腈水合酶和生產醯胺的方法

2023-05-25 07:56:21 4

專利名稱：腈水合酶和生產醯胺的方法
技術領域：
本發明涉及新穎的腈水合酶(nitrile hydratase)和使用該腈水合酶從腈化合物生產醯胺化合物的方法。
背景技術：
為了提高腈水合酶的表達水平，已經檢驗了利用遺傳工程在微生物細胞中過量表達腈水合酶的方法和使用這些細胞轉化腈化合物為對應的醯胺化合物的方法。例如，已知的腈水合酶是源於下列微生物的。所有腈水合酶都是由兩種類型的異種亞單位組成的酶。
紅球菌(Rhodococcus)屬(已審日本專利申請公報(JP-B)NO.平3-54558)紅球菌屬(未審日本專利申請公報(JP-A)NO.平2-119778)假單胞菌(Pseudomonas)屬(JP-A平3-251184)紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)屬(歐洲專利申請NO.455646)不過，在所有情況下，利用大腸桿菌所得腈水合酶活性的表達水平都不是足夠高的，該大腸桿菌是用含有任意如這些專利申請所述腈水合酶基因的插入片段的表達質粒所轉化的；每重量份轉化體細胞的腈水合活性低於作為基因來源的原始微生物(Ikehata，O.，Nishiyama，M.，Horinouchi，S.and Beppu，T.″Primary structure of nitrile hydratase deducedfrom the nucleotide sequence of a Rhodococcus speices N-774 and itsexpression in Escherichia coli″Eur.J.Biochem.181(1989)，563-570；Nishiyama，M.，Horinouchi，S.，Kobayashi，M.，Nagasawa，T.，Yamada，H.and Beppu，″Cloning and Characterization of Genes Responsible forMetabolism of Nitrile Compounds from Pseudomonas chlororaphis B23″Journal of bacteriology 173(1991)2465-2472；Kobayashi，M.，Nishiyama，M.，Nagasawa，T.，Horinouchi，S.，Beppu，T.and Yamada，H.″Cloningnucleotide sequence and expression in Escherichia coli of twocobalt-containing nitrile hydratase genes from Rhodococcus rhodochrousJl″Biochimica et Biophysica Acta.1129(1991)23-33)。
如上所述，已經有可能利用基因重組技術在大腸桿菌中表達腈水合酶活性本身。不過，迄今尚不存在可利用的轉化體，它具有如此高的腈水合活性，以便用於醯胺的工業生產。
另一方面，在乾燥無色桿菌(IFO 12668)中已經見到腈水合酶，它表現非常高的腈水合活性，還已經克隆了編碼該酶的基因。進而，使用表達質粒向大腸桿菌引入該基因，利用所得轉化體過度產生了腈水合酶(JP-A平8-266277)。這份報導僅顯示了丙烯醯胺和α-羥基異丁醯胺的生產實例，因而在該報導中沒有關於這種酶對2-羥基-4-甲硫基丁腈的活性的說明。
因而，關於能夠使用2-羥基-4-甲硫基丁腈(methylthiobutyronitrile)(以下縮寫為HMBN)作為底物的腈水合酶知之甚少。此外，尚無使用大腸桿菌從2-羥基-4-甲硫基丁腈生產2-羥基-4-甲硫基丁醯胺(methylthiobutylamides)(以下縮寫為HMBAm)的現有方法，該大腸桿菌是用含有腈水合酶基因作為插入片段的表達質粒所轉化的。
另一方面，關於由微生物生產α-羥基醯胺，存在一種已知的方法，使用屬於芽孢桿菌屬、炭疽芽孢桿菌屬(the genus Bacteridium)、微球菌(Micrococcus)屬或短桿菌(Brevibacterium)屬的微生物從乳腈、羥乙腈、α-羥基甲硫基丁腈等生產對應的醯胺(參見JP-B昭62-21519)。另外，還存在一種從氰醇(cyanohydrin)生產扁桃醯胺(mandelamide)的公知方法(參見JP-A平4-222591；JP-A平8-89267)。
不過，具有腈水合酶活性、能夠轉化腈化合物為醯胺化合物的酶具有這樣一個問題，由於原料腈化合物或產物醯胺化合物的存在，這些酶容易喪失它們固有的酶活性。如果為了增加醯胺化作用的速率而升高腈化合物的濃度，那麼腈水合酶容易在短時間內失活，從而難以在所需時間內得到反應產物醯胺化合物。另外，產物醯胺化合物也容易使腈水合酶失活，從而難以得到高濃度的醯胺化合物。
此外，在不同程度上取決於化合物的類型，已知α-羥基腈在極性溶劑中部分分解為對應的醛和氫氰酸(V.Okano et al.，J.Am.Chem.Soc.，Vol.98，4201(1976))。一般而言，醛與蛋白質連接，能夠使酶活性失活(Chemical Modification of Proteins，G.E.Means et al.，Holden-Day，125(1971))。進而，象醛一樣，氫氰酸(氰化物)也能夠抑制性地作用於很多酶。因而，從原料α-羥基腈所產生的醛和氰化物能夠成為降低酶活性的原因。由於在酶水合作用或α-羥基腈水解作用中，酶在短時間內失活這一問題，難以以高生產率得到高濃度的α-羥基醯胺。
為了防止酶活性的喪失，已經試驗了各種增加酶活性或抑制酶活性喪失(失活)的方法。這樣的努力例如包括如下在凝固點至15℃的更低溫度下進行反應(JP-B昭56-38118)；從多個供給口連續供給更低濃度的底物(JP-B昭57-1234)；將微生物或其加工產物用有機溶劑處理(JP-A平5-308980)；在不飽和高級脂肪酸的存在下進行反應(JP-A平7-265090)；使微生物細胞受到戊二醛的交聯處理等(JP-A平7-265091；JP-A平8-154691)；利用化學方法降低汙染腈化合物的氫氰酸的濃度，然後使腈水合酶與腈化合物反應(JP-A平11-123098)；利用亞硫酸離子、酸式亞硫酸離子或連二亞硫酸離子的存在實現酶活性的長期穩定化(JP-A平8-89267)；加入醛(JP-A平4-222591)。
這些方法沒有一個在工業應用上具有實際的效果。儘管有些方法是有效的，不過它們仍有經濟性或實用性改善的空間。例如，上述加入醛的方法需要大量的醛作為原料，是氰醇的1-5倍摩爾量，因而該方法並非經濟的解決方案。類似地，加入亞硫酸離子、酸式亞硫酸離子或連二亞硫酸離子的方法要求加入離子的量等於或大於原料，因而該方法不實用。
本發明的一個目的是提供具有很高腈水合活性的腈水合酶。本發明的另一個目的是提供穩定的腈水合酶，它能夠在長時間內保持很高的酶活性。另外，本發明的另一個重要目的是提供也能夠使用2-羥基-4-甲硫基丁腈作為底物的腈水合酶。
此外，本發明的另一個目的是提供編碼具有很高腈水合活性的腈水合酶的基因、含有該基因的重組質粒和含有該重組質粒的轉化體。另外，本發明的另外一個目的是提供使用表達很高腈水合活性的該轉化體從腈生產對應的醯胺的方法。

發明內容
本發明人為達到上述目的而進行了艱苦的研究，在屬於紅球菌屬的微生物(Rhodococcus sp.)中發現了具有非常高腈水合活性的腈水合酶。然後，發明人確認了該腈水合酶是一種新穎的酶，可用於達到上述目的，從而完成了本發明。
發明人然後利用重組DNA技術克隆了編碼該酶的基因，製備了用包含表達載體的表達質粒轉化的大腸桿菌，該表達載體含有所分離的基因作為插入片段。進而，本發明人成功地利用所得轉化體大規模生產該腈水合酶，從而完成了本發明。
也就是說，本發明提供了下列腈水合酶、編碼該酶的多核苷酸、生產該酶的方法和使用本發明的酶生產醯胺的方法。
本發明的腈水合酶具有下列物理化學性質(a)和(b)(a)作用於腈化合物的腈基，使腈基水合，將其轉化為醯胺基；(b)是氰化物耐受性的。
本發明中，使腈化合物的腈基水合和將其轉化為醯胺基的活性被稱為「腈水合酶活性」。優選地，能夠作用於下式(1)化合物並生成式(3)醯胺化合物的酶被稱為「腈水合酶」。
式(1) 式(3) (其中R代表取代或未取代的烷基、取代或未取代的鏈烯基、取代或未取代的環烷基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、取代或未取代的飽和或不飽和雜環基)。
優選地，本發明的腈水合酶能夠作用於2-羥基-4-甲硫基丁腈，產生2-羥基-4-甲硫基丁醯胺。
本發明的腈水合酶活性如下得以確認。首先，向0.1M磷酸鉀緩衝液(pH 6.5)加入酶樣本，緩衝液含有10％v/v 2-羥基-4-甲硫基丁腈(HMBN)作為底物。也可使用微生物細胞和粗酶(crude enzyme)代替酶樣本。加入酶後，將溶液在20℃下培育15分鐘。然後將反應溶液與過量體積的0.1％(v/v)磷酸鹽溶液混合，劇烈搖動混合物以終止反應。可以利用HPLC分析反應產物。
按照這種測定方法，1U腈水合酶被定義為在20℃具有標準組成的反應溶液中1分鐘能夠產生1μmol煙醯胺的酶的量；1U被定義為在20℃具有標準組成的反應溶液中1分鐘能夠產生1μmol HMBAm的酶的量。
具體而言，例如可以利用實施例所述工藝測定酶活性。進而，使用來自Bio-Rad的蛋白質測定試劑盒，利用染劑結合法進行蛋白質的量化。
另一方面，本文所用的「氰化物耐受性」意味著在20℃下用1mM氰化物離子處理30分鐘後，酶保留40％或更多的腈水合酶活性。作為替代選擇，如果在20℃下用5mM氰化物離子處理30分鐘後，酶保留10％或更多的腈水合酶活性，那麼可以認為該酶是氰化物耐受性的。
進而，本發明提供具有下列物理化學性質(1)-(7)的腈水合酶(1)分子量在用凝膠過濾法測定時，分子量大約是110,000Da；利用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳法將酶分離為26.8kDa和29.5kDa的兩個亞單位。
(2)作用該酶作用於腈化合物的腈基。
(3)最佳pH使腈基水合的活性在pH 5.5-6.5下最大。
(4)最佳溫度使腈基水合的活性在40-45℃下最大。
(5)pH穩定性該酶在pH 4-9內是穩定的。
(6)熱穩定性在50℃下熱處理30分鐘後，該酶保留70％或更多的活性。
(7)抑制劑
該酶被HgCl2、AgNO3、羥胺或苯肼所抑制。
進而，除了上述物理化學性質(a)和(b)或(1)-(7)以外，本發明提供具有下列物理化學性質(c)和/或(d)的腈水合酶。
(c)底物特異性該酶使用2-羥基-4-甲硫基丁腈作為底物，產生2-羥基-4-甲硫基丁醯胺。
(d)穩定性該酶被二價金屬離子所穩定。
本發明中，腈水合酶的底物特異性可以利用上述試驗腈水合酶活性的方法加以測定。進而，本文所用的「被二價金屬離子所穩定」意味著即使在二價金屬離子的存在下酶與1.8w/w％2-羥基-4-甲硫基丁腈培育20分鐘，酶活性也基本上沒有減少。在本發明的優選實施方式中，本發明的腈水合酶能夠在這些條件下保持110％或更高的活性。
本發明中，上述二價金屬離子包括鎳離子和鈷離子。這些二價金屬離子在0.1mM-1M、一般為0.5-100mM、優選為1-10mM的濃度下提高本發明腈水合酶的酶活性。
利用常用的蛋白質純化方法，可以從能夠產生該酶的微生物中純化本發明的腈水合酶。可以將上述微生物培養在標準的細菌培養基中。可以向培養基加入一些誘導腈水合酶表達的化合物。例如，腈化合物或醯胺化合物的加入能夠提高腈水合酶的活性。更具體而言，乙腈、乙醯胺等可以用作酶誘導劑。
使能夠產生該酶的微生物充分生長，然後收穫細胞。在適當的緩衝液中溶解細胞，製備無細胞的提取物。緩衝液可以含有還原劑，例如2-巰基乙醇，蛋白酶抑制劑，例如苯甲磺醯氟(PMFS)。利用基於蛋白質溶解度的分離法和各種色譜工藝的適當組合，可以從無細胞的提取物純化腈水合酶。
作為基於蛋白質溶解度的分離法，例如可以使用有機溶劑沉澱法，例如丙酮和二甲基亞碸，或硫酸銨鹽析法。另一方面，已知的色譜方法包括陽離子交換色譜、陰離子交換色譜、凝膠過濾、疏水性色譜以及很多使用染劑、抗體及其他的親合色譜工藝。更具體而言，本發明的腈水合酶可以被純化為電泳上同種的多肽，例如使用苯基-TOYOPEARL的疏水性色譜、使用DEAE-瓊脂糖的陰離子交換色譜、使用丁基-TOYOPEARL的疏水性色譜、使用藍-瓊脂糖的親合色譜、使用Superdex200的凝膠過濾和其他。
能夠用於此目的的微生物例如包括屬於紅球菌屬(Rhodococcus sp.)的那些。更具體而言，Rhodococcus sp.Cr4是適合於生產本發明腈水合酶的微生物。Rhodococcus sp.Cr4已被保藏在International PatentOrganism Depositary中，入藏號FERM BP-6596。
Rhodococcus sp.Cr4的國際保藏(a)保藏機構的名稱和地址名稱International Patent Organism Depositary，National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology(AIST)，IndependentAdministrative Institution(原名The National Institute of Bioscience andHuman-Technology，The Agency of Industrial Science and Technology，TheMinistry of International Trade and Industry)地址Chuo 6，1-1，Higashi l-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566Japan(b)保藏日期(原始保藏日期)1998年12月8日(c)保藏號FERM BP-6596本發明的腈水合酶是可以從Rhodococcus sp.得到的。Cr4是一種新穎的酶，具有上述物理化學性質(a)-(d)和(1)-(7)。結構特徵是上述物理化學性質(1)；根據SDS-PAGE的測定，該酶是由26.8kDa的α-亞單位和29.5kDa的β-亞單位組成的雜二聚多肽。α-亞單位的胺基酸序列如SEQ ID NO2所示(226個胺基酸殘基)，β-亞單位的胺基酸序列如SEQID NO4所示(207個胺基酸殘基)。也就是說，本發明提供下列具有腈水合酶活性的基本上純的蛋白質複合體。
本發明涉及在包含胺基酸序列SEQ ID NO2的多肽與包含胺基酸序列SEQ ID NO4的多肽之間的、基本上純的蛋白質複合體。進而，本發明包括在包含胺基酸序列SEQ ID NO2的多肽與包含胺基酸序列SEQ ID NO4的多肽之間的蛋白質複合體的同系物。
本文關於給定蛋白質、多肽或蛋白質複合體所用的術語「基本上純」意味著該蛋白質、多肽或蛋白質複合體基本上不含其他生物大分子。基本上純的蛋白質、多肽或蛋白質複合體是至少75％(例如至少80、85、95或99％)純的，以乾重計。純度可以利用本領域已知的任意適當標準方法加以測量，例如柱色譜、聚丙烯醯胺凝膠電泳或HPLC分析。
本發明的蛋白質複合體是這樣一種腈水合酶，它能夠被使用所分離的編碼本發明腈水合酶的多核苷酸的基因重組技術所表達。編碼本發明腈水合酶的多核苷酸例如可以利用下列方法分離。
由本發明所提供的腈水合酶由如(A)-(E)任意一個所示多核苷酸所編碼的α-亞單位和如(a)-(e)任意一個所示多核苷酸所編碼的β-亞單位組成，是具有下列物理化學性質(i)和(ii)的蛋白質複合體。
(i)作用作用於腈化合物的腈基，使腈基水合，將其轉化為醯胺基；(ii)底物特異性該酶使用2-羥基-4-甲硫基丁腈作為底物，產生2-羥基-4-甲硫基丁醯胺。
如下列(A)-(E)任意一個所示多核苷酸可以用作編碼構成本發明蛋白質複合體的α-亞單位的基因。本發明中，如(A)-(E)任意一個所示多核苷酸可用於表達本發明腈水合酶的α-亞單位(A)包含核苷酸序列SEQ ID NO1的多核苷酸；(B)編碼包含胺基酸序列SEQ ID NO2的多肽的多核苷酸；(C)編碼包含胺基酸序列SEQ ID NO2的多肽的多核苷酸，它含有一個或多個胺基酸取代、缺失、插入和/或加入；(D)能夠在嚴格條件下與包含核苷酸序列SEQ ID NO1的多核苷酸雜交的多核苷酸；(E)編碼與胺基酸序列SEQ ID NO2具有70％或更高同一性的多肽的多核苷酸。
而且，如下列(a)-(e)任意一個所示多核苷酸可以用作編碼構成本發明蛋白質複合體的β-亞單位的基因。本發明中，如(a)-(e)任意一個所示多核苷酸可用於表達本發明腈水合酶的β-亞單位(a)包含核苷酸序列SEQ ID NO3的多核苷酸；(b)編碼包含胺基酸序列SEQ ID NO4的多肽的多核苷酸；(c)編碼包含胺基酸序列SEQ ID NO4的多肽的多核苷酸，它含有一個或多個胺基酸取代、缺失、插入和/或加入；(d)能夠在嚴格條件下與包含核苷酸序列SEQ ID NO3的多核苷酸雜交的多核苷酸；(e)編碼與胺基酸序列SEQ ID NO4具有70％或更高同一性的多肽的多核苷酸。
本發明涉及所分離的編碼腈水合酶亞單位的多核苷酸及其同系物。
本文所用的「所分離的多核苷酸」是這樣一種多核苷酸，它的結構不等同於任意天然存在的多核苷酸或任意跨越三個以上單獨基因的天然存在的基因組多核苷酸片段。該術語因此例如包括(a)DNA，它具有天然存在於生物基因組中的基因組DNA分子部分的序列，在該生物中是天然存在的；(b)摻入載體或原核生物或真核生物基因組DNA中的多核苷酸，其方式以便所得分子不等同於任意天然存在的載體或基因組DNA；(c)單獨的分子，例如cDNA、基因組片段、由聚合酶鏈反應(PCR)生成的片段或限制酶切片段；(d)重組核苷酸序列，它是雜種基因的一部分，也就是編碼融合多肽的基因。具體從這種定義中排除在外的是這樣的DNA分子的多核苷酸，它們存在於不同的(i)DNA分子、(ii)轉染細胞或(iii)細胞克隆體的混合物中；例如它們存在於DNA文庫中，例如cDNA或基因組DNA文庫。
因此，本發明在一方面提供所分離的多核苷酸，它編碼本文所述的多肽或其片段。優選地，所分離的多核苷酸包括至少60％等同於如SEQID NO1或3所示核苷酸序列的核苷酸序列。更優選地，所分離的核酸分子至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多等同於如SEQ ID NO1或3所示核苷酸序列。在所分離的多核苷酸長度長於或等於參照序列、例如SEQID NO1或3的情況下，利用全長參照序列進行對比。若所分離的多核苷酸短於參照序列，例如短於SEQ ID NO1或3，則對相同長度的參照序列節段(排除同源性計算所需的所有環)進行對比。
編碼本發明腈水合酶α-亞單位與β-亞單位的多核苷酸的核苷酸序列以及被這些核苷酸序列編碼的胺基酸序列都是新穎的。基於由本發明揭示的核苷酸序列的信息，可以從上述保藏的微生物得到有關基因。可以利用PCR或雜交技術篩選得到這些基因。還可以利用化學DNA合成得到全長基因。
進而，基於上述核苷酸序列的信息，有可能得到源於其他生物的腈水合酶。例如，使用上述核苷酸序列或其部分序列作為探針，在嚴格條件下與從其他生物製備的多核苷酸進行雜交，可以分離源於各種生物的腈水合酶基因。
術語「能夠在嚴格條件下雜交的多核苷酸」表示能夠與作為探針的多核苷酸雜交的多核苷酸，前者具有選自核苷酸序列SEQ ID NO1(α-亞單位)和SEQ ID NO3(β-亞單位)的核苷酸序列，例如在手冊所述條件下(在42℃下用含有0.5×SSC的初步洗滌緩衝液洗滌)利用ECL直接核酸標記與檢測系統(Amersham Pharmacia Biotech)。還包括在本發明中的是在高嚴格條件下與本文所述核苷酸序列SEQ ID NO1或其片段雜交的多核苷酸。「高嚴格條件」表示在約45℃下在6×SSC中雜交，然後在65℃下用0.2×SSC，0.1％SDS洗滌一次或多次。構成探針多核苷酸的核苷酸序列可以被製成一種或多種任意組成的序列，但是具有至少20個連續的核苷酸，優選至少30個連續的核苷酸，例如40、60或100個連續的核苷酸，選自上述核苷酸序列。
進而，基於關於上述核苷酸序列的信息，可以從表現高同源性的區域設計PCR引物。使用這樣的引物和染色體DNA或cDNA作為模板，利用PCR可以從各種生物分離編碼腈水合酶的基因。
在本發明的方法中，有可能不僅使用天然的酶，而且使用包含天然酶的胺基酸序列的酶，其中一個或多個胺基酸已被取代、刪去和/或插入，只要該酶能夠構成具有上述物理化學性質(a)與(b)或(1)至(7)的蛋白質複合體即可。本領域技術人員可以修飾該多肽的結構，例如通過位點特異性誘變引入適當取代、缺失、插入和/或加入的突變(Nucleic Acid Res.10，pp.6487(1982)；Methods in Enzymol.100，pp.448(1983)；MolecularCloning 2nd Edt.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；PCR，APractical Approach IRL Press pp.200(1991))等。進而，胺基酸突變可以自然發生。因而，不僅具有人工胺基酸突變的酶、而且含有自發性胺基酸突變的酶都能夠用在本發明的方法中。
被突變的胺基酸的數量沒有特別的限制，只要該酶能夠構成具有上述物理化學性質(a)與(b)或(1)至(7)的蛋白質複合體即可。正常情況下，它在50個胺基酸以內，優選在30個胺基酸以內，更優選在10個胺基酸以內，進而更優選在3個胺基酸以內。突變的位點可以是任意位點，只要該酶能夠構成具有上述物理化學性質(a)與(b)或(1)至(7)的蛋白質複合體即可。
胺基酸取代優選地被突變成不同的胺基酸，其中保存了胺基酸側鏈的性質。「保守性胺基酸取代」是屬於下列具有化學相似側鏈的小組之一的一個胺基酸殘基被同組另一個胺基酸代替。具有相似側鏈的胺基酸殘基小組在本領域中已有定義。這些小組包括具有鹼性側鏈的胺基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側鏈的胺基酸(例如天冬氨酸、穀氨酸)、具有不帶電極性側鏈的胺基酸(例如甘氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非極性側鏈的胺基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支側鏈的胺基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳族側鏈的胺基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。
另外，在本發明的方法中，編碼與腈水合酶每種亞單位的胺基酸序列具有同源性的多肽的基因也可以用於本發明，只要該產物能夠構成具有上述物理化學性質(a)與(b)或(1)至(7)的蛋白質複合體即可。利用蛋白質同源性檢索可以得到這些基因。這類同源性檢索例如可以使用下列公知的資料庫進行關於蛋白質的胺基酸序列資料庫，例如SWISS-PROT和PIR，DNA資料庫，例如DNA Databank of JAPAN(DDBJ)、EMBL和GenBank，從DNA序列推導的胺基酸序列資料庫，同源性檢索程序，例如FASTA程序和BLAST程序。
進而，在網際網路上也可獲得檢索上述資料庫的資料庫檢索服務。利用這種類型的服務可以找到用在本發明中的腈水合酶。
與胺基酸序列SEQ ID NO2(α-亞單位)或SEQ ID NO4(β-亞單位)具有至少85％、優選90％或更高、更優選95％或更高同一性的多肽是本發明優選的多肽，構成用在本發明中的腈水合酶。本文所用的「同一性百分率(percent identity)」例如表示利用BLAST程序所得「陽性(Positive)」同一性百分率的值。具體而言，兩種胺基酸序列或兩種核酸的「同一性百分率」是利用Karlin和Altschul的算法測定的(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268，1990)，這種算法也被Karlin和Altschul修正過(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877，1993)。將這樣一種算法結合到Altschul等的NBLAST與XBLAST程序中(J.Mol.Biol.215403-410，1990)。BLAST核苷酸檢索是用NBLAST程序進行的，分值＝100，字長＝12。蛋白質的同源性檢索是容易進行的，例如在DNADatabank of JAPAN(DDBJ)中，利用FASTA程序、BLAST程序等。BLAST蛋白質檢索是用XBLAST程序進行的，分值＝50，字長＝3。若在兩個序列之間存在間隙，則採用有間隙的BLAST，如Altsuchl等所述(NucleicAcids Res.253389-3402，1997)。若採用BLAST和有間隙的BLAST程序，則使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的默認參數。
本發明中，若打算使用包含胺基酸序列SEQ ID NO2的突變α-亞單位和包含胺基酸序列SEQ ID NO4的突變β-亞單位製備蛋白質複合體，二者在它們的胺基酸序列中都具有突變，則它們之一或之二可以是突變的多肽。進而，不同來源的亞單位可以彼此結合，生成本發明的蛋白質複合體。若兩個亞單位之一打算是突變的，則應當選擇能夠與其他亞單位構成具有上述物理化學性質(1)和(2)的蛋白質複合體者。
進而，若α-亞單位和β-亞單位都打算是突變體，則將一種突變體與另一種結合，並且選擇能夠構成具有上述物理化學性質(i)和(ii)的蛋白質複合體的突變體。在這種情況下，首先，試驗突變的亞單位，以評估它在與其他具有野生型胺基酸序列的亞單位結合後是否產生所需的物理化學性質。若結果是陽性的，則選擇另一種產生所需物理化學性質的突變體作為配偶亞單位，用於與第一突變體結合；因而這些突變體是容易選擇的。本發明可取的突變體具有上述物理化學性質(a)與(b)或(1)-(7)以及上述物理化學性質(i)與(ii)。
本發明優選的酶活性材料包括同種或異種宿主的轉化體，該宿主表達編碼腈水合酶的基因，已經利用基因重組技術製備，再處理其產物。
不存在關於用於轉化作用以表達本發明腈水合酶基因的生物的限制，只要該生物能夠用含有編碼構成具有腈水合酶活性的蛋白質複合體的各亞單位的多核苷酸的重組載體轉化、並且能夠表達腈水合酶活性即可。編碼各亞單位的多核苷酸可以保留在單一的載體中。各亞單位的多核苷酸還可以被分別插入在兩種類型的載體中；通過載體的共同轉化作用，可以表達本發明的蛋白質複合體。進而，有可能通過使各自表達單一亞單位的轉化體結合，體外得到有關蛋白質複合體。可利用的微生物是其宿主-載體系統是可利用的那些，例如包括細菌，例如埃希氏桿菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、沙雷氏菌屬、短桿菌屬、棒桿菌屬、鏈球菌屬和乳桿菌屬；放線菌，例如紅球菌屬和鏈黴菌屬；酵母，例如酵母屬、克魯維氏酵母屬、裂殖糖酵母屬、接合糖酵母屬、Yarrowia屬、毛孢子菌屬、紅孢子菌屬、畢赤氏酵母屬和假絲酵母屬；真菌，例如鏈孢黴屬(Neurospora)、麴黴屬、頭孢子菌屬(Cephalosporium)和木黴屬等。
適合於宿主的轉化體的製備工藝和重組載體的構建工藝可以採用分子生物學、生物工程和遺傳工程領域中常用的技術(例如參見Sambrook et al.，″Molecular Cloning″，Cold Spring Harbor Laboratories)。為了在微生物中表達編碼本發明腈水合酶的基因，有必要向在微生物中穩定的質粒載體或噬菌體載體引入多核苷酸，並使遺傳信息轉錄和轉譯。為此，在本發明多核苷酸5』-末端上遊放置啟動子，即用於調節轉錄和轉譯的單元，並且優選地在多核苷酸3』-末端下遊方式終止子。啟動子和終止子應當在被用作宿主的微生物中是功能性的。可用於上述各種微生物的載體、啟動子和終止子詳細描述在″Fundamental Course inMicrobiology(8)Genetic Engineering″，Kyoritsu Shuppan中，具體關於酵母，見″Adv.Biochem.Eng.43，75-102(1990)″和″Yeast 8，423-488(1992)″。
例如，關於埃希氏桿菌屬，確切地關於大腸桿菌，可利用的質粒包括pBR系列和pUC系列的質粒；可利用的啟動子包括源於lac(源於β-半乳糖苷酶基因)、trp(源於色氨酸操縱子)、tac與trc(它們是lac和trp的嵌合體)、λ噬菌體的PL與PR等的啟動子。可利用的終止子源於trpA、噬菌體、rrnB核糖體RNA等。其中，可以優選地使用載體pSE420D(描述在未審日本專利申請公報No.(JP-A)2000-189170中)，它是通過部分地修飾商業上可得到的pSE420(Invitrogen)的多克隆位點所構建的。
關於芽孢桿菌屬，可利用的載體是pUB110系列和pC194系列的質粒；載體可以被整合到宿主染色體中。可利用的啟動子和終止子源於apr(鹼性蛋白酶)、npr(中性蛋白酶)、amy(α-澱粉酶)等。
關於假單胞菌屬，存在為惡臭假單胞菌和洋蔥假單胞菌開發的宿主-載體系統。適用廣泛宿主的載體pKT240(含有自主複製所需的源於RSF1010的基因)是可利用的，它基於TOL質粒，參與甲苯化合物的分解；源於脂肪酶基因的啟動子和終止子(JP-A平5-284973)是可利用的。
關於短桿菌屬，確切地關於乳發酵短桿菌，可利用的質粒載體包括pAJ43(Gene 39，281(1985))。可以採用用於大腸桿菌的啟動子和終止子，無需為短桿菌屬進行任何修飾。
關於棒桿菌屬，確切地關於穀氨酸棒桿菌，質粒載體是可利用的，例如pCS11(JP-A昭57-183799)和pCB101(Mol.Gen.Genet.196，175(1984))。
關於鏈球菌屬，可以使用質粒載體，例如pHV1301(FEMS Microbiol.Lett.26，239(1985))和pGK1(Appl.Environ.Microbiol.50，94(1985))。
關於乳桿菌屬，可以採用質粒載體，例如pAMβ1(J.Bacteriol.137，614(1979))，它是為鏈球菌屬開發的；用於大腸桿菌的啟動子也是可用的。
關於紅球菌屬，從紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)分離的質粒載體是可利用的(J.Gen.Microbiol.138，1003(1992))。
關於鏈黴菌屬，可以按照Hopwood等在″Genetic Manipulation ofStreptomycesA Laboratory Manual″(Cold Spring Harbor Laboratories(1985))中所述方法構建質粒。確切地關於淺青紫鏈黴菌，pIJ486(Mol.Gen.Genet.203，468-478，1986)、pKC1064(Gene 103，97-99(1991))和pUWL-KS(Gene 165，149-150(1995))是可用的。相同的質粒也可用於維吉尼亞鏈黴菌(Actinomycetol.11，46-53(1997))。
關於酵母屬，確切地關於釀酒酵母，YRp系列、YEp系列、YCp系列和YIp系列的質粒是可利用的；整合載體(參照EP 537456等)經由與多拷貝核糖體基因的同源性重組而被整合到染色體中，可以引入有關基因的多個拷貝，所摻入的基因被穩定地保持在微生物中；因而，這些類型的載體是非常有用的。可利用的啟動子和終止子源於編碼ADH(醇脫氫酶)、GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)、PHO(酸性磷酸酶)、GAL(β-半乳糖苷酶)、PGK(磷酸甘油酯激酶)、ENO(烯醇化酶)等的基因。
關於克魯維氏酵母屬，確切地關於乳克魯維氏酵母，可利用的質粒例如源於釀酒酵母的2-μm質粒、pKD1系列質粒(J.Bacteriol.145，382-390(1981))、源於pGK11並參與殺死活性的質粒、KARS(克魯維氏酵母屬自主複製序列)質粒和能夠經由與核糖體DNA的重組而被整合到染色體中的質粒(參照EP537456等)。源於ADH、PGK等的啟動子和終止子是可利用的。
關於裂殖糖酵母屬，有可能使用這樣的質粒載體，它們包含源於粟酒裂殖糖酵母的ARS(自主複製序列)和源於釀酒酵母的營養缺陷-補充性可選擇的標記(Mol.Cell.Biol.6，80(1986))。可用的啟動子例如源於粟酒裂殖糖酵母的ADH啟動子(EMBO J.6，729(1987))。確切而言，pAUR224在商業上可從TaKaRa Shuzo獲得。
關於接合糖酵母屬，例如源於Zygosaccharomyces rouxii的pSB3質粒(Nucleic Acids Res.13，4267(1985))是可利用的；有可能使用源於釀酒酵母的PHO5啟動子和源於Zygosaccharomyces rouxii的GAP-Zr(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)啟動子(Agri.Biol.Chem.54，2521(1990))。
關於畢赤氏酵母屬，已經開發了宿主-載體系統，其中參與自主複製的源於畢赤氏酵母的基因(PARS1和PARS2)被用在巴斯德畢赤氏酵母等中(Mol.Cell.Biol.5，3376(1985))，因而高密度培養和強啟動子是可用的，例如甲醇可誘導的AOX(Nucleic Acids Res.15，3859(1987))。在畢赤氏酵母屬中，已經為Pichia angusta(以前稱Hansenula polymorpha)開發了宿主-載體系統。可用的載體包括參與自主複製的源於Pichiaangusta的基因(HARS1和HARS2)，但是它們是相對不穩定的。因此，向染色體整合該基因的多個拷貝是有效的(Yeast 7，431-443(1991))。AOX(醇氧化酶)和FDH(甲酸脫氫酶)的啟動子也是可利用的，它們受甲醇的誘導。還已經開發了另一種宿主-載體系統，其中參與自主複製的源於畢赤氏酵母的基因(PARS1和PARS2)被用在巴斯德畢赤氏酵母等中(Mol.Cell.Biol.5，3376(1985))，因而高密度培養和強啟動子是可用的，例如甲醇可誘導的AOX(Nucleic Acids Res.15，3859(1987))。
關於假絲酵母屬，已經為麥芽糖假絲酵母、白色假絲酵母、熱帶假絲酵母、產朊假絲酵母等開發了宿主-載體系統。已經克隆了來源於麥芽糖假絲酵母的自主複製序列(Agri.Biol.Chem.51，51，1587(1987))，已經為麥芽糖假絲酵母開發了使用這些序列的載體。進而，已經為產朊假絲酵母開發了具有高效啟動子單元的染色體-整合載體(JP-A平08-173170)。
關於麴黴屬，已經集中研究了真菌中的黑麴黴和米麴黴，因而質粒載體和染色體整合載體是可利用的，以及源於細胞外蛋白酶基因和澱粉酶基因的啟動子(Trends in Biotechnology 7，283-287(1989))。
關於木黴屬，已經為Trichoderma reesei開發了宿主-載體系統，可利用的啟動子例如源於細胞外纖維素酶基因的那些(Biotechnology 7，596-603(1989))。
除了微生物以外，還存在各種為植物和動物開發的宿主-載體系統；確切而言，這些系統包括昆蟲，例如蠶(Nature 315，592-594(1985))，和植物，例如油菜籽、玉蜀黍、馬鈴薯等。轉化體的培養和從轉化體純化腈水合酶可以利用本領域技術人員已知的方法進行。
本發明的編碼用作載體插入片段的腈水合酶的多核苷酸例如包括如(A)-(E)所示任意一種上述多核苷酸和如(a)-(e)所示任意一種上述多核苷酸。
在本發明的載體中編碼腈水合酶α-亞單位和β-亞單位的多核苷酸優選地是前後連接的。術語「優選地前後(in tandem)連接」表示這樣的連接，普通的調節區域指向這些亞單位的表達。這樣一種排列預期能夠更有效地表達亞單位和更有效地生成具有酶活性的蛋白質複合體。作為替代選擇，各亞單位的多核苷酸還可以分別被插入在兩種類型的載體中；通過兩種載體的共同轉化作用，可以表達蛋白質複合體。
本發明還涉及以可表達的方式保留載體的本發明轉化體。本發明的載體可以被轉化到任意宿主中，只要宿主能夠以功能性方式保留載體即可。這樣一種可用於該目的的宿主例如包括大腸桿菌。
本發明的腈水合酶、產生該腈水合酶的微生物、本發明的蛋白質複合體、產生該蛋白質複合體的轉化體及其處理產物可用於使用腈化合物作為底物生產醯胺的方法。也就是說，本發明提供生產醯胺的方法，該方法包含使腈化合物與酶活性材料接觸、再回收醯胺的步驟，酶活性材料選自由本發明的腈水合酶、產生該腈水合酶的微生物、本發明的蛋白質複合體、產生該蛋白質複合體的轉化體及其加工產物組成的組。
本文所用的術語「腈水合酶(nitrile hydratase)」表示具有上述物理化學性質(a)和(b)的酶或具有上述物理化學性質(1)-(7)的酶。進而，能夠產生該酶的微生物包括菌株Rhodococcus sp.Cr4(該酶即源於此)、產生本發明酶的屬於紅球菌屬的微生物和含有編碼該酶的多核苷酸的轉化宿主微生物。進而，術語「轉化宿主微生物」表示能夠表達編碼上述α-亞單位的多核苷酸(A)-(E)和/或編碼β-亞單位的多核苷酸(a)-(e)的宿主微生物。上述宿主微生物能夠產生由本發明α-亞單位和β-亞單位組成的本發明蛋白質複合體。
進而，微生物的處理產物具體包括已用洗滌劑或有機溶劑(例如甲苯)處理而改變細胞膜滲透性的微生物、用玻璃珠粒或酶處理而溶解細胞所得無細胞提取物和從該提取物部分純化的材料等。作為替代選擇，酶的處理產物包括與不溶性載體或水性載體分子連接的酶和通過固定包埋而製備的固定化酶分子等。
本發明中，酶活性材料包括所有具有本發明腈水合酶活性的材料。因此，只要材料具有所需的酶活性，它就包括在酶活性材料中，而不管它的酶純度和溶解度。
構成本發明醯胺生產方法的酶反應可以這樣進行，使上述酶活性材料與反應溶液接觸，後者含有腈化合物作為底物。具體而言，酶活性材料可以與底物在水性溶劑、由水性溶劑與水溶性有機溶劑組成的混合溶劑或含有水不溶性溶劑的兩相系統中接觸。水性溶劑包括在中性pH下具有緩衝作用的緩衝液，例如磷酸鹽緩衝液和Tris-HCl緩衝液。作為替代選擇，若在反應期間使用酸和鹼使pH變化能夠在可取的範圍內，則不需要緩衝液。與水不可混溶的有機溶劑例如包括乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、氯仿、正己烷和異辛烷等。反應可以在混合溶劑中進行，其由水性溶劑和有機溶劑組成，後者例如乙醇、丙酮、二甲基亞碸和乙腈。
在兩相系統中，酶活性材料存在於水相中，其中在使用該材料時無需任何其他溶劑或者與水或緩衝液混合。底物化合物可以溶解在水性溶劑中，例如水、緩衝液和乙醇，並供應到反應系統中。在這種情況下，與酶活性材料一起，底物構成單相反應系統。另外，本發明的反應可以利用固定化酶、膜反應釜等進行。此外，本發明的轉化體可以使用培養物、通過過濾、離心等從培養基分離的細胞或者在離心分離和洗滌之後懸浮在緩衝液、水等中的細胞的形式。所分離的細胞可以使用回收時的狀態、破裂的狀態、用丙酮或甲苯處理後的狀態或凍乾產物的狀態。若酶是被細胞外產生的，則還可以在利用通常方法從轉化體分離後使用轉化體的培養基。使酶活性材料與反應溶液接觸的方式不限於這些實施例。反應溶液表示由溶解在適當溶劑中的底物組成的溶液，該溶劑提供適合於酶活性表達的環境。
關於用在使用本發明腈水合酶生產醯胺的方法中的腈化合物的類型沒有限制。例如，下列腈化合物可以用在本發明的方法中。
飽和單腈乙腈、丙腈、丁腈、異丁腈、戊腈、異戊腈、己腈等。
飽和二腈丙二腈、琥珀腈、戊二腈、己二腈等。
α-氨基腈α-氨基丙腈、α-氨基甲硫基丁腈、α-氨基丁腈、氨基乙腈等。
具有羧基的腈氰基乙酸等。
β-氨基腈氨基-3-丙腈等。
不飽和腈丙烯腈、異丁烯腈(methacrylonitrile)、氰基烯丙基、巴豆腈等。
芳族腈苄腈、鄰-、間-與對-氯苄腈、鄰-、間-與對-氟苄腈、鄰-、間-與對-硝基苄腈、對-氨基苄腈、4-氰基苯酚、鄰-、間-與對-甲苯基腈(tolunitrile)、2，4-二氯苄腈、2，6-二氯苄腈、2，6-二氟苄腈、茴香腈、α-萘甲腈、β-萘甲腈、鄰苯二甲腈、間苯二腈、對苯二腈、氰基苄基、苯乙腈等。
α-羥基腈。
本發明中，特別優選的腈化合物包括α-羥基腈化合物。在本發明的醯胺生產方法中，關於α-羥基腈化合物的類型沒有限制。更具體而言，例如可以使用由上式(1)代表的化合物。
式中，R代表取代或未取代的烷基、取代或未取代的鏈烯基、取代或未取代的環烷基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳氧基、取代或未取代的飽和或不飽和的雜環基。從α-羥基腈化合物可以生產α-羥基醯胺。
雜環基包括具有至少一個氮、氧和硫作為雜原子的基團。進而，取代基例如包括烷基、烷氧基、醯基、芳基、芳氧基、滷素(例如氯和溴)、羥基、氨基、硝基、巰基等。
具體而言，例如可以使用下列化合物或其取代產物。本文所用的取代產物表示具有上面例證的取代基的化合物。
乳腈α-羥基-正丙腈α-羥基-正丁腈α-羥基-異丁腈α-羥基-正己腈α-羥基-正庚腈α-羥基-正辛腈α，γ-二羥基-β，β-二甲基丁腈丙烯醛氰醇(acroleincyanohydrin)異丁烯醛氰醇3-氯乙腈4-甲硫基-α-羥基丁腈α-羥基-α-苯基丙醯另外，具有芳族環和雜環的底物化合物包括下列例證性化合物及其取代產物。
扁桃腈(Mandelonitrile)2-噻吩甲醛氰醇2-吡啶甲醛氰醇
2-吡咯甲醛氰醇2-呋喃甲醛氰醇2-萘甲醛氰醇很多由式(1)α-羥基腈化合物代表的腈化合物在極性溶劑中分解為醛和氫氰酸。例如，式(1)α-羥基腈化合物轉化為上式(2)醛和氫氰酸。由於在這些化合物之間建立了平衡狀態，α-羥基腈化合物被酶反應所消耗使平衡向α-羥基腈化合物移動。
另一方面，源於氫氰酸的氰化物和醛可以對酶多肽造成一定損害。因此，由於酶活性降低，以前已知的腈水合酶不能使足量的α-羥基腈化合物水合，從而不會提供足夠產量的產物。不過，本發明的腈水合酶即使在氰化物或醛的存在下也保留了酶活性。因而，該酶能夠採用從醛和氫氰酸產生的腈化合物作為底物。因此，利用生產α-羥基醯胺的本發明方法，可以從由上式(2)代表的醛化合物和氫氰酸供應式(1)化合物。
本發明的醯胺生產方法優選地是在二價金屬離子的存在下進行的。二價金屬離子有助於本發明腈水合酶的活性。優選的二價金屬離子包括鎳離子和鈷離子。可以向反應溶液加入這些離子的適當的含水鹽。具體而言，可以加入該離子的氯化物鹽。
本發明中，腈化合物的水合作用或水解作用可以這樣實現，使本發明的酶活性材料與底物化合物或由式(2)代表的醛與氫氰酸混合物接觸，該混合物能夠在水性溶劑(例如水或緩衝液)中轉化為底物化合物。反應溶液優選地含有二價金屬離子。
本文所用的術語「水合作用」表示水分子附加於腈基的反應。與「水合作用」相對照，術語「水解作用」表示這樣的反應，其中從取代基與腈基連接的化合物中，取代基被水解作用裂解除去。兩種反應都包括在本發明的醯胺生產方法中。
關於反應溶液中底物化合物的濃度沒有限制。為了防止酶活性被底物化合物所抑制，在α-羥基腈的情況下，濃度例如可以相當於0.1-10w/w％，這是一般而言，優選0.2-5.0w/w％。底物可以在反應開始時一次性加入，但是優選的是連續地或不連續地加入底物，以防止底物濃度過高。
若底物腈化合物在水性溶劑中的溶解度過低，則可以向反應溶液加入洗滌劑。可以使用0.1-5.0w/w％Triton X-100或Tween 60作為洗滌劑。為了增加底物溶解度，可以有效地使用含有有機溶劑的混合溶劑。具體而言，例如通過加入甲醇、乙醇、二甲基亞碸等可以提高反應效率。作為替代選擇，本發明的反應可以在不溶於水的有機溶劑中或由水性溶劑與不溶於水的有機溶劑組成的兩相系統中進行。可用的與水不可混溶的有機溶劑例如包括乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、氯仿、正己烷、環己烷、辛烷或1-辛醇等。
若底物濃度落在上述範圍內，則使用本發明的腈水合酶能夠實現有效的酶反應，酶濃度例如是1mU/mL-100U/mL，優選100mU/mL或更高。進而，若使用微生物細胞作為酶活性材料，微生物的用量相對於底物而言優選地從0.01至5.0w/w％，以幹細胞計。酶活性材料、例如酶和細胞可以這樣與底物接觸，將它們溶解或分散在反應溶液中。作為替代選擇，有可能使用被化學連接或包埋技術所固定的酶活性材料。進而，反應可以在這樣一種狀態中進行，其中底物溶液與酶活性材料是用多孔性膜隔離開的，該膜允許底物滲透，但是限制酶分子或細胞的滲透。
反應通常可以在凝固點至-50℃、優選10-30℃的溫度下進行0.1-100小時。關於反應溶液的pH沒有限制，只要能夠維持酶活性即可。由於本發明腈水合酶的最佳pH是5.5至6.5，優選的是調節反應溶液的pH在該範圍內。
因而，腈化合物被微生物的水合作用或水解作用轉化為對應的醯胺，蓄積在反應溶液中。利用適當的方法可以從反應溶液回收和純化所產生的醯胺。具體而言，例如聯合採用典型方法可以回收和純化醯胺，例如超濾、濃縮、柱色譜、萃取、活性炭處理、蒸餾等。
本發明提供在腈化合物的存在下使腈水合酶活性穩定的方法，其中該方法是以二價金屬離子的共存為特徵的。進而，本發明提供生產醯胺的方法，該方法包含在二價金屬離子的存在下使腈水合酶與腈化合物反應、再回收所產生的醯胺的步驟。
本發明基於這樣的發現，反應系統中二價金屬離子的存在顯著抑制腈水合酶活性的降低。本發明中，關於腈水合酶的來源沒有限制。也就是說，可以使用任何酶，只要該酶具有作用於並使腈化合物腈基水合和轉化腈基為醯胺基的活性即可。使α-羥基腈水合為對應的醯胺的腈水合酶是本發明中優選的酶。
可以假定，本發明的二價金屬離子實現了抑制腈水合酶活性降低的效果，機理例如如下首先，金屬離子與底物化合物的氰醇(cyanohydrin)結構結合，可以增強酶反應。其次，金屬離子的結合可以防止氰醇離解。其結果是，減少了反應溶液中氰化物離子的濃度。由於減少了氰化物離子濃度也降低了對酶的抑制作用，也就提高了酶活性。
無論如何，假定這些現象不是特定腈水合酶所特有的，而是普遍見於具有氰醇結構的底物化合物的使用中。這就是為什麼關於用在使本發明腈水合酶活性穩定的方法或生產醯胺的方法中的腈水合酶的來源沒有限制的原因。
已知能夠使腈化合物水合為對應醯胺的酶例如包括源於下列微生物的酶(參見JP-A平04-040899)。
紅球菌屬棒桿菌屬假單胞菌屬分節孢子菌屬產鹼桿菌屬芽孢桿菌屬炭疽芽孢桿菌(Bacteridium)屬微球菌屬短桿菌屬諾卡氏菌屬更具體而言，微生物例如包括如下紫紅紅球菌ATCC33278紅串紅球菌IFO12320Corynebacterium nitrilophilus ATCC21419假單胞菌SK87(FERMP-11311)節桿菌(Arthrobacter sp.)HR1(FERM BP-3323)產鹼桿菌(Alcaligenes sp.)BC 16-2(FERM BP-3321)紅球菌(Rhodococcus sp.)HT40-6(FERM P-11774)JP-B昭62-21519所述微生物其他微生物是公知的，可得自American Type Culture Collection(ATCC)；Institute of Applied Microbiology(IAM)，The University of Tokyo；Fermentation Research Institute，the Agency of Industrial Science andTechnology；KAKEN PHARMACEUTICAL Co.(KCC)；Institute forFermentation，Osaka(IFO)；RESEARCH CENTER FOR PATHOGENICFUNGI AND MICROBIAL TOXICOSES(IFM)，The University of Chiba。另外，能夠從上述紅球菌Cr4(FERMBP-6596)得到的本發明腈水合酶也是本發明優選的酶之一。
關於用在本發明醯胺生產方法中的腈化合物沒有限制。更具體而言，優選的底物例如包括上面關於利用本發明腈水合酶生產α-羥基醯胺的方法所述化合物。
還有可能適宜地僅生產α-羥基醯胺或α-羥基酸的兩種旋光活性異構體之一，在反應中使用能夠立體定向性使腈水合或水解的酶或含有該酶的微生物。因而，利用本發明的方法，能夠得到立體專一性α-羥基醯胺或α-羥基酸，要比以前通過旋光拆分或外消旋化步驟的生產方法更有利得多。
本發明中，腈化合物的水合作用或水解作用例如是這樣進行的，使腈水合酶與由式(1)代表的α-羥基腈在水性溶劑中接觸，溶劑例如水或緩衝液。若所用腈水合酶對氰化物和醛是耐受性的，反應還可以在由式(2)代表的醛和氫氰酸的存在下進行，它們可以轉化為α-羥基腈。除了純化的酶以外，腈水合酶還可以是能夠產生該酶的微生物的溶胞產物、粗酶或使材料固定化所得產物。進而，在本發明中，可以在反應溶液中加入二價金屬離子，濃度為0.1mM-1M，一般0.5-100mM，優選1-10mM。
關於用在本發明中的金屬離子的類型沒有限制，只要該離子能夠有效保持腈水合酶的活性即可。例如，鈷離子和鎳離子是優選的金屬離子，它們能夠保持腈水合酶的高活性。可以在反應溶液中加入這些金屬離子的鹽，例如氯化物鹽。
本發明中，可以適當調整反應條件，這取決於除了二價金屬離子的存在以外，還與腈水合酶聯合使用的底物化合物的性質。關於用在反應中的底物化合物的類型和反應條件沒有限制。具體而言，例如可以基於使用上述本發明腈水合酶生產α-羥基醯胺的方法所述例證性條件調整反應系統。
本文引用的所有專利、專利申請和出版物都引用在此作為參考。
本文中，關於濃度的「％」表示重量/體積百分率，另有指定除外。


圖1顯示利用SDS-PAGE測定本發明腈水合酶的分子量。橫坐標表示相對遷移率，縱坐標表示分子量(kDa)。
圖2顯示利用柱色譜、用丁基-Toyopearl650M洗脫本發明腈水合酶。白方形(□)代表OD280，實心圓(●)代表活性，連字符(-)代表(NH4)2SO4。
圖3顯示利用凝膠過濾測定本發明腈水合酶的分子量。橫坐標表示保留時間(分鐘)，縱坐標表示分子量(kDa)。
圖4顯示本發明腈水合酶關於HMBN的Km值，這是用S-V繪圖測定的。
圖5顯示本發明腈水合酶關於HMBN的Km值，這是用Lineweaver-Burk繪圖測定的。
圖6顯示本發明腈水合酶關於3-氰基吡啶的Km值，這是用S-V繪圖測定的。
圖7顯示本發明腈水合酶關於3-氰基吡啶的Km值，這是用Lineweaver-Burk繪圖測定的。
圖8顯示溫度對本發明腈水合酶活性的影響。
圖9顯示本發明腈水合酶的熱穩定性。
圖10顯示pH對本發明腈水合酶活性的影響。
圖11顯示本發明腈水合酶的pH穩定性。
圖12顯示紅球菌Cr4中基因簇的組織化。由大寫字母表示的核苷酸序列相當於ORF。由ORF編碼的亞單位名稱顯示在核苷酸序列右側。
圖13顯示在來自紅球菌Cr4與紫紅紅球菌J1的腈水合酶α-亞單位之間的胺基酸對比。在紅球菌Cr4(頂行；CrNH-α)與紫紅紅球菌J1(底行；J1 L-α)之間，相同的胺基酸由星號代表，不同的胺基酸由空格代表。
圖14顯示在來自紅球菌Cr4與紫紅紅球菌J1的腈水合酶β-亞單位之間的胺基酸對比。在紅球菌Cr4(頂行；CrNH-β)與紫紅紅球菌J1(底行；J1 L-β)之間，相同的胺基酸由星號代表，不同的胺基酸由空格代表。
具體實施例方式
下面參照實施例詳細闡述本發明，但是本發明不被解釋為僅限於此。
1、酶活性測定方法在下列實施例中採用腈水合酶活性的標準測定方法，如下。用於酶反應的反應溶液的標準組成如表1和2所示。加入3-氰基吡啶或2-羥基-4-甲硫基丁腈(HMBN)作為底物化合物，引發酶反應。在3-氰基吡啶的情況下，在20℃下培育10分鐘，在HMBN的情況下，在20℃下培育15分鐘。在反應中使用3-氰基吡啶時，向反應加入0.1ml 2N鹽酸，劇烈搖動混合物以終止反應；在反應中使用HMBN時，將0.1ml反應溶液加入到0.9ml 0.1％(v/v)磷酸中，劇烈搖動混合物以終止反應。利用HPLC分析反應溶液。
表1含10％(v/v)HMBN的0.1M KPB(pH 6.5) 0.36ml0.1M KPB(pH 6.5)0.64ml酶溶液 0.10ml0.85％(w/v)NaCl水溶液 0.90ml總體積 2.00ml→加入10％(v/v)HMBN，引發反應。
→在搖動的同時，將混合物在20℃下培育10分鐘。
→加入0.1％(v/v)H3PO4，終止反應。
→離心。
→HPLC分析。
表20.3M 3-氰基吡啶 1.00ml0.1M KPB(pH 7.0) 0.50ml酶溶液0.10ml0.85％(w/v)NaCl水溶液(NaClaq) 0.90ml
總體積 2.00ml→加入 0.3M 3-氰基吡啶，引發反應。
→在搖動的同時，將混合物在20℃下培育3分鐘。
→加入2N HCl，終止反應。
→離心。
→HPLC分析。
用於反應溶液的HPLC分析條件用於HMBN的HPLC分析條件如下柱子 Spherisorb S5ODS2(4.6×150nm)移動相 0.1％(v/v)磷酸/乙腈＝9/1流速 1.0ml/min檢測 UV 210nm柱溫 40℃關於酶活性的HPLC分析利用HPLC量化所產生的煙醯胺或HMBAm，計算腈水合酶活性。關於HMBAm的HPLC測定條件與HMBN相同。1U被定義為在20℃下1分鐘，用標準組成的反應溶液能夠產生1μmol煙醯胺的酶量；或者1U被定義為在20℃下1分鐘，用標準組成的溶液能夠產生1μmolHMBAm的酶量。
蛋白質定量利用來自Bio-Rad的蛋白質測定試劑盒，按照Bradford法測定蛋白質的量(Bradford，M.，Anal，Biochem.，72，248(1976))。
試劑所用DEAE-Sephacel和丁基-Toyopearl 650M由Pharmacia提供；牛血清白蛋白來自Bio-Rad；用於SDS-PAGE的分子量標記來自Pharmacia；用於HPLC的分子量標記來自Oriental Yeast。除非另有指定，其他所用試劑是商業上可得到的專用試劑。
2、培養條件將組成如下的預培養基每5ml等量分配在每支試管(25×200mm)內；將矽酮塞置於試管內，然後高壓滅菌。試管冷卻後，用鉑環接種菌株，然後在28℃下搖動培養兩天。
預培養基(pH 7.0)聚腖 5.0g肉膏 5.0gNaCl 2.0g酵母提取物 0.5g蒸餾水 1.0L然後，將預培養物轉移至在500ml Sakaguchi燒瓶內高壓滅菌過的20ml主培養基。在主培養物中，在培養24小時後用加料針頭加入0.75％(v/v)乙腈，然後繼續在33℃下搖動培育兩天。
主培養基(pH 7.0)乙醯胺 7.5g葡萄糖 10.0gC.S.L. 10.0g酵母提取物 1.0gMgSO4.7H2O 0.5gK2HPO41.0gCoCl2.6H2O 20.0mg蒸餾水 1.0L3、無細胞提取物的製備將相當於500ml培養液的細菌細胞以5倍高的細胞密度懸浮在50mM磷酸鹽緩衝液/44mM正丁酸(pH 7.0)中。將所懸浮的細菌細胞在4℃或更低溫度下用150W聲波處理器201M(Kubota)勻化60分鐘。然後，在13,000rpm下離心20分鐘，將培養物分離為上清液和沉澱部分。上清液用作下列純化中的無細胞提取物。
4、硫酸銨級分向無細胞提取物加入硫酸銨到30％飽和度。將混合物用10％(v/v)氨水中和至pH 7.0，然後在4℃下攪拌三小時。然後在13,000rpm下離心30分鐘，將溶液分離為上清液和沉澱部分。向上清液部分加入硫酸銨到60％飽和度。將混合物中和至pH 7.0，然後在4℃下攪拌三小時。然後通過離心將溶液分離為上清液和沉澱部分。進而，向上清液部分加入硫酸銨到80％飽和度。攪拌後，將溶液分離為上清液和沉澱部分。將各沉澱懸浮在10mM磷酸鹽緩衝液/44mM正丁酸(pH 7.0)中。使溶液對相同緩衝液透析三次。然後測定活性。
5、DEAE-Sephacel柱色譜將已被相同緩衝液充分透析的酶溶液上柱到用10mM磷酸鹽緩衝液/44mM正丁酸(pH 7.0)充分平衡過的柱子(φ13×216mm)。然後將柱子用相同緩衝液洗滌。然後，用下列洗脫緩衝液進行洗脫，評估各部分的酶活性。在用10mM磷酸鹽緩衝液/44mM正丁酸(pH 7.0)/0.3M KCl洗脫時，在第74-80號級分見到腈水合酶活性。每次所用洗脫緩衝液的體積大約是載體體積的3倍。
10mM磷酸鹽緩衝液/44mM正丁酸(pH 7.0)/0.1M KCl10mM磷酸鹽緩衝液/44mM正丁酸(pH 7.0)/0.2M KCl10mM磷酸鹽緩衝液/44mM正丁酸(pH 7.0)/0.3M KCl10mM磷酸鹽緩衝液/44mM正丁酸(pH 7.0)/0.4M KCl6、丁基-Toyopearl 650M柱色譜將含有丁基-Toyopearl的柱子(φ11×89mm)用含有20％飽和度硫酸銨的10mM磷酸鹽/44mM正丁酸緩衝液(pH 7.0)充分平衡。向酶溶液加入20％飽和度硫酸銨，攪拌混合物。將酶溶液裝上該柱子。將柱子用相同緩衝液洗滌。然後，用下列洗脫緩衝液進行洗脫，評估各部分的酶活性。在用10mM磷酸鹽緩衝液/44mM正丁酸(pH 7.0)/15％飽和度硫酸銨洗脫時，在第58-66部分見到腈水合酶活性。每次所用洗脫緩衝液的體積大約是載體體積的3倍。
10mM磷酸鹽緩衝液/44mM正丁酸(pH 7.0)/15％飽和度硫酸銨10mM磷酸鹽緩衝液/44mM正丁酸(pH 7.0)/10％飽和度硫酸銨10mM磷酸鹽緩衝液/44mM正丁酸(pH 7.0)/5％飽和度硫酸銨7、SDS-PAGE利用SDS-PAGE分析所得純化的酶。SDS-PAGE是按照Laemmli的方法進行的(Laemmli，U.K.Nature，227，pp680，1970)。也就是說，在含有Tris/甘氨酸緩衝液的12％聚丙烯醯胺平板凝膠中進行電泳。將酶溶液與樣本緩衝液的等體積混合物在90℃下加熱處理約10分鐘。將凝膠用庫馬斯豔藍R-250染色；退色是用乙醇/乙酸/dH2O(體積比2/3/6)進行的。結果如圖1所示。揭示了純化的酶由α-亞單位(26.8kDa)和β-亞單位(29.5kDa)組成。
8、HPLC凝膠過濾按照上述方法純化腈水合酶。首先，通過離心將勻化的細菌細胞懸液分離為上清液和沉澱部分。在上清液部分中含有活性，因而使用上清液作為無細胞提取物。將無細胞提取物用硫酸銨級分，其結果是在硫酸銨濃度為30-60％飽和度的級分中含有活性。對活性級分進行DEAE-Sephacel柱色譜。收集從DEAE-Sephacel柱洗脫的活性級分(No.74-80)，然後進行丁基-Toyopearl 650M柱色譜。使用從丁基-Toyopearl650M柱洗脫的活性級分(No.58-66)作為純化的酶(圖2)。
最後，關於紅球菌Cr4的腈水合酶，總蛋白質含量為5.32mg；比活性477U/mg；收率44％；比活性13.9倍(表3)。純化的酶被SDS-PAGE評估為同源的。在標準條件下，最終純化的酶的比活性關於用作底物的HMBN是880U/mg，關於3-氰基吡啶是477U/mg。
表3步驟 總蛋白質 總活性 比活性 純化 收率(mg) (U)(U/mg) (倍數) (％)1.無細胞提取物 167 5740 34.4 11002.(NH4)2SO4級分56.6 5220 92.2 2.68 913.DEAE-Sephacel18.7 4030 2156.25 704.丁基-Toyopearl 650M 5.32 2540 47713.9 441U酶被定義為在1分鐘內，在標準條件下，從3-氰基吡啶(cyanopyridine)催化產生1μmol煙醯胺(nicotinamide)的量。
在表4所示條件下利用凝膠過濾分析約2.3μg純化酶，以測定分子量；基於分子量標記的保留時間計算，推斷酶在自然狀態下的分子量為約112.5kDa(圖3)。
HPLC凝膠過濾用於腈水合酶分子量的HPLC分析條件如表4所示。所用分子量標記來自Oriental Yeast。
表4
柱子TSK凝膠G-3000SW(0.75×60cm)溶劑0.1M KPB(pH 7.5)+0.2M KCl流速0.7ml/min注射5μl檢測280nm9、底物濃度的影響(Km值)利用S-V繪圖(圖4)和Lineweaver-Burk繪圖(圖5)測定關於HMBN的Km值。向含有不同濃度HMBN的溶液加入0.0585U酶，在20℃下培育15分鐘。利用HPLC分析反應。利用Lineweaver-Burk繪圖測定關於HMBN的Km值為1.43mM，這表明酶對HMBN具有很高的親合性。
另外，利用S-V繪圖(圖6)和Lineweaver-Burk繪圖(圖7)測定關於3-氰基吡啶的Km值。類似地，向含有不同濃度3-氰基吡啶的溶液加入0.0265U酶，在20℃下培育15分鐘。利用HPLC分析反應。利用Lineweaver-Burk繪圖測定關於3-氰基吡啶的Km值為1.38mM，這表明酶對3-氰基吡啶也具有很高的親合性。
10、溫度的影響評價了純化酶的最佳溫度和熱穩定性。利用如表1所示標準組成的反應溶液，將2.92U酶在每種溫度下(10、20、30、35、40、45、50、55、60或65℃)培育15分鐘，以評估最佳溫度(圖8)。在45℃下，酶反應速率最大。進而，將2.92U酶在每種溫度下(10、20、30、40、50或60℃)加熱處理30分鐘，然後在標準反應條件下評估熱穩定性。將酶在50℃下處理後，剩餘活性為77％(圖9)。
11、pH的影響評價了純化酶的最佳pH和pH穩定性。利用如表1所示標準組成的反應溶液，將2.92U酶在20℃每種緩衝液中(檸檬酸鈉或Tris-HCl緩衝液，最終濃度為50mM)培育15分鐘，代替磷酸鹽緩衝液，以測定最佳pH。最佳pH為6.0(圖10)。
進而，將2.92U酶在20℃每種緩衝液中(檸檬酸鈉、磷酸鹽緩衝液、Tris-HCl、甘氨酸/NaOH或Na2HPO4/NaOH緩衝液，最終濃度為50mM)培育30分鐘，然後在標準反應條件下測定剩餘活性，以評估pH穩定性。將酶在pH 4.0-9.0下處理30分鐘後，剩餘活性幾乎為100％(圖11)。
12、底物特異性檢查了酶的底物特異性。利用如表2所示標準組成反應溶液，將2.92U酶與各種類型底物培育，代替3-氰基吡啶；利用HPLC分析反應溶液中醯胺的產生。因而，測定相對活性。所加入的底物化合物類型、其最終濃度、反應時間和用於分析對應於各底物的產物的HPLC條件如表6所示。HPLC條件(1)-(9)列在表6之後。
純化的腈水合酶顯示底物特異性，與休息細胞反應非常相似；丙二腈、正丁腈和2-氰基吡啶是適合的底物。關於HMBN的相對活性是154％，關於3-氰基吡啶的活性被視為100％(表5)。
表5底物 相對活性(％) 底物 相對活性(％)3-氰基吡啶 1003-氰基吡啶*76.52-氰基吡啶 223正丁腈*3794-氰基吡啶 127異丁腈*40.9丙烯腈 114正戊腈*118異丁烯腈 93.7 異戊腈*2.71巴豆腈 87.4 正己腈*18.1乙腈 14.6 3-吲哚基乙腈*2.33丙腈 173苄腈*138HMBN 154鄰-氯苄腈*58.6KCN0 間-氯苄腈*7.18丙二腈 673對-氯苄腈*28.46.162-氰基乙醯胺 46.3氰基吡嗪 114反應在20℃下進行，酶的用量為2.92U。星號「*」表示加入甲醇以提高底物溶解度(最終濃度＝20％v/v)。
表6底物 最終濃度(mM) 反應時間(min) HPLC條件
3-氰基吡啶15015(1)3-氰基吡啶*15015(1)2-氰基吡啶12510(1)4-氰基吡啶12510(1)丙烯腈2503 (5)異丁烯腈 1505 (1)巴豆腈1505 (1)乙腈 25010(4)丙腈 1505 (4)正丁腈*15010(2)苄腈*50 10(3)鄰-氯苄腈*25 5 (3)間-氯苄腈*25 5 (3)對-氯苄腈*25 5 (3)丙二腈2503 (6)異丁腈*15010(7)正戊腈*15010(7)異戊腈*15010(7)正己腈*15010(9)氰基吡嗪 15010(8)3-吲哚基乙腈*50 5 (9)HPLC條件如下(1)柱子Waters Spherisorb 5μODS2(4.6×150mm)；溶劑10mM KH2PO4(pH 2.8)/乙腈(v/v)＝9∶1；流速1.0ml/min；檢測230nm；注射體積5μl。
(2)柱子Waters Spherisorb 5μODS2(4.6×150mm)；溶劑10mM KH2PO4(pH 2.8)/乙腈(v/v)＝9∶1；流速1.0ml/min；檢測230nm；
注射體積5μl。
(3)柱子Waters Spherisorb 5μODS2(4.6×150mm)；溶劑5mM KH2PO4(pH 2.8)/乙腈(v/v)＝12∶7；流速1.0ml/min；檢測230nm；注射體積5μl。
(4)柱子Waters Spherisorb 5μODS2(4.6×150mm)；溶劑10mM KH2PO4(pH 2.5)/乙腈(v/v)＝99∶1；流速1.0ml/min；檢測210nm；注射體積5μl。
(5)柱子Waters Spherisorb 5μODS2(4.6×150mm)；溶劑10mM KH2PO4(pH 2.5)/乙腈(v/v)＝99∶1；流速1.0ml/min；檢測230nm；注射體積5μl。
(6)柱子Spherisorb S5ODS2(4.6×150mm)；溶劑0.1％(v/v)磷酸鹽/乙腈(v/v)＝99∶1；流速1.0ml/min；檢測210nm；注射體積5μl。
(7)柱子Spherisorb S5ODS2(4.6×150mm)；溶劑0.1％(v/v)磷酸鹽/乙腈(v/v)＝9∶1；流速1.0ml/min；檢測210nm；注射體積5μl；溫度40℃。
(8)柱子Spherisorb S5ODS2(4.6×150mm)；溶劑0.1％(v/v)磷酸鹽/乙腈(v/v)＝9∶1；流速1.0ml/min；檢測230nm；
注射體積5μl；溫度40℃。
(9)柱子Spherisorb S5ODS2(4.6×150mm)；溶劑5mM KH2PO4(pH 2.8)/乙腈(v/v)＝12∶7；流速1.0ml/min；檢測210nm；注射體積5μl；溫度40℃。
13、抑制劑對酶活性的影響研究了酶的抑制劑。利用如表1所示標準組成的反應溶液，向含有2.92U酶的溶液加入各種抑制劑，最終濃度為1.0mM或0.1mM；將混合物在20℃下培育10分鐘後，進行15分鐘反應。酶活性顯著被羰基試劑所抑制，例如苯肼和羥胺(表7)。
表7各種化合物對腈水合酶活性的影響化合物(1.0mM) 相對活性(％)游離 100碘乙酸酯 97.0N-乙基馬來醯亞胺 101對-氯汞基苯甲酸酯 97.75-5』-dithiobis(0.1mM)99.1羥胺 62.1苯肼 8.19半胱胺106D-環絲氨酸94.8EDTA 101鈦試劑(Tiron) 132二硫代氨基甲酸二乙酯 97.7尿素 95.7NaN398.5二硫蘇糖醇93.4
將酶與各種化合物在20℃下培育20分鐘，測定酶活性。
14、金屬離子對酶活性的影響研究了金屬離子對酶反應的影響。利用如表1所示標準組成的反應溶液，向含有2.92U酶的溶液加入各種金屬離子，最終濃度為1.0mM；將混合物在20℃下培育10分鐘後，進行15分鐘反應。酶活性顯著被重金屬離子所抑制，例如能夠特異性相互作用於SH基的Ag+和Hg++離子。相反，Ni++或Co++離子的加入提高酶活性(表8)。
表8金屬離子對腈水合酶活性的影響金屬(1.0mM) 相對活性(％)游離100CaCl296.4MnCl296.7NiCl2196CoCl2154ZnSO484.1CuSO4109FeSO478.9FeCl3100AgNO37.85HgCl27.48將酶與金屬離子在20℃下培育10分鐘，測定酶活性。
15、共存的Ni++和Co++離子對酶活性的影響已經揭示了向反應系統加入Ni++或Co++離子可提高酶活性。利用如表1所示標準組成的反應溶液，向含有2.92U酶的溶液加入Ni++或Co++離子，濃度為0-8.0mM；研究它對酶活性的影響。在加入1.0-2.0mM濃度的Ni++或Co++離子時，酶活性提高2倍或1.5倍。隨著加入高於上述濃度的金屬離子，這種提高作用削弱了(表9和10)。
表9鈷離子對腈水合酶活性的影響CoCl2(mM) 相對活性(％)
0 1000.5 1291.0 1502.0 1534.0 1436.0 1368.0 127將酶與鎳離子在20℃下培育5分鐘，測定酶活性。
表10NiCl2(mM)相對活性(％)0 1000.5 1711.0 1972.0 1964.0 1956.0 1848.0 185將酶與鎳離子在20℃下培育5分鐘，測定酶活性。
16、共存Ni++離子的影響如表10所示，向反應系統加入1.0mM濃度的Ni++離子可提高兩倍本發明腈水合酶的酶活性。然後，利用如表2所示標準組成的反應溶液，向含有2.92U酶的溶液加入各種類型底物，代替3-氰基吡啶，以研究它們對活性的影響。在使用HMBN或扁桃腈作為底物時，活性僅提高兩倍。假定在底物是α-羥基腈時，Ni++離子的加入特異性地提高反應效率(表11)。
表11底物 游離 NiCl2(1mM)HMBN 100 1963-氰基吡啶 100 992-氰基吡啶 100 974-氰基吡啶 100 99
正丁腈 100 94巴豆腈 100 103(chlotononitrilile)扁桃腈 100 201(manderonitlile)乙烯氰醇 100 91氨基乙腈 00羥乙腈 003-氨基丙腈 100 97β-氨基巴豆腈00使用2.92U酶，在20℃下延長培育10分鐘。
17、N-末端胺基酸序列的測定在Applied Biosystem的470A型Procise序列分析儀中分析來自紅球菌Cr4菌株的腈水合酶的α-亞單位和β-亞單位的N-末端胺基酸序列。α-亞單位的N-末端15個殘基是TAHNPVQGTFPRSNE(SEQ ID NO5)，β-亞單位的是MDGIHDLGGRAGLGP(SEQ ID NO6)。
與來自紫紅紅球菌J1菌株的低分子量腈水合酶對比，α-亞單位的N-末端15個殘基序列表現93％同一性，β-亞單位的表現100％同一性(表12/α-亞單位；表13/β-亞單位)。
表12菌株N-末端胺基酸序列 同一性(％)紅球菌Cr4 1 TAHNPVQGTFPRSNE 15 -紫紅紅球菌J1(低)1 TAHNPVQGTLPRSNE 15 93枯草芽孢桿菌211 VVSNPLAGSRPRSND 225 47表13菌株N-末端胺基酸序列 同一性(％)紅球菌Cr4 1 MDGIHDLGGRAGLGP 15 -紫紅紅球菌J1(低)1 MDGIHDLGGRAGLGP 15 100紫紅紅球菌J1(高)1 MDGIHDTGGMTGYGP 15 73惡臭假單胞菌1 MNGIHDTGGAHGYGP 15 67綠針假單胞菌B23 1 MDGFHDLGGFQGFGK 15 67
19、共存的NiCl2和CoCl2對休息細胞反應(resting cell reaction)的影響將下列組成的預培養基每5ml等量分配到每支試管(25×200mm)內；將矽酮塞置於試管內，然後高壓滅菌。
預培養基(pH 7.0)聚腖 5.0g肉膏 5.0gNaCl 2.0g酵母提取物 0.5g蒸餾水 1.0L試管冷卻後，將紅球菌Cr4或紫紅紅球菌ATCC 332878菌株用鉑環接種在預培養基中，然後在28℃下搖動培養兩天。然後，將紅球菌Cr4的預培養物轉移至主培養基1；將紫紅紅球菌ATCC 332878的預培養物轉移至主培養基2。將二者在33℃下搖動培養兩天。收穫細菌細胞，洗滌，然後進行如表14所示反應，以研究所加入的NiCl2和CoCl2的影響。
在向反應系統加入1mM最終濃度的NiCl2或CoCl2時，見表15，共存的NiCl2或CoCl2提高腈水合酶活性，因而這些離子的加入具有積極影響。
主培養基1(用於紅球菌Cr4)(pH 7.0)乙醯胺7.5g葡萄糖10.0gC.S.L.10.0g酵母提取物1.0gMgSO4.7H2O 0.5gK2HPO41.0gCoCl2.6H2O 10.0mgFeSO4.7H2O 10.0mg蒸餾水1L主培養基2(用於紫紅紅球菌ATCC 332878)(pH 7.0)ε-己內醯胺 5.0g葡萄糖10.0g
C.S.L.10.0g酵母提取物1.0gMgSO4.7H2O 0.5gK2HPO41.0gCoCl2.6H2O 20.0mg蒸餾水1L將每種培養基每20ml等量分配到500ml Sakaguchi燒瓶內，在高壓滅菌後使用。
表14含10％(v/v)HMBN的0.1M KPB(pH 6.5) 0.36ml0.1M KPB(pH 6.5) 0.64ml細胞懸浮溶液(最終0.5倍) 0.10ml0.85％(w/v)NaCl水溶液 0.90，0.80ml20mM NiCl2或CoCl20.00，0.10ml總體積 2.00ml→加入HMBN(反應開始)。
→將混合物在20℃下搖動培育15分鐘。
→加入0.1％(v/v)H3PO4(反應終止)。
→離心。
→HPLC分析。
表15相對活性(％)紅球菌Cr4 ATCC 332878游離 100*100**NiCl2186 193CoCl2137 123*118μmol/ml/min**30.5μmol/ml/min在休息細胞反應中，加入NiCl2或CoCl2也提高了酶活性。
20、氰化物離子的影響研究了氰化物離子對源於紅球菌Cr4的本發明腈水合酶和源於紫紅紅球菌J1的已知腈水合酶(Biochimica et Biophysica Acta.1129(1991)23-33)的影響。利用下列標準組成的反應溶液，向反應系統加入0mM-20mM氰化物離子(KCN)。在沒有底物(3-氰基吡啶)的存在下，將反應溶液在20℃下培育30分鐘後，向其中加入底物，引發酶反應。酶在20℃下反應10分鐘後，向其中加入0.1ml 2N鹽酸，劇烈搖動混合物，以終止反應。利用與第1節所述相同的方法，用HPLC分析反應溶液。
標準反應溶液0.5M 3-氰基吡啶 0.5ml0.1M磷酸鹽緩衝液(pH 7.5) 0.25ml酶溶液 0.1ml總體積 1.0ml在紅球菌Cr4腈水合酶的情況下，酶的用量為288U/ml；在紫紅紅球菌J1腈水合酶的情況下，酶的用量為61U/ml。見表16，紫紅紅球菌J1的腈水合酶在lmM氰化物離子的存在下被完全抑制了，但是紅球菌Cr4的腈水合酶在1mM氰化物離子的存在下保留47％的活性，在5mM氰化物離子的存在下保留17％的活性。
表16KCN(mM) Cr4J10 100％ 100％1 47 05 17 01011 0158 0203 021、N-末端胺基酸序列的測定對從紅球菌Cr4純化的腈水合酶進行SDS-PAGE。將蛋白質用AE6678-P型Horiz-Blot電泳儀(ATTO)電轉移至PVDF膜上，然後用醯胺黑染色。切下對應於α-亞單位和β-亞單位的部分，在473A型氣相肽序列分析儀(Applied Biosystem)中對每種亞單位蛋白質進行自動埃德曼降解，從而得到PTH胺基酸衍生物。在120A型PTH胺基酸衍生物分析儀(Applied Biosystem)中分析α-亞單位和β-亞單位的N-末端胺基酸序列。
α-亞單位的N-末端序列是TAHNPVQGTFPRSNE(SEQ ID NO5)；β-亞單位的是MDGIHDLGGRAGLGPI(SEQ ID NO7)。與來自紫紅紅球菌J1的低分子量腈水合酶的α-亞單位的N-末端序列對比，α-亞單位的序列表現93％的同一性(L位於J1中的胺基酸殘基10)；β-亞單位與來自紫紅紅球菌J1的等價物表現100％的同一性。
因而，來自紫紅紅球菌J1的腈水合酶α-亞單位和β-亞單位的N-末端胺基酸序列幾乎等同於來自紅球菌Cr4的。進而，已知前人報導的腈水合酶的α-亞單位共享高度同源性一級結構。因而，使用來自紫紅紅球菌J1腈水合酶α-亞單位的基因片段作為探針DNA，進行Rhodococcus sp.Cr4的腈水合酶基因的克隆。進而，來自紫紅紅球菌J1腈水合酶β-亞單位的基因片段用於評價紅球菌Cr4腈水合酶基因的完整區域是否被成功地克隆。
22、探針DNA的製備在紫紅紅球菌J1中存在兩種類型的腈水合酶，也就是低分子量形式和高分子量形式。因此，首先選擇紫紅紅球菌J1中低分子量腈水合酶基因的一級結構區域，其序列不同於高分子量形式的對應區域。具體而言，所選擇的各胺基酸序列如下所述。
α-亞單位有義引物區(sense primer region)QGTLPRSN(SEQ ID NO8)反義引物區(antisense primer region)PDPDVEIR(SEQ ID NO9)β-亞單位有義引物區PHDYLTSQ(SEQ ID NO10)反義引物區PNVVNHID(SEQ ID NO11)然後，基於胺基酸序列，真正設計用於特異性擴增一部分低分子量腈水合酶基因的PCR引物。最後，設計包含下列核苷酸序列的引物。
用於擴增的α-亞單位基因片段有義引物5′-cagggcacgttgccacgatcg-3′(SEQ ID NO12)反義引物5′-cggatctcgacgtcagggtcg-3′(SEQ ID NO13)
用於擴增的β-亞單位基因片段有義引物5′-cgcacgactacctgacctcgc-3′(SEQ ID NO14)反義引物5′-cgatgtgattgactacgttcgg-3′(SEQ ID NO15)然後，按照Ausbel等的方法從紫紅紅球菌J1製備基因組DNA(Ausbel，FM et alUNIT 2.4，Preparation of Genomic DNA from Bacteria inCurrent Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons，New York)1987)。進而，利用相同的方法還從紅球菌Cr4的培養細胞製備基因組DNA。
利用PCR擴增紫紅紅球菌J1的一部分低分子量腈水合酶基因，使用Taq DNA 30(Takara Shuzo)和下列循環在94℃下變性1分鐘，在60℃下退火90秒鐘，在72℃下延長90秒鐘，使用10ng所得基因組DNA作為模板。對擴增後的DNA片段進行瓊脂糖凝膠電泳，然後使用RECOCHIP(Takara Shuzo)從凝膠收集之。
使用用於α-亞單位基因片段擴增的引物進行PCR擴增，並使用來自紫紅紅球菌J1和紅球菌Cr4的基因組DNA作為模板，從兩種菌株得到約450bp的擴增產物。不過，在使用來自紅球菌Cr4的基因組DNA作為模板時，PCR擴增的效率較低。因而，使用紫紅紅球菌J1的基因組DNA作為模板擴增的片段用作隨後實驗的探針DNA。
利用DIG標記試劑盒(Boehringer Manheim)，按照隨機啟動法將所擴增的源於紫紅紅球菌J1的DNA片段用地高辛配基標記。被地高辛配基標記的DNA片段在隨後的DNA印跡分析和集落雜交中用作探針DNA。
23、DNA印跡分析將紅球菌Cr4的基因組DNA用各種限制酶消化，使用來自源於紫紅紅球菌J1的腈水合酶α-亞單位的探針DNA進行DNA印跡分析。將10μg來自紅球菌Cr4的基因組DNA用PstI、SphI和BanIII(Toyobo)完全消化，然後使1μg等份消化產物在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳。按照隨附手冊的指導，在785型真空印跡儀(Bio-Rad)中，將DNA轉移至尼龍膜NY13N(Schleicher Schuel)上。在自動交聯儀CL-1000(BMEquipment)中，將DNA固定在膜上。使所得膜與探針DNA在60℃下雜交過夜，然後在室溫下洗滌5分鐘，然後在60℃下洗滌15分鐘。按照隨附手冊的指導，將由CDP-Star所致化學發光在Fuji RX膠片上曝光，利用DIG檢測試劑盒(Boehringer Manheim)檢測信號。
DNA印跡分析揭示了3.2kb、4.2kb和7.8kb的單一譜帶分別在來自用PstI、SphI和BanIII消化的紅球菌Cr4的基因組DNA欄中。發現Rhodococcus sp.Cr4的腈水合酶基因是單拷貝基因。從由PstI消化產物所製備的基因組文庫克隆Rhodococcus sp.Cr4的腈水合酶基因。
24、紅球菌Cr4基因組文庫的製備和集落雜交將質粒pBluescript II SK(+)(Stratagene)用PstI消化，然後利用細菌鹼性磷酸酶(Takara Shuzo)脫磷酸化。將紅球菌Cr4的基因組DNA用PstI消化，然後利用T4 DNA連接酶(Takara Shuzo)連接到上述pBluescript IISK(+)上。然後，利用上述載體轉化大腸桿菌DH5α。
按照Sambrook等的方法進行集落雜交(Molecular cloning(ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor)1989)。具體而言，將硝基纖維素膜置於含有50μg/ml氨苄西林的LB瓊脂平板上，將所得轉化體塗鋪其上。將平板在37℃下培育過夜。有集落生成後，將備好的複製濾膜(replica filter)置於瓊脂平板上，在其上培養。在複製濾膜上生成集落後，將濾膜轉移至含有200μg/ml氯黴素的瓊脂平板上。將平板在37℃下培育24小時。將濾膜用SDS和鹼處理，以溶解集落。然後，在與DNA印跡分析所用相同的條件下進行集落雜交。因而，從大約2000個集落得到陽性克隆。
25、陽性克隆的分析培養陽性克隆後，利用鹼-SDS法製備質粒；該質粒名為pNHCr4P。質粒pNHCr4P含有約3.2kb的DNA插入片段。
為了確認pNHCr4P的DNA插入片段含有β-亞單位基因，利用PCR製備探針DNA，其中使用用於β-亞單位基因片段擴增的引物，並使用紫紅紅球菌J1的基因組DNA作為模板。利用這種探針DNA，利用DNA印跡分析pNHCr4P。結果確認約3.2kb的插入片段含有β-亞單位基因。
使用377A型DNA序列分析儀(Applied Biosystem)和Taq引物循環測序試劑盒(Applied Biosystem)，利用二脫氧鏈終止法分析pNHCr4P中DNA插入片段(約3.2kb)的核苷酸序列。所測定的核苷酸序列如SEQID NO16所示。測序結果顯示，pNHCr4P中PstI DNA插入片段的大小為3205bp，並且存在ORF(圖12)。紅球菌Cr4中基因簇的組織化與紫紅紅球菌J1中含有低分子量腈水合酶基因的區域非常相似(Komeda et alProc Natl Acad Sci USA 9436-41，1997)。
26、一級結構的分析從PstI片段核苷酸245-2100的區域推導的α-亞單位和β-亞單位的一級結構分別如SEQ ID NO2和SEQ ID NO4所示。α-亞單位和β-亞單位的N-末端胺基酸序列與利用蛋白質測序儀測定的結果完全一致。另外，α-亞單位和β-亞單位與來自紫紅紅球菌J1的腈水合酶都表現最大程度的同源性。
表17α β紫紅紅球菌J1(低分子量型) 92％ 87％紅球菌 65％ 45％惡臭假單胞菌 59％ 37％芽孢桿菌BR44960％ 38％Mesorhizobium loti 56％ 38％苜蓿中華根瘤菌 55％ 39％紅球菌(Rhodococcus sp.)M852％ 37％紫紅紅球菌J1(高分子量型) 52％ 37％紅串紅球菌(R.erythropolis) 50％ 35％綠針假單胞菌B23 50％ 31％Brevibacterium sp.R312 50％ ？專利WO 95/04828 42％ 34％腈水合酶α-亞單位的207個殘基中有17個胺基酸殘基在紅球菌Cr4(SEQ ID NO2)與紫紅紅球菌J1(SEQ ID NO18)之間是不同的。進而，腈水合酶β-亞單位的227個殘基中有29個胺基酸殘基在紅球菌Cr4(SEQ ID NO4)與紫紅紅球菌J1(SEQ ID NO19)之間是不同的(圖13和14)。
工業實用性本發明提供能夠從作為底物的2-羥基-4-甲硫基丁腈產生2-羥基-4-甲硫基丁醯胺的腈水合酶。2-羥基-4-甲硫基丁醯胺作為飼料添加劑是一種有用的化合物(甲硫氨酸代用品)。
本發明不僅提供能夠通過酶作用產生2-羥基-4-甲硫基丁醯胺的腈水合酶，而且在本發明中還克隆了編碼基因。本發明的腈水合酶能夠在適當用編碼由本發明所提供的腈水合酶的基因轉化的宿主細胞中被高水平地表達。因而，可以按照本發明獲得的轉化體本身或者從轉化體得到的酶蛋白質可用於通過酶作用產生2-羥基-4-甲硫基丁醯胺。很多已知通過基因重組生產的腈水合酶不能達到很高的酶活性，而本發明的腈水合酶的優異之處在於即使是基因重組體也保留很高的活性。
進而，本發明的腈水合酶在氰化物或醛的存在下仍保留很高的酶活性。在極性溶劑中，作為底物化合物的α-羥基腈分解為氫氰酸和醛。氫氰酸轉化為氰化物，這經常減少酶的活性。醛也對蛋白質造成損害，減少酶的活性。已知的腈水合酶不是工業上可實用的原因之一是這些氰化物和醛減少酶的活性。
本發明的水合酶即使在氰化物或醛的存在下也保留酶活性。因此，從醛和氫氰酸產生的α-羥基腈可以用作底物。因而，本發明的腈水合酶可用於使用α-羥基腈作為原料生產醯胺的方法。
序列表110大賽璐化學工業株式會社(DAICEL CHEMICAL INDUSTRIES，LTD.)120腈水合酶和生產醯胺的方法130D1-A0102Y1P140
141
150JP 2001-590231512001-03-02150JP 2002-162221512002-01-2416018170PatentIn Ver.2.12101211681212DNA213紅球菌(Rhodococcus sp.)220
221CDS222(1)..(681)4001atg gat ggt atc cac gat ctg ggc ggg cgc gcc ggt ctg ggg ccg gtc 48Met Asp Gly Ile His Asp Leu Gly Gly Arg Ala Gly Leu Gly Pro Val1 5 10 15aat ccc gaa ccc ggt gag ccg gtc ttt cat tct cgt tgg gag cgg tcg 96Asn Pro Glu Pro Gly Glu Pro Val Phe His Ser Arg Trp Glu Arg Ser20 25 30gtt ttg acg atg ttt ccg gcc atg gcg tta gcc ggg gcg ttc aac ctc 144Val Leu Thr Met Phe Pro Ala Met Ala Leu Ala Gly Ala Phe Asn Leu35 40 45gac cag ttc cgg ggc gcg atg gaa cag att ccc ccg cac gac tat ctg 192
Asp Gln Phe Arg Gly Ala Met Glu Gln Ile Pro Pro His Asp Tyr Leu50 55 60acc tcg cag tac tac gag cac tgg atg cac gcg atg atc cac tac ggc 240Thr Ser Gln Tyr Tyr Glu His Trp Met His Ala Met Ile His Tyr Gly65 70 75 80atc gag gcg ggc atc ttc gac ccg aac gag ctc gac cgt cgc acc cag 288Ile Glu Ala Gly Ile Phe Asp Pro Asn Glu Leu Asp Arg Arg Thr Gln85 90 95tac tac ctg gag cat ccg gac gaa gac ccg ccc ctg cgg cag gac ccg 336Tyr Tyr Leu Glu His Pro Asp Glu Asp Pro Pro Leu Arg Gln Asp Pro100 105 110cag ttg gtg gag acg atc tcg cag ttg atc atg cac gga gcc gac tac 384Gln Leu Val Glu Thr Ile Ser Gln Leu Ile Met His Gly Ala Asp Tyr115 120 125cga agg ccg acc gac gcc gag ggc gtc ttc gcg gtg ggc gac aag gtc 432Arg Arg Pro Thr Asp Ala Glu Gly Val Phe Ala Val Gly Asp Lys Val130 135 140gtt gtg cgg tcg gac gcc tcg ccg aac acc cac acc cgt cgc gcc ggc 480Val Val Arg Ser Asp Ala Ser Pro Asn Thr His Thr Arg Arg Ala Gly145 150 155 160tac atc cgt gga cgc acc ggt gag atc gtc gca gct cac ggc gcc tac 528Tyr Ile Arg Gly Arg Thr Gly Glu Ile Val Ala Ala His Gly Ala Tyr165 170 175gtt ttc ccg gac act aac gcc gtc ggc gcc ggc gaa cac ccc gaa cac 576Val Phe Pro Asp Thr Asn Ala Val Gly Ala Gly Glu His Pro Glu His180 185 190ctg tac acg gtg cgg ttc tcg gcg acc gag ttg tgg ggc gag acc gcc 624Leu Tyr Thr Val Arg Phe Ser Ala Thr Glu Leu Trp Gly Glu Thr Ala195 200 205acc tcc aac gcg gtc aac cac atc gac gtg ttc gaa ccc tac ctg ctg 672Thr Ser Asn Ala Val Asn His Ile Asp Val Phe Glu Pro Tyr Leu Leu210 215 220ccg gcc tga 681
Pro Ala2252102211226212PRT213紅球菌(Rhodococcus sp.)4002Met Asp Gly Ile His Asp Leu Gly Gly Arg Ala Gly Leu Gly Pro Val1 5 10 15Asn Pro Glu Pro Gly Glu Pro Val Phe His Ser Arg Trp Glu Arg Ser20 25 30Val Leu Thr Met Phe Pro Ala Met Ala Leu Ala Gly Ala Phe Asn Leu35 40 45Asp Gln Phe Arg Gly Ala Met Glu Gln Ile Pro Pro His Asp Tyr Leu50 55 60Thr Ser Gln Tyr Tyr Glu His Trp Met His Ala Met Ile His Tyr Gly65 70 75 80Ile Glu Ala Gly Ile Phe Asp Pro Asn Glu Leu Asp Arg Arg Thr Gln85 90 95Tyr Tyr Leu Glu His Pro Asp Glu Asp Pro Pro Leu Arg Gln Asp Pro100 105 110Gln Leu Val Glu Thr Ile Ser Gln Leu Ile Met His Gly Ala Asp Tyr115 120 125Arg Arg Pro Thr Asp Ala Glu Gly Val Phe Ala Val Gly Asp Lys Val130 135 140Val Val Arg Ser Asp Ala Ser Pro Asn Thr His Thr Arg Arg Ala Gly145 150 155 160Tyr Ile Arg Gly Arg Thr Gly Glu Ile Val Ala Ala His Gly Ala Tyr165 170 175Val Phe Pro Asp Thr Asn Ala Val Gly Ala Gly Glu His Pro Glu His180 185 190Leu Tyr Thr Val Arg Phe Ser Ala Thr Glu Leu Trp Gly Glu Thr Ala195 200 205Thr Ser Asn Ala Val Asn His Ile Asp Val Phe Glu Pro Tyr Leu Leu210 215 220Pro Ala2252103211624
212DNA213紅球菌(Rhodococcus sp.)220
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223人工序列的描述人工合成的引物序列40014cggatctcga cgtcagggtc g 212101521122212DNA213人工序列220
223人工序列的描述人工合成的引物序列40015cgatgtgatt gactacgttc gg 22210162113205212DNA
213紅球菌(Rhodococcus sp.)40016ctgcagtgtg cgcggcccgg gacgagcgac ggggtctcga ggactcgtcc accatgctcg 60ccgatccggg gggcagacga aaagacaatg agttgagtga atgaggcgta actgaatcta 120gactagtggg ggcctgtcgg gttgtccaga gcgtgtcgtc gcgcgcagga aagcgtcaaa 180aatcaactgc cgcaacgttt gctccggaat gaggcagctc ccctgttgcg cccatgcggg 240ggagtctgcc ctctggatcc cccgtgcgag aggcaacaaa atcttaacag gtcacgaagt 300catgacctat tgacctatcg ggattgtggt gtttaaggtt ggtgacccaa gccacaagga 360ggcaatgcga tggatggtat ccacgatctg ggcgggcgcg ccggtctggg gccggtcaat 420cccgaacccg gtgagccggt ctttcattct cgttgggagc ggtcggtttt gacgatgttt 480ccggccatgg cgttagccgg ggcgttcaac ctcgaccagt tccggggcgc gatggaacag 540attcccccgc acgactatct gacctcgcag tactacgagc actggatgca cgcgatgatc 600cactacggca tcgaggcggg catcttcgac ccgaacgagc tcgaccgtcg cacccagtac 660tacctggagc atccggacga agacccgccc ctgcggcagg acccgcagtt ggtggagacg 720atctcgcagt tgatcatgca cggagccgac taccgaaggc cgaccgacgc cgagggcgtc 780ttcgcggtgg gcgacaaggt cgttgtgcgg tcggacgcct cgccgaacac ccacacccgt 840cgcgccggct acatccgtgg acgcaccggt gagatcgtcg cagctcacgg cgcctacgtt 900ttcccggaca ctaacgccgt cggcgccggc gaacaccccg aacacctgta cacggtgcgg 960ttctcggcga ccgagttgtg gggcgagacc gccacctcca acgcggtcaa ccacatcgac 1020gtgttcgaac cctacctgct gccggcctga ccggagcgtc cgatacaacc tcgctgatac 1080ccccactgcc ccgcctacgg aaacgagttc acccgatgac cgcccacaat cccgtccagg 1140gcaccttccc ccgatcgaac gaggagatcg ccgcccgcgt caaggccatg gaggccatcc 1200tcgtcgacaa gggcctgatc tccaccgacg ccatcgacta catgtcctcg gtctacgaga 1260acgaggtcgg tcctcagctc ggcgccaaga tcgccgccca tgcctgggtc gatcccgagt 1320tcaaacagcg cctgctcgcc gacgcaaccg gcgcctgcaa ggaaatgggc gtcggcggga 1380tgcagggcga agaaatggtc gtgctggaaa acaccgacac cgtcaacaac atggtcgtgt 1440gcaccctgtg ctcgtgctac ccgtggccgg tgctcggatt gccgcccaac tggtacaagt 1500accccgccta ccgcgcccgc gccgcccgcg acccgcgagg ggtgatggcc gagttcggct 1560atacccccgc ctcggacgtc gagatccggg tgtgggactc gagcgccgaa ctgcgctact 1620gggtgctgcc gcagcgcccc gccggcaccg agaacttcac cgaagagcag ctcgccgccc 1680tcgtcacccg cgactcgctc atcggcgtgt ccgtccccac cgcaccgaac aaggcctgac 1740atgccccaac tcaacgaaca acccagccag gacctcaagg accgcctcga cggcctggtg 1800cagaacctac cgttcaacga gcagattccc cggcgctccg gggaggtcgc cttcgaccat 1860gcctgggaga tccgcgcttt cagcatcgcc accgccctgc atgcccaggg ccggttcgag 1920tgggacgaat tccagtcccg cctgatcgac tcgatcaaac agtgggaaac cgaacacacc 1980accaccgagg agtggagcta ctacgagtgt tggatgctcg cactcgaaga gctggtgcgg 2040gacaaggggc tggtcgccgg tgatgaactc gagcaccgca ccgagcaggt gctggccacc 2100ccggccaacg cccaccacca acacgctgta cgcgacccca ttgccgtgca caccagcgaa 2160gtacctactg ctcagtactc ccggtagccc ctggggcctc gccttcacgg aggtggaact 2220ctcgtgtaaa ggctcctggg ctctgcgacg tagagatacc accgatcttt ctcttgggct 2280ccccaggagc cgaagacgca tccctgatat ggcaactcgg acctggccgg gcgcgcagac 2340acaacgtgcg agcgccccgg aacttccaag cctctggcgt attcggaaga cgctgcgaat 2400tagtcgaagg acaagggttt gaccagtacc gcaatgacac cgcaccgcat gggcggtgcg 2460
tggactcgta cagagcgcca gcggctggca tcggttgtcg gcgccgtcgt gatcctgcat 2520gtattgggcg tggccctgta tgtgggatac tccggtaatc cagcagccgc cggaggcctc 2580gccggatccg gtgtgctcgc ctacgtgctc ggcgtccgcc acgcattcga cgccgatcac 2640ctcgctgcca tcgatgacac cacgcgcctg atgctgttgc gcggacgccg tccggtcggg 2700gtcgggttct tcttcgcgat gggacactcg accgtcgtca ttgtccttgc tctggtcgtg 2760gcgctgggcg ccagctccct gaccacgagt gagctcgagg gggtccagga gatcggcgga 2820atggtcgcga cggtcgtcgc cgtagccttc ttgctggtcg tcgccggact caacagcgtg 2880gtcctgcgca atctgctctc cctggcccga cgggtgcgga ccggggcgga catcgcaggt 2940gatctcgaga gcagcctcag cgagcgtggg ttgttcgccc ggctgctcgg tgcccgctgg 3000cgtggactga ttcgttcgtc ctggcacatg tatccggtcg ggctgttgat ggggctcggg 3060ctcgagaccg catccgaggt caccctgctc actctcactg cttcggcggt gaccgggggc 3120accttgtccg tggctgcagc gggctcacgg acggatcggc cgccagatag tcgctcgcgg 3180tgcgcgccag atgccagttc tgcag 320521017211207212PRT213紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)40017Met Thr Ala His Asn Pro Val Gln Gly Thr Leu Pro Arg Ser Asn Glu1 5 10 15Glu Ile Ala Ala Arg Val Lys Ala Met Glu Ala Ile Leu Val Asp Lys20 25 30Gly Leu Ile Ser Thr Asp Ala Ile Asp His Met Ser Ser Val Tyr Glu35 40 45Asn Glu Val Gly Pro Gln Leu Gly Ala Lys Ile Val Ala Arg Ala Trp50 55 60Val Asp Pro Glu Phe Lys Gln Arg Leu Leu Thr Asp Ala Thr Ser Ala65 70 75 80Cys Arg Glu Met Gly Val Gly Gly Met Gln Gly Glu Glu Met Val Val85 90 95Leu Glu Asn Thr Gly Thr Val His Asn Met Val Val Cys Thr Leu Cys100 105 110Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Val Leu Gly Leu Pro Pro Asn Trp Tyr Lys115 120 125
Tyr Pro Ala Tyr Arg Ala Arg Ala Val Arg Asp Pro Arg Gly Val Leu130 135 140Ala Glu Phe Gly Tyr Thr Pro Asp Pro Asp Val Glu Ile Arg Ile Trp145 150 155 160Asp Ser Ser Ala Glu Leu Arg Tyr Trp Val Leu Pro Gln Arg Pro Ala165 170 175Gly Thr Glu Asn Phe Thr Glu Glu Gln Leu Ala Asp Leu Val Thr Arg180 185 190Asp Ser Leu Ile Gly Val Ser Val Pro Thr Thr Pro Ser Lys Ala195 200 20521018211226212PRT213紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)40018Met Asp Gly Ile His Asp Leu Gly Gly Arg Ala Gly Leu Gly Pro Ile1 5 10 15Lys Pro Glu Ser Asp Glu Pro Val Phe His Ser Asp Trp Glu Arg Ser20 25 30Val Leu Thr Met Phe Pro Ala Met Ala Leu Ala Gly Ala Phe Asn Leu35 40 45Asp Gln Phe Arg Gly Ala Met Glu Gln Ile Pro Pro His Asp Tyr Leu50 55 60Thr Ser Gln Tyr Tyr Glu His Trp Met His Ala Met Ile His His Gly65 70 75 80Ile Glu Ala Gly Ile Phe Asp Ser Asp Glu Leu Asp Arg Arg Thr Gln85 90 95Tyr Tyr Met Asp His Pro Asp Asp Thr Thr Pro Thr Arg Gln Asp Pro100 105 110
Gln Leu Val Glu Thr Ile Ser Gln Leu Ile Thr His Gly Ala Asp Tyr115 120 125Arg Arg Pro Thr Asp Thr Glu Ala Ala Phe Ala Val Gly Asp Lys Val130 135 140Ile Val Arg Ser Asp Ala Ser Pro Asn Thr His Thr Arg Arg Ala Gly145 150 155 160Tyr Val Arg Gly Arg Val Gly Glu Val Val Ala Thr His Gly Ala Tyr165 170 175Val Phe Pro Asp Thr Asn Ala Leu Gly Ala Gly Glu Ser Pro Glu His180 185 190Leu Tyr Thr Val Arg Phe Ser Ala Thr Glu Leu Trp Gly Glu Pro Ala195 200 205Ala Pro Asn Val Val Asn His Ile Asp Val Phe Glu Pro Tyr Leu Leu210 215 220Pro Ala22權利要求
1.具有下列物理化學性質的腈水合酶(a)作用於腈化合物的腈基，水合腈基並將其轉化為醯胺基；和(b)是氰化物耐受性的。
2.具有下列物理化學性質的腈水合酶(1)在用凝膠過濾法測定時，分子量大約是110,000Da，利用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳法可分離為26.8kDa和29.5kDa的兩個亞單位；(2)作用於腈化合物的腈基，使腈基水合，將其轉化為醯胺基；(3)使腈基水合的活性最大的最佳pH在pH5.5至6.5；(4)使腈基水合的活性最大的最佳溫度在40至45℃；(5)酶的pH穩定性在pH4至9內；(6)熱穩定性，以便在50℃下熱處理30分鐘後，該酶保留70％或更多的活性；(7)被HgCl2、AgNO3、羥胺或苯肼所抑制。
3.根據權利要求1和2任意一項的腈水合酶，其中所述腈水合酶進一步具有下列物理化學性質(c)底物特異性，其中該酶使用2-羥基-4-甲硫基丁腈作為底物，產生2-羥基-4-甲硫基丁醯胺。
4.根據權利要求1和2任意一項的腈水合酶，其中所述腈水合酶進一步具有下列物理化學性質(d)穩定性，其中該酶被二價金屬離子所穩定。
5.根據權利要求1和2任意一項的腈水合酶，其中所述腈水合酶是源於已被保藏的紅球菌Cr4菌株的，入藏號為FERM BP-6596。
6.生產根據權利要求1和2任意一項的腈水合酶的方法，所述方法包含培養已被保藏的紅球菌Cr4菌株的步驟，入藏號為FERMBP-6596。
7.蛋白質複合體，由被下列多核苷酸(A)至(E)任意一個所編碼的α-亞單位和被下列多核苷酸(a)至(e)任意一個所編碼的β-亞單位組成，其中所述蛋白質複合體具有下列物理化學性質(i)和(ii)(i)作用於腈化合物的腈基，使腈基水合，將其轉化為醯胺基；(ii)底物特異性，其中該酶使用2-羥基-4-甲硫基丁腈作為底物，產生2-羥基-4-甲硫基丁醯胺；α-亞單位(A)包含核苷酸序列SEQ ID NO1的多核苷酸；(B)編碼包含胺基酸序列SEQ ID NO2的蛋白質的多核苷酸；(C)編碼包含胺基酸序列SEQ ID NO2的蛋白質的多核苷酸，它含有一個或多個胺基酸取代、缺失、插入和/或添加；(D)能夠在嚴格條件下與包含核苷酸序列SEQ ID NO1的多核苷酸雜交的多核苷酸；(E)編碼與胺基酸序列SEQ ID NO2具有70％或更高同一性的蛋白質的多核苷酸；β-亞單位(a)包含核苷酸序列SEQ ID NO3的多核苷酸；(b)編碼包含胺基酸序列SEQ ID NO4的蛋白質的多核苷酸；(c)編碼包含胺基酸序列SEQ ID NO4的蛋白質的多核苷酸，它含有一個或多個胺基酸取代、缺失、插入和/或添加；(d)能夠在嚴格條件下與包含核苷酸序列SEQ ID NO3的多核苷酸雜交的多核苷酸；(e)編碼與胺基酸序列SEQ ID NO4具有70％或更高同一性的蛋白質的多核苷酸。
8.根據權利要求7的蛋白質複合體，其中該α-亞單位包含胺基酸序列SEQ ID NO2。
9.根據權利要求7的蛋白質複合體，其中該β-亞單位包含胺基酸序列SEQ ID NO4。
10.編碼根據權利要求7的蛋白質複合體的α-亞單位的多核苷酸，其中所述多核苷酸選自下組(A)包含核苷酸序列SEQ ID NO1的多核苷酸；(B)編碼包含胺基酸序列SEQ ID NO2的蛋白質的多核苷酸；(C)編碼包含胺基酸序列SEQ ID NO2的蛋白質的多核苷酸，它含有一個或多個胺基酸取代、缺失、插入和/或添加；(D)能夠在嚴格條件下與包含核苷酸序列SEQ ID NO1的多核苷酸雜交的多核苷酸；(E)編碼與胺基酸序列SEQ ID NO2具有70％或更高同一性的蛋白質的多核苷酸。
11.編碼根據權利要求7的蛋白質複合體的α-亞單位的多核苷酸，其中所述多核苷酸選自下組(a)包含核苷酸序列SEQ ID NO1的多核苷酸；(b)編碼包含胺基酸序列SEQ ID NO2的蛋白質的多核苷酸；(c)編碼包含胺基酸序列SEQ ID NO2的蛋白質的多核苷酸，它含有一個或多個胺基酸取代、缺失、插入和/或添加；(d)能夠在嚴格條件下與包含核苷酸序列SEQ ID NO1的多核苷酸雜交的多核苷酸；(e)編碼與胺基酸序列SEQ ID NO2具有70％或更高同一性的蛋白質的多核苷酸。
12.被根據權利要求10和11任意一項的多核苷酸所編碼的蛋白質。
13.重組載體，其中已經插入根據權利要求10的多核苷酸和/或根據權利要求11的多核苷酸。
14.用根據權利要求13的重組載體轉化宿主所得到的轉化體。
15.根據權利要求14的轉化體，其中該宿主是微生物。
16.生產腈水合酶或其亞單位的方法，其中所述方法包含培養根據權利要求14的轉化體的步驟。
17.生產醯胺的方法，其中所述方法包含下列步驟使腈化合物與選自下組的酶活性材料接觸根據權利要求1和2任意一項的腈水合酶；產生根據權利要求1和2任意一項的腈水合酶的微生物；根據權利要求7的蛋白質複合體；根據權利要求14的轉化體；及其加工產物，並且回收所產生的醯胺。
18.根據權利要求17的方法，其中該腈化合物是α-羥基腈化合物，該醯胺是α-羥基醯胺。
19.根據權利要求18的方法，其中該α-羥基腈化合物是由下式(1)代表的化合物，該產物是由下式(3)代表的α-羥基醯胺化合物式(1) 式(3) 其中R代表取代或未取代的烷基、取代或未取代的鏈烯基、取代或未取代的環烷基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、取代或未取代的飽和或不飽和雜環基。
20.根據權利要求19的方法，其中所述方法包含在一種混合物中產生由上式(1)代表的化合物的步驟，該混合物包含由下式(2)代表的醛和氫氰酸R-CHO (2)其中R代表取代或未取代的烷基、取代或未取代的鏈烯基、取代或未取代的環烷基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、取代或未取代的飽和或不飽和雜環基。
21.根據權利要求17的方法，其中所述酶活性材料是在二價金屬離子的存在下與所述腈化合物反應的。
22.根據權利要求21的方法，其中該二價金屬離子是鎳離子和/或鈷離子。
23.在腈化合物的存在下使腈水合酶活性穩定的方法，其中所述方法包含使腈水合酶與二價金屬離子接觸的步驟。
24.生產醯胺的方法，其中所述方法包含下列步驟在二價金屬離子的存在下使腈水合酶與腈化合物反應；和回收所產生的醯胺。
25.根據權利要求24的方法，其中該腈化合物是α-羥基腈，該醯胺是α-羥基醯胺。
26.根據權利要求23或24的方法，其中該二價金屬離子是鎳離子和/或鈷離子。
全文摘要
本發明的目的是提供能夠產生2－羥基－4－甲硫基丁醯胺的腈水合酶。本發明提供新穎的腈水合酶，它使用α－羥基腈作為底物產生α－羥基醯胺，還提供其編碼DNA。該酶可以從紅球菌獲得。進而，該酶的酶活性在反應期間得以穩定地保持。本發明提供生產醯胺化合物的方法，該方法使這種酶與腈化合物反應的步驟。按照本發明，從羥基腈化合物可以通過生物化學作用生產對應的醯胺化合物，而不會減少腈水合酶的酶活性。
文檔編號C12N15/60GK1571843SQ0280875
公開日2005年1月26日 申請日期2002年3月1日 優先權日2001年3月2日
發明者長澤透, 松山彰收 申請人:大賽璐化學工業株式會社