檢測禽流感病毒的含有糖脂組合探針的光敏囊泡及其製法的製作方法

2023-05-25 13:43:31 2

專利名稱：檢測禽流感病毒的含有糖脂組合探針的光敏囊泡及其製法的製作方法
技術領域：
本發明屬於具有糖脂探針的聚聯乙炔(PCDA)囊泡生物傳感器領域，特別涉及用 於檢測禽流感病毒的含有糖脂組合探針的光敏囊泡，以及該檢測禽流感病毒的含有糖脂組 合探針的光敏囊泡的製備方法。
背景技術：
禽流感(Avian Influenza, Al)是由正粘病毒科/流感病毒屬/A型流感病毒 引起的禽類感染或疾病症候群，被國際獸疫局確定為A類傳染病。低致病性禽流感(Low Pathogenic Avian Influenza,LAPI)主要表現從無症狀感染到中輕度的呼吸系統疾病、產 蛋下降，而高致病性禽流感(High Pathogenic AvianInfluenza, HAPI)則主要表現為高致 病率和高死亡率的全身感染。該病毒血清型極多，變異性極強，嚴重威脅世界各地的家禽養 殖業，常常造成巨大的經濟損失，尤其是H5和H7亞型病毒引起的高致病性禽流感是目前家 禽養殖業的一種災難性的傳染病。而近年來隨著病毒的不斷變異，宿主範圍已經由禽類擴 大到很多哺乳動物甚至人類，給人的生命安全造成了極大的威脅，1997年香港高致病性禽 流感H5W不經過中間宿主而直接從雞傳染給人，導致18人感染，6人死亡，打破了傳統上 所認為的禽流感病毒需要在中間宿主體內與人流感病毒重組之後才能傳染人的觀點。WHO 發表聲明表示，儘管到目前為止，仍然沒有足夠的科學依據來證明已經形成了人傳人的傳 播鏈，但是臨床數據、科學家積累的研究資料和非常有限的病例個案已經顯示，H5W禽流感 病毒很有可能在人與人之間傳播，從而有可能在今後某個時期在人群中爆發大規模的禽流 感。這些證據更加凸顯了禽流感研究在公共衛生學中的重大意義，引起越來越多科學家的 高度重視。禽流感病毒一般是具有八個基因區段的RNA病毒，病毒的外鞘膜上由血球凝集素 (hemagglutinin)H蛋白與神經氨酸苷酶(唾液酸苷酶)(neuraminidasdN蛋白組成，分別 在入侵寄主細胞及釋放子代病毒時扮演著關鍵的角色，其中H蛋白是禽流感病毒的吸附蛋 白。動物細胞膜的受體部分含有細胞膜糖蛋白上的唾液酸糖頭和/或糖脂末端上的唾液酸 糖頭，吸附階段決定了病毒感染的開始和病毒感染的特異性。因此對禽流感H5W的檢測主 要是針對H蛋白進行檢測，H蛋白和唾液酸糖頭之間的相互作用就成為了檢測禽流感H5W 最為重要的可靠手段。所述的唾液酸_半乳糖糖頭具有以下結構
OH-
OH-HOx/CO2
OOH 由於天然糖脂或天然糖蛋白具有多個唾液酸-半乳糖糖頭，如果根據檢測需要進 行人工合成天然糖脂時，就會遇到大量複雜的合成問題，難以推廣。
專利號為CN98103306. 7的專利提供了一種具有識別病菌、病毒功能的光敏泡囊 及其製法，該專利提供的技術方案可簡便、快速用於檢測病菌、病毒及蛋白質。本發明結合前述專利的技術方案，提供一種基於簡單物理插入方法，利用光敏囊 泡的球形結構，使各種單糖頭糖脂在光敏囊泡表面組合形成有效的空間結構直接對禽流 感病毒進行檢測。此方法具有製備簡單，成本低，靈敏度高等優點，並可根據各種不同單 糖頭糖脂的組合，模擬出各種對應的多糖頭糖脂，為將來利用組合單糖篩選出比天然唾液 酸-半乳糖有更強與禽流感蛋白結合能力作用的多糖提供方法。

發明內容
本發明的目的是提供用於檢測禽流感病毒的含有糖脂組合探針的光敏囊泡，而糖 脂組合探針是由簡單的單糖頭糖脂通過物理力組裝而成。本發明的再一目的是提供一種用於檢測禽流感病毒的含有糖脂組合探針的光敏 囊泡的製備方法。本發明是一種基於光敏囊泡的疏水作用，將各種單糖頭糖脂識別分子用物理方法 插入到聚聯乙炔-磷脂雙分子層中作為組合探針，組裝形成能有效檢測禽流感病毒的含有 單糖頭糖脂組合探針的變色囊泡。所述的單糖頭糖脂由不同單糖頭、縮合乙醛親水剛性結 構和長鏈烷基疏水長鏈組成；在用旋蒸法製備檢測禽流感病毒的含有單糖頭糖脂組合探 針的光敏囊泡過程中，單糖頭糖脂的疏水長鏈插入到聯乙炔-磷脂囊泡雙分子層的磷脂區 域，親水剛性結構幫助單糖頭糖脂在聯乙炔-磷脂囊泡表面直立舒展，當加入單糖頭糖脂 的比例、種類發生變化時，也相應形成數目不同，結構不一的有效檢測禽流感病毒的空間受 體。當使用本發明的光敏囊泡檢測禽流感病毒時，光敏囊泡經過紫外光照射聚合後，一旦空 間受體與溶液中的禽流感病毒蛋白結合，單糖頭糖脂的疏水長鏈就會通過擠壓磷脂區域誘 導聯乙炔共軛二烯的長鏈骨架(聯乙炔經過紫外光照射聚合，會形成聯乙炔共軛二烯的長 鏈骨架)發生擾動，使變色囊泡由藍色逐漸依次變成紫色、紫色變成紫紅色、紫紅色變成紅 色，從而形成新穎，直觀的生物變色傳感器，並通過觀察變色囊泡的顏色變化實現檢測禽流 感病毒。本發明的檢測禽流感病毒的含有單糖頭糖脂組合探針的光敏囊泡，包括內水相、 聚聯乙炔-磷脂雙分子層以及作為組合探針的具有識別禽流感病毒功能的單糖頭糖脂識 別分子；具有識別禽流感病毒功能的單糖頭糖脂識別分子利用疏水力嵌入到光敏囊泡的聚 聯乙炔-磷脂雙分子層的磷脂區域中，內水相被聚聯乙炔-磷脂雙分子層包裹在其中而形 成光敏泡囊；所述的單糖頭糖脂識別分子與形成光敏囊泡雙分子層結構的聯乙炔的類脂單 體和磷脂單體總的摩爾比為1 100 4 5，聚聯乙炔-磷脂雙分子層由聯乙炔的類脂單 體和磷脂單體聚合而成，聯乙炔的類脂單體與磷脂單體的摩爾比為1 1 4 1。所述的單糖頭糖脂識別分子具由單糖頭R1和R2、縮合乙醛親水剛性結構和長鏈烷 基疏水長鏈。所述的單糖頭糖脂識別分子為唾液酸糖脂和乳糖糖脂或葡萄糖糖脂，其中嵌入到 光敏囊泡的聚聯乙炔-磷脂雙分子層的磷脂區域中的唾液酸糖脂與乳糖糖脂或葡萄糖糖 脂的摩爾比為1 9 9 1 ；所述的唾液酸糖脂具有以下結構
R1-X- (C2H4O) 2- (C2H4O) m_CH2- (CH2) n_CH3 ；其中=R1為唾液酸；X為氧或碳；m = 1 2，η = 8 14 ；所述的乳糖糖脂或葡萄糖糖脂具有以下結構R2-X- (C2H4O) 2- (C2H4O) m_CH2- (CH2) n_CH3 ；
其中R2為乳糖或葡萄糖；X為氧或碳；m = 1 2，η = 8 14。所述的聯乙炔結構的類脂單體具有以下結構CH3-(CH2)n-C = C-C = C-(CH2)m-COOH,其中m = 0 10，η = 17 30。所述的磷脂具有以下結構R1-COO-CH-CH2-COO-R2 ；CH2-O-PCV-O-CH2CH2N+ (CH3) 3其中=R1和R2均為10 26個碳的脂肪鏈。所述的內水相為去離子水或ρΗ在6 8之間的緩衝溶液等。所述的緩衝溶液是磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩衝液、磷酸鹽緩衝溶液、Tris-鹽酸緩 衝溶液或巴比妥鈉_鹽酸緩衝液等中的一種。本發明的檢測禽流感病毒的含有糖脂組合探針的光敏囊泡的製備方法將單糖 頭糖脂識別分子、磷脂單體、聯乙炔的類脂單體混溶於有機溶劑中，其中，單糖頭糖脂識別 分子與形成聯乙炔-磷脂光敏囊泡雙分子層結構的聯乙炔的類脂單體和磷脂單體總的摩 爾比為1 100 1 5，聯乙炔的類脂單體與磷脂單體的摩爾比為1 1 4 1;旋 蒸除去有機溶劑，加入水相溶液使聯乙炔的類脂單體和磷脂單體在水相溶液中的總濃度為 0. 01 200mmol/L，使單糖頭糖脂利用疏水力嵌入到光敏囊泡的聯乙炔-磷脂雙分子層的 磷脂區域中；在溫度為30 90°C下，超聲水合10 180分鐘，使內水相被聯乙炔-磷脂雙 分子層包裹，得到非聚合的囊泡溶液；靜置於4°C冰箱中陳化2 48小時，再將此囊泡溶液 用波長為200 360nm的紫外燈照射10 600秒使聯乙炔的類脂單體聚合，最終得到藍色 的具有識別禽流感病毒功能的含有糖脂組合探針的光敏囊泡。所述的單糖頭糖脂識別分子為唾液酸糖脂和乳糖糖脂或葡萄糖糖脂，其中嵌入到 光敏囊泡的聚聯乙炔-磷脂雙分子層的磷脂區域中的唾液酸糖脂與乳糖糖脂或葡萄糖糖 脂的摩爾比為1 9 9 1 ；所述的唾液酸糖脂具有以下結構R1-X- (C2H4O) 2- (C2H4O) m_CH2- (CH2) n_CH3 ；其中=R1為唾液酸；X為氧或碳；m = 1 2，η = 8 14 ；所述的乳糖糖脂或葡萄糖糖脂具有以下結構R2-X- (C2H4O) 2- (C2H4O) m_CH2- (CH2) n_CH3 ；其中R2為乳糖或葡萄糖；X為氧或碳；m = 1 2，η = 8 14。所述的聯乙炔結構的類脂單體具有以下結構CH3-(CH2)n-C = C-C = C-(CH2)m-COOH,其中m = 0 10，η = 17 30。所述的磷脂具有以下結構R1-COO-CH-CH2-COO-R2 ；
CH2-O-PCV-O-CH2CH2N+ (CH3) 3其中=R1和R2均為10 26個碳的脂肪鏈。所述的有機溶劑為丙酮、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇等中的一種或大於 一種以上的混合物。所述的水相溶液為去離子水或pH在6 8之間的緩衝溶液等。所述的緩衝溶液是磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩衝液、磷酸鹽緩衝溶液、Tris-鹽酸緩 衝溶液或巴比妥鈉_鹽酸緩衝液等中的一種。所述的超聲是探針超聲或水浴超聲。在本發明中，當識別分子與形成光敏囊泡雙分子層結構的聯乙炔的類脂單體和磷 脂單體的摩爾比為0.2，同時識別分子為唾液酸糖脂與乳糖糖脂，且兩者摩爾比為1 1，而 聯乙炔的類脂單體與磷脂單體的摩爾比為3 2時，所製備得到的變色光敏囊泡效果最好。 另外紫外光波長優選為240 260nm，照射時間優選為15 60秒，而探針超聲6分鐘，超聲 溫度為90°C所得到的光敏囊泡更為均一、透明。本發明中的變色光敏囊泡具有製備簡單、成本低等優點。具有識別功能的兩種單 糖頭糖脂易於合成，原料易得，價格低廉，並可靈活多變組合；本發明的將兩種單糖頭糖脂 組裝後對識別禽流感病毒的能力，比使用單一功能性唾液酸糖頭或唾液酸_半乳糖天然糖 頭對禽流感病毒的檢測能力有顯著的提高，且光敏囊泡變色響應時間更加短暫。


圖1.本發明實施例3基於疏水作用將單糖頭糖脂物理插入聚聯乙炔_磷脂雙分 子層中組裝形成能有效檢測禽流感的光敏囊泡結構示意圖。
具體實施例方式實施例1將單糖頭糖脂識別分子、磷脂單體、聯乙炔的類脂單體混溶於丙酮中，其中，單糖 頭糖脂識別分子與形成聯乙炔_磷脂光敏囊泡雙分子層結構的聯乙炔的類脂單體和磷脂 單體總的摩爾比為1 100，聯乙炔的類脂單體與磷脂單體的摩爾比為4 1;旋蒸除去丙 酮，加入去離子水，使聯乙炔的類脂單體和磷脂單體在去離子水中的總濃度為0. 01mmol/L, 使單糖頭糖脂利用疏水力嵌入到光敏囊泡的聯乙炔_磷脂雙分子層的磷脂區域中；在溫度 為90°C下，探針超聲水合10分鐘，使去離子水被聯乙炔-磷脂雙分子層包裹，得到非聚合 的囊泡溶液；靜置於4°C冰箱中陳化2小時，再將此囊泡溶液用波長為360nm的紫外燈照射 600秒使聯乙炔的類脂單體聚合，最終得到藍色的具有識別禽流感H5m病毒功能的含有糖 脂組合探針的光敏囊泡。所述的單糖頭糖脂識別分子為唾液酸糖脂和乳糖糖脂，其中嵌入到光敏囊泡的聚 聯乙炔-磷脂雙分子層的磷脂區域中的唾液酸糖脂與乳糖糖脂的摩爾比為1 9。所述的唾液酸糖脂具有以下結構R1-X- (C2H4O) 2- (C2H4O) m_CH2- (CH2) n_CH3 ；其中氓為唾液酸；χ為氧；m= l，n = 8;所述的乳糖糖脂具有以下結構
R2-X- (C2H4O) 2- (C2H4O) m_CH2- (CH2) n_CH3 ；其中R2為乳糖；χ為氧；m= l，n = 8。所述的聯乙炔的類脂單體具有以下結構CH3-(CH2)n-C = C-C = C-(CH2)m-COOH,其中 m = 0，η = 17。所述的磷脂單體具有以下結構(CH2) 10-COO-CH-CH2-COO- (CH2) 10CH2-0-P03:0-CH2CH2N+ (CH3) 3將4 μ L濃度為lOmg/mL的禽流感病毒HAl蛋白溶液加入到2mL上述藍色的光敏 囊泡中，在30°C水浴中恆溫5分鐘後，光敏囊泡溶液由藍色變成紫色。而相應的未加入禽流 感病毒HAl蛋白溶液的藍色光敏囊泡溶液則未發生顏色變化。實施例2將單糖頭糖脂識別分子、磷脂單體、聯乙炔的類脂單體混溶於二氯甲烷中，其中， 單糖頭糖脂識別分子與形成聯乙炔-磷脂光敏囊泡雙分子層結構的聯乙炔的類脂單體和 磷脂單體總的摩爾比為1 100，聯乙炔的類脂單體與磷脂單體的摩爾比為1 1;旋蒸除 去二氯甲烷，加入PH為6. O的磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩衝液，使聯乙炔的類脂單體和磷脂 單體在磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩衝液中的總濃度為200mmol/L，使單糖頭糖脂利用疏水力 嵌入到光敏囊泡的聯乙炔-磷脂雙分子層的磷脂區域中；在溫度為30°C下，水浴超聲水合 180分鐘，使pH為6. O的磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩衝液被聯乙炔_磷脂雙分子層包裹，得到 非聚合的囊泡溶液；靜置於4°C冰箱中陳化48小時，再將此囊泡溶液用波長為360nm的紫 外燈照射600秒使聯乙炔的類脂單體聚合，最終得到藍色的具有識別禽流感H5W病毒功能 的含有糖脂組合探針的光敏囊泡。所述的單糖頭糖脂識別分子為唾液酸糖脂和乳糖糖脂，其中嵌入到光敏囊泡的聚 聯乙炔-磷脂雙分子層的磷脂區域中的唾液酸糖脂與乳糖糖脂的摩爾比為9 1。所述的唾液酸糖脂具有以下結構R1-X- (C2H4O) 2- (C2H4O) m_CH2- (CH2) n_CH3 ；其中=R1為唾液酸；X為碳；m = 2，η = 14 ；所述的乳糖糖脂具有以下結構R2-X- (C2H4O) 2- (C2H4O) m_CH2- (CH2) n_CH3 ；其中R2為乳糖；X為碳；m = 2，η = 14。所述的聯乙炔的類脂單體具有以下結構CH3-(CH2)n-C = C-C = C-(CH2)m-COOH,其中 m = 10，η = 30。所述的磷脂單體具有以下結構(CH2) 26-COO-CH-CH2-COO- (CH2) 26CH2-0-P03:0-CH2CH2N+ (CH3) 3將4 μ L濃度為lOmg/mL的禽流感病毒HAl蛋白溶液加入到2mL上述藍色的光敏 囊泡中，在30°C水浴中恆溫5分鐘後，光敏囊泡溶液由藍色變成紫紅色。而相應的未加入禽 流感病毒HAl蛋白溶液的藍色光敏囊泡溶液則未發生顏色變化。
實施例3將單糖頭糖脂識別分子、磷脂單體、聯乙炔的類脂單體混溶於氯仿中，其中，單糖 頭糖脂識別分子與形成聯乙炔_磷脂光敏囊泡雙分子層結構的聯乙炔的類脂單體和磷脂 單體總的摩爾比為1 5，聯乙炔的類脂單體與磷脂單體的摩爾比為3 2;旋蒸除去氯仿， 加入pH為6. 9的磷酸鹽緩衝溶液，使聯乙炔的類脂單體和磷脂單體在磷酸鹽緩衝溶液中的 總濃度為2mmol/L，使單糖頭糖脂利用疏水力嵌入到光敏囊泡的聯乙炔-磷脂雙分子層的 磷脂區域中；在溫度為90°C下，探針超聲水合20分鐘，使pH為6. 9的磷酸鹽緩衝溶液被聯 乙炔_磷脂雙分子層包裹，得到非聚合的囊泡溶液；靜置於4°C冰箱中陳化12小時，再將此 囊泡溶液用波長為264nm的紫外燈照射30秒使聯乙炔的類脂單體聚合，最終得到藍色的具 有識別禽流感H5W病毒功能的含有糖脂組合探針的光敏囊泡。單糖頭糖脂物理插入聚聯 乙炔-磷脂雙分子層中組裝形成能有效檢測禽流感的光敏囊泡結構如圖1所示；其中(1) 代表聯乙炔單體的聚合結構，(2)代表磷脂單體，(3)代表唾液酸糖脂，(4)代表乳糖糖脂。所述的單糖頭糖脂識別分子為唾液酸糖脂和乳糖糖脂，其中嵌入到光敏囊泡的聚 聯乙炔-磷脂雙分子層的磷脂區域中的唾液酸糖脂與乳糖糖脂的摩爾比為1 1。所述的唾液酸糖脂具有以下結構R1-X- (C2H4O) 2- (C2H4O) m_CH2- (CH2) n_CH3 ；其中禮為唾液酸；χ為氧；m = 1，n = 11 ;所述的乳糖糖脂具有以下結構 R2-X- (C2H4O) 2- (C2H4O) m_CH2- (CH2) n_CH3 ；其中R2為乳糖；χ為氧；m= l，n= 11。所述的聯乙炔的類脂單體具有以下結構CH3- (CH2) n-C = C-C = C- (CH2) m_C00H，其中 m = 9，η = 11。所述的磷脂單體具有以下結構(CH2) 13-C00-CH-CH2-C00- (CH2) 13︱CH2-0-P03:0-CH2CH2N+ (CH3) 3將3 μ L濃度為lOmg/mL的禽流感病毒HAl蛋白溶液加入到2mL上述藍色的光敏 囊泡中，在30°C水浴中恆溫5分鐘後，光敏囊泡溶液由藍色變成紅色。而相應的未加入禽流 感病毒HAl蛋白溶液的藍色光敏囊泡溶液則未發生顏色變化。實施例4將單糖頭糖脂識別分子、磷脂單體、聯乙炔的類脂單體混溶於乙酸乙酯中，其中， 單糖頭糖脂識別分子與形成聯乙炔-磷脂光敏囊泡雙分子層結構的聯乙炔的類脂單體和 磷脂單體總的摩爾比為1 100，聯乙炔的類脂單體與磷脂單體的摩爾比為3 2;旋蒸 除去乙酸乙酯，加入pH為8. O的Tris-鹽酸緩衝溶液，使聯乙炔的類脂單體和磷脂單體在 Tris-鹽酸緩衝溶液中的總濃度為200mmol/L，使單糖頭糖脂利用疏水力嵌入到光敏囊泡 的聯乙炔-磷脂雙分子層的磷脂區域中；在溫度為30°C下，水浴超聲水合180分鐘，使pH為 8. O的Tris-鹽酸緩衝溶液被聯乙炔-磷脂雙分子層包裹，得到非聚合的囊泡溶液；靜置於 4°C冰箱中陳化48小時，再將此囊泡溶液用波長為200nm的紫外燈照射10秒使聯乙炔的類 脂單體聚合，最終得到藍色的具有識別禽流感H5W病毒功能的含有糖脂組合探針的光敏囊泡。所述的單糖頭糖脂識別分子為唾液酸糖脂和乳糖糖脂，其中嵌入到光敏囊泡的聚聯乙炔-磷脂雙分子層的磷脂區域中的唾液酸糖脂與乳糖糖脂的摩爾比為7 3。所述的唾液酸糖脂具有以下結構R1-X- (C2H4O) 2- (C2H4O) m_CH2- (CH2) n_CH3 ；其中氓為唾液酸；χ為氧；m = 2，η= 14;所述的乳糖糖脂具有以下結構R2-X- (C2H4O) 2- (C2H4O) m_CH2- (CH2) n_CH3 ；其中R2為乳糖；χ為氧；m = 2，n= 14。所述的聯乙炔的類脂單體具有以下結構CH3-(CH2)n-C = C-C = C-(CH2)m-COOH,其中 m = 10，η = 30 ；所述的磷脂單體具有以下結構(CH2) 26-C00-CH-CH2-C00- (CH2) 26CH2-0-P03:0-CH2CH2N+ (CH3) 3將4μ L濃度為lOmg/mL的禽流感病毒HAl蛋白溶液加入到2mL上述藍色的光敏 囊泡中，在30°C水浴中恆溫5分鐘後，光敏囊泡溶液由藍色變成紅紫色。而相應的未加入禽 流感病毒HAl蛋白溶液的藍色光敏囊泡溶液則未發生顏色變化。實施例5將單糖頭糖脂識別分子、磷脂單體、聯乙炔的類脂單體混溶於甲醇中，其中，單糖 頭糖脂識別分子與形成聯乙炔_磷脂光敏囊泡雙分子層結構的聯乙炔的類脂單體和磷脂 單體總的摩爾比為1 100，聯乙炔的類脂單體與磷脂單體的摩爾比為3 2;旋蒸除去甲 醇，加入pH8. O巴比妥鈉-鹽酸緩衝液，使聯乙炔的類脂單體和磷脂單體在巴比妥鈉_鹽酸 緩衝液中的總濃度為200mmol/L，使單糖頭糖脂利用疏水力嵌入到光敏囊泡的聯乙炔-磷 脂雙分子層的磷脂區域中；在溫度為30°C下，水浴超聲水合180分鐘，使pH8. O巴比妥 鈉_鹽酸緩衝液被聯乙炔_磷脂雙分子層包裹，得到非聚合的囊泡溶液；靜置於4°C冰箱中 陳化2小時，再將此囊泡溶液用波長為360nm的紫外燈照射600秒使聯乙炔的類脂單體聚 合，最終得到藍色的具有識別禽流感H5W病毒功能的含有糖脂組合探針的光敏囊泡。所述的單糖頭糖脂識別分子為唾液酸糖脂和乳糖糖脂，其中嵌入到光敏囊泡的聚 聯乙炔-磷脂雙分子層的磷脂區域中的唾液酸糖脂與乳糖糖脂的摩爾比為3 7。所述的唾液酸糖脂具有以下結構R1-X- (C2H4O) 2- (C2H4O) m_CH2- (CH2) n_CH3 ；其中氓為唾液酸；χ為氧；m= l，n = 8;所述的乳糖糖脂具有以下結構R2-X- (C2H4O) 2- (C2H4O) m_CH2- (CH2) n_CH3 ；其中R2為乳糖；χ為氧；m= l，n = 8。所述的聯乙炔的類脂單體具有以下結構CH3-(CH2)n-C = C-C = C-(CH2)m-COOH,其中 m = 0，η = 17。所述的磷脂單體具有以下結構
(CH2) 10-COO-CH-CH2-COO- (CH2) 10CH2-0-P03:0-CH2CH2N+ (CH3) 3將4μ L濃度為lOmg/mL的禽流感病毒HAl蛋白溶液加入到2mL上述藍色的光 敏 囊泡中，在30°C水浴中恆溫5分鐘後，光敏囊泡溶液由藍色變成紫紅色。而相應的未加入禽 流感病毒HAl蛋白溶液的藍色光敏囊泡溶液則未發生顏色變化。實施例6將單糖頭糖脂識別分子、磷脂單體、聯乙炔的類脂單體混溶於甲醇與氯仿的混合 溶劑中，其中，單糖頭糖脂識別分子與形成聯乙炔-磷脂光敏囊泡雙分子層結構的聯乙炔 的類脂單體和磷脂單體總的摩爾比為1 5，聯乙炔的類脂單體與磷脂單體的摩爾比為 3 2;旋蒸除去甲醇與氯仿的混合溶劑，加入pH為6. O的磷酸鹽緩衝溶液，使聯乙炔的類 脂單體和磷脂單體在磷酸鹽緩衝溶液中的總濃度為200mmol/L，使單糖頭糖脂利用疏水力 嵌入到光敏囊泡的聯乙炔-磷脂雙分子層的磷脂區域中；在溫度為90°C下，探針超聲水合 10分鐘，使PH為6. O的磷酸鹽緩衝溶液被聯乙炔-磷脂雙分子層包裹，得到非聚合的囊泡 溶液；靜置於4°C冰箱中陳化12小時，再將此囊泡溶液用波長為264nm的紫外燈照射30秒 使聯乙炔的類脂單體聚合，最終得到藍色的具有識別禽流感H5W病毒功能的含有糖脂組 合探針的光敏囊泡。所述的單糖頭糖脂識別分子為唾液酸糖脂和葡萄糖糖脂，其中嵌入到光敏囊泡的 聚聯乙炔-磷脂雙分子層的磷脂區域中的唾液酸糖脂與葡萄糖糖脂的摩爾比為1 1。所述的唾液酸糖脂具有以下結構R1-X- (C2H4O) 2- (C2H4O) m_CH2- (CH2) n_CH3 ；其中Rl為唾液酸；χ為氧；m = l，n = 11 ;所述的葡萄糖糖脂具有以下結構R2-X- (C2H4O) 2- (C2H4O) m_CH2- (CH2) n_CH3 ；其中R2為乳糖；χ為氧；m= l，n= 11。所述的聯乙炔的類脂單體具有以下結構CH3-(CH2)n-C = C-C = C-(CH2)m-COOH,其中 m = 10，η = 10。所述的磷脂單體具有以下結構(CH2) 13-COO-CH-CH2-COO- (CH2) 13CH2-0-P03:0-CH2CH2N+ (CH3) 3將6 μ L濃度為lOmg/mL的禽流感病毒HAl蛋白溶液加入到2mL上述藍色的光敏 囊泡中，在30°C水浴中恆溫5分鐘後，光敏囊泡溶液由藍色變成紅色。而相應的未加入禽流 感病毒HAl蛋白溶液的藍色光敏囊泡溶液則未發生顏色變化。
權利要求
一種檢測禽流感病毒的含有單糖頭糖脂組合探針的光敏囊泡，包括內水相、聚聯乙炔-磷脂雙分子層以及作為組合探針的具有識別禽流感病毒功能的單糖頭糖脂識別分子；其特徵是具有識別禽流感病毒功能的單糖頭糖脂識別分子利用疏水力嵌入到光敏囊泡的聚聯乙炔-磷脂雙分子層的磷脂區域中，內水相被聚聯乙炔-磷脂雙分子層包裹在其中而形成光敏泡囊；所述的單糖頭糖脂識別分子與形成光敏囊泡雙分子層結構的聯乙炔的類脂單體和磷脂單體總的摩爾比為1∶100～1∶5，聚聯乙炔-磷脂雙分子層由聯乙炔的類脂單體和磷脂單體聚合而成，聯乙炔的類脂單體與磷脂單體的摩爾比為1∶1～4∶1；所述的單糖頭糖脂識別分子為唾液酸糖脂和乳糖糖脂或葡萄糖糖脂，其中唾液酸糖脂與乳糖糖脂或葡萄糖糖脂的摩爾比為1∶9～9∶1；所述的唾液酸糖脂具有以下結構R1-X-(C2H4O)2-(C2H4O)m-CH2-(CH2)n-CH3；其中R1為唾液酸；X為氧或碳；m＝1～2，n＝8～14；所述的乳糖糖脂或葡萄糖糖脂具有以下結構R2-X-(C2H4O)2-(C2H4O)m-CH2-(CH2)n-CH3；其中R2為乳糖或葡萄糖；X為氧或碳；m＝1～2，n＝8～14。
2.根據權利要求1所述的檢測禽流感病毒的含有單糖頭糖脂組合探針的光敏囊泡，其 特徵是所述的聯乙炔的類脂單體具有以下結構CH3-(CH2)n-C = C-C = C-(CH2)m-COOH,其中m = 0 10，η = 17 30。
3.根據權利要求1所述的檢測禽流感病毒的含有單糖頭糖脂組合探針的光敏囊泡，其 特徵是所述的磷脂具有以下結構R1-COO-CH-CH2-COO-R2 ；CH2-O-PCV-O-CH2CH2N+ (CH3) 3其中=R1和R2均為10 26個碳的脂肪鏈。
4.根據權利要求1所述的檢測禽流感病毒的含有單糖頭糖脂組合探針的光敏囊泡，其 特徵是所述的內水相為去離子水或ρΗ在6 8之間的緩衝溶液。
5.根據權利要求4所述的檢測禽流感病毒的含有單糖頭糖脂組合探針的光敏囊泡，其 特徵是所述的緩衝溶液是磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩衝液、磷酸鹽緩衝溶液、Tris-鹽酸緩 衝溶液或巴比妥鈉_鹽酸緩衝液中的一種。
6.一種根據權利要求1 5任意一項所述的檢測禽流感病毒的含有糖脂組合探針的 光敏囊泡的製備方法，其特徵是將單糖頭糖脂識別分子、磷脂單體、聯乙炔的類脂單體混 溶於有機溶劑中，其中，單糖頭糖脂識別分子與形成聚聯乙炔-磷脂光敏囊泡雙分子層結 構的聯乙炔的類脂單體和磷脂單體總的摩爾比為1 100 1 5，聯乙炔的類脂單體與磷 脂單體的摩爾比為1 1 4 1 ；旋蒸除去有機溶劑，加入水相溶液使聯乙炔的類脂單體 和磷脂單體在水相溶液中的總濃度為0. 01 200mmol/L，使單糖頭糖脂利用疏水力嵌入到 光敏囊泡的聯乙炔-磷脂雙分子層的磷脂區域中；在溫度為30 90°C下，超聲水合10 180分鐘，使內水相被聯乙炔-磷脂雙分子層包裹，得到非聚合的囊泡溶液；靜置於4°C冰箱 中陳化2 48小時，再將此囊泡溶液用波長為200 360nm的紫外燈照射10 600秒使 聯乙炔的類脂單體聚合，最終得到具有識別禽流感病毒功能的含有糖脂組合探針的光敏囊泡；所述的單糖頭糖脂識別分子為唾液酸糖脂和乳糖糖脂或葡萄糖糖脂，其中唾液酸糖脂 與乳糖糖脂或葡萄糖糖脂的摩爾比為19 91; 所述的唾液酸糖脂具有以下結構 R1-X- (C2H4O) 2- (C2H4O) ffl-CH2" (CH2) n-CH3 ； 其中=R1為唾液酸；X為氧或碳；m = 1 2，η = 8 14 ； 所述的乳糖糖脂或葡萄糖糖脂具有以下結構 R2-X- (C2H4O) 2- (C2H4O) m-CH2- (CH2) n_CH3 ； 其中=R2為乳糖或葡萄糖；X為氧或碳；m = 1 2，η = 8 14。
7.根據權利要求6所述的製備方法，其特徵是所述的有機溶劑為丙酮、氯仿、二氯甲 烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇中的一種或大於一種以上的混合物。
8.根據權利要求6所述的製備方法，其特徵是所述的水相溶液為去離子水或ρΗ在 6 8之間的緩衝溶液。
9.根據權利要求8所述的製備方法，其特徵是所述的緩衝溶液是磷酸二氫鉀_氫氧 化鈉緩衝液、磷酸鹽緩衝溶液、Tris-鹽酸緩衝溶液或巴比妥鈉-鹽酸緩衝液中的一種。
10.根據權利要求6所述的製備方法，其特徵是所述的超聲是探針超聲或水浴超聲。
全文摘要
本發明屬於具有糖脂探針的聚聯乙炔囊泡生物傳感器領域，特別涉及檢測禽流感病毒的含有糖脂組合探針的光敏囊泡及其製法。作為組合探針的具有識別禽流感病毒功能的單糖頭糖脂識別分子利用疏水力嵌入到光敏囊泡的聚聯乙炔-磷脂雙分子層的磷脂區域中，內水相被聚聯乙炔-磷脂雙分子層包裹在其中而形成光敏泡囊；聚聯乙炔-磷脂雙分子層由聯乙炔的類脂單體和磷脂單體聚合而成；嵌入到磷脂區域中的單糖頭糖脂是乳糖糖脂或葡萄糖糖脂和唾液酸糖脂；本發明的將兩種單糖頭糖脂組裝後對識別禽流感病毒的能力，比使用單一功能性唾液酸糖頭或唾液酸-半乳糖天然糖頭對禽流感病毒的檢測能力有顯著的提高，且光敏囊泡變色響應時間更加短暫。
文檔編號C12Q1/04GK101805801SQ200910077739
公開日2010年8月18日 申請日期2009年2月13日 優先權日2009年2月13日
發明者江龍, 鄧潔麗 申請人:中國科學院化學研究所