利用內源性血管生成抑制因子Arresten基因製備蛋白的方法

2023-05-17 12:57:41

專利名稱：利用內源性血管生成抑制因子Arresten基因製備蛋白的方法
技術領域：
本發明涉及一種基因重組、表達技術，具體為一種利用內源性血管生成抑制因子Arresten基因製備蛋白的方法。
背景技術：
腫瘤是一種典型的血管依賴性疾病，20世紀70年代初，Folkman提出「腫瘤的生長和轉移都依賴於新生血管的生成」。新生血管不僅為腫瘤生長提供充足的氧氣和營養物質，並及時運走代謝產生的有害物質，而且還以旁分泌的形式刺激腫瘤的生長，促進腫瘤細胞進入血液循環，從而向其它組織器官浸潤轉移。因此Folkman提出對實體瘤採用抑制血管生成的治療方法，人的抗血管生成治療研究始於1988年，最新發現的來源於人基底膜膠原的腫瘤血管生成抑制因子Arresten、Tumstatin、Canstatin、Endostatin和Vastatin、Restin等具有特異性抑制腫瘤血管內皮細胞的增殖生長作用，其與腫瘤細胞分泌的促血管生長因子相拮抗，從而達到阻止腫瘤血管生成，使腫瘤毛細血管生長萎縮，切斷腫瘤營養供應的目的。Arresten是由Colorado等2000年研究發現的一種強有效血管生成抑制因子，在胎盤中表達量高，胎肝中也有表達。它是IV型膠原α1鏈的羧基末端NCl結構域多肽片段，全長690bp，編碼229個胺基酸，等電點為6.4，分子量約為26KD。所以利用人體中的Arresten基因製備具有抑制腫瘤血管生成的蛋白質是當前國內外研究開發的重點，例如Colorado等採用質粒pET22b(+)進行原核表達；鄭啟昌等採用連接載體pGEM-T，表達載體pET22b(+)，而且用的也是原核表達系統，即大腸桿菌作為表達宿主菌；而盧燦榮等則採用真核表達體系，真核表達載體pcDNA3.1(+)；何愛彬等用T載體pGEM-T作為連接載體，最後在畢赤酵母中表達。這些操作方法都是將連接和表達分開進行，效率比較低下。

發明內容
本發明為了解決現有技術中存在的利用人體中的Arresten基因製備具有抑制腫瘤血管生成的蛋白質過程中存在的製備效率低下的缺點而提供了一種利用內源性血管生成抑制因子Arresten基因製備蛋白的方法。
本發明採用以下技術方案實現的，利用內源性血管生成抑制因子Arresten基因製備蛋白的方法，步驟包括從人體中提取總RNA，加入上、下遊引物，(RT-PCR)反轉錄擴增得到Arresten基因的DNA，再取質粒載體雙酶切後與RT-PCR擴增產物Arresten DNA雙酶切後連接，得到連接反應產物，最後將產物轉化入到宿主菌大腸桿菌中表達，得到Arresten蛋白；連接及表達載體所用質粒為pBV220，按載體pBV220/目的ArrestenDNA的摩爾數比1∶1～1∶3，在15～18℃連接8～10小時，得到連接反應產物pBV220-Arr。
反轉錄擴增反應條件的起始溫度控制在93-95℃，40sec；退火溫度56-58℃，40sec，延伸71-73℃，1min，共35個循環。
引物的設計和合成根據已知的Arresten mRNA基因序列設計出引物，上、下遊引物近5′端分別引入限制性內切酶，酶切位點和一對起始密碼子及兩對終止密碼子。
宿主菌大腸桿菌為E.coliJM109、DH5α、BL21、BL21(DE3)，均由山西醫科大學生物化學教研室提供。
大腸桿菌培養溫度30℃，時間4個小時，表達一般在42℃，時間4個小時，最佳溶解氧量選擇比例在1∶5。
1、四種菌性能篩選對比實驗數據如下1.1、重組質粒pBV220-Arr在JM109中的表達(1)將重組質粒pBV220-Arr轉化JM109感受態細胞①-70℃保存的E.coliJM109在Amp陰性的LB平板上劃線，37℃恆溫箱培養15h；②從平板中挑取一個直徑2mm大小的單克隆菌落，移至含5ml LB培養基的試管中，37℃，220r/min強烈振蕩培養8h；③吸取試管中的菌液2ml轉移至100ml LB三角瓶中，37℃ 220r/min強烈振蕩培養3h，使細胞濃度達到OD600在0.4左右；④將培養物在冰上放置10min，然後轉到兩個50ml離心管中，4000r/min，4℃離心10min；⑤棄上清，倒置離心管1min，流盡剩餘液體，然後加入10ml冰預冷的0.1mol/L CaCl2懸浮細胞，置於冰上10min；⑥4000r/min，4℃離心10min回收細胞，棄上清，分別加入2ml冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液，懸浮細胞。按每份200μl分裝細胞，若不馬上進行轉化，分別加入50μl 80％的滅菌甘油，置-70℃凍存。
⑦取本室-70℃保存的pBV220空質粒4μl加入200μl感受態細胞中，溫和混勻，置冰上30min；⑧設立對照，將不加任何質粒的200μl感受態細胞置於冰上30min；⑨將⑥⑦同時於42℃水浴熱休克90sec，迅速放冰上2min，加入800μlLB培養基，37℃，225r/min，振蕩培養1h，讓細菌中的質粒表達抗生素抗性蛋白；⑩取200μl轉化混合物鋪於LB(Amp+)平板，室溫下放置20min，待溶液被瓊脂吸收後，放置平皿於37℃培養15h；
(2)pBV220-Arr/JM109生長曲線研究從成功轉化的瓊脂平板上挑取一個陽性克隆，接種到5ml LB(Amp10μL)液體培養基，30℃，220r/min過夜培養至OD600＝1.0左右，取1份樣品按照1∶50擴種於50ml(Amp50μL)液體培養基，30℃，分別於1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h取樣，然後在600nm波長下測定OD600，並繪製pBV220-Arr/JM109生長曲線。如圖7所示意(3)pBV220-Arr/JM109表達蛋白形式的研究挑取一個陽性克隆，接種於5ml LB(Amp5μL)液體培養基，30℃，200r/min過夜培養至OD600＝0.8左右，再按1∶50擴種於100ml LB(Amp100μL)液體培養基，30℃，培養3h至OD600＝0.6左右升溫至42℃誘導表達，分別於2h、4h、6h、8h，收集1ml菌液，離心收集菌體沉澱和上清；同時將攜帶有pBV220空質粒的JM109進行誘導表達作為對照。將二者上清和菌體SDS-PAGE凝膠電泳。按照說明書安裝電泳槽，配製12％的分離膠和5％的積層膠，取少許樣品加入等體積的上樣緩衝液，於沸水中煮5min，取20μL上樣，進行SDS-PAGE分析。積層膠電壓為80V，進入分離膠後加入110V，電泳1h結束後，卸下膠進行考馬斯亮藍染色30min，脫色1h，照相保存。
如圖8所示意1低分子量標準蛋白質 2表達前 3表達後2h 4表達後4h 5表達後6h 6表達後8h從圖8可以看出，JM109菌在2h、4h、6h、8h均能表達Arresten蛋白，其Arresten蛋白表達量分別佔到總菌體蛋白表達量的20.92％、24.65％、21.11％和19.08％，結合圖及表達量可知重組質粒pBV220-Arr在JM109菌中表達4h達到最佳表達。
1.2、重組質粒pBV220-Arr在DH5α中的表達(1)將重組質粒pBV220-Arr轉化DH5α感受態細胞，方法同1.1(1)(2)pBV220-Arr/DH5α生長曲線研究，方法同1.1(2)圖9(3)pBV220-Arr/DH5α表達蛋白形式的研究，方法同1.1(3)圖101低分子量標準蛋白質 2表達前 3表達後2h 4表達後4h 5表達後6h 6表達後8h從圖10可以看出，DH5α菌在2h、4h、6h、8h均能表達Arresten蛋白，其Arresten蛋白表達量分別佔到總菌體蛋白表達量的21.06％、24.38％、22.02％和21.15％，結合圖及表達量可知重組質粒pBV220-Arr在DH5α菌中表達4h達到最佳表達。
1.3、重組質粒pBV220-Arr在BL21中的表達(1)將重組質粒pBV220-Arr轉化BL21感受態細胞，方法同1.1(1)(2)pBV220-Arr/BL21生長曲線研究，方法同1.1(2)圖11(3)pBV220-Arr/BL21表達蛋白形式的研究，方法同1.1(3)圖12
1低分子量標準蛋白質 2表達前 3表達後2h 4表達後4h 5表達後6h 6表達後8h從圖12可以看出，BL21菌在2h、4h、6h、8h均能表達出Arresten蛋白，其Arresten蛋白表達量分別佔到總菌體蛋白表達量的21.08％、25.03％、22.15％和21.22％，結合圖及表達量可知重組質粒pBV220-Arr在BL21菌中表達4h達到最佳表達。
1.4、重組質粒pBV220-Arr在BL21(DE3)中的表達(1)將重組質粒pBV220-Arr轉化BL21(DE3)感受態細胞，方法同1.1(1)(2)pBV220-Arr/BL21(DE3)生長曲線研究，方法同1.1(2)圖13(3)pBV220-Arr/BL21(DE3)表達蛋白形式的研究，方法同1.1(3)圖141低分子量標準蛋白質 2表達前 3表達後2h 4表達後4h 5表達後6h 6表達後8h從圖14可以看出，BL21(DE3)菌在2h、4h、6h、8h均能表達出Arresten蛋白，其Arresten蛋白表達量分別佔到總菌體蛋白表達量的22.12％、26.10％、22.09％和21.26％，結合圖及表達量可知重組質粒pBV220-Arr在BL21(DE3)菌中表達4h達到最佳表達。
1.5、重組質粒pBV220-Arr在四種菌中不同時間表達的比較(1)重組質粒pBV220-Arr在四種菌中表達2h的SDS-PAGE分析(2)重組質粒pBV220-Arr在四種菌中表達4h的SDS-PAGE分析圖151在JM109中表達2h2在DH5α中表達2h3在BL21中表達2 h4在BL21(DE3)中表達2h5低分子量標準蛋白質(14.4、20.1、31.0、43.0、66.2、97.4KD)6在JM109中表達4h7在DH5α中表達4h8在BL21中表達4h 9在BL21(DE3)中表達4h從圖15可以看出，在四種菌中2h、4h均能表達出Arresten蛋白，其Arresten蛋白表達量佔到總菌體蛋白表達量在2h、4h分別為20.92％、21.06％、21.08％、22.12％和24.65％、24.38％、25.03％、26.10％，結合圖及表達量可知重組質粒pBV220-Arr在BL21(DE3)菌中表達4h達到最佳表達。
(3)重組質粒pBV220-Arr在四種菌中表達6h的SDS-PAGE分析(4)重組質粒pBV220-Arr在四種菌中表達8h的SDS-PAGE分析圖161在JM109中表達6h2在DH5α中表達6h3在BL21中表達6h4在BL21(DE3)中表達6h5低分子量標準蛋白質(14.4、20.1、31.0、43.0、66.2、97.4KD)6在JM109中表達8h7在DH5α中表達8h8在BL21中表達8h9在BL21(DE3)中表達8h從圖16可以看出，在四種菌中6h、8h均能表達出Arresten蛋白，其Arresten蛋白表達量佔到總菌體蛋白表達量在6h、8h分別為21.11％、22.02％、22.15％、22.09％和19.08％、21.15％、21.22％、21.26％。
1.6、培養溫度對BL21(DE3)表達Arresten的影響同時製備3瓶100ml 1∶50擴種的LB氨苄陽性培養基，25℃、30℃、37℃，200r/min，恆溫培養至對數生長期(約4h)，製備誘導前樣品後升溫至42℃誘導表達4h，測菌密度，同時製備表達後樣品，共3支；SDS-PAGE，經凝膠分析系統得出定性、定量結論，並收集菌體。圖17125℃培養表達樣品 230℃培養表達樣品 337℃培養表達樣品 4低分子量標準蛋白質 5表達前樣品從圖17可見，25℃、30℃、37℃三種溫度表達4h後42℃誘導4h的表達量都很高，分別為22.15％、26.23％、23.18％，可見30℃培養Arresten蛋白表達量最大，其次為37℃、25℃。
1.7、培養持續時間對BL21(DE3)表達Arresten的影響同時製備3瓶100ml 1∶50擴種的LB氨苄陽性培養基，30℃，200r/min，恆溫分別培養2h、4h、6h，製備誘導前樣品後升溫至42℃誘導表達4h，測菌密度，同時製備表達後樣品，共3支；SDS-PAGE，經凝膠分析系統得出定性、定量結論，並收集菌體。圖181培養2h表達樣品 2培養4h表達樣品 3培養6h表達樣品 4表達前樣品 5低分子量標準蛋白質從上圖18可見，Arresten蛋白在2h、4h、6h的表達量分別為23.03％、26.23％、23.86％，可見在培養4h表達量最高。其次是6h和2h。
1.8、誘導溫度對BL21(DE3)表達Arresten的影響同時製備3瓶100ml 1∶50擴種的LB氨苄陽性培養基，30℃，200r/min，恆溫分別培養4h，製備誘導前樣品後升溫至37℃、42℃、48℃誘導表達4h，測菌密度，同時製備表達後樣品，共3支；SDS-PAGE，經凝膠分析系統得出定性、定量結論，並收集菌體。圖19137℃表達樣品 242℃表達樣品 348℃表達樣品 4表達前樣品 5低分子量標準蛋白質從上圖19可見，Arresten蛋白在42℃的表達量最高，佔總體蛋白表達量的26.45％，48℃表達次之，為18.38％，而在37℃Arresten蛋白表達量為0％。
1.9、誘導持續時間對BL21(DE3)表達Arresten的影響同時製備3瓶100ml 1∶50擴種的LB氨苄陽性培養基，30℃，200r/min，恆溫分別培養4h，製備誘導前樣品後升溫至42℃分別誘導表達4h、6h、8h，測菌密度，同時製備表達後樣品，共3支；SDS-PAGE，經凝膠分析系統得出定性、定量結論，並收集菌體。圖201誘導4h表達樣品 2誘導6h表達樣品 3誘導8h表達樣品 4表達前樣品 5低分子量標準蛋白質從上圖20可知，誘導表達4h Arresten蛋白表達量達到最高，佔總體菌蛋白的26.45％，而6h、8h次之，分別為24.86％、22.59％，主要原因在於表達時間過長則會導致菌體生長過老，甚至細菌死亡，蛋白減少。
1.10、溶解氧量對BL21(DE3)表達Arresten的影響分別於500ml的培養瓶中加入25ml、50ml、100ml、200ml LB氨苄陽性培養基，30℃，200rpm，恆溫分別培養4h，製備誘導前樣品後升溫至42℃分別誘導表達4h，測菌密度，同時製備表達後樣品，共4支；SDS-PAGE，經凝膠分析系統得出定性、定量結論，並收集菌體。圖211低分子量標準蛋白質 2表達前樣品 325ml LB 450ml LB 5100ml LB 6200ml LB從上圖21可見，溶解氧量比例在1∶5時表達量達到最高，佔總體菌蛋白的25.24％，即500ml錐形瓶中裝100ml培養基，而在25ml LB、50ml LB、200ml LB中表達量分別為20.35％、22.58％和23.38％，可見溶解氧量也是其中的一個影響因素。
1.11、最優表達條件的組合在500ml的培養瓶中加入100ml LB氨苄陽性培養基，按1∶50擴種含重組質粒pBV220-Arr的BL21(DE3)，於表達前30℃，200r/min，恆溫培養4h，升溫至42℃，200r/min，恆溫培養4h，分別製備表達前、後樣品，SDS-PAGE，經凝膠分析系統得出定性、定量結論，並收集菌體。
小結(1)大腸桿菌E.coli JM109、DH5α、BL21、BL21(DE3)均可表達Arresten蛋白，且對數生長期約為0.5～0.7之間，SDS-PAGE分析顯示表達產物分子量約為26KD，表達產物主要以包涵體形式存在；(2)分別對四種菌不同時間表達產物的SDS-PAGE分析及目的蛋白佔總菌體蛋白表達量分析及溼菌重，最終篩選出最優表達菌種為E.coli BL21(DE3)，表達量為26.10％；(3)最佳培養溫度選擇30℃，表達量為26.23％；(4)最佳培養時間選擇4h，表達量為26.23％；(5)最佳表達溫度選擇42℃，表達量為26.45％；(6)最佳表達時間選擇4h，表達量為26.45％；(7)最佳溶解氧量選擇比例在1∶5，即500ml錐形瓶中裝100ml培養基，表達量為25.24％；(8)通過優化表達，結果在菌BL21(DE3)30℃培養4h，42℃誘導表達4h，溶解氧量比例在1∶5時表達量達到最高，表達量佔全菌蛋白的25％以上。
本發明構建了重組質粒pBV220-Arr高效表達體系並在E.coli JM109、DH5α、BL21、BL21(DE3)中得到了高表達，同時對表達條件分別從菌種的選擇、培養溫度、培養持續時間、表達溫度、表達持續時間和溶解氧量六個方面進行了優化，四種菌在2h、4h、6h、8h蛋白表達量分別佔總菌體蛋白表達量的20.92％、21.06％、21.08％、22.12％；24.65％、24.38％、25.03％、26.10％；21.11％、22.02％、22.15％、22.09％；19.08％、21.15％、21.22％、21.26％。由數據可以看出，在表達4h時，各菌表達量達到最高，表達時間延長則會導致菌體生長過老，甚至細菌死亡，蛋白減少。結合E.coliBL21(DE3)溼菌重明顯大於其他菌種，因此選BL21(DE3)為最優表達菌種。同理在選最優表達條件時也是考慮了成本效益之間的關係，選擇經濟且效益高的、好操作的作為最終條件。最終確定了在500ml的培養瓶中加入100ml LB氨苄陽性培養基中，E.coli BL21(DE3)30℃培養4h，42℃誘導表達4h，為最優表達體系，目的蛋白表達量佔菌體總蛋白表達量的25％。經過研究發現，經42℃蛋白表達後以包涵體的形式存在，為了後續工藝生產大量的Arresten蛋白，我們決定採用包涵體的表達方式，這樣既有利於目的蛋白的高產量表達，又有利於下遊的分離純化。
Arresten蛋白產物分子量約為26KD，表達產物主要以包涵體的形式存在。以包涵體形式表達的蛋白質可以防止蛋白酶對目的蛋白的降解，並且有利於表達產物的純化。包涵體中重組蛋白處於部分變性狀態，因而不具有同野生蛋白一樣的生物學活性，因此包涵體必須經過溶解成單體，再通過復性，才可能使部分蛋白恢復其天然構想，具有生物學活性。
2、Arresten蛋白從菌體內的分離過程優化實驗，實驗方法2.1、超聲法破菌獲得包涵體(1)將菌體沉澱用STE緩衝液溶解並4000r/min，10min洗滌2次，以1∶5比例重懸於STE中，並進行分裝於20支1.5ml EP管中，每管1ml。
(2)取4支12000r/min，4℃，離心2min，棄上清，每管中分別加入2M、3M、4M、5M尿素1ml，溶解後，靜置片刻，以500W，超聲3sec，間隔3sec，在冰浴的條件下超聲200次。M均指mol/L(3)將超聲後EP管以6000r/min，4℃，離心10min，保留上清備用，沉澱用1ml STE洗滌兩次，分別加入8mol/L尿素，混勻，分別製備上清及沉澱樣品，進行SDS-PAGE，經凝膠分析系統得出定性、定量結論。
Arresten因子包涵體具有較強的抗剪切能力，直接使用高強度超聲法不但避免了溶菌酶的引入，而且破菌效果好。
2.2、包涵體的洗滌和分離(1)最優獲取包涵體取2.1(1)中的15支EP管，用微量離心機於12000r/min，4℃，離心2min，棄上清，均用2M尿素1ml，溶解後，靜置片刻，以500W，超聲3sec，間隔3sec，在冰浴的條件下超聲200次。
(2)1-5M尿素洗滌包涵體效果評價2.2(1)的沉澱樣品取5支分別加入2M、3M、4M、5M尿素1ml，上下混勻，靜置10min，6000r/min，4℃，離心20min，保留上清備用，同法再洗滌一次沉澱，離心取沉澱、上清製備SDS-PAGE樣品。如圖221低分子量標準蛋白質 2表達前樣品32M尿素洗滌包涵體離心上清樣品42M尿素洗滌包涵體離心沉澱樣品53M尿素洗滌包涵體離心上清樣品63M尿素洗滌包涵體離心沉澱樣品74M尿素洗滌包涵體離心上清樣品84M尿素洗滌包涵體離心沉澱樣品95M尿素洗滌包涵體離心上清樣品105M尿素洗滌包涵體離心沉澱樣品隨著尿素濃度的增加，Arresten因子包涵體佔沉澱總蛋白的百分比逐漸增加，分別佔到40.42％、40.46％、40.95％、41.53％，上清中去除的雜質蛋白量也逐漸增加，因子的損失降到最小，但各種濃度之間差別不大，因此選用2M尿素。
(3)Triton X-100洗滌包涵體效果評價2.2(1)的沉澱樣品取3支分別加入1％、2％、4％的Triton X-100溶液各1ml，上下混勻，靜置10min，6000r/min，4℃，離心20min，保留上清備用，離心取沉澱、上清製備SDS-PAGE樣品。圖2311％Triton X-100洗滌包涵體離心沉澱樣品22％Triton X-100洗滌包涵體離心沉澱樣品3表達前樣品44％Triton X-100洗滌包涵體離心沉澱樣品從上圖可見，1％、2％、4％Triton X-100洗滌包涵體後蛋白分別佔總菌體蛋白的35.76％、38.38％、37.91％，由此可見到2％Triton X-100洗滌包涵體效果最好。
(4)綜合法洗滌包涵體效果評價2.2(1)的沉澱樣品取4支分別加入2M尿素1ml，在其中3支中分別加入1％、2％、4％Triton X-100溶液，和1M的蔗糖溶液，及少許的EDTA，上下混勻，靜置10min，6000r/min，4℃，離心20min，保留上清備用，離心取沉澱、上清製備SDS-PAGE樣品。圖2412M尿素洗滌包涵體離心上清樣品22M尿素洗滌包涵體離心沉澱樣品32M尿素+1％Triton X-100洗滌包涵體離心上清樣品42M尿素+1％Triton X-100洗滌包涵體離心沉澱樣品52M尿素+2％Triton X-100洗滌包涵體離心上清樣品62M尿素+2％Triton X-100洗滌包涵體離心沉澱樣品72M尿素+4％Triton X-100洗滌包涵體離心上清樣品82M尿素+4％Triton X-100洗滌包涵體離心沉澱樣品9表達前樣品從上圖可見，三種差別不大，表達量都很高，但2M尿素與2％TritonX-100洗滌效果最好。表達量佔菌體蛋白的42.48％。
2.3、包涵體的純化、復性(1)用8M尿素溶解的包涵體加入透析袋中，燒杯中加入6M的尿素，用攪拌子攪拌1d；(2)燒杯中的溶液換為4M的尿素，用攪拌子攪拌1d；(3)燒杯中的溶液換為2M的尿素，用攪拌子攪拌1d；(4)燒杯中的溶液換為復性液〔0.6mol/l尿素，0.1mmol/l氧化型穀胱甘肽，20mmol/l Tris·Cl(PH8.0)，0.9mmol/l氧化型穀胱甘肽〕，用攪拌子攪拌1d，重複換液攪拌共3次，並回收復性液；(5)最後將燒杯中溶液換為PBS液，用攪拌子攪拌1d，回收作為對照。
(6)用考馬斯亮藍法測蛋白濃度。
包涵體復性的方法有一步稀釋法和梯度稀釋法，本發明用梯度稀釋法，採用透析方法復性包涵體，對純化的溶解蛋白進行重摺疊，同時進一步提高了目的蛋白的純度。透析復性的優點是不增加純化蛋白溶液的體積，能通過逐漸降低外透液濃度來控制變性劑的去除速度。包涵體的復性效率受多種因素的影響，包括蛋白質的復性濃度，緩衝液pH值，變性劑的起始濃度和去除速度、氧化還原電勢、離子強度、共溶劑和其他添加劑的存在與否等。在透析復性前，首先將蛋白溶液稀釋至融合蛋白濃度約為0.1mg/ml，尿素濃度為6M，並調整溶液pH值至7.4。然後，進行透析使緩衝液中的尿素濃度得以逐級降低，以免尿素下降太快而使蛋白形成聚集體沉澱。表達的目的蛋白中含有半胱氨酸殘基，故在復性過程中加入了GSH/GSSG氧化還原體系，以促使二硫鍵形成。GSH/GSSG氧化還原系統通過促進不正確形成的二硫鍵快速交換反應，提高了正確配對的二硫鍵的產率。在透析過程中，仍有部分融合蛋白沉澱出來。透析後蛋白懸液經離心分層，上清液即為復性的目的蛋白溶液，沉澱部分為不能正確摺疊的目的蛋白。SDS-PAGE分析結果顯示，上清中目的蛋白的純度達到40.5％。
2.4、Arresten蛋白抑制新生血管的雞胚絨毛尿囊膜實驗結果取不同濃度的Arresten蛋白與陽性對照組比較(1)雞胚在38-40℃、60％相對溼度的孵箱內正常發育。實驗共使用雞胚60個，死弱精5個，取材55個，總受精率91.67％，成活率90％。整個CAM的血管呈葉脈狀分布。陰性對照組(PBS組、空白組)載體膜下血管生長良好，血管分支適中；20μg/ml組、40μg/ml樣品組和陽性對照組的載體膜下血管數明顯減少，出現大血管斷裂、小血管消失的現象，部分樣品出現血管繞行的現象，以20μg/ml實驗組、40μg/ml實驗組尤甚。
(2)對載體膜周圍一級、二級血管生長的影響以藥物載體膜為中心，計數與其邊緣相接的一級、二級血管數，進行比較發現陽性對照組、20μg/ml組與陰性對照組(PBS組、空白組)比較無顯著性差異，與對照組比較有顯著性差異(P＜0.05)。說明復性後的Arresten因子抑制血管新生的效果顯著。
表1Arresten因子對雞胚CAM影響的一級、二級血管計數(X±s)

*P＜0.05(與空白組比較)(3)對載體膜周圍大、中、小血管生長的影響對照組中、小血管數明顯較多，與實驗組比較有顯著性差異，而大血管數無顯著性差異，說明Arresten因子主要抑制中、小血管的發生。Arresten與對照組比較無統計學意義。
表2Arresten因子對雞胚CAM影響的大、中、小血管計數(X±s)

*P＜0.05(與空白組比較) #P＜0.05(與陽性組比較)(4)對載體膜下血管生長的影響圖1陰性對照組圖2陽性對照組圖3Arresten組由圖1、2、3看出，陰性對照組沒有抑制血管生成的作用，陽性對照組和Arresten組均有抑制血管生成的作用，但Arresten組抑制血管生成的活性比陽性對照組強。
以上研究結果顯示，本發明製備的重組人Arresten蛋白對體外血管內皮細胞的增殖和遷移具有抑制作用，並能有效抑制體內的新生血管形成；即重組人Arresten蛋白能在細胞和整體水平上顯著抑制血管生成。總之，人Arresten重組蛋白能有效抑制血管內皮細胞的增殖、遷移以及體內血管生成，在腫瘤的抗血管生成治療方面顯示出良好的應用前景。載體pBV220是由中國研究人員成功構建的(購自上海生物工程技術有限公司)，全長3666bp，閉環雙鏈，含有多克隆位點，溫度敏感阻遏蛋白，Amp陽性位點及複製起始點、轉錄中止序列等。本發明選用原核表達體系，在原核細胞中高效表達外源基因時，需要一個可調控的啟動子，因為某些外源蛋白對宿主細胞可能有毒，並在短時間內快速合成外源蛋白質，可減少宿主細胞蛋白酶對外源蛋白的破壞作用。pBV220載體為PRPL啟動子，溫控誘導表達，PR和PL啟動子為λ噬菌體啟動子，為強啟動子，受λ噬菌體CI基因的負調控，CI阻遏蛋白是溫度敏感蛋白，在28-30℃時，CI阻遏蛋白產生抑制作用，在升溫至42℃，CI被破壞，PR和PL啟動子開始轉錄，利用溫度控制，使宿主菌在30℃生長，42℃誘導表達目的蛋白。溫控誘導的方式合理地調節了宿主菌的代謝負荷與外源基因高效表達的關係，減少了大量外源蛋白給宿主菌生長和代謝帶來的損傷。
與現有技術相比，本發明使用了一種同時作為連接載體和表達載體的質粒pBV220，既簡單又經濟，節省了成本，而且表達效果非常好，提高了合成的效率。為所需目的蛋白的合成提供了一種新途徑。


圖1為陰性對照組圖2為陽性對照組圖3為Arresten蛋白組圖4為人胎盤組織中總RNA變性膠電泳5為人Arresten基因cDNA的RT-PCR圖6為PCR產物的克隆純化及酶切鑑定圖7為pBV220-Arr/JM109的生長曲線圖8為重組質粒pBV220-Arr在JM109菌中表達前後SDS-PAGE分析圖9 pBV220-Arr/DH5α的生長曲線圖10重組質粒pBV220-Arr在DH5α菌中表達前後SDS-PAGE分析圖11 pBV220-Arr/BL21的生長曲線圖12重組質粒pBV220-Arr在菌BL21中表達前後SDS-PAGE分析圖13 pBV220-Arr/BL21(DE3)的生長曲線圖14重組質粒pBV220-Arr在菌BL21(DE3)中表達前後SDS-PAGE分析圖15重組質粒pBV220-Arr在四種菌表達蛋白2h、4h的SDS-PAGE分析圖16質粒pBV220-Arr在四種菌表達蛋白6h、8h的SDS-PAGE分析圖17重組質粒pBV220-Arr在菌BL21(DE3)中不同培養溫度表達前後SDS-PAGE分析圖18重組質粒pBV220-Arr在菌BL21(DE3)中不同培養時間表達前後SDS-PAGE分析圖19重組質粒pBV220-Arr在菌BL21(DE3)中不同誘導溫度表達前後SDS-PAGE分析圖20重組質粒pBV220-Arr在菌BL21(DE3)中不同誘導時間表達前後SDS-PAGE分析圖21重組質粒pBV220-Arr在菌BL21(DE3)中不同溶解氧量表達前後SDS-PAGE分析圖22圖3-1 2-5M尿素洗滌Arresten因子包涵體SDS-PAGE結果圖23 Triton X-100洗滌Arresten因子包涵體SDS-PAGE結果圖24綜合法洗滌Arresten因子包涵體SDS-PAGE結果具體實施方式
實施例13、材料與試驗方法3.1材料3.1.1標本胎盤組織由山西醫科大學第二附屬醫院婦產科提供。
3.1.2質粒和菌株宿主菌E.coli JM109、DH5α、BL21、BL21(DE3)和原核表達載體pBV220均由山西醫科大學生物化學教研室-70℃保存提供。
JM109基因型recA1 supE44 endA1 hsdR17 gyr A96 relA1 thiΔ(lac-proAB)F′[traD36 proAB+lac IqlacZΔM15]DH5α基因型supE44ΔlacU169(80 lacZΔM15)hsdR17 recA1 endA1gyrA96 thi-l relA1BL21基因型F-，ompT，hsdSB(rB-，mB-)gal，demBL21(DE3)基因型hsdSgal(λcI ts857indl Sam7 nin5 lacUV5-T7基因1)pBV220空質粒載體全長3666bp，氨苄青黴素抗性(Amp+)，為溫控誘導表達載體，具有PRPL強串聯啟動子。
3.1.3主要試劑TRIzol試劑為Invitrogen產品，PCR反轉錄試劑盒、100bp DNA LadderMarker購自寶生物工程(大連)有限公司，T4 DNA連接酶、限制性內切酶BamH I、EcoR I、Pvu II、Lambda DNA/HindIII+EcoR I Markers均購自華美生物工程公司，UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒，瓊脂糖(Agrose)、低熔點瓊脂糖購自Promega公司，胰蛋白腖、酵母提取物為OXOID公司產品，其它試劑均為國產分析純。
3.1.4培養基和溶液LB培養基10g/L胰蛋白腖，5g/L NaCl，10g/L酵母提取物，調節pH至7.4，高壓滅菌。
LB(Amp+)培養基含100mg/L Amp的LB培養基。
LB(Amp+)平板含100mg/L Amp的LB平板。
STE0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl，1mmol/L EDTA。
溶液I50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，10mmol/L EDTA，高壓消毒滅菌，4℃保存。
溶液II0.2mol/L NaOH，1％SDS(新鮮配製)。
溶液III60ml 5mol/L KAc，11.5ml冰醋酸，28.5ml水。
5×TBE緩衝液(每升)54g Tris鹼，27.5g硼酸，20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)3.1.5、引物設計和合成根據GenBank中報導的Arresten mRNA序列(序列號AF258349)，用DNAman軟體設計引物，上、下遊引物近5′端分別引入限制性內切酶BamHI、EcoR I(劃線部分)酶切位點和一對起始密碼子及兩對終止密碼子(著重號部分)，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。
上遊引物5′--GCCGAATTCATGTCTGTTGATCACGGC 3′下遊引物5′-GCGGATCCCTATTATTATGTTCTTCTC 3′3.2、試驗方法3.2.1胎盤組織中總RNA的提取和檢測(1)用TRIzol試劑從健康中國人胎盤組織中提取總RNA。
①取100mg新鮮的胎盤組織，在液氮中研磨成粉末；②待液氮揮發乾，立即加入1ml TRIzol，融化後，用加樣槍吸打，使樣品充分裂解，移入1.5ml離心管中，室溫靜置5min；③在離心管中加入0.2ml預冷的氯仿，振蕩混勻；④將離心管在4℃，12000r/min，離心15min；⑤用移液器小心吸出上層水相(不要吸取中間白色的那層)，加入另一離心管中，加入0.5ml預冷的異丙醇，振蕩混勻；⑥-20℃沉澱過夜；⑦4℃，12000r/min，離心15min；⑧小心移出上清；⑨沉澱中加入1ml 75％預冷的乙醇洗滌RNA沉澱，4℃，12000r/min，離心5min；⑩重複用75％預冷的乙醇洗滌一次RNA沉澱，去上清，稍微涼幹，RNA略顯透明，加入20μL RNase-free的水充分溶解。
(2)定量和檢測總RNA①紫外定量和檢測
i用752紫外光柵分光光度計檢測RNA的產量，在260nm的吸光度，1OD＝40μg/ml；ii根據在260nm和280nm處的吸光值，檢測RNA的純度，純RNA的OD260/OD280的比值應接近2.0(比值最好在1.9～2.1之間)。
②瓊脂糖凝膠電泳檢測i配製1％的瓊脂糖凝膠Agrose 0.25g5×TBE緩衝液 2.5ml去離子水 22.5ml微波爐加熱熔解Agrose，稍微冷卻至60℃，加入10mg/mL溴乙錠1.25μL搖勻後倒膠，待膠冷凝後，置於電泳槽中，浸於1×TBE緩衝液中平衡10分鐘，待用。
ii樣品變性5×Loading Buffer 2μLRNA樣品 1μgRNase-free水調節至10μL65℃變性5min，立即置於冰上冷卻。
iii電泳將處理好的RNA樣品，稍微離心，加入加樣孔中，60V恆壓電壓10min電泳結束後，在凝膠成像儀上觀察結果。
鑑定檢測結果從正常人的胎盤組織中提取總RNA，甲醛變性電泳可見清晰的三條帶，即5.8s、18s、28s，且28s亮度是18s的兩倍，結果見圖4，符合要求。
紫外定量和檢測總RNAOD260＝0.019，OD280＝0.010，OD260/OD280＝1.9，正好在RNA的正常值範圍內，RNA的濃度為0.76μg/ml3.2.2、RT-PCR擴增Arresten及回收純化(1)陽性對照①反轉錄反應i反應體系為MgCl22μL10×RT Buffer 1μLRNase Free dH2O 3.75μLdNTP Mixture(10mmol/L)1μLRNase Inhibitor 0.25μL
AMV逆轉錄酶 0.5μLRandom 9 mers 0.5μLPositive Control RNA 1μLTotal 10μLii反應條件為30℃ 10min42℃ 30min99℃ 5min5℃ 5min②PCR反應i反應體系為 反轉錄反應液10μL5×PCR Buffer 10μL滅菌蒸餾水 28.75μLTaKaRa Ex TaqTMHS 0.25μLControl F-1 Primer 0.5μLControl R-1 Primer 0.5uLTotal 50μLii反應條件為94℃ 2min 1Cycle94℃ 30min55℃ 30sec72℃ 1min 30 Cycle(2)Arresten①反轉錄反應i反應體系為 MgCl22μL10×RT Buffer 1μLRNase Free dH2O3.75μLdNTP Mixture(10mmol/L) 1μLRNase Inhibitor 0.25μLAMV逆轉錄酶 0.5μLRandom 9 mers 0.5μL總RNA 1μLTotal 10μL
ii反應條件為30℃ 10min42℃ 30min99℃ 5min5℃ 5min②PCR擴增反應體系i反應體系為 反轉錄反應液 10μL5×PCR Buffer 10μL滅菌蒸餾水28.75μLTaKaRa Ex TaqTMHS0.25μLControl F-1 Primer0.5μLControl R-1 Primer0.5μLTotal 50μLii反應條件為94℃2min 1Cycle94℃40sec57℃40sec72℃1min 35 Cycle72℃延伸5min(3)分別取陽性對照和Arresten擴增產物各10μL，用2％瓊脂糖凝膠電泳鑑定，其餘存放於-20℃以備後用。
(4)PCR產物的切膠回收純化①用1×TBE配製2％低熔點瓊脂糖凝膠，並且在制膠的過程中使用寬梳子；②將100μL擴增產物和20μL 6×loading buffer混勻後全部上樣，80V電泳40min，將凝膠小心放到長波紫外燈下，照射時間儘可能短，用一乾淨鋒利的刀片從瓊脂糖凝膠中切取目的DNA片段，儘量少切凝膠，將膠條轉移到一個1.5mL的無菌EP管中；③加入1ml Binding BufferII，置於56℃水浴中10min，使膠徹底熔化。加熱熔膠時，每2min混勻一次；④將融化的膠溶液轉移到套放在2ml收集管內的UNIQ-10柱中，室溫放置2min，8000r/min室溫離心1min；⑤取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一個收集管中，加入500μL Wash Solution，8000r/min室溫離心1min；⑥重複步驟⑤一次；⑦取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一個收集管中，12000r/min室溫離心15sec；⑧將UNIQ-10柱放入一根新的1.5ml離心管中，在柱子膜中央加40μLElution Buffer，37℃放置2min；⑨12000r/min室溫離心1min以洗脫DNA，將獲得的DNA置-20℃保存；⑩取2μL純化產物進行2％瓊脂糖凝膠電泳鑑定。
鑑定結果從人的胎盤組織中提取總RNA，進行RT-PCR擴增，擴增產物經2.0％瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖5，在相對分子量為700bp處，有特異性擴增條帶，為擬擴增的目的基因片段，其分子量為718bp。如附圖51:100bp DNA Ladder Marker2RT-PCR擴增產物(718bp)3Control RNA作為陽性對照(462bp)3.2.3、質粒載體pBV220的獲取及回收、純化(為常規技術)3.2.4、PCR產物及質粒pBV220的雙酶切、連接(1)BamH I酶切10×Buffer E 2μLAcetylated BSA(1mg/ml)2μLBamH I0.5μL純化的DNA底物 5μL無菌去離子水 10.5μL20μL加入內切酶後緩慢抽吸3次進行混合，37℃恆溫箱孵育3h(2)無水乙醇沉澱DNA將20μL移至1.5ml EP管中，加入40μL冰預冷的無水乙醇，混勻，在4℃冰箱裡冰上放置1h，12000r/min，4℃離心10min，棄上清，蒸發痕量乙醇。
(3)EcoR I酶切10×Buffer H 2μLAcetylated BSA(1mg/ml)2μLEcoR I0.5μLBamH I酶切並沉澱後DNA底物 0.5μL無菌去離子水 15.5μL20μL加入內切酶後緩慢抽吸3次進行混合，37℃恆溫箱孵育3h，同時行1％瓊脂糖凝膠電泳進行鑑定。
(4)酶切片段的挖塊回收及純化方法同3.2.2(4)同時測OD260與OD280，得出各自濃度(5)純化的Arresten片段和pBV220載體片段的連接按載體/目的DNA的摩爾數比1∶2，則此反應體系如下純化的Arresten基因片段13μLpBV220載體酶切基因片段12μLT4DNA連接酶 2μL10×連接緩衝液 3μL30μL16℃連接過夜一般為8～10小時，得到連接反應產物pBV220-Arr。
3.2.5、連接產物的鑑定轉化受體菌並進行鹼裂解提取質粒，經PCR及經BamH I、EcoR I、PvuII分別酶切後行0.8％瓊脂糖凝膠電泳.結果見圖6，表明目的基因片段被成功克隆。
1PCR產物PCR鑑定 2、4重組質粒pBV220-Arr(4365 bp) 3純化的pBV220 5Lambda DNA/HindIII+EcoR I Markers(5148/4973、4269、3530、2027、1904、1587、1375、941、831、564) 6100bpDNA Ladder Marker(1500、1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100) 7純化的Arresten8酶切鑑定(約3645、565、150、10)3.2.6、DNA序列測定取含有重組質粒的菌液1ml，用pBV220F引物由上海生工基因組DNA測序儀序列測定。結果顯示，Arresten基因的mRNA長度為690 bp，編碼229個胺基酸。＞0719068(JM109)PBV220+sequence exported from chromatogramfile測序表明其所編碼的胺基酸與GenBank中編碼人IV型膠原α1鏈非膠原末端229個胺基酸基本一致。但本試驗從人胎盤中提取Arresten基因與美國Colorado等報導的人Arresten基因編碼區cDNA序列(GenBank中報導的基因註冊號AF258349)的同源性達99％，有4個基因位點不同，即第132位由A變為C，第148位由G變為A，200位由T變為C，236位由A變為G。胺基酸由甘氨酸GGC變為甘氨酸GGA，丙氨酸GCC變為蘇氨酸ACC，異亮氨酸ATT變為蘇氨酸ACT，酪氨酸TAC變為半胱氨酸TGC。
3.2.7、pBV220-Arr/JM109菌株的擴增和保存將測序正確的菌株新鋪於LB瓊脂(Amp+)平板上，37℃倒置培養24h，挑取陽性克隆，接種於5ml LB(Amp10μL)液體培養基中，37℃、220 rpm過夜培養至OD600約為0.6左右，然後取0.2ml加入到滅菌EP管中，加入50μL滅菌甘油，-70℃保存。
4、Arresten因子分離純化4.1材料4.1.1試劑
(1)尿素、TritonX-100為上海生工進口分裝產品，氧化型穀胱甘肽和還原型穀胱甘肽為北京鼎國生物技術發展中心，其它試劑同此(2)雞胚60顆由太原市小店區華夏種雞場提供，0.22μm濾膜為Sigma公司產品，Arresten因子產品由本室製備，其它試劑均為國產分析純。
4.1.2儀器KS-600超聲波粉碎機寧波儀器廠4.2、實驗方法4.2.1超聲法破菌獲得包涵體(1)將菌體沉澱用STE溶解並4000r/min，10min洗滌2次，以1∶5比例重懸於STE中，並進行分裝於20支1.5ml EP管中，每管1ml。
(2)取4支12000r/min，4℃，離心2min，棄上清，每管中分別加入2M(mol/L)、3M、4M、5M尿素1ml，溶解後，靜置片刻，以500W，超聲3sec，間隔3sec，在冰浴的條件下超聲200次。
(3)將超聲後EP管以6000r/min，4℃，離心10min，保留上清備用，沉澱用1ml STE洗滌兩次，分別加入8mol/L尿素，混勻，分別製備上清及沉澱樣品，進行SDS-PAGE，經凝膠分析系統得出定性、定量結論。
4.2.2、包涵體的洗滌和分離(1)最優獲取包涵體取4.2.1(1)中的15支EP管，用微量離心機於12000r/min，4℃，離心2min，棄上清，均用2M尿素1ml，溶解後，靜置片刻，以500W，超聲3sec，間隔3sec，在冰浴的條件下超聲200次。
(2)1-5M尿素洗滌包涵體效果評價4.2.2(1)的沉澱樣品取5支分別加入2M(mol/L)、3M、4M、5M尿素1ml，上下混勻，靜置10min，6000r/min，4℃，離心20min，保留上清備用，同法再洗滌一次沉澱，離心取沉澱、上清製備SDS-PAGE樣品。
(3)Triton X-100洗滌包涵體效果評價4.2.2(1)的沉澱樣品取3支分別加入1％、2％、4％的Triton X-100溶液各1ml，上下混勻，靜置10min，6000r/min，4℃，離心20min，保留上清備用，離心取沉澱、上清製備SDS-PAGE樣品。
(4)綜合法洗滌包涵體效果評價4.2.2(1)的沉澱樣品取4支分別加入2M尿素1ml，在其中3支中分別加入1％、2％、4％Triton X-100溶液，和1M的蔗糖溶液，及少許的EDTA，上下混勻，靜置10min，6000r/min，4℃，離心20min，保留上清備用，離心取沉澱、上清製備SDS-PAGE樣品。
4.2.3、包涵體的復性、純化
(1)用8M尿素溶解的包涵體加入透析袋中，燒杯中加入6M的尿素，用攪拌子攪拌1d；(2)燒杯中的溶液換為4M的尿素，用攪拌子攪拌1d；(3)燒杯中的溶液換為2M的尿素，用攪拌子攪拌1d；(4)燒杯中的溶液換為復性液(0.6mol/l尿素，0.1mmol/l氧化型穀胱甘肽，20mmol/l Tris·Cl(PH8.0)，0.9mmol/l氧化型穀胱甘肽)，用攪拌子攪拌1d，重複換液攪拌共3次，並回收復性液；(5)最後將燒杯中溶液換為PBS液，用攪拌子攪拌1d，回收作為對照。
(6)用考馬斯亮藍法測蛋白濃度，實施例2試驗方法同實施例1，區別在於Arresten的PCR擴增反應體系反應條件為93℃ 2min 1Cycle93℃ 40sec56℃ 40sec71℃ 1min 35Cycle71℃ 延伸5min純化的Arresten片段和pBV220載體片段的連接，按載體/目的DNA的摩爾數比1∶1，15℃連接過夜，時間為10小時，得到連接反應產物pBV220-Arr。
實施例3上述試驗方法同實施例1，區別在於Arresten的PCR擴增反應體系反應條件為95℃ 2min1Cycle95℃ 40sec58℃ 40sec73℃ 1min35Cycle73℃ 延伸5min純化的Arresten片段和pBV220載體片段的連接，按載體/目的DNA的摩爾數比1∶3，18℃連接過夜，時間為8小時，得到連接反應產物pBV220-Arr。
英文縮略語(Abbreviation)英文縮寫 英文全稱中文全稱LB Luria-Bertani medium LB培養基AMPAmpicillin氨苄青黴素EDTA Ethyline diaminetertraaacetic acid乙二胺四乙酸Tris Tris(hydroxyrnethyl)aminomethane 三(羥甲基)氨基己烷SDSSodium dodecyl sulfate十二烷基磺酸鈉
r/mRevolutions per minute每分鐘轉速RNase ribonuclease RNA酶EB ethidium btomide 溴化乙錠PCRprolymerase chain reaction聚合酶鏈式反應OD optical density 光吸收值PBSphosphatic buffer solution磷酸鹽緩衝液PAGE polyacrylamide gel electrophoresis聚丙烯醯胺凝膠電泳DTTdithiothreitol二硫蘇糖醇KD kilodaltons 千道爾頓RT room temperature 室溫PH 酸鹼度SDS-PAGE 變性膠-聚丙烯醯胺凝膠電泳AP ammonium persulfate 過硫酸胺。
權利要求
1.一種利用內源性血管生成抑制因子Arresten基因製備蛋白的方法，步驟包括，從人體中提取總RNA，加入上、下遊引物，RT-PCR反轉錄擴增得到Arresten基因的DNA，再取質粒載體雙酶切後與RT-PCR擴增產物Arresten DNA雙酶切後連接，得到連接反應產物，最後將產物轉化入到宿主大腸桿菌中表達，得到Arresten蛋白，其特徵在於連接及表達載體所用質粒為pBV220，載體pBV220與目的ArrestenDNA的摩爾數比1∶1～1∶3，在15～18℃連接，時間8～10小時，得到連接反應產物pBV220-Arr。
2.根據權利要求1所述的利用內源性血管生成抑制因子Arresten基因製備蛋白的方法，其特徵在於選擇大腸桿菌為E.coliJM109、DH5α、BL21、BL21(DE3)，其中最優表達菌種為E.coli BL21(DE3)。
3.根據權利要求1或2所述的利用內源性血管生成抑制因子Arresten基因製備蛋白的方法，其特徵在於大腸桿菌表達產物以包涵體存在，包涵體的洗滌和分離使用2mol/L尿素與2％Triton X-100洗滌，效果最好。
4.根據權利要求1或2所述的利用內源性血管生成抑制因子Arresten基因製備蛋白的方法，其特徵在於反轉錄擴增反應條件的起始溫度控制在93-95℃，40sec；退火溫度為56-58℃，40sec；延伸溫度71-73℃；1min，共35個循環。
5.根據權利要求1或2所述的利用內源性血管生成抑制因子Arresten基因製備蛋白的方法，其特徵在於大腸桿菌培養溫度30℃，時間4個小時，表達一般在42℃，時間4個小時，最佳溶解氧量選擇比例在1∶5。
全文摘要
本發明涉及一種基因重組、表達技術，具體為一種利用內源性血管生成抑制因子Arresten基因製備蛋白的方法。解決了現有技術中存在的利用人體中的Arresten基因製備具有抑制腫瘤血管生成的蛋白質過程中存在的效率低下的問題。步驟包括，從人體中提取總RNA，加入上、下遊引物，RT－PCR反轉錄擴增得到Arresten基因的DNA，再取質粒載體pBV220雙酶切後與RT－PCR擴增產物Arresten DNA雙酶切後連接，得到連接反應產物pBV220－Arr，最後將產物轉化入到宿主大腸桿菌中表達，得到Arresten蛋白。與現有技術相比，本發明使用一種同時作為連接載體和表達載體的質粒pBV220，既簡單又經濟，節省了成本，而且表達效果非常好，提高了合成的效率。為所需目的蛋白的合成提供了一種新途徑。
文檔編號C07K14/435GK1884527SQ20061001282
公開日2006年12月27日 申請日期2006年6月9日 優先權日2006年6月9日
發明者鄭金平, 唐海英, 陳顯久, 解軍 申請人:鄭金平, 唐海英