具有腫瘤抑制作用的工頻電磁場發生裝置和加載方式的製作方法
2023-05-17 00:13:27 2
本發明屬於物理學、生物學與醫學交叉領域，涉及醫療器械，尤其是腫瘤治療性電磁場。
背景技術：
低頻電磁場頻率在300千赫(kHz)之內，不具有熱效應但具有生物學效應，其機制尚不明，可能與作用於帶電荷的大分子並改變其功能狀態有關。磁場對腫瘤的抑制作用已有廣泛報導(參見Artacho-Cordón Francisco等，2013，Int J Mol Sci；Tofani S，2015，Curr Topics in Med Chem)。歐盟與美國FDA已批准腫瘤治療性磁場發生設備(以色列Novocure公司)用於多形性神經膠質母細胞瘤的臨床治療，該技術特徵是採用100-300kHz的磁場(參見美國專利US8019414，US8019414，US8406870)。中國專利中也提出了多種具有腫瘤抑制效應的磁場加載方法，其中包括大於0.4特斯拉(T)的強磁場(參見中國專利90100152.X)和脈衝磁場(參見中國專利94111668.9)。在該領域的研究和應用中，電磁場自身屬性與作用對象、方式不同，包括時間、強度、脈衝頻率、載波頻率、間隔時間等參數不同，會產生不同的生物效應。而且磁場的生物物理作用機制複雜，並非單一分子通路起作用，故對磁場的生物學效應，包括抑制腫瘤細胞的效應，並沒有統一的和完整的認識。具體效果需針對某種特定的磁場加載方式和特定的作用對象來進行甄別驗證。
有一種特殊的加載方式，將直流電產生的靜態磁場與超低頻交流電產生的交變磁場疊加。在理論上，這種疊加磁場對自由基孤對電子單線態-三線態躍遷的影響最大，可能增加能級躍遷機率、延長自由基的半衰期，從而擴大其生物效應(參見Tofani S,1999，Physica Medica；Barnes FS等，2015，Bioelectromagnetics)。
目前腫瘤治療通常採用有創的手術治療以及無創的放化療。放療可為全身性或局部性。化療分為靶向與非靶向。對於放化療抵抗並且目前沒有有效靶向藥物的病例，臨床上亟待發現新的治療方法，尤其是無創、低毒副作用的方法。在低頻電磁場作用於動物和人類的過程中，尚未發現明顯的全身性毒副作用(參見Tofani S等,2002,IEEE Transactions on Plasma Science；Ronchetto F等，2004，Bioelectromagnetics)。
細胞自噬具有重要的病生理功能，大隅良典因在此領域的開拓性貢獻獲得2016年諾貝爾醫學與生理學獎。自噬對細胞命運決定具有雙刃劍作用，可幫助細胞存活或誘導細胞凋亡，是惡性腫瘤的重要生物學特徵與治療靶點(參見White E等，2009，Clin Caner Res；Hanahan D等，2011，Cell；Booth LA等，2014，Cell Signal)。低頻磁場具有誘導細胞自噬的作用(參見Marchesi N等，2014，Cellular Physiology)，但繼而如何影響腫瘤細胞內存活和死亡，以及具體分子機制，均尚未明確了解。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種具有腫瘤抑制作用的工頻電磁場發生裝置，是一種超低頻、低強度，可作用於生物體並產生特定生物學效應的磁場發生裝置和加載方式，該裝置和加載方法在體內外具有腫瘤抑制作用。
本發明提供一種工頻電磁場發生裝置，由工頻電源、第一自耦變壓器(交流AC)、第二自耦變壓器(直流DC)、第一二極體電橋、第二二極體電橋，第一組線圈、第二組線圈、輻照部件、電壓檢測部件、磁場檢測部件、測溫部件和終端電腦組成，工頻電源分別與第一自耦變壓器和第二自耦變壓器的一端連接，第一自耦變壓器和第二自耦變壓器的另一端分別與第一二極體電橋和第二二極體電橋連接，第一二極體電橋的另一端與第一組線圈連接，第二二極體電橋的另一端與第二組線圈連接，輻照部件置於第一組線圈和第二組線圈之間，電壓檢測部件一端分別與第一組線圈和第二組線圈連接，另一端與終端電腦連接，磁場檢測部件和測溫部件各自一端分別與輻照部件相連，各自的另一端分別與終端電腦相連。
輻照部件有兩種，第一種為細胞輻照平臺，針對細胞培養板和培養皿設計，由隔板一、隔板二、以及位於兩個隔板之間的載物臺組成，細胞培養板放置於載物臺之上，隔板一和隔板二間距為12.9釐米，載物臺高度可調，保證細胞培養板底部位於輻照區域正中位置。第二種輻照部件為動物輻照平臺，主要針對小鼠設計，由隔板一、隔板二、以及位於兩個隔板之間的6個動物輻照小室組成，組成動物輻照小室的部件包括前擋板、後擋板、中間隔板、以及小室隔板一、小室隔板二、小室隔板三、小室隔板四，其中前擋板和後擋板鑽多個小孔作為透氣孔，以免動物發生缺氧，隔板一和隔板二間距為12.9釐米，6個輻照小室位於輻照區域正中位置，每輪輻照可處理6隻小鼠。輻照部件的材料選用透明樹脂板，可以清洗與紫外消毒。
本發明的另一個目的是提供利用所述裝置進行磁場加載的方法，通過以下步驟實現：
採用工頻50/60Hz電源，通過直流與交流自耦變壓器不斷改變電壓，從而在輻照部件內部產生疊加的靜態(來自直流)與交變(來自交流)電磁場；具體改變電壓方案與加載的磁場強度如下：分為T1-T8共8個時間段，T1時間段直流電壓為3毫伏(mV)，產生靜態電磁場強度為2.97毫特斯拉(mT)，交流電壓平均值為1.5mV，產生交變電磁場平均強度為1.48mT；T2時間段直流電壓為4mV，產生靜態電磁場強度為3.95mT，交流電壓平均值為2.5mV，產生交變電磁場平均強度為2.47mT；T3時間段直流電壓為3mV，產生靜態電磁場強度為2.97mT，交流電壓平均值為1.5mV，產生交變電磁場平均強度為1.48mT；T4時間段直流電壓為4mV，產生靜態電磁場強度為3.95mT，交流電壓平均值為2.5mV，產生交變電磁場平均強度為2.47mT；T5時間段直流電壓為3mV，產生靜態電磁場強度為2.97mT，交流電壓平均值為1mV，產生交變電磁場平均強度為1.08mT；T6時間段直流電壓為4mV，產生靜態電磁場強度為3.95mT，交流電壓平均值為1.5mV，產生交變電磁場平均強度為1.48mT；T7時間段直流電壓為3mV，產生靜態電磁場強度為2.97mT，交流電壓平均值為1mV，產生交變電磁場平均強度為1.08mT；T8時間段直流電壓為4mV，產生靜態電磁場強度為3.95mT，交流電壓平均值為1.5mV，產生交變電磁場平均強度為1.48mT；輻照區域內部不同位置總磁場強度相同，T1至T8時間段平均磁場強度為5.5mT；T1-T8時間段每次改變電壓持續輻照3.5-10分鐘，每輪輻照時間累計30-90分鐘，每日輻照2-4輪，對於細胞和動物每天總輻照時間為60-120分鐘。
本發明描述的具有腫瘤抑制效應的電磁場，其頻率在30-300Hz範圍內，靜態(直流)與交變(交流)電磁場總強度在1-10mT範圍內，靜態(直流)與交變(交流)電磁場強度比值在0.5-2.5範圍內。
磁場作用時間為，各個時間段每次改變電壓持續輻照3.5-10分鐘，每輪輻照時間30-90分鐘，對於細胞和動物每天總輻照時間為60-120分鐘，此裝置和加載方法對多種腫瘤產生顯著的體內外抑制作用，磁場作用可以增加細胞內超氧自由基含量、並促進細胞自噬。
通過本發明中描述的電磁場發生裝置和加載方式，對多種腫瘤產生顯著的體內外抑制作用，磁場作用可以增加細胞內超氧自由基含量、並促進細胞自噬。在細胞體外培養和細胞活力實驗中，顯示所產生的磁場可以抑制多種腫瘤細胞生長，包括腎母細胞瘤、神經母細胞瘤、乳腺癌，結直腸癌等細胞；在體外實驗中，可以有效抑制結直腸癌和乳腺癌的生長和轉移。
本發明具有如下有益效果：(1)裝置設計合理，採用獨特的工頻，實施方便；(2)將直流電產生的靜態磁場與交流電產生的交變磁場疊加，可影響磁場中的自由基，擴大其生物效應；(3)輻照部件內磁場強度均勻；(4)操作簡便，通過改變電壓即可實現加載方案；(5)持續監測輻照部件內部產生磁場的相關電壓、磁場強度、溫度，高度可控；(6)置於輻照部件內的生物體所受幹擾小，無創傷；(7)對多種腫瘤具有顯著的抑制作用，且毒副作用低；(8)對細胞自噬具有促進作用。
附圖說明
圖1是本發明電磁場發生裝置結構示意圖。
圖2是本發明裝置輻照部件之一，置於磁場中的細胞輻照平臺示意圖。
圖3是本發明裝置輻照部件之二，置於磁場中的動物輻照平臺示意圖。
圖4是本發明電磁場加載方式的主要參數，即直流(DC)與交流(AC)電壓變化方案與產生的對應電磁場強度，圖中交流電壓以平均值表示。
圖5是本發明針對腎母細胞瘤細胞G401的抑制效果圖。
圖6是本發明針對神經母細胞瘤細胞CHLA255的抑制效果圖。
圖7是本發明針對體內生長結直腸細胞WiDr的抑制效果圖。
圖8是本發明針對乳腺癌細胞MBA-MD-435肺轉移的抑制效果圖。
圖9是本發明中電磁場改變腎母細胞瘤細胞G401內超氧自由基含量的效果圖。
圖10是本發明中電磁場抑制腫瘤細胞G401與CHLA255的原理圖，包括HRP化學發光法顯影自噬相關蛋白條帶。
具體實施方式
下面結合附圖和實施例對本發明做進一步的描述。
實施例1，本發明提供的一種具有腫瘤抑制作用的工頻電磁場發生裝置，由一個工頻電源1、第一自耦變壓器2(交流AC)、第二自耦變壓器3(直流DC)、第一二極體電橋4、第二二極體電橋5，第一組線圈6、第二組線圈7、輻照部件8、電壓檢測部件9、磁場檢測部件10、測溫部件11和終端電腦12組成，工頻電源1分別與第一自耦變壓器2和第二自耦變壓器3的一端連接，第一自耦變壓器2和第二自耦變壓器3的另一端分別與第一二極體電橋4和第二二極體電橋5連接，第一二極體電橋4的另一端與第一組線圈6連接，第二二極體電橋5的另一端與第二組線圈7連接，輻照部件8置於第一組線圈6和第二組線圈7之間，電壓檢測部件9一端分別與第一組線圈6和第二組線圈7相連，另一端與終端電腦12相連，磁場檢測部件10和測溫部件11各自一端分別與輻照部件8相連，各自的另一端分別與終端電腦12相連。
輻照部件8有兩種，第一種為細胞輻照平臺，針對細胞培養板和培養皿設計，由隔板一13、隔板二14、以及位於兩個隔板之間的載物臺15組成，細胞培養板放置於載物臺之上，隔板一13和隔板二14間距為12.9釐米，載物臺高度可調，保證細胞培養板底部位於輻照區域正中位置。
第二種輻照部件8為動物輻照平臺，主要針對小鼠設計，由隔板一13、隔板二14、以及位於兩個隔板之間的6個動物輻照小室16組成，組成動物輻照小室16的部件包括前擋板18、後擋板19、中間隔板20、以及小室隔板一21、小室隔板二22、小室隔板三23、小室隔板四24，其中前擋板18和後擋板19鑽多個小孔17作為透氣孔，以免動物發生缺氧，隔板一13和隔板二14間距為12.9釐米，6個輻照小室16位於輻照區域正中位置，每輪輻照可處理6隻小鼠。輻照部件8的材料選用透明樹脂板，可以清洗與紫外消毒。
具體磁場加載方式採取如圖4所示方案，採用工頻50/60Hz電源，通過直流與交流自耦變壓器不斷改變電壓，從而在輻照部件內部產生靜態與交變場疊加的電磁場；具體改變電壓方案與產生的磁場強度如下：分為T1-T8共8個時間段，T1時間段直流電壓為3mV，產生靜態電磁場強度為2.97mT，交流電壓平均值為1.5mV，產生交變電磁場平均強度為1.48mT；T2時間段直流電壓為4mV，產生靜態電磁場強度為3.95mT，交流電壓平均值為2.5mV，產生交變電磁場平均強度為2.47mT；T3時間段直流電壓為3mV，產生靜態電磁場強度為2.97mT，交流電壓平均值為1.5mV，產生交變電磁場平均強度為1.48mT；T4時間段直流電壓為4mV，產生靜態電磁場強度為3.95mT，交流電壓平均值為2.5mV，產生交變電磁場平均強度為2.47mT；T5時間段直流電壓為3mV，產生靜態電磁場強度為2.97mT，交流電壓平均值為1mV，產生交變電磁場平均強度為1.08mT；T6時間段直流電壓為4mV，產生靜態電磁場強度為3.95mT，交流電壓平均值為1.5mV，產生交變電磁場平均強度為1.48mT；T7時間段直流電壓為3mV，產生靜態電磁場強度為2.97mT，交流電壓平均值為1mV，產生交變電磁場平均強度為1.08mT；T8時間段直流電壓為4mV，產生靜態電磁場強度為3.95mT，交流電壓平均值為1.5mV，產生交變電磁場平均強度為1.48mT；輻照區域內部不同位置總磁場強度相同，T1至T8時間段平均磁場強度為5.5mT；T1-T8時間段每次改變電壓持續輻照3.5-10分鐘，每輪輻照時間累計30-90分鐘，每日輻照2-4輪，對於細胞和動物每天總輻照時間為60-120分鐘。
實施例2，本發明作用於培養的腎母細胞瘤細胞G401，使用圖1與圖2所示裝置，按照圖4所述方案處理細胞，每次改變電壓作用3.5分鐘，每輪作用時間共約30分鐘，每天處理4輪，共2小時電磁場輻照時間；陰性對照組將細胞置於未加載電磁場的線圈之間的置物臺，時間相同；陽性對照為順鉑(江蘇豪森藥業股份有限公司)，給藥濃度為500nM，每天給藥1次。
具體實施過程是：
細胞系和培養方法：腎母細胞瘤細胞G401，此細胞為貼壁細胞，用含10％胎牛血清的McCoy培養基培養於37℃孵箱，含5％二氧化碳和飽和水蒸氣；
主要設備：工頻電磁場發生裝置，細胞培養箱，活細胞計數儀，多功能酶標儀；
主要試劑：CCK8試劑盒，螢光探針DCFH-DA，BCA試劑盒，40％丙烯醯胺凝膠貯存液，Tris鹼，TEMED，SDS，蛋白酶抑制劑，蛋白標準品，HRP化學放光檢測試劑盒；
抗體：一抗包括LC3，GAPDH，p62，抗鼠與抗兔HRP偶聯二抗；
細胞活力實驗：將腎母細胞瘤細胞G401以1×10∧5個/孔的密度接種於6孔板，每個處理條件3個復孔，對照組、輻照組和順鉑組按照上述方案分別處理，每天收集前一天處理的細胞，用活細胞計數儀計數，根據讀數計算細胞數目，做出細胞增殖曲線和電磁場對細胞的抑制曲線；
統計分析：每種輻照條件重複3次，每次3個復孔，結果以平均值±標準誤表示，結果做T檢驗，以P<0.05作為具有顯著性差異指標；
如圖5所示，左側圖為細胞增殖曲線，其中X軸為磁場輻照天數，Y軸為細胞數，曲線一為對照組細胞增殖曲線，曲線二為輻照組細胞增殖曲線，曲線三為陽性對照順鉑組細胞增殖曲線；右側圖為細胞抑制曲線，其中X軸為磁場輻照天數，Y軸為抑瘤率(％)，曲線一為輻照組細胞抑制率曲線，曲線二為順鉑組細胞抑制率曲線；圖中結果顯示輻照組細胞增殖減慢，抑制率增加；
超氧自由基含量測定：將腎母細胞瘤細胞G401以1×10∧4個/孔的密度接種於96孔板，每個處理條件3個復孔，輻照組按照圖4所述方案處理，每輪時間30分鐘，對照組放在未加載電磁場的線圈之間的置物臺，一共處理4輪，輻照時間共計120分鐘，每輪處理結束後用螢光探針DCFH-DA(10μM)在培養箱內孵育20分鐘，孵育後用PBS洗去未進入細胞的探針，用多功能酶標儀檢測，激發波長488nm，吸收波長525nm，分別讀取各組螢光強度值；如圖9所示，其中X軸為磁場輻照時間，Y軸為細胞內探針螢光強度，即超氧自由基的相對含量，曲線一為對照組細胞內超氧自由基的相對含量，曲線二為輻照組細胞內超氧自由基的相對含量，圖中結果顯示輻照組細胞內超氧自由基在接受一輪30分鐘的輻照後即比對照組有所增高，並且一直持續，直到120分鐘時降至與對照組接近的水平，此結果說明此磁場加載方式的確可以提高細胞內自由基含量，並且顯效迅速，時間在1小時之內。
免疫雜交實驗：細胞處理後離心、PBS洗滌後，懸浮於預冷的RIPA緩衝液(加入蛋白酶和磷酸化酶抑制劑)，試劑盒BCA法進行蛋白定量後，用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，每孔上樣量為20μg，用適當的抗體進行免疫雜交後，HRP化學發光法顯影蛋白條帶，如圖10所示，輻照後p62降低，LC3-II增加，說明輻照可誘導G401細胞自噬。
實施例3，本發明作用於培養的神經母細胞瘤細胞CHLA255，使用圖1與圖2所示裝置，按照圖4所述方案處理細胞，每次改變電壓作用3.5分鐘，每輪作用時間約30分鐘，每天處理4輪，共2小時電磁場輻照時間；陰性對照組將細胞置於沒有加載電磁場的線圈之間的置物臺相同時間；陽性對照為順鉑(江蘇豪森藥業股份有限公司)，給藥濃度為500nM，每天給藥1次。
具體實施過程是：
細胞系和培養方法：神經母細胞瘤細胞CHLA255，此細胞為貼壁細胞，用含10％胎牛血清的IMDM培養基培養於37℃孵箱，含5％二氧化碳和飽和水蒸氣；
主要設備：工頻電磁場發生裝置，細胞培養箱，活細胞計數儀；
主要試劑：CCK8試劑盒，BCA試劑盒，40％丙烯醯胺凝膠貯存液，Tris鹼，TEMED，SDS，蛋白酶抑制劑，蛋白上樣標準品，HRP化學放光檢測試劑盒；
抗體：一抗包括LC3，GAPDH，p62，抗鼠與抗兔HRP偶聯二抗；
細胞活力實驗：將神經母細胞瘤細胞CHLA255以1×10∧5個/孔的密度接種於6孔板，每個處理條件3個復孔，對照組、輻照組和順鉑組按照上述方案分別處理，每天收集前一天處理的細胞，用活細胞計數儀計數，根據讀數計算細胞數目，做出細胞增殖曲線和電磁場對細胞的抑制曲線；
統計分析：每種輻照條件重複3次，每次3個復孔，結果以平均值±標準誤表示，結果做T檢驗，以P<0.05作為具有顯著性差異指標；
如圖6所示，左側圖為細胞增殖曲線，其中X軸為磁場輻照天數，Y軸為細胞數，曲線一為對照組細胞增殖曲線，曲線二為輻照組細胞增殖曲線，曲線三為順鉑組細胞增殖曲線；右側圖為細胞抑制曲線，其中X軸為磁場輻照天數，Y軸為抑瘤率(％)，曲線一為輻照組細胞抑制率曲線，曲線二為順鉑組細胞抑制率曲線，圖中結果顯示輻照組細胞增殖減慢，抑制率增加；
免疫雜交實驗：細胞處理後離心、PBS洗滌後，懸浮於預冷的RIPA緩衝液(加入蛋白酶和磷酸化酶抑制劑)，BCA法進行蛋白定量後，用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，每孔上樣量為20μg，用適當的抗體進行免疫雜交後，HRP化學發光法顯影蛋白條帶，如圖9所示，輻照後p62降低，LC3-II增加，說明輻照可誘導CHLA255細胞自噬。
實施例4，本發明作用於體內生長的結直腸癌細胞WiDr，
具體實施過程是：裸鼠皮下接種結腸腺癌細胞WiDr後，輻照組使用圖1與圖3所示裝置，按照圖4所述方案處理動物，每次改變電壓作用10分鐘，每輪輻照時間為70分鐘，每天輻照1輪。對照組同時放入無磁場的動物輻照平臺中。每日記錄輻照組與對照組小鼠生存情況。如圖7所示，輻照組小鼠生存期顯著延長。
實施例5，本發明針對乳腺癌細胞MBA-MD-435，
具體實施過程是：SCID鼠皮下接種乳腺癌細胞MBA-MD-435，輻照組使用圖1與圖3所示裝置，按照圖4所述方案處理動物，每次改變電壓作用10分鐘，每輪輻照時間為70分鐘，每天處理1輪，每周5天，連續4周。陰性對照組同時放入不加載磁場的輻照平臺內。陽性對照組給予環磷醯胺，劑量為50mg/kg，每日1次。4周處理結束後處死動物，取肺臟固定，病理切片，觀察並計數肺轉移灶數目與大小，**P<0.01,***P<0.001，如圖8所示，輻照組小鼠轉移灶數目顯著減少，效果與環磷醯胺相當，同時輻照組轉移灶顯著減小，輻照抗轉移效果優於環磷醯胺。