(在確定的離子強度和pH下)，每1%的錯配，Tm降低大約lt:;因此，Tm、雜交和/或洗滌條件可被調節以與具有人們需要的一致性的序列雜交.例如，如果尋找具有>90%—致性的序列，Tm可被降低10"C.—般地，在確定的離子強度和pH下對於特定序列及其互補物而言，嚴格條件被選定為比Tm低51C'但是，非常嚴格的條件可在比Tm低l、2、3、41C時使用雜交和/或洗滌；中度嚴格條件可在比Tm低6、7、8、9或101C時使用雜交和/或洗滌；低度嚴格條件可在比Tm低11、12、13、14、15或20C時使用雜交和/或洗滌.使用方程、雜交和洗滌組合物、以及人們需要的Tm，普通技術人員將理解雜交和/或洗滌溶液的嚴格性的改變是被內在描述的.如果希望的錯配程度導致了小於45TC(水溶液)或321C(甲耽胺溶液)的1\，最優地，提高SSC濃度使得更高的溫度可被使用，關於核酸序列雜交的大量指導可在Tijssen(1993)掛&rWi'za"VmiV"c/Wc/1drfPartI，Chapter2(Elsevier,NewYork);和Ausubel"d/，，eds,(1995)C"rre"f/Vo似co/sMo/mi/ar所o/ogy，Chapter2(GreenePublishingandWiley-Interscience，NewYork)找到。見Sambrook^a/.,見上，以下的術語被用於說明兩條或多條核苷酸或多肽之間的序列關係(a)"參照序列"，(b)"比較窗"，(c)"序列一致性"和(d)"序列一致性百分比"。(a)當在本文中使用時，"參照序列"是作為序列比較的基礎被使用的確定序列.參照序列可以是特定序列的一部分(subset)或全部；例如，作為全長cDNA或基因序列的片斷，或完整的cDNA或基因片斷，(b)當在本文中使用時，"比較窗"指多核苷酸序列的連續的特定片斷，其中，為進行對兩條多核苷酸的最優比對，在比較窗中的多核苷酸序列與參照序列(該序列不包含添加或刪除)相比可包含添加或刪除(即缺口(gap)).通常，比較窗是長度為最少20個的連續核苷酸，可選地可以是30、40、50、100個或更長.本領域的技術人員明白為了避免由於在多核苷酸中包括缺口造成的與參照序列的高度相似性，典型地，引入缺口懲罰，其從配對數目中減除.用於比較的序列比對法是本領域公知的.因此，任何兩條序列之間的百分比序列一致性的確定可以使用數學算法完成.這些數學算法的非限定性例子是MyersandMiller(1988)C45/OS4:11-17的算法；Smith"a/.(1981)爿rfv.J/;/;/.Ma狄.2:482的局部比對算法；NeedlemanandWunsch(1970)/Mo/.所o/.48:443-453的全局(global)比對運算；PearsonandLipman(1988)屍roc.Mi汰5W.85:2444-2448的搜索局部比對(search-for-localalignment)法；KarlinandAltschul(1990)iVoc.iVa比Jcarf.5W.tAJ/l872264的算法，如KarlinandAltschul(1993)屍,oc，JVa".Sd.CAS^90:5873-5877中改進的算法.這些數學算法的計算機實現可被用於序列的比較以確定序列一致性.這樣的實現包括但不限於PC/Gene程序中的CLUSTAL(獲自Intelligenetics，MountainView,California);ALIGN程序(2.0版)和GCGWisconsinGenetics軟體包，版本10中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA(獲自AccelrysInc.,9685ScrantonRoad，SanDiego,California,USA).使用這些程序的比對可使用默認參數進行.CLUSTAL程序由HigginsWa/.(1988)G^/ie73:237-244(1988);ffigginsa,.(1989)5:151-153;Corpet等(1988)iVMc/c4c!Vfa及d16:10881-90;Huang"flA(1992)C4醜/OS8:155-65;和PearsonWa/.(1994)MeA.Mo/.24:307-331詳細描述.ALIGN程序基於MyersandMiller(1988)同上的算法.當比較胺基酸序列時，PAM120權重殘基表(weightresiduetable)、缺口長度懲罰12以及缺口懲罰4被用於ALIGN程序.Altschul"a/.(1990)丄Mo/.Bio/.215:403的BLAST程序基於KarlinandAltschul(1990)同上的算法，BLAST核苷酸檢索可使用BLASTN程序，分值(score)-100，字長(wordlength)=12進行以獲得與編碼具體實施方式的蛋白質同源的核苷酸序列.BLAST蛋白質檢索可使用BLASTX程序，分值-50，字長=3進行以獲得與具體實施方式的蛋白質或多肽同源的胺基酸序列.為了實現帶缺口比對，用於比較目的，如AltschulW(1997)WMc/e/cJa'rfs25:3389中所述，GappedBLAST(在BLAST2.0中)可被使用.可替換地，PSI-BLAST(在BLAST2.0中)可被用於進行迭代檢索，該檢索檢測到分子間的遠關聯.見Altschule"/.(1997)同上.當使用BLAST、GappedBLAST、PSI-BLAST時，相應程序的默認參數(例如用於核苷酸序列的BLASTN，用於蛋白的BLASTX)可被使用.見www.ncbi.nlm.nih.gov.比對也可以通過人工觀察進行.除非另外聲明，在此提供的序列一致性/相似性數值指使用GAP版本10使用以下參數獲得的數值使用缺口權重(GapWeight)50和長度權重(LengthWeight)3以及nwsgapdna.cmp計分矩陣獲得的核苷酸序列的％—致性和％相似性；使用缺口權重8和長度權重2以及BLOSUM62計分矩陣獲得的胺基酸序列的°/。一致性和％相似性的數值；或使用它們的任何等同程序獲得的數值."等同程序"意在表示下述任何序列比較程序，對於任何兩條待研究的序列，在與由GAP版本10產生的相應的比對比較時，該程序產生具有相同的核苷酸或胺基酸殘基配對以及相同的百分比序列一致性的比對.GAP使用NeedlemanandWunsch(1970)/Mo/.所o/.48:443-453的算法以找出對兩條完整序列的下述比對，所述比對將配對數量最大化且將缺口數量最小化.GAP考慮所有可能的比對和缺口位置，且創造出具有最大數量配對鹼基和最少缺口的比對.它可以提供以配對鹼基為單位的缺口製造懲罰(gapcreationpenalty)和缺口延伸懲罰(gapextensionpenalty).針對其插入的每個缺口GAP必須獲得缺口製造懲罰數量的配對利益.如果選擇大於零的缺口延伸懲罰，GAP還必須針對每個插入的缺口獲得缺口長度乘以缺口延伸懲罰的利益.在GCGWisconsinGenetics軟體包的版本10中對於蛋白質序列的默認的缺口製造懲罰值和缺口延伸懲罰值分別為8和2.對於核苷酸序列，默認的缺口製造懲罰是50而默認的缺口延伸懲罰是3.缺口製造和缺口延伸懲罰可被表示為選自由O至200組成的整數組中的整數，因此，例如，缺口製造和缺口延伸懲罰可以是O、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更高，GAP是最佳比對家族中的一員.該家族還有^^多成員，但沒有其它成員具有更好的性質.對於比對，GAP呈現了四個優良數據質量、比率、一致性和相似性.質量是為了比對序列的最大化的基準.比率是質量除以更短片斷中的械基數目.百分比一致性是真正匹配的符號的百分比.百分比相似性是相似的符號的百分比.越過缺口的符號為忽略.當一對符號的計分矩陣值大於或等於相似性閾值0.50時，相似性被計分.在GCGWisconsinGenetics軟體包版本10中使用的計分矩陣是BLOSUM62(見HenikoffandHenikoff(1989)屍roc.TVa".月carf.5W.t/5L489:10915)(c)當在本文中使用時，關於兩條多核苷酸或多肽序列的"序列一致性"或"一致性"指當在特定比較窗中以最大對應性進行比對時，兩序列中完全相同的殘基.當關於蛋白質的序列一致性百分比被使用時，將認識到不相同的殘基位點常常是由於保守胺基酸取代而不同，其中胺基酸殘基由其它具有相似化學性質(例如電荷或疏水性)的胺基酸殘基取代，因此不會改變分子的功能性質.當序列由於保守取代不同時，百分比序列一致性可被上調，以針對取代的保守性質進行校正.由於此類保守取代而不同的序列被稱作具有"序列相似性"或"相似性".進行這樣的調節的方法是本領域技術人員公知的.典型地，調節方法包括將保守取代計分為部分而非完全錯配，由此增加了百分比序列一致性.因此，例如，當相同的胺基酸被給予1分且非保守取代被給予0分時，保守取代被給予0至1之間的分數.計算保守取代的得分，例如在程序PC/GENE(Intelligenetics，MountainView,California)中實現.(d)當在本文中使用時，"序列一致性的百分比"指通過在比較窗中比較兩條最優比對的序列從而確定的數值，其中對於兩序列的最優比對而言，比較窗中的多核苷酸序列的部分與參照序列(該序列不含添加或刪除)相比可包含添加或刪除(即缺口).通過確定在兩序列中發生相同核酸鹼基或胺基酸殘基的位點的數量，產生配對位點的數量，將配對位點的數量除以在比較窗中的位點的總數量，並將結果乘以100，產生序列一致性的百分比，從而計算百分比，術語"多核苷酸"的使用無意於將具體實施方式限制為包含DNA的多核苷酸.本領域普通技術人員將認識到多核苷酸可包含核糖核苷酸以及核糖核苷酸與脫氣核糖核苷酸的組合.這些脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然發生的分子和合成類似物.具體實施方式的多核苷酸也包含序列的所有形式，包括但不限於單鏈形式、雙鏈形式等.在一些具體實施方式中，進一步提供了下述表達盒，所述表達盒包含了與編碼抗真菌多肽的具體實施方式的異源核苷酸序列可搮作性連接的啟動子.具體實施方式的表達盒可用於生成轉化植物、植物細胞和微生物，以及用於實現在此公開的誘導真菌病原體抗性的方法.表達盒將包括與具體實施方式的多核苷酸可搮作性連接的5，和3，調節序列."可搮作性連接"意在表示兩個或多個元件之間的功能性連接。例如，感興趣的多核苷酸和調節序列(即啟動子)之間的可操作性連接是允許感興趣的多核苷酸表達的功能性連接.被可搮作性連接的元件可以是相連的或非相連的.當用於指通過可搮作性連接將兩個蛋白編碼區的連接時，可搮作性連接意指編碼區在相同的閱讀框內，表達盒還可包含將被共轉化進生物體的至少一個額外基因.可替換地，可在多重表達盒中提供額外的基因.這樣的表達盒提供了用於下述多核苷酸插入的多個限制性位點和/或重組位點，所述多核苷酸編碼位於調節區的轉錄調節下的抗真菌多肽.表達盒還可以包含選擇性標記基因.表達盒將以5，-3，的轉錄方向包括轉錄起始區(即啟動子)、翻譯起始區具體實施方式的多核苷酸、翻譯終止區以及可選地，在宿主生物體中發揮功能的轉錄終止區.調節區(即啟動子、轉錄調節區和翻譯終止區)和/或具體實施方式的多核苷酸可以是宿主細胞自身的/類似的或相互是自身的/類似的.可替換地，調節區和/或具體實施方式的多核苷酸可以是宿主細胞異源的或相互異源的.當在此使用時，關於序列的"異源的"是指來自其它物種的序列，或如果來自相同物種，已通過有意人為幹涉在組成和/或基因組位點上從其天然形式經實質上改變的序列.例如，與異源多核苷酸可搮作性連接的啟動子來自於下述物種，該物種不同於獲取該多核苷酸的物種，或如果來自相同/相似物種，其中之一或兩者均從它們的原始形式和/或基因組位點發生充分2修飾，或啟動子不是可搮作性連接的多核苷酸的天然啟動子.可選被包含的終止區可以是轉錄起始區本身的，可以是可搮作連接的感興趣的多核苷酸本身的，可以是植物宿主本身的，或可以來自與啟動子、感興趣的多核苷酸、宿主不同的另一來源(即外源或異源的)，或它們的任意組合.方便的終止區域可獲自根癌農桿菌(A似附e/aciV附)的Ti-質粒，例如章魚鹼合成酶和胭脂鹼合成酶終止區.也見GuerineauWa/.(1991)3fo/.Ge".262:141-144;Proudfoot(1991)。//64:671-674;Sanfacon等(1991)(e陋Z)ev.5:141-149;MogenW(1990)屍/fl似CW/2:1261-1272;Munroe"a/.(1990)91:151-158;BallasWa/.(1989)iV"c/eic17:7891-7903;以及JoshiWfl/.(1987)7V"c/e/cJaVfo及戰15:9627-9639.在特定具體實施方式中，馬鈴薯蛋白酶抑制刑H基因(PinlI)終止子被使用.見例如Keile"/.(1986)iV"c/.Jc/必及四，14:5641-5650;和AnWa/.(1989)戶/a擬Ce//1:115-122，這些文獻通過引用整體併入本文.在合適的情況下，可針對提高在轉化生物體中的表達對多核苷酸進行優化.例如，為了提高的表達，可以使用植物偏好密碼子合成多核苷酸.關於宿主偏好密碼子用法的討論見例如CampbellandGowri(1990)P/aWiV^W.92:1-11.合成植物偏好基因的方法在本領域可獲得.見例如美國專利號5，380，831和S，436，391，以及Murray"a/.(1989)iV"c/"cJciVfoW戰17:477-498,這些文獻通過引用併入本文.已知有其它的序列修飾能提高在細胞宿主中的基因表達.這些修飾包括將編碼假多聚腺苷酸化信號、外顯子-內含子拼接位點信號、類轉座子重複的序列和其它此類可能對基因表達不利的充分表徵的序列去除.可將序列的G-C含量調節至給定細胞宿主的平均水平，該水平通過參考在宿主細胞中表達的已知基因計算得出.在可能時，修飾序列以避免預測的髮夾二級mRNA結構，表達盒可額外包含5，前導序列(leadersequences).這些前導序列可以發揮作用提高翻譯.翻譯前導序列是本領域已知的，其包括小核糖核酸病毒前導序列，例如EMCV先導(腦心肌炎5，非編碼區)(Elroy-SteinWC(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:6126-6130);馬鈴薯丫病毒屬(potyvirus)前導序列，例如TEV前導序列(菸草蝕故病毒)(Gallie""(1995)Gene165(2):233-238)、MDMV前導序列(玉米矮花葉病毒)、和人免疫球蛋白重鏈結合蛋白(BiP)(MacejakW(1991)Nature353:90-94);來自紫花苜蓿花葉病毒的外殼蛋白mRNA的非翻譯前導序列(AMVRNA4)(Jobling"a/.(1987)Nature325:622-625);菸草花葉病毒前導序列(TMV)(Gallie"a/,(1989)inMolecularBiologyofRNA，ed,Cech(Liss，NewYork),pp,237-256)j和玉米枯黃斑點病毒前導序列(MCMV)(LommelWa/.(1991)Virology81:382-385),也見Della-CioppaW"/.(1987)PlantPhysiol.84:965-968,在製備表達盒的過程中，可以對多種DNA片段加以搮縱，由此提供正確定向以及適用的話，在正確閱讀框內的DNA序列，為了這個目標，可以使用接頭(adapter)或連接子連接DNA片段，或可以包含其它的操作以提供方便的限制性位點，實現多餘DNA的去除、限制性位點的去除等.為了這個目的，體外誘變、引物修復、限制性酶切、退火、重取代例如轉換(transition)和顛換(transversion)等可被包含.表達盒還可包含用於選擇轉化細胞的選擇性標記基因.選擇性標記基因被用於轉化細胞或組織的選擇.標記基因包括編碼抗生素抗性的基因，例如那些編碼新審素磷酸轉移醉II(NEO)和潮審素磷酸轉移醉(HPT)的基因，以及賦予對除草化合物抗性的基因，例如草銨鱗、溴苯腈(Bromoxynil)、咪唑啉嗣、草甘聘和2，4-二氯苯氧乙酸鹽(2，4-D),其它的選擇性標記包括表型標記(phenotypicmarkers)例如P-半乳糖苷酶和螢光蛋白例如綠色螢光蛋白(GFP)(Sue"/.(2004)BiotechnolBioeng85:610-9和Fetter等(2004)PlantCell16:215-28)、青色螢光蛋白(CYP)(Bolte"fl/.(2004)J.CellScience117:943-54和Kato"fl/.(2002)PlantPhysiol129:913-42)、以及黃色螢光蛋白(來自Evrogen的PhiYFP,見BolteCa/.(2004)J.CellScience117:943-54).關於其它選擇性標記，一般地見Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3:506-511;ChristophersonWa/,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:6314-6318;YaoWa/.(1992)Cell71:63-72;Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6:2419-2422;Barkley"C(1980)inTheOperon，pp.177-220;Hu"fl/.(1987)Cell48:555-566;Brown"a/.(1987)Cell49:603-612;FiggeC(1988)Cell52:713-722;DeuschleWd/.(1989)Proc.Natl.Acad.Aci.USA86:5400-5404;FuerstW1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2549-2553;Deuschlee"/.(1990)Science248:480-483;Gossen(1993)Ph.D.Thesis,UniversityofHeidelberg;ReinesWfl/.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:1917-1921;LabowWa/.(1990)Mol.Cell.Biol.10:3343-3356;ZambrettiWfl/.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:3952-3956;BaimWa/,(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:5072-5076;WyborskiW(1991)NucleicAcidsRes.19:4647-4653;HHlenand-Wissman(1989)TopicsMol.Struc.Biol.10:143-162;Degenkolba/.(1991)Antimicrob.AgentsChemother.35:1591-1595;Kleinschnidt1988)Biochemistry27:1094-1104;Bonin(1993)Ph.D.Thesis，UniversityofHeidelberg;Gossena/.(1992)Proc.Natl.Acad.Sd.USA89:5547-5551;Oliva"a/.(1992)Antimicrob.AgentsChemother.36:913-919;HlavkaWa/.(1985)HandbookofExperimentalPharmacology,Vol.78(Springer-Verlag，Berlin);GillWfl/.(1988)Nature334:721-724;和WO02/36782.這些iS開物通過引用併入本文.選擇性標記基因的以上列表並不意味著限定.任何選擇性標記基因可被用於具體實施方式.術語"啟動子"指位於轉錄起始的上遊和/或下遊的區域或序列，該區域或序列涉及對RNA聚合酶和其它蛋白的識別和結合以起始轉錄.啟動子包括轉錄起始位點附近的核酸序列，例如在聚合醉II型啟動子的例子中，TATA元件.啟動子還可選地包括遠端增強或遏制元件，這些元件可位於距離轉錄起始位點幾千個鹼基對之遠的位點."組成型"啟動子是在大多數環境和發育條件下有活性的啟動子，"可誘導"啟動子是在環境或發育調節下有活性的啟動子.術語"可操作性連接"指在核酸表達控制序列(例如啟動子或一系列轉錄因子結合位點)和笫二核酸序列之間的功能性連接，其中表達控制序列引導對應於第二序列的核酸的轉錄.一些啟動子可被用於具體實施方式的實踐，包括感興趣的多核苷酸序列的天然啟動子.可根據希望的結果對啟動子加以選擇.廣泛的植物啟動子在最近的Potenza"a/.(2004)/fiK,7roCe〃Z)ev5iWiVawf^:/-"的綜述中被討論，該綜述通過引用併入本文.例如，核酸分子可以與組成型的、組織偏好的、病原體誘導的或其它啟動子組合以在植物中表達.這些組成型啟動子包括例如Rsyn7啟動子的核心啟動子和在WO99/43838和美國專利號6，072，050中公開的其它組成型啟動子；核心CaMV35S啟動子(Odellfl/.(1985)iV加m/^313:810-812);大米肌動蛋白(McElroy"(1990)屍/a^CW/2:163-171);泛素(ChristensenCa/.(1989)屍/flW醜iVi/.12:619-632和ChristensenWfl/.(1992)屍/朋fMo/.說W.18:675-689);pEMU(LastWa/.(1991)T7^or.Xp//.81:581-588);MAS(Ve"en"W.(1984)五M醜O3:2723-2730);ALS啟動子(美國專利號5,659,026)等.其它組成型啟動子包括例如那些在美國專利號5,608,149;5,608,144;5,604,121;5,569,597;5,466,785;5,399,680;5,268,463;5,608,142和6,177,611中公開的啟動子.一般地，從可誘導啟動子特別是從病原體誘導啟動子表達基因將是有益的.這樣的啟動子包括那些來自致病相關蛋白(PR)的啟動子，這些啟動子在病原體感染後被誘導；例如PR蛋白、SAR蛋白、P-l，3-葡聚糖酶、幾丁質酶等.見例如RedolfiWfl/.(1983)Neth.J.PlantPathol.89:245-254;UknesWa/.(1992)PlantCell4:645-656;以及VanLoon(1985)PlantMol.Virol.4:111-116,也見WO99/43819，其通過引用併入本文.感興趣的是在病原體感染位點或附近產生局部表達蛋白的啟動子.見例如Marineauem/.(1987)所"9:335-342;Matton"a/.(1989)Mo/ecw/ariVa/i"M/cro6e/繞nicrt》/ts2:325-331;Somsischa/.(1986)/Voc.7VflZ/,Sci*.83:2427-2430;Somsischa/.(1988)Mo/.Ge".Ge/i飢2:93-98;以及Yang(1996)iVoc.7VW/.爿caA5W.93:14972-14977,也見Chen(1996)屍/a加/.10:955-966;ZhangWa/.(1994)/Voc.TVa".爿carf.5W.tASJ91:2507-2511;WarnerC1993)屍/a似/'3:191-201;Siebertz1989)屍/a"fCW/1:961-968;美國專利號5，750，386;以及在其中引用的參考文獻.進一步的例子是玉米PRms基因的可誘導啟動子，該基因的表達由病原體輪狀鐮刀菌(F麵"謂ve/tic漁Wto)謙導，(見例如Cordero"fl/.(1992)屍A戸o/.Mo/.屍/朋,Pa狄.41:189-200)。此外，當病原體通過傷口或昆蟲傷口找到進入植物的入口時，傷口誘導啟動子可被用於具體實施方式的構建.這類傷口誘導啟動子包括馬鈴薯蛋白酵抑制劑(pinII)基因(Ryan和wun2，美國專利號5,428,148;winl和win2(Stanford"fl/.(1989)M"215:200-208);系統素(McGurl"fl/.(1992)5Wewce225:1570-1573);WIP1(RohmeierWfl/.(1993)屍/a似所o/.22:783-792;Eckelkampe《(1993)Z^股rj323:73-76);MPI基因(Corderoke"/.(1994)/Va"f丄6(2):141-150)等，它們通過引用併入本文.化學藥品調節啟動子可被用於通過使用外源化學調節刑來調節基因在植物中的表達.取決於目的，啟動子可以是化學藥品誘導啟動子，其中使用化學藥品誘導基因表達；或化學藥品抑制啟動子，其中使用化學藥品遏制基因表達.化學藥品誘導啟動子是本領域已知的，其包括但不限於玉米In2-2啟動子，該啟動子由苯磺醯胺除草刑安全刑激活，玉米GST啟動子，該啟動子由被用作苗前除草刑的疏水親電化合物激活，以及菸草PR-la啟動子，該啟動子由水楊酸激活，其它感興趣的化學藥品調節啟動子包括類固醇應答啟動子(見例如Schenae"/.(1991)P/w.iVfl汰/4cflrf.&f'.88:10421-10425和McNellis"a/.(1998)屍/nwr義14(2):247-257中的糖皮質激素誘導啟動子)以及四環素誘導和四環素抑制啟動子(見例如GatzW(1991)Mo/.Ge汰227:229-237，和美國專利號5,814,618和5,789,156)，它們通過引用併入本文.組織偏好啟動子可被用於將具體實施方式的抗真菌多肽的提高的表達把向到特定植物組織中.例如，組織偏好啟動子可被用於在其中疾病抗性是特別重要的植物組織中表達抗真菌多肽，所述組織例如根、莖或葉.組織偏好啟動子包括Yamamotoe"/.(1997)屍/aW/.12(2):255-265;KawamataWfl/.(1997)屍/a擬Ce//屍/^j"/.38(7):792-803;HansenWa/.(1997)淑.GewGe/i".254(3):337-343;Russell(1997)r腦艱emc及e"(2):157-168;RinehartWa/.(1996)112(3):1331-1341;VanCamp"a/.(1996)屍/a"fiVi戸o/.112(2):525-535;Ca譜ascini"a/.(1996)屍/a/t,112(2):513-524;Yamamoto"(1994)/Va/ifCWZ屍/^戸o/.35(5):773-778;Lam(1994)及柳to/V祝CW/卿e,.20:181-196;OrozcoWa/.(1993)屍/朋,Mo/所o/.23(6):1129-1138;MatsuokaWa/.(1993)屍wcTVa".爿carf.5W.tAR490(20):9586-9590;以及Guevara-Garcia&a/.(1993)屍/a",/4(3):495-505.如果需要的話，此類啟動子可以經改進以用於弱表達.維管組織偏好啟動子是本領域已知的，其包括那些在例如木質部和韌皮部組織中選擇性驅動蛋白表達的啟動子.維管組織偏好啟動子包括但不限於黑櫻桃(Prw""swrW朋)野黑櫻苷水解醃基因啟動子(見例如國際公開號WO03/006651),以及還在美國專利申請序列號10/109,488中發現的啟動子.莖偏好啟動子可被用於驅動具體實施方式的抗真菌多肽的表達.典型的莖偏好啟動子包括玉米MS8-15基因啟動子(見例如美國專利號5,986,174和國際公開號WO98/00533)，以及在Graham"a/.(1997)iVa似Mo/所o/33(4):729-735中發現的啟動子.葉偏好啟動子是本領域已知的.見例如YamamotoCa/.(1997)/Vfl"//.12(2):255-265;KwonWa/.(1994)屍AjwV/.105:357-67;Yaraamoto"a/.(1994)/Vd加CW/屍/^s/c/.35(5):773-778;GotorW"(1993)屍/a"f3:509誦18;OrozcoWa/.(1993)P/amA/o/.23(6):1129-1138;和Matsuoka"a/.(1993)屍roc.iVa".JcaASc/.t/5L490(20):9586-9590,根偏好啟動子是已知的，其可選自從很多文獻中可獲得的啟動子中，或從各種相容的物種中重新分離.見例如HireCd/.(1992)/，/aWMo/.所o/.20(2):207-218(大豆根特異性穀氨醯胺合成酶基因)；KellerandBaumgartner(1991)3(10):1051-1061(四季豆GRP1.8基因的根特異性控制元件)；SangerWa/.(1990)/Vfl似Mo/.14(3):433-443(根瘤農桿菌(Jgro^"eWwmto附e/"de"s)的甘露氨酸合成酶(MAS)基因的根特異性啟動子)；和MiaoWfl/.(1991)CW/3(1):11-22(編碼胞液穀氨醯胺合成酶(GS)的全長cDNA克隆，該cDNA在大豆的根和根痗中表達)，也見BoguszWa/.(1990)7>/a/^Ce〃2(7):633-641,其中說明了從固氮非豆科Pflras/wm'aawrf^yom'i'和相關的非固氮非豆科山黃麻(7Ve附"似me"似幼)的血紅蛋白基因中分離出的兩種根特異性啟動子.LeachandAoyagi(1991)說明了他們關於髮根農桿菌(^4gw6fl"e〃'MWr/f/wge"ey)的高度表達的roIC和rolD根誘導基因的啟動子的合成(見屍/a"fSdew"(Limerick)79(1):69-76).其它的根偏好啟動子包括VfENOD-GRP3基因啟動子(Kuster^a/.(1995)外fl^Mo/.所o/,29(4):759-772);和rolB啟動子(CapanaW(1994)屍/a"fMo/.25(4):681曙691).也見美國專利號5，837，876;5，750，386;5,633,363;5,459,252;5，401，836;5,110,732和5,023,179,"種子偏好"啟動子包括"種子特異性"啟動子(這些啟動子在種子發育中有活性，例如種子儲存蛋白的啟動子)以及"種子萌發(germination)"啟動子(這些啟動子在種子萌發中有活性).見ThompsonC"/.(1989)fi,oEwa^s10:108,其通過引用併入本文，此類種子偏愛啟動子包括但不限於Ciml(細胞分裂素誘導信息)；cZ19Bl(玉米19kDa玉米醇溶蛋白(zein));milps(肌醇-l-鱗酸合成酶)(見WO00/11177和美國專利號6,225,529;在此被參考引用).Y-玉米醇溶蛋白是優選的胚乳特異性啟動子.Glob-l是優選的胚芽特異性啟動子。對於雙子葉植物而言，種子特異性啟動子包括但不限於豆e-菜豆蛋白、油菜蛋白(napin)、P-大豆聚球蛋白、大豆凝血素、十字花科蛋白(cruciferiii)等.對於單子葉植物而言，種子特異性啟動子包括但不限於玉米15kDa玉米醇溶蛋白、22kDa玉米醇溶蛋白、27kDa玉米醇溶蛋白、g-玉米醇溶蛋白、裙蛋白(waxy)、shrunken1、shrunken2、球蛋白1(globulin1)等.也見WO00/12733，其中公開了來自ewrf/和em/2的種子偏好啟動子；該文獻通過引用併入本文.在某些具體實施方式中，具體實施方式的核酸序列可與感興趣的多核苷酸序列的任意組合疊加(stack)，由此生成具有人們想要的表型的植物.例如，具體實施方式的多核苷酸可與具體實施方式的任何其它多核苷酸，如SEQIDNOS:3、6和9的任何組合，或其它抗真菌基因等疊加.生成的組合也可包括任何一個感興趣的多核苷酸的多個拷貝.具體實施方式的多核苷酸也可以與任何其它的基因或與基因的組合疊加以生成具有各種想要的性狀組合的植物，這些性狀組合包括但不限於對動物飼養而言，希望的性狀例如高油基因(例如美國專利號6,232,529);平衡的胺基酸(例如hordothionins(美國專利號5,990,389;5,885,801;5，885，802和5,703,409));大麥高賴氨酸(WilliamsonWa/.(1987)/醜ioc/^附.165:99-106;和WO98/20122);和髙甲疏氨酸蛋白(Pedersen"a/.(1986)/所o/.CT^m.261:6279;Kirihara"a/.(1988)71:359;和MusumuraWa/.(1989)/Vd/^MW.所o/.12:123));提高的可消化性(例如改進的儲存蛋白(提交於2001年11月7日的美國申請序列號10/053,410));和疏氧還蛋白(提交於2001年12月3日的美國申請序列號10/005,429)),這些公開文獻通過引用併入本文.具體實施方式的多核苷酸也可與針對昆蟲、疾病或殺蟲刑抗性的所需性狀疊加(例如蘇雲金芽桿菌(醜w7/"j^M/7>igie/iws)毒性蛋白(美國專利號5,366,892;5,747,450;5,737,514;5723,756;5,593,881;GeiserCa/.(1986)48:109);植物凝血素(VanDammeC(1994)iVa似Mo/.BiW.24:825);伏馬菌毒素解毒基因(美國專利號5,792,931);無毒性(avirulence)和疾病抗性基因(Jones"a/.(1994)Science266:789;Martin"a/.(1993)Science262:1432;Mindrinos"a/.(1994)Cell78:1089);導致除草刑抗性的乙醯乳酸合成酶(ALS)突變體例如S4和/或Hra突變；穀氨耽胺合成醉抑制刑例如草丁鱗(phosphinothricin)或basta(例如bar基西)；以及草甘膊抗性(EPSPS基因，GAT基因如那些在美國專利申請公開號US2004/0082770以及WO02/36782和WO03/092360中公開的基因))；以及對於加工或加工產物而言所希望的性狀，如高油(例如美國專利號6，232，529);改進的油(例如脂肪酸脫氬酶基因(美國專利號5,952,544;WO94/11516));改進的澱粉(例如ADPG焦砩酸化酶(AGPase)、澱粉合成醉(SS)、澱粉分支醃(SBE)和澱粉去分支醉(SDBE));以及聚合物或生物塑料(例如美國專利號5，602，321;P-酮基疏解酶、聚羥基丁酯合成酶和乙醯乙醯輔酶A還原醉(SchubertCd/.(1988)醜a"e"W.170:5837-5847)促進聚鞋基烷酸(PHAs)的表達)，這些公開文獻通過引用併入本文.人們也可以將具體實施方式的多核苷酸與提供農藝學性狀(例如雄性不育(例如見美國專利號5,583,210)、莖強度、花期)或轉化技術性狀(例如細胞周期調節或基因把向(例如WO99/61619;WO00/17364;WO99/25821))的多核苷酸組合，這些公開文獻通過引用併入本文.這些疊加組合可以通過任何方法產生，所述方法包括但不限於通過任何傳統的或1\^(>088@方法或遺傳轉化法雜交育種植物。如果通過遺傳轉化植物將這些性狀疊加，感興趣的多核苷酸序列可以在任何時刻以任何順序組合.例如，包含一種或多種想要的性狀的轉基因植物可被用作靶植物，以通過隨後的轉化進一步引入性狀.性狀可與用轉化盒的任何組合提供的感興趣的多核苷酸在共轉化步碟中同時被引入。例如，如果兩個序列將被引入，該兩個序列可以被包含在分開的轉化盒(trans)或包含在相同的轉化盒(cis)中.序列的表達可以由相同的啟動子或不同的啟動子驅動.在某些例子中，引入將遏制感興趣的多核苷酸表達的轉化盒是人們希望的.這可與其它遏制盒或過量表達盒的任意組合相組合，以在植物中產生想要的性狀的組合.技術人員還將認識到，可以使用位點特異性重組系統將多核苷酸序列在想要的基因組位點疊加.見例如W099/25821、W099/25854、WO99/25840、W099/25855和W099/25853，所有這些文獻通過引用併入本文.具體實施方式的方法包括將多肽或多核苷酸引入植物."引入"意在表示將多核苷酸呈現給植物.在某些具體實施方式中，多核苷酸將以下述方式呈現，所述方式使得序列能夠進入植物細胞的內部，包括其對植物基因組的潛在插入.具體實施方式的方法不依賴於特別的將序列引入植物的方法，只要多核苷酸能夠進入至少一個植物細胞即可.將多核苷酸引入植物的方法是本領域已知的，其包括但不限於穩定轉化法、瞬間轉化法和病毒介導法.多肽也可以以下述方式被引入植物，所述方式使得它們能夠進入植物細胞的內部，或雖然保持在細胞的外部但與細胞緊密接觸."穩定轉化"意在表示引入植物的核苷酸構建體整合進植物基因組並能夠由其後代遣傳，"瞬間轉化"或"瞬間表達"意在表示多核苷酸被引入植物且不整合進植物的基因組，或多肽被引入植物。轉化方案以及將多肽或多核苷酸序列引入植物的方案可根據目標轉化植物或植物細胞的類型(即單子葉或雙子葉)而變化.將多肽和多核普酸引入植物細胞的合適方法包括微注射(CrosswayWfl/.(1986)BiWecA/i《es4:320-334)、電穿孑"RiggsWa/，(1986)iVa".hrf.5W.tASJ83:5602-5606)、農桿菌(y^w6fl"e〃'"m)-介導轉化(美國專利號5，563，055和5，981，840)、直接基因轉移(PaszkowskiW"/，(1984)五M50/3:2717-2722)以及彈道粒子加速(見例如SanfordWfl/.，美國專利號4,945,050;5，879，918;5，886，244;和5,932,782;Tomese"/.(1995)in屍/a"ZCW/，r/swie,Orga/iC"/似re:FM/tda附ewfa/i^/e^offc，ed.GamborgandPhillips(Springer-Verlag，Berlin);McCabeo/.(1988)醜/W"A朋/ogy6:923-926);以及Lecl轉化(WO00/28058).也見Weissinger"a/.(1988)^肌及ev.22:421-477;Sanforde《a/.(1987)Pam'oi/flfeSc/e/ice朋rfre由o/柳5:27-37(洋蔥)；ChristouWa/.(1988)屍/fl/if87:671曙674(大豆)；McCabe"a/.(1988)說V7Vc/i/io/ogy6:923-926(大豆)；FinerandMcMullen(1991)//iFrtroCW/Dev.所o/.27P:175-182(大豆)；Singhe"/.(1998)7%^/*.4/p/.Gew"96:319-324(大豆)；DattaWa/.(1990)JJiV^c/^oto"8:736-740(水稻);KleinWa/.(1988)屍roc.TVfl".爿carf.5W.tAS^85:4305-4309(玉米)；Klein"a/.(1988)胸ecA朋/柳6:559-563(玉米)；美國專利號5,240,855;5，322，783和5，324，646;KleinWfl/.(1988)i>Aj;siV/.91:440-444(玉米)；FrommCa/.(1990)說Vtec/wo/ogv8:833-839(玉米)；Hooykaas-VanSlogteren"a/.(1984)iVa似"(Xomto^311:763-764;美國專利號5,736,369(蕎麥)；BytebierWa/.(1987)/Voc.iVarf.Jcn忒5W.tASL484:5345-5349(百合科)；DeWetW(1985)in五jc/;erime/i似/Maw(pu/a"VmOvw/e7Y柳四,ed.Chapmana/.(Longman,NewYork),pp.197-209(pollen);Ka印pler"a乙(1990)屍/fl"《Ce//及印orto9:415-418和KaepplerWa/.(1992)rAeor.J//;/.Ce"汰84:560-566(whisker曙介導轉化)；D，HalluinWa/.(1992)/VaWCeW4:1495-1505(電穿孔)；LiWa/.(1993)屍/a"fCe//及印or"12:250-255以及ChristouandFord(1995)j/mafco/5Wfl/y;75:407-413(水稻)；Osjoda"C(1996)iVa似re醜/WecA/w/ogv14:745-750(通過根瘤農桿菌(爿gro6fl"en'"mmme/aci'e/is)的玉米)；所有這些文獻通過引用併入本文.在特定具體實施方式中，可使用各種瞬間轉化法將具體實施方式的抗真菌序列提供給植物.這些瞬間轉化法包括但不限於將抗真菌蛋白或其變體及片段直接引入植物或將抗真菌蛋白轉錄本引入植物.這樣的方法包括例如微注射或粒子轟擊.見例如Crossway"a/.(1986)Mo/Ge".Ge/iW.2^2:179-185;NomuraWa/.(1986)iVa加Sd.^/:53-5S;HeplerWa/.(1994)TVfl".Jcarf.97:2176-2180和HushCfl/.(1994)77^■/wi/tw/o/Ce//Sdewce^7:775-784,所有這些文獻通過引用併入本文.可替換地，可使用本領域已知技術將多核苷酸瞬間轉化進植物.此類技術包括病毒栽體系統和以能防止DNA隨後釋放的方式進行的多核苷酸沉澱.因此，粒子結合DNA的轉錄可發生，但其釋放整合進基因組的頻率被大大降低，此類方法包括使用包被了聚乙亞胺(PEI;Sigma#P3143)的粒子，在其它具體實施方式中，通過將植物與病毒或病毒核酸接觸，具體實施方式的多核苷酸可被引入植物，通常，這樣的方法包括將具體實施方式的核苷酸構建體併入病毒DNA或RNA分子.技術人員將知道，具體實施方式的抗真菌多肽可首先作為病毒多聚蛋白的一部分被合成，隨後可通過體內或體外的蛋白水解對該多聚蛋白進行加工，生成想要的重組蛋白.進一步地，技術人員將知道，具體實施方式的啟動子也包含用於通過病毒RNA聚合醉進行轉錄的啟動子.將多核苷酸引入植物並在其中表達由其編碼的蛋白質的、涉及病毒DNA或RNA分子的方法是本領域已知的.見例如美國專利號5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367、5,316,931，和PortaW"(1996)Mo/ec"/ar5:209-221;它們通過引用併入本文，用於在植物基因組的特定位點將多核苷酸靶向插入的方法是本領域已知的.在一種具體實施方式中，多核苷酸在想要的基因組位點的插入通過位點特異性重組系統實現.見例如W099/25821、W099/25854、WO99/25840、W099/25855和W099/25853，所有這些文獻通過引用併入本文.簡言之，具體實施方式的多核苷酸可被包含在轉移盒中，該盒由兩個不引起重組的重組位點包夾.轉移盒被引入下述植物，所述植物具有被穩定引入其基因組的靶位點，該位點由兩個不引起重組的重組位點包夾，這些重組位點對應於轉移盒的位點.提供合適的重組酶，轉移盒被整合進靶位點.感興趣的多核苷酸由此被整合進植物基因組中的特定染色體位點.可根據常規方法將已轉化的細胞培養為植物.見例如McCormick^a/.(1986)屍/朋《O//及e/w他5:81-84。這些植物隨後可被培養，並由相同轉化林或不同林授粉，得到的具有想要的表型特徵的組成型表達的後代被鑑定出來.可培養兩代或更多代，以確保想要的表型特徵的表達被穩定維持且被遺傳，隨後收穫種子以確保想要的表型特徵的表達已被實現.以這種方式，具體實施方式提供了經轉化的種子(也被稱作"轉基因種子")，所述種子具有穩定整合進它們的基因組的具體實施方式的核苷酸構建體，例如具體實施方式的表達盒.當在本文中使用時，術語"植物"包括整個植物，植物細胞，植物原生質，下述植物細胞組織培養物(通過所述培養物可再生玉米植物)，植物愈傷組織，植叢(plantclump)以及在植物中完整的植物細胞或植物的部分例如胚、花粉、種子、胚乳、種皮、葉、花、花器官/結構(例如苞葉、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花粉囊和胚珠)、枝、果實、核、穗、穗軸、殼、莖、塊莖、根、根尖、花粉囊、植物組織(例如維管組織、基本組織等)和細胞(例如保衛細胞、卵細胞、毛狀體等)和相同的後代.穀類意在表示由商業栽培者為了生長或繁殖物種以外的目的生產的成熟種子.再生植物的後代、變體和突變體也被包含在具體實施方式的範閨內，前提是這些部分包含引入的多核苷酸.可用於具體實施方式的方法中的植物的種類通常和能夠適應轉化技術的高等和低等植物種類一樣廣泛，包括被子植物(單子葉植物和雙子葉植物)、棵子植物、獲類植物和多細胞藻類.植物包括不同倍體水平的植物，包括非整倍體、多倍體、二倍體、單倍體和半合子植物.具體實施方式的方法可被用於在任何植物物種中誘導真菌抗性或保護不受真菌病原體攻擊，所述植物包括但不限於單子葉和雙子葉植物.感興趣的植物物種例子包括但不限於玉米(Zefl附fl^)、芸苔屬(JJ/"似si'casp.)(例如甘藍型油菜(及/tapws)、白菜(及m/")、芥菜型油菜(醜.),特別是那些用於種子油來源的芸苔屬，紫花苜蓿(Me必cagos油'va)、稻(O/jzfls幼'va)、黑麥(5"ecfl/ece/*ea/e)、高梁(5^/^Am附Wa/or、SorgAnmvm/gdre)、黍(例如珍珠黍(Pew/ii'se似附g/awciim)、稷(Pa附'c謹mf7/dtceum)、穀子(5Wari'flf7a"cd)、龍爪稷(￡7eiiVieco/Yic朋a))、向曰葵(好e/Za/t狄Ksa朋MMS)、紅花(d/t/ra附附《//i"o"'i/s)、小麥(7Wft'CMmae幼'vw/w)、大豆(C/戸7ie)、菸草(iWcCfl"a似6flcn附)、馬鈴茅(So/ami/w勵e"osMw)、花生(y4rac船—/ogaea)、棉花((o輝/w'"附6a由&朋e、(aw爐'w附W簡,謂)、甘薯(印0m0ea6齒似s)、木募(Mam'AWescu/e幽)、咖啡(CojQ^ispp.)、椰子(CocosWMCiy"era)、獲蘿(y4/iflfiflsco附aww)、措桔樹(Ci7riwspp.)、可可(rAeo6ro附acacao)、茶(Ca附e〃/flsiVie/ts/s)、香蕉(Musaspp.)、跨梨(屍erseaa附e〃'cflw")、無花果(caw.ca)、番石榴(屍s!V/i'"mg呵'ava)、芒果(Mflw7"era//irfi'cd))、橄欖、木瓜(Car/cfl/apa")、腰果(J/iacflnfi.ii附oc"Vfew似/e)、澳洲堅果(Mac(z^im/a/w峰/7yb/iVi)、杏(iVw"MSa考g^"s)、甜菜(醜"avw/g"〃's)、甘蔗(Sacc/m/wMspp.)、燕麥、大麥、蔬菜、觀賞植物和松類.蔬菜包括西紅柿(Z^co/^rwcowi[ycoiperw'cwi)、萵苣(例如Z^c似caWva)、綠豆(戶toeo/"sv/ga/*&)、青豆(屍to幼/"s/i'/wewsi's)、豌豆(Z^狄""sspp.)、以及甜瓜屬(C"cmw&)的成員例如黃瓜(C.jarfvKS)、香瓜(C.cfl/ito/"/^附fe)和甜瓜(C.附eto),觀賞植物包括杜鵑花(及/^wtorfe"rf/Y/tspp.)、A^(山花(/ryrfrafigea)、芙蓉(歷6&面r纖卵"e附^)、玫瑰(及謹spp.)、鬱金香(7>i/—spp,)、水仙花(iVarctowspp.)、矮牽牛花(屍""wVi一r/rfa)、康乃馨(awyo/^〃Ms)、一品紅(五M//^r6!.flp/cAem'/nfl)和菊花.可用於實現具體實施方式的松類包括例如松樹如火炬松(屍i'mw、溼地*》(戶/mwe〃i.Wi.i')、美國黃*》(Pi7iiw/wm;tewsfl)、小杆松(i//f"jco/tto加)和插射松(rfl必Ca);花旗松(屍se"rfo加^j附ewz^w7);西部鐵杉(7^g/;/i'ai紐)和阿拉斯加檜柏(C/^waec^/7ari's/i卯汰ate附i's)。在特定具體實施方式中，具體實施方式的植物是農作物(例如玉米、紫花苜蓿、向日葵、芸苔、大豆、棉花、紅花、花生、高梁、小麥、黍、菸草等)在其它一些具體實施方式中，玉米和大豆植物是最優的，在另一些具體實施方式中玉米植物是最優的.感興趣的其它植物包括提供感興趣的種子的穀類植物、油籽植物和豆科植物.感興趣的種子包括穀物種子例如玉米、小麥、大麥、稻、高梁、黑麥等.油籽植物包括棉花、大豆、紅花、向日葵、芸苔、玉米、紫花苜薦、棕櫚、椰子等.豆科植物包括豆(bean)和豌豆，豆包括瓜兒豆、槐豆、胡,巴、大豆、菜豆、豇豆、綠豆、青豆、蠶豆、小扁豆、鷹嘴豆等.抗真菌組合物也被包含在本發明中.抗真菌組合物可包含抗真菌多肽或含有編碼抗真菌多肽的核苷酸序列的經轉化微生物.本發明的抗真菌組合物可應用於植物真菌病原體的環境，如下文所述，由此保護植物免受真菌病原體攻擊.此外，抗真菌組合物可以與可接受的栽體配方，所述栽體例如懸浮劑、溶液、乳劑、撒布粉劑(dustingpowder)、可分散粒刑、可溼性粉劑、可乳化濃縮劑、氣溶膠、浸漬粒刑、佐劑、可包被貼刑，其還可以包裝在例如聚合物質中.編碼具體實施方式的抗真菌多肽可根據本領域的標準方法被引入任何合適的微生物宿主.例如，可選擇已知佔領一種或多種感興趣的農作物的"植物閨(phytosphere)"(葉面(phylloplane)、葉閨(phyllosphere)、根圍(rhizosphere)和/或根面(rhizoplana))的微生物.選擇這些微生物使得它們能夠在特定環境中成功地與野生型微生物竟爭，並且提供表達抗真菌蛋白的基因的穗定維持和表達.這些微生物包括細菌、藻類和真菌.特別感興趣的是微生物如細菌,傘il如i^enrfowMmfls、￡"nvi>i/a、ye/TYift'fluJS7e^s/e//fl、Aii/^/^附omw、ift,印似mycas、(Jfls/rf/o附^c^eyyeastH9及A0rfo似rM/a、y411re06as1VWMm、iy/w/Y^0/0附yces等.特別感興趣的微生物宿主生物體包括酵母例如及/^rfo似w/a印p.、JreotoiW"w卿，、5"accAar麵，ces柳.和5^oro6tf/o考cas卿.，葉面微生物如屍seMrfo柳"as、￡>H7>.asp/.和/7flvoftacte"'賺s/;/;.，以及其它這樣的微生物,包括/^ei^/omd"asflgnigi'朋sa、/^eiirfomowas^EscAer/c似flco/,、醜w7/ms訓M似等，編碼具體實施方式的抗真菌蛋白的基因可被引入下述微生物中，所述微生物在植物(附生物(印iphyte))中繁殖以將抗真菌蛋白運送到潛在的靶向真菌病原體.附生物，例如，可以是革蘭氏陽性或革蘭氏陰性菌，根拓殖細菌(Root-colonizingbacteria),例如，可以使用本領域已知方法從感興趣的植物中分離.特別地，拓殖在根上的蠟狀芽孢桿菌(Jac///Jcere"j)菌林可以從植物的根上分離(見例如HandelsmanWfl/.(1991)v4p//.五/mro仗M/cro6iW.56:713-718).可以通過本領域已知的標準方法將編碼具體實施方式的抗真菌多肽的基因引入根拓殖蠟狀芽孢桿菌(5aci7/"sce/"戰s)中.可以通過電轉化法將編碼具體實施方式的抗真菌多肽的基因引入根拓殖桿菌(5a"7/"s)中.特別地，編碼蛋白的基因可被克隆進穿梭栽體(shuttlevector)例如pHT3101(LereciusWa/.(1989)FC"M5M,'cwW"Z^tt.60:211-218).含有特定蛋白的編碼序列的穿梭栽體pHT3101可以例如通過電穿孔被轉化進根拓殖桿菌(Lerecius"(1989)F五MSM,croW"1W汰60:211-218).本發明提供了保護植物免受真菌病原體侵害的方法，該方法包括將有效量的本發明的抗真菌蛋白或組合物施加到真菌病原體的環境中."有效量"意在表示足以控制病原體的蛋白或組合物的量.可通過本領域普通技術人員已知的方法將抗真菌蛋白和組合物應用於病原體的環境中.本發明的抗真菌組合物可通過下述方法獲得添加表面活性刑、惰性栽體、防腐刑、溼潤劑、攝食促進劑、引誘劑、包袞劑、粘合刑、乳化刑、染料、UV保護劑、緩衝劑、流動刑或肥料、微量營養素供應物、或其它影響植物生長的製劑.一種或多種農用化學品包括但不限於除草劑、殺蟲刑、殺真菌刑、殺菌劑、殺線蟲刑、軟體動物殺滅劑、acaracides、植物生長調節劑、輔助收穫刑(harvestaids)和肥料，其可與栽體、表面活性劑或通常用於製劑領域的佐刑組合或與其它有助於產品處理和用於特定靶向病原體的成分組合.合適的栽體和佐刑可以是固體或液體的，其對應於製劑技術中通常使用的物質，例如天然的或再生的礦物質、溶刑、分散刑、溼潤刑、增粘刑、粘合劑或肥料.本發明的活性成分通常以組合物的形式應用，其可應用於待處理的農作物區域、植物或種子.例如，本發明的組合物可應用於準備儲藏或正儲藏在谷箱或谷筒等內的穀物上.本發明的組合物可與其它化合物同時或先後應用.應用含有本發明的至少一種抗真菌蛋白的本發明的活性成分或本發明的農用化學品組分的方法包括但不限於葉應用、種包覆和土壤應用.應用的次數和應用的速率取決於被相應真菌病原體侵襲的密度.合適的表面活性刑包括但不限於陰離子化合物例如金屬的羧酸鹽；長鏈脂肪酸的羧酸酯；N-醯基肌氨酸醋；具有脂肪醇乙氣基物的砩酸單酯或二酯或這些酯的鹽；脂肪醇碟酸鹽例如十二烷基磺酸鈉、八烷基磺酸鈉或十六坑基磺酸鈉；乙氧基化脂肪醇硫酸鹽；乙氣基化烷基酚硫酸鹽；木質素橫酸鹽；石油橫酸鹽；烷基芳香基磺酸鹽例如烷基苯磺酸鹽或更低級的烷基萘磺酸鹽例如丁基萘磺酸鹽；磺基化的萘-甲S^縮合物的鹽；更複雜的磺酸鹽如氨基磺酸鹽，例如油酸和N-甲基牛磺酸的磺基化縮合產物；或二坑基琥珀酸鹽，例如磺酸鈉或辛基琥珀酸鹽.非離子性試劑包括脂肪酸酯、脂肪醇、脂肪酸醯胺或脂肪烷基或烯基取代的的酚與環氣乙烷、多羥基醇酯的脂肪酯(例如山梨聚糖脂肪酸酯)的縮合產物，此類醋與環氣乙烷的縮合產物，例如山梨聚糖脂肪酸酯，環氧乙烷和環氧丙烷的嵌段共聚物、乙炔類乙二醇例如2,4，7，9-四乙基-5-癸炔-4，7-二醇、或乙氣基化乙炔類乙二醇，陽離子表面活性劑的例子包括例如脂肪族單、雙或聚胺例如醋酸鹽、環烷酸鹽或油酸鹽；或含氧胺例如聚氧乙烯烷基胺的氨基氣化物；通過羧酸和二或聚胺的縮合製備的連接醯胺的胺；或季銨鹽.惰性材料的例子包括但不限於無機礦物質例如高嶺土、頁矽酸鹽、碳酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽或植物性材料例如軟木、粉末狀玉米穗軸、花生殼、稻米殼和胡桃殼.本發明的抗真菌組合物可以是適合直接使用的形式或作為初始組合物的濃縮刑，該濃縮劑在使用前需要用合適量的水或其它稀釋劑進行稀釋.抗真菌多肽的濃度將根據特定製劑的性質變化，特別地，根據其是否為濃縮劑或將被直接使用而變化.組合物含有1至98%的固體或液體惰性栽體，和0至50%，最優地O.l至5%的表面活性劑.這些組合物將以商業產品的標記速率被使用，最優地，當為乾燥形式時，為大約每英畝0.01lb-5.0lb，當為液體形式時，為大約每英畝0.01pts.-10pts.,在另一種具體實施方式中，只要預處理對活性沒有損害，可以在配製製劑前對本發明的組合物以及經轉化的微生物和抗真菌蛋白進行處理，從而在使用到把向病原體的環境中時延長抗真菌活性。此類可以通過化學和/或物理手段進行，只要處理不會有害地影響組合物的性質.化學試刑的例子包括但不限於由化劑；醛例如甲醛和戊二醛；抗感染刑例如氯化鋅；醇例如異丙醇和乙醉；以及組織學固定劑例如Bouin，s固定劑和Helly，s固定劑(見例如Humason(1967)^wi'mfl/TYsswe7Vc/im'《Mes(W.H，FreemanandCo.))可通過例如噴灑、霧化、橄粉末、散播、包復或傾倒、引入土壤內或土壤上、引入灌溉水中、通過種子處理或一般使用或在病原體已經開始出現或在病原體出現之前作為保護性措施進行撒粉末，將本發明的抗真菌組合物用於植物病原體的環境.例如，可將本發明的抗真菌蛋白和/或經轉化的微生物與穀物混合以在儲存期間保護穀物.一般而言，在植物生長的早期實現對病原體的良好控制是重要的，因為這是植物會被最嚴重傷害的時期.如果認為是必須的，本發明的組合物可方便地含有殺蟲劑.組合物可以以栽體和本發明的桿菌菌抹或轉化微生物的死細胞的組合物的粒劑形式在種植時直接使用到土壤上.另一具體實施方式是組合物的粒刑形式，該組合物含有農用化學品例如除草劑、殺蟲劑、肥料、惰性栽體和本發明的桿菌菌株或轉化微生物的死細胞，本發明的組合物在保護植物、種子和植物產品中以各種方式發揮用途.例如，該組合物可被用於下述方法中，所述方法包括通過一定程序將有效量的抗真菌組合物放置在病原體的環境中，該程序選自噴灑、撒粉末、廣播或種子包復(coating),在植物繁殖材料(果實、塊莖、闢莖、球莖、谷、種子)特別是種子被作為商業產品售出之前，其通常經過保護性包4L處理，該包覆包括除草刑、殺蟲刑、殺真菌刑、殺菌刑、殺線蟲刑、軟體動物殺滅刑，或若干這些製劑的混合物，如果需要，還進一步含有栽體、表面活性刑或製劑領域中慣常使用的促進應用的佐刑，從而針對由真菌病原體造成的損害提供保護.為了處理種子，保護性包覆可通過液體制刑滲透入塊莖或穀物用於種子，或通過使用組合的溼試劑或幹試劑包復種子而用於種子.此外，在特定情況下，用於植物的其它方法是可能的，例如針對芽或果實的處理.包含下述DNA分子的本發明的植物種子可使用種子保護性包復加以處理，所述DNA分子包含編碼本發明的抗真菌多肽的核苷酸序列，所述包復包含種子處理化合物，例如克菌丹(captan)、萎鏽靈(carboxin)、福美雙(thiram)、methalaxyl、蟲蟎褲(pirimiphos-methyl)和其它通常用於種子處理的化合物.可替換地，本發明的種子包含種子保護性包覆，所述包覆包含本發明的抗真菌組合物，所述包菝被單獨使用或與通常用於種子處理的種子保護性包覆之一組合使用.本發明的抗真菌多肽可被用於任何應用，包括包復表面以靶向微生物.在該方式中，靶向微生物包括人病原體或微生物.可用本發明的抗真菌多肽包復的表面包括毯子和無菌醫療設備.結合了本發明多肽的聚合物可被用於包覆表面.將具有抗微生物性質的組合物與聚合物結合的方法是本領域已知的.見美國專利號5,847,047,該專利通過引用併入本文.具體實施方式的方法可對多種植物真菌病原體有效，例如但不限jF附a/7."附gram//ieariim、F"s肌'"/w狄yspor"m和Fm做/7'"附ver,/ci'戰oiVtes,主要農作物的特異性病原體包括大豆:i^^o^似/^/"flsCa附'、5We/v"/HVisc/ewrt'or"m、F"sCn附ojc"/wr"附、Z)i'flpo/t/re/^aseo/(rMmvar.s咖e(/^o附o/w/s卯乂a、D一or狄e/7/r似e0/or謂var.fni/ic(i《iim、Coo^esporflcaswco/a、iyep似ri'fl^i[yci'/ies、iV^Z/oWi.c^a卯力'cdJto7ia〃.afl"e/7i幽、屍jeM^omo/ias砂"7i^iep.v.g/戸Vieii、se/m7e""/w、屍A/fl/opAo/Yig/"eg她、G/o/e/*e//a妙c,V1e51、i^Ao/wompac^y/"/t/z,'、i^^/w'w附fltpAfl/MVfer附artim、i^MiViiMM&f'附Mm、i^^Af'"/nde6a/ja/tMm、Fiija〃'n/wf(/a/tf';油菜J/6wgocaw必V/a、J/te/7ia"'fl6ra孤'c(ze、l印^p/tae"'a附acw/a附、及/t/席似附VisCa"/、5WerW"/asc/erW/on/附、聊co印/rfle/W/a6mwi'c/co/a、/^A/"附m似附m附、屍e/Ymos/wrapa/uw',/ca、/^a/7'wmmsewm、jfterwar/aoto7ta似；紫花苜a/7/r朋fV/e/7na似m、屍/r，鄉似/rorflt附ega5pef/wa、i^rowas/w/Yi加ybWom附、屍/ro附fl/nerf/cflgiVi/svar.附e必ca^m's、Ce/"c呻ora附e必cagf'/i/s、狄"/wm附、Ferft'c〃/i'"附"/6o-"加附、A!ia/i狄o/rKmfl5ca附pe自'sp.v.60^3^wim、I^p似"/c/^7awerfi'cagi7ii.s;小麥:Psenrfomoitas砂"'wgaep.v.fl^/to'e附、t/rocj幼's紹ro/;戸'、ATfl/i,Ao/Mowascfl/npeWr/sp.v.的/is7"ce/m1、i^ewrfo附owaysyriTigaep.v.s戸Vigfle、J/te/TwiWfla/《e/7ta似、gra附/"i'sf.sp.fr射c/、屍MCci./w'agra/rn'm'sf.sp,"加"'、屍"cc/附'fl/"eco"必似f.sp.W"ci'、屍"c"."iViW,/iyirim's、/^ewOjpA0/"fl,/77/ciVepe/i似、5^p似"'fl朋rfoni/M、5^or/a加'"c/、iS印tor/aave/iae、屍se"rfocerc呻ore〃aAer/w^7'cAw'flfey、及A/zo"cm/aso/flwi'、i/'zo"o/ii'acerea/i's、Ga戰ma/t朋mj;cesgrfl附iVii'svar.、/^A/wmapAamV/er附d似m、JP，Z/i/m附"/rAe/io附a/td、i^^/t/mu/n'mw附、醜(po/ariiS0ro/ri7nVWfl、C/flv/，s/mrpMrea、7Y〃e"aW"ci'、7>7/幼'"/aeWs、C/幼7agoWf/c/、77//幼Vxg/Yi/w/co/a、/^f/w'MmapAa"fV/ermaffim,向曰葵:7Vfls附o/;orflAa/Weof//、j/,e/*fl".a/re/iVm狄z'、/4to*"flWaziViwi'ae、5W;y他"Vierea、/^o附amac(/own/di'/、3fac/Y^/rowiViflp/rfl^eo/iVifl、五/jw^/je"'c/wraceflrii附、及/i&0/7Kso;yziie、及Af'zo/7MSarrA&MS、及/t/zo/7MsWo/owiyi/*、P"cci7n'flAeZ/aw^ti'、Fe/ti'ci7ftVi/mda/t//ae、J5"nWwiVicdrCov0rM附pv.cflt/v似vo/vi、/rflgfl/wgort&;玉米0//"WcA"/wg/Yi/M/"/cd/fl、F"sfl"'"/wveW"7/iWrfesvar.s<i6g/{i《iVia/is、五nvi'附Vistewflr說、Kve/t/ci7/iVw'to、、/^/r/ii附iVreg"/fl/^、/^狄i'騰rfe6fl/ya朋附、/^*'謂gm附/m.co/a、i^to/wsp/e/i^附、/^to附n/Wm畫、(1/7/^/{{7^/771似拊、^45/^/^///"5/avMS、B^w/ar&ma，d/s0、TfCVcAWo6(/s/r"ero5/wp/rs^、/^//w7i狄呻or/M附ca由w繊I、II&IIIfC"oc緒o6o/iwc/i由/iMw)、五xsew/w7"附Zm/t/cm附I、II&III、/fe//w/"^tos/wr/mpe必cW/fl似m、/^S0齡腳may他、i^〃o幼'c似may船、Ka6a"W/a附fl^rf/s、卵rg似、C/幼7ago附ay他、屍nc"'m'a卯/^/'、屍"c"ViiVi/w(y卯ra、MflcropAowi'/ia/^asedVw、屍em."7/i'n/nftxaWcw附、iWg/Yw/wao/^zae、C/arfos/w"'"附/re由rn附、C"rv/a"'fl/wwafa、Cwrvn/(iri'fliTtae《Ka"s、C"rvw/a"'flpa/tescews,C7av/6a"erm/c/r/gawe附esubsp."e6ra由"se、7WcAorfermflwWrfe、C7謂.c，卵rgW、i^ewrf纖cmasavewae、JS"rH7'mVicA/ys誠/te/w'pv.卿、E簡'/n'acctrotovom、Co/7t湘wi1■sp/rop/as/Mil、ZW/;/o必fl附acros/wm、5We考緣ora/nflc/vspora、flcre卿w/"m，高梁:Jxyero緒"m似rc/c"附、C.訓6〃fte0/M附、Oraw/wrasorg/'、(7/0eocerc0印oni卵rgW、Jscoc/^aw/^/fi7ia、屍senrf簡owas砂"Vigaep.v.s戶Vigflfe、Xfl/i^ro/iu"flsca附peW"'sp.v.Ao/c/co/a、/^aseo/i7ta、.iVrco/ii'fl"'r"Vifl似、F"sfl〃'm附ver"W肌o,'to、/i/te/7tfl"Via&er朋似、醜—/"r/ss0/*g/w'co/a、/^/附!>1狄呻0">|附卵rgA/co/a、Oirv/a"'aa/6oprmWaw^)、及a附u/一0,a卯rg/t/、及a附n/f'印ora卯/^/ri'co/a、卯,a"f'、y4cremom'"m、5Wco/;似Atf"a附acms/wra、冠詞"一"("a"和"an")在此被用於指一或多於一個(即至少一個)的該冠詞的語法對象.舉例而言，"一種元件"表示一種或多種元件.單位、前綴和符號以它們的SI可接受形式表示.除非另外說明，核酸序列從左向右以5，至3，方向書寫；胺基酸序列從左向右以分別從氨基至羧基的方向書寫.數字範圍包含了定義範圍的數字.胺基酸在此可通過由IUPAC-IUB生物化學命名委員會推薦的單字母符號或它們的普遍已知的三字母符號表示.同樣地，核苷酸可通過它們的普遍接受的單字母代碼表示.以上定義的術語通過參考整個說明書可以更充分地被限定.應當理解，本文描述的實施例和具體實施方式僅用於闡述性目的，依據它們的各種修改或變化將被提示給本領域的技術人員，且應被包含在本申請的精神和範圍內以及所附權利要求書的範圍內.為一切目的而言，本文引用的所有的公開物、專利和專利申請通過引用併入本文.實驗實施例l:抗真苗生物實驗在大腸桿菌中重組表達若干多肽，隨後在抗真菌生物實驗中進行篩選.生物功能性多肽的表達包括製備融合蛋白，所述融合蛋白包括麥芽糖結合蛋白(MBP)和感興趣的多肽，隨後將融合蛋白在蛋白酶識別序列處酶切以釋放出感興趣的肽.編碼感興趣的多肽的DNA在大腸桿菌(五.co/i')表達栽體pMAL中與MelE基因的C末端融合(NewEnglandBiolabs;見GuanWa/,，(7麼67:21-30(1987》和MainaWaA，74:365-73(1988))。編碼蛋白酶因子Xa(FactorXa)或基因酶I(GenenaseI)的裂解位點的序列被結合進MBP和感興趣的多肽的基因之間，組氨酸標籤也可添加在MBP的N-末端，將構建的質粒栽體轉化進大腸桿菌XL-1Blue細胞，在含有50ig/ral羧苄青審素的2YT培養基中培養轉化物，至細胞密度O.D.卿-0,6-0.9,通過向培養基中添加IPTG至終濃度1mM誘導融合蛋白的表達，在收穫前將細胞培養4-16小時至飽和.通過離心收穫細胞，隨後用B-PER試刑(PierceChemicals,Rockford，IL)裂解細胞以獲得可溶蛋白片段，通過將細胞裂解液與Ni-NTA瓊脂糖樹脂一起溫育20分鐘至1小時，利用組氨酸標籤將融合蛋白從細胞裂解液中純化出來.用Tris緩衝液洗滌樹脂以去除所有未結合的蛋白.2-巰基乙醇(10mM)被包含在裂解和洗滌緩衝液中，以允許蛋白的部分重摺疊.使用含有20-40mM組氨酸的緩衝液洗脫結合的融合蛋白.為了釋放感興趣的多肽，將純化的融合蛋白與因子Xa或基因酶I(室溫，8-24小時)一同溫育.隨後將切下的蛋白樣品用於抗真菌活性實驗中.在30"C培養箱中，在馬鈴茅右旋葡萄糖瓊脂(PDA)平板上培養和維持所有的真菌菌株.這些平板被放置在更小的二級容器中(每種真菌菌林)，用溼潤的紙巾保持高溼度.在培養大約2周後，將孢子收穫在1/4強度(aquarterstrenghth)的馬鈴薯右旋葡萄糖培養液(PDB)中，使用血球計對孢子計數且隨後按小等份儲存在-80TC.將冷凍孢子在1/4強度的PDB中稀釋至工作濃度(對各真菌菌林按經驗加以確定)，且將50Ml(每孔)加入無菌、平底96孔實驗平板中.將實驗平板在室溫放置於溼潤的盒子中5-7小時，以允許孢子萌發.隨後將純化的、經蛋白酶切割的融合蛋白樣品的梯度稀釋物以50Ml的體積加入實驗平板中，每孔的最終實驗體積為100Ml.令實驗平板在溼潤的盒子中在30TC溫育過夜.在18至48小時後(取決於真菌菌株)對抗真菌活性計分，表l展示了了鑑定為對列舉的真菌病原體中至少一種具有活性的多肽.表ltableseeoriginaldocumentpage48表2得分分析(HitCharacterization).使用經純化及定量的本發明的多肽從刑量-應答實驗中確定的IC50(Mg/mL),tableseeoriginaldocumentpage48可注意到，Dfn37、Dfn49和Dfn56每種都具有對廣泛的真菌病原體強有力的抗真菌活性，如在本公開物中早先討論的，由於植物疾病起的亊實，需要廣謙抗性有效地調節疾病控制.實施例2:轉基因玉米植物的轉化和再生用含有下述核苷酸序列的質粒轟擊來自溫室供體植物的未成熟玉米胚芽，該核苷酸序列編碼SEQIDNO:l中提供的抗真菌多肽，該序列與在玉米植物細胞中驅動表達的啟動子和選摔性標記(例如選擇性標記基因PAT(WohUebenaa/.(1988)70:25-37),該基因賦予植物對除草刑雙丙氛磷(Bialaphos)的抗性)可搮作性連接.可替換地，在另外的質粒上提供選擇性標記基因.轉化如下進行.培養基配方按以下說明.靶組織的製備將穗去殼，在30%次氯酸鈉漂白刑外加0.5%微去垢刑中表面滅菌20分鐘，用無菌水漂洗兩次，切割未成熟胚芽，將胚軸一側向下(盾片一側向上)放置，每盤25個胚芽，在560Y培養基上放裡4小時，然後在2.5cm的靶區域內排列，為轟擊做準備，DNA的製備製備含有下述核苷酸序列的質粒栽體，所迷核苷酸序列編碼SEQIDNO:1中提供的抗真菌多肽，其與能在玉米細胞中驅動表達的啟動子可採作性連接.使用如下的CaCl2沉澱步稞將該質粒DNA和含有選擇性標記的質粒DNA(例如PAT)沉澱至1.1pm(平均直徑)的鎢沉澱物上100ML水中製備好的鎢粒子10iiL(lMg)TrisEDTA緩衝液中的DNA(lpg總的DNA)100ML2.5MCaCl210pLO.lM亞精胺將各試刑順序加入鎢粒子懸浮液中，同時保持在多管振蕩器上.對最終的混合物簡單地進行超聲處理，令混合物在恆定的振蕩下放置IO分鐘.在沉澱階段後，將管筒單離心，去除液體，用500mL100%乙醇洗滌，並離心30秒，再一次將液體去除，並將10SmL100。/o乙醇加入最終的鵠粒子沉澱物中.為進行粒子槍轟擊，對鎢/DNA潁粒進行簡單的超聲處理，並取IOmL點樣於各大栽體(macrocarrier)的中心且允許其在轟擊前乾燥大約2分鐘。粒子槍處理在粒子槍弁HE34-1或弁HE34-2中以#4水平轟擊樣品平板，所有樣品在650PSI下接受單次轟擊，從每管經製備的顆粒/DNA中取出總計IO小等份.隨後的處理在轟擊後，將胚芽放置在560Y培養基上2天，隨後轉移至含有3mg/mL雙丙氨褲的560R選擇培養基中，且每2周進行亞培養(subculture).在大約10周的選擇後，將選擇抗性的愈傷組織克隆轉移至288J培養基上以起始植物再生.在體細胞胚芽成熟(2-4周)後，將發育良好的體細胞胚芽轉移至用於萌發的培養基上，轉移至光照培養箱中.在大約7-10天後，將發育中的植物苗轉移至管中的272V不含激素的培養基中，放置7-10天，直至苗充分形成.隨後將植物轉移插入含有盆栽土的平板(等同於2.5"盆)並在生長箱中生長1周，隨後在溫室中再生長l-2周，隨後被轉移至經典的600罐(pot)(1.6加侖)中，培養至成熟.對植物的真菌抗性進行監控和計分.轟擊和培養用培養基轟擊培養基(560Y)含有4.0g/LN6基礎鹽(basalsalts)(SIGMAC-1416K1.0mL/LEriksson，s維生素混合物(1000xSIGMA-1511)、0.5mg/L維生素Bl、120.0g/L蔗糖、1.0mg/L2，4-D和2.88g/LL-脯氨酸(在用KOH調節至pH5.8後用D-IH20調節體積)；2.0g/L水晶洋菜(Gelrite)(在用D-IH20調節體積後加入)；以及8.5mg/L硝酸銀(在將培養基滅菌並冷卻至室溫後加入).選擇培養基(560R)含有4.0g/LN6基礎鹽(SIGMAC-1416)、1.0mL/LEriksson，s維生素混合物(IOOOxSIGMA-1511)、0.5mg/L維生素Bl、30.0g/L蔗糖、和2.0mg/L2，4-D(在用KOH調節至pH5.8後用D-IHzO調節體積)；3.0g/L水晶洋菜(Gelrite)(在用D-IH20調節體積後加入)；以及0.85mg/L硝酸銀和3.0mg/L雙丙氨磷(均在將培養基滅菌並冷卻至室溫後加入)，植物再生培養基(288J)包含4.3g/LMS鹽(GIBCO11117-074)、5.0mL/LMS維生素儲備液(0.100g煙酸、0.02g/L維生素Bl、0.10g/L維生素B6、和0.40g/L甘氨酸，用處理後(polished)的D-IH20調節體積)(MurashigeandSkoog(1962)PA"/0/.P/a擬.15:473)、100mg/L肌醇、0.5mg/L玉米素、60g/L蔗糖和1.0mL/L的0.1mM脫落酸(在調節至pH5.6後用處理後的D-IH20調節體積)；3.0g/L水晶洋菜(在用D-1調節體積後加入)；以及1.0mg/L弓l咮乙酸和3.0mg/L雙丙氨磷(在將培養基滅菌並冷卻至60TC後加入).不含激素的培養基(272V)包含4.3g/LMS鹽(GIBCO11117-074)、5.0mL/LMS維生素(0.100g煙酸、0.02g/L維生素Bl、0.10g/L維生素B6、和0.40g/L甘氨酸，用處理後的D-IH20調節體積)、0.1g/L肌醇、和40.0g/L蔗糖(在調節至pH5.6後用處理後的D-IHzO調節體積)；以及6g/L細菌瓊脂(在用處理後的D-IH20調節體積後加入)，滅菌並冷卻至60實施例3:農桿菌-介導的玉米轉化和轉基因植物的再生為了用含有SEQIDNO:1的多核苷酸構建體進行農桿菌64gw6fl"eri'"m,介導的玉米轉化，使用Zhao的方法(美國專利號5,981,840,和PCT專利公開W098/32326;這些文獻通過引用併入本文).簡言之，從玉米中分離出未成熟的胚芽，將胚芽與農桿菌64g,o6acte/7'"wJ的懸浮液接觸，其中該細菌能夠將多核苷酸構建體轉移至至少一個未成熟胚芽的至少一個細胞(步驟l:感染步驟).在該步驟中，將未成熟的胚芽浸入農桿菌6igw6a"er,'"m,懸浮液中以起始接種.將胚芽與農桿菌64g,o^icter/"附7共同培養一段時間(步驟2:共培養步驟).在感染步驟後，將未成熟的胚芽在固體培養基上培養.在該共培養步驟後，進行可選的"靜止"步驟，在該靜止步驟中，在至少一種抗生素的存在下培養胚芽，已知該抗生素在不加入植物轉化林的選擇性試刑時能抑制農桿菌6^,o^c/e,/";,的生長(步驟3:休眠步驟).在具有抗生素但沒有選擇性試劑的固體培養基上培養未成熟胚芽以去除農桿菌64gra^i"eri'"w>>，並為受感染細胞提供靜止期.此後，在含有選擇性試劑的培養基上培養經接種的胚芽，生長中的經轉化愈傷組織被收集(步驟4:選擇步驟)，在具有選擇性試劑的固體培養基上培養未成熟的胚芽，造成經轉化細胞的選摔性生長.愈傷組織隨後再生成為植物(步驟5:再生步稞)，且在固體培養基上對在選擇性培養基上生長的愈傷組織加以培養，以再生植物.實施例4:體細胞大豆胚芽培養物的轉化和大豆植物的再生以下儲備液和培養基被用於大豆植物的轉化和再生儲備液碟酸鹽100x儲備液37.0gMgS04.7H20,1.69gMnS04.H20，0.86gZnS04.7H20，0駕5gCuS04.5H20.離化物100x儲備液30.0gCaCl2.2H20，0.083gKI，0.0025gCoCl2.6H20，P，B，MolOOx儲備液18.5gKH2P04，0.62gH3B03，0.025gNa2Mo04.2H20FeEDTA100x儲備液3.724gNa2EDTA，2.784gFeS04.7H20,2，4-D儲備液10mg/mL.維生素B51000x儲備液10.0g肌醇，O.lOg煙酸，0.10g維生素B6，1g疏胺.培養基(每升)SB196:以上各儲備液各10mL，1mLB5維生素儲備液，0.463g(NH4)2S04，2.83gKN03，1mL2，4-D儲備液，1g天冬酜胺，10g蔗糖，pH5.7.SB103:1pk.Murashige&Skoog鹽混合物，1mLB5維生素儲備液，750mgMgCl2六水合物，60g麥芽糖，2g雙丙氨磷，pH5.7。SB166:每升補充了5g活性炭的SB103.SB71-4:Gamborg，sB5鹽(Gibco-BRL目錄號21153-028),1mLB5維生素儲備液，30g蔗糖，5gTC瓊脂，pH5.7.在旋轉搖床(150rpm)上於281C將大豆胚性懸浮培養物保持在35mL液體培養基(SB196)中，用螢光燈提供16小時白天/8小時夜晚循環.通過將大約35mg組織接種到35mL新鮮的液體培養基中，每兩周將培養物進行亞培養.通過使用DuPontBiolisticPDS1000/He設備進行粒子槍轟擊的方法(見KleinWfl/.(1987)7Vfl似re327:70-73)對大豆胚性懸浮培養物進行轉化.在粒子槍轟擊步驟中，可能可以使用純化的l)整個質粒DNA或2)僅含有感興趣的重組DNA表達盒的DNA片段.對於每八次轟擊轉化而言，製備30inl下述懸浮液，該懸浮液含有每DNA片段的鹼基對1至90皮克(pg)的DNA片段.用於表達抗真菌基因的重組DNA質粒或片段在與選捧性標記基因分離的重組DNA質粒或片段上.按下文所述將重組DNA質粒或片段共沉澱於金粒子上.將懸浮液中的DNA加到50mL20-60mg/mL0.6m加金粒子懸浮液中，隨後與50pLCaCl2(2.5M)和20mL亞精胺(O.lM)混合.將混合物脈衝振蕩5次，在微離心機中離心10秒，並去除上清液.隨後用150mL100%乙醇將DNA包夜的粒子洗滌一次，再次脈衝振蕩並在微離心機中離心，且重懸在85yL無水乙醇中。隨後將5mLDNA包度的金粒子加樣至各個大栽體盤中.將大約150至250mg的2周齡懸浮培養物置於空的60mmx15mm培養皿中，使用移液管將殘留液體從組織上去除.將組織放在留置篩(retainingscreen)3.5英寸處且對各組織平板轟擊一次.膜破裂壓力設定為650psi，箱體被抽真空至-28英寸Hg.轟擊18個平板，轟擊後，來自各平板的組織被分進兩個燒瓶中，放回到液體培養基中，如上文所述進行培養.轟擊後七天，液體培養基與新鮮的SB196培養基交換，該SB196培養基中根據轉化中使用的選擇性標記基罔的不同補充有50mg/mL潮審素或100ng/mL氯磺隆.選擇性培養基每周或每兩周被更新，轟擊後7周，觀察到從未經轉化的壞死胚性細胞簇中生長出綠色的經轉化的組織.分離出的綠色組織被取走，接種至各燒瓶中以生成新的、無性繁殖的轉化胚性懸浮培養物.因此，各個新的林系被作為獨立的轉化亊件加以處理，這些懸浮液隨後可通過亞培養得以維持為在未成熟發育階段聚集的胚芽的懸浮液，或通過各體細胞胚芽的成熟和萌發被再生為整林植物，將經轉化的胚性簇從液體培養基中移出，在不含有激素或抗生素的固體瓊脂培養基(SB166)中放置一周.在261C培養胚芽，使用混合螢光和白熾光以16小時白天8小時黑夜的時間安排.一周後，將培養物隨後轉移至SB103培養基中，在相同的培養條件下保持額外3周，在從液體培養物轉移至固體培養基上前，針對抗真菌基因的存在，用PCR或Southern分析對來自選定抹系的組織進行分析.體細胞胚芽在4周後變得適於萌發，隨後從成熟培養基上將其移開，在空培養皿中乾燥l至5天.隨後將乾燥的胚芽種植在SB71-4培養基中，在該培養基中，胚芽被允許在上述的相同的光照和發芽條件下萌發，將萌發的胚芽轉移至無菌土中並培養至成熟.在說明書中提及的所有公開物和專利申請對本發明所屬的
技術領域：
的技術人員的水平是有說明性的.所有的公開物和專利申請通過引用併入本文，與各公開物或專利申請被特別地、各個地通過引用併入本文一樣.儘管為了清楚理解的目的，通過闡述和實施例對前文所述的發明進行了一些細節描述，但某些改變和變化可在所附權利要求書的範圍內得到實現將是顯而易見的.權利要求1、一種轉基因植物，該植物具有穩定結合進其基罔組的多核苷酸，所迷多核苷酸編碼包含與SEQIDNOs:1，2，4，5，7或8至少95%相同的胺基酸序列的多肽，其中所述植物對至少一種植物致病真菌具有提高的病原體抗性.2、根據權利要求l中所述的植物，其中所述植物是單子葉植物.3、根據權利要求l中所述的植物，其中所述植物是雙子葉植物.4、根據權利要求l中所述的植物的經轉化種子，其中所迷種子包含所述胺基酸序列.5、根據權利要求l中所述的植物，其中所述多核苷酸與能在所述植物的細胞中驅動表達的啟動子可採作性連接，其中所迷啟動子選自由以下啟動子組成的組a)組成型啟動子；b)組織特異性啟動子；c)根特異性啟動子；d)可誘導啟動子；和e)病原體誘導啟動子.6、根據權利要求l中所述的植物，其中所述多肽包含信號序列.7、根據權利要求l中所述的植物，其中所述多肽缺乏信號序列.8、根據權利要求6中所述的植物，其中所述信號序列是分泌信號序列.9、根據權利要求6中所述的植物，其中所述信號序列是細胞器信號序列.10、根據權利要求9中所迷的植物，其中所迷信號序列是質體信號序列.11、根據權利要求1中所述的植物，其中所述胺基酸序列選自SEQIDNOs:1，2，4，5，7和8示出的序列構成的序列組.12、一種提高植物對真菌病原體抗性的方法，所述方法包含(a)用至少一種表達盒穩定轉化植物細胞，所述表達盒包含與能在所述植物的細胞中驅動表達的啟動子可搮作性連接的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列編碼與SEQIDNOs:1，2，4，5，7或8具有至少95%序列一致性的多肽，並且進一步地，其中所述多肽對至少一種植物真菌病原體具有活性；以及(b)從所述的植物細胞再生轉化的植物，其中在所述植物中，對所述真菌病原體的抗性水平較之沒有包含所迷表達盒的植物被提高.13、根據權利要求12中所述的方法，其中所述真菌是十字花科黑斑病菌(Jto7ifl〃'a6rajs/ci.co/a).14、根據權利要求12中所迷的方法，其中所述真菌是輪狀鐮刀菌(Fmw/m附veWa'腸/to)。15、根據權利要求12中所迷的方法，其中所述真菌是尖孢鐮刀菌16、根據權利要求12中所述的方法，其中所迷真菌是黃萎病菌(KerftW//i'K/n).17、根據權利要求12中所述的方法，其中所迷真菌是灰黴病菌(5CWsci7ierea).18、根據權利要求12中所述的方法，其中所述真菌是禾生炭疽菌(C^//WC/7'c/rMWgm/w/rt/co/")。19、根據權利要求2中所述的方法，其中所述真菌是玉米色二孢(Z)f》/o必amay船).20、根據權利要求12中所述的方法，其中所述真菌是禾穀鐮刀菌(屍Msa/7'wwgra/m'/tearn附)，21、根據權利要求12中所述的方法，其中所述核苷酸序列編碼下述多肽，該多肽選自在SEQIDNOs:1，2，4，5，7和8所示的多肽序列構成的組.22、根據權利要求12中所述的方法，其中所迷啟動子選自由以下啟動子組成的組a)組成型啟動子；b)組織特異性啟動子；c)根特異性啟動子；d)可誘導啟動子；和e)病原體誘導啟動子.23、根據權利要求12中所述的方法，其中所述多肽包含信號序列.24、根據權利要求12中所迷的方法，其中所述多肽缺乏信號序列25、根據權利要求23中所述的方法，其中所述信號序列是分泌信號序列.26、根據權利要求23中所述的方法，其中所述信號序列是細胞器信號序列，27、根據權利要求23中所述的方法，其中所述信號序列是質體信號序列.28、一種提高植物對病原體抗性的方法，所述方法包含(a)用至少一種表達盒穩定轉化植物細胞，所述表達盒包含與能在所述植物的細胞中驅動表達的啟動子可搮作性連接的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列與SEQIDNOs:3，6或9具有至少95%序列一致性，並且進一步地，其中所述核苷酸序列編碼對至少一種植物真菌病原體具有活性的多肽；以及(b)從所述的植物細胞再生轉化的植物，其中，在所述植物中，對所述真菌病原體的抗性水平較之沒有包含所述表達盒的植物被提高.29、根據權利要求28中所述的方法，其中所述啟動子選自由以下啟動子組成的組a)組成型啟動子；b)組織特異性啟動子；c)根特異性啟動子；d)可誘導啟動子；和e)病原體誘導啟動子。30、根據權利要求28中所述的方法，其中所述多肽包含信號序列.31、根據權利要求28中所述的方法，其中所述多肽缺乏信號序列32、根據權利要求30中所迷的方法，其中所迷信號序列是分泌信號序列.33、根據權利要求30中所述的方法，其中所述信號序列是細胞器信號序列.34、根據權利要求30中所述的方法，其中所述信號序列是質體信號序列.35、根據權利要求28中所述的方法，其中所述核苷酸序列選自SEQIDNOs:3，6和9示出的核苷酸序列構成的組.36、一種轉基因植物，該植物具有穩定併入其基因組的、與SEQIDNOs:3，6或9至少95%相同的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列編碼對植物真苗病原體具有活性的多肽，進一步地，其中所述植物對至少一種植物致病真菌具有提高的真菌病原體抗性.37、根據權利要求36中所述的植物，其中所述植物是單子葉植物.38、根據權利要求36中所述的植物，其中所述植物是雙子葉植物.39、根據權利要求36中所述的植物的經轉化種子，其中所迷種子包含所述多核苷酸序列.40、根據權利要求36中所述的植物，其中所述多核苷酸與能在所述植物細胞中驅動表達的啟動子可操作性連接，其中所述啟動子選自由以下啟動子組成的組a)組成型啟動子；b)組織特異性啟動子；c)根特異性啟動子；d)可誘導啟動子；和e)病原體誘導啟動子，41、根據權利要求36中所述的植物，其中所述多肽包含信號序列.42、根據權利要求36中所述的植物，其中所述多肽缺乏信號序列.43、根據權利要求41中所述的植物，其中所述信號序列是分泌信號序列.44、根據權利要求41中所述的植物，其中所迷信號序列是細胞器信號序列.45、根據權利要求41中所述的植物，其中所述信號序列是質體信號序列.46、根據權利要求36中所述的植物，其中所述多核苷酸序列選自SEQIDNO:3，6和9中示出的多核苷酸序列所構成的組.全文摘要本發明提供了保護植物免受植物致病真菌侵害的方法。本發明還提供了使用本文公開的核苷酸序列提高植物真菌病原體抗性的方法。該方法包含將下述表達盒引入植物，所述表達盒包含與核苷酸序列可操作性連接的啟動子，所述核苷酸序列編碼本發明的抗真菌多肽。本發明還公開了包含下述核苷酸序列的經轉化的植物、植物細胞、種子和微生物，所述核苷酸編碼具體實施方式的抗真菌多肽或其變體或片段。文檔編號C07K14/415GK101124323SQ200580029228公開日2008年2月13日申請日期2005年6月30日優先權日2004年6月30日發明者H·阿利,M·L·穆勒,M·拉斯納,R·J·基南,毋谷穗申請人:先鋒高級育種國際公司