一種可大幅提高包涵體蛋白復性效率的高分子複合膠束及其復性工藝的製作方法

2023-05-25 14:02:26

本發明屬於高分子材料領域，涉及一種可大幅提高包涵體蛋白復性效率的高分子複合膠束及其復性工藝。

背景技術：

蛋白質和多肽藥物是生物製藥行業的支柱，目前，市場上超過200個蛋白質藥物正在進行臨床前和臨床試驗。此類蛋白質藥物主要以大腸桿菌為宿主菌以「重組蛋白」的形式進行表達和生產。但是在大腸桿菌中表達的目的蛋白常常以包涵體的形式沉積於細胞內，表現為無活性的不溶性聚集物，如何對包涵體蛋白進行高效率的復性以獲得活性產品是生物工程產業化經常面臨的一個難題。

目前，包涵體蛋白體外復性的方法主要有透析和稀釋復性法、摺疊促進劑協助復性法、天然分子伴侶介導的復性法以及層析摺疊復性法等。這些方法往往操作複雜、成本高昂、復性效率低下，並且方法的選擇往往局限於蛋白質自身結構的複雜性，適用範圍很窄，因此發展一種適用範圍廣並且可以促使包涵體蛋白高效率復性的新技術是很有價值的。

技術實現要素：

本發明的目的是針對現有技術中存在的不足，提供一種經濟且適用範圍廣的可大幅提高包涵體蛋白復性效率的高分子複合膠束，同時提供了該高分子複合膠束高效率復性包涵體蛋白的復性工藝。該複合膠束可提高包涵體蛋白的復性效率，並且針對不同特性的包涵體蛋白，通過調節相應高分子複合膠束的組成，均能達到較高效率的復性效果。

本發明的技術方案：

一種可大幅提高包涵體蛋白復性效率的高分子複合膠束，由粒徑為30-500nm且均勻分布的顆粒構成，所述複合膠束由兩種雙親性嵌段共聚物組成，兩種雙親性嵌段共聚物中包括一種親水端具有環境響應性的雙親性嵌段共聚物和一種為親水端不帶環境響應性的雙親性嵌段共聚物，該複合膠束在一定條件下為核-殼結構，核層和殼層分別由兩種雙親性嵌段共聚物的疏水端和親水端混合組成。

所述兩種雙親性嵌段共聚物的疏水端為5-20kda(千道爾頓)，且兩種疏水端的分子量相差不超過10kda。

所述親水端具有環境響應性的雙親性嵌段共聚物，其親水環境響應性鏈段為具有溫度響應性的聚n-異丙基丙烯醯胺(poly(n-isopropylacrylamide),pnipam)、聚2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯(poly(2-(2-methoxyethoxy)ethylmethacrylate),pmeo2ma)，或者具有ph響應性的聚β氨酯(poly(β-aminoester),pae)，或者具有溫度和ph雙重響應性的聚甲基丙烯酸n,n-二甲氨基乙酯(poly(2-(dimethylamino)ethylmethacrylate),pdmaema)、聚n-2-乙氨基乙基丙烯醯胺(poly(n-[2-(diethylamino)ethyl]acrylamide),pdeaeam)；其疏水鏈段為聚已內酯(poly(ε-caprolactone),pcl)、聚乳酸(polylactide,pla)或者聚苯乙烯(polystyrene,ps)。

針對帶正電荷的包涵體蛋白(等電點pi>7.0)的復性，所述親水端具有環境響應性的雙親性嵌段共聚物，其親水環境響應性鏈段混聚了疏水類單體：包括但不限於n-叔丁基丙烯醯胺(n-tert-butylacrylamide)、n-苯基丙烯醯胺(n-phenylacrylamide)；和帶正電荷類的單體：包括但不限於帶氨基類(-nh2)單體、帶叔胺類單體(-nr1r2，r1、r2可相同也可不同)、帶季銨鹽類單體(-n+r1r2r3)、帶胍基類單體、帶咪唑基類單體。針對帶負電荷的包涵體蛋白(等電點pi<7.0)的復性，所述親水端具有環境響應性的雙親性嵌段共聚物，其親水環境響應性鏈段混聚了疏水性單體：包括但不限於n-叔丁基丙烯醯胺(n-tert-butylacrylamide)、n-苯基丙烯醯胺(n-phenylacrylamide)；和帶負電荷的單體：包括但不限於帶羧基(-cooh)類單體、帶磷酸基團類單體、帶磺酸基類單體。

所述親水端不具有環境響應性的雙親性嵌段共聚物，其親水鏈段為聚乙二醇(poly(ethyleneglycol),peg)、聚2一甲基丙烯醯氧乙基磷醯膽鹼(poly(2-methacryloyl-oxyethylphosphorylcholine),pmpc)，其疏水鏈段為聚已內酯(poly(ε-caprolactone),pcl)、聚乳酸(polylactide,pla)或者聚苯乙烯(polystyrene,ps)。

一種可大幅提高包涵體蛋白復性效率的高分子複合膠束，用於促使包涵體蛋白的復性，其單次復性工藝包括如下步驟：

1)將包涵體蛋白溶解到到變性緩衝溶液中製得變性蛋白溶液，所述變性緩衝液含有6m鹽酸胍、edta和dtt。

2)製備含有高分子複合膠束的復性緩衝溶液，針對帶正電荷的包涵體蛋白，所用高分子複合膠束，其親水環境響應性鏈段混聚了疏水類單體和帶正電荷類單體；針對帶負電荷的包涵體蛋白，所用高分子複合膠束，其親水環境響應性鏈段混聚了疏水類單體和帶負電荷類單體。

3)將製備的含有高分子複合膠束的復性緩衝溶液於一定條件下穩定一定時間以獲得呈核-殼-冠結構的高分子複合膠束，然後將上述溶液與變性的蛋白溶液混合均勻，於適當條件下進行復性實驗。

4)室溫下隨時間監測酶的活性。

一種可大幅提高包涵體蛋白復性效率的高分子複合膠束，用於促使包涵體蛋白的復性，其連續復性工藝包括如下步驟：

1)將包涵體蛋白溶解到到變性緩衝溶液中製得變性蛋白溶液，所述變性緩衝液含有6m鹽酸胍、edta和dtt。

2)製備含有高分子複合膠束的復性緩衝溶液，針對帶正電荷的包涵體蛋白，所用高分子複合膠束，其親水環境響應性鏈段混聚了疏水類單體和帶正電荷類單體；針對帶負電荷的包涵體蛋白，所用高分子複合膠束，其親水環境響應性鏈段混聚了疏水類單體和帶負電荷類單體。

3)將製備的含有高分子複合膠束的復性緩衝溶液于于一定條件下穩定一定時間以獲得呈核-殼-冠結構的高分子複合膠束，然後將一定量的變性蛋白質以2-10μl/s的流速分批稀釋到復性緩衝液中，並將分批覆性完畢的活性蛋白分離出來。

4)室溫下監測酶的活性。

該高分子複合膠束促使包涵體蛋白高效率復性的原理：

在生物體內，新生多肽鏈的從頭摺疊到具有活性的狀態需要一系列的分子伴侶發揮調控作用。當缺少分子伴侶輔助時，新生肽鏈中的疏水胺基酸殘基之間容易相互聚集，從而形成沒有活性的不溶的包涵體。本發明開發出一種新的帶電荷的具有核-殼-冠結構的複合膠束，在適當的環境刺激下，處於殼層的環境響應性親水部分發生相分離，疏水塌縮形成新的殼層，而不帶環境響應性的親水部分則作為冠層，阻止了複合膠束之間的聚集，使這種帶有疏水表面的核-殼-冠納米結構能夠穩定存在，從結構和功能上精確模擬天然分子伴侶，從而可以促使包涵體蛋白高效率復性。以帶正電的包涵體蛋白為例，使用變性劑和還原劑使包涵體蛋白完全變性以模擬新生肽鏈。沒有複合膠束存在時，當把變性的包涵體蛋白快速稀釋到復性緩衝液中時，多肽鏈之間由於疏水相互作用快速聚集，形成無活性的聚集體，自發復性效率非常低(圖1，過程i)。當把變性的包涵體蛋白快速稀釋到含有帶正電荷的高分子複合膠束復性緩衝液中時，在疏水作用力的推動下，多肽鏈快速吸附到複合膠束表面的疏水受限空腔中，從而阻止了多肽鏈之間的聚集；同時，在同種電荷相斥作用下，多肽鏈中的正電片斷可以從複合膠束的疏水受限空腔表面解離，從而逐漸帶動多肽鏈的整體正確摺疊，最終摺疊成活性狀態(圖1，過程ii)。當把變性的包涵體蛋白快速稀釋到含有帶負電荷的高分子複合膠束復性緩衝液中時，雖然複合膠束抑制的多肽鏈之間的聚集，但是由於異性電荷相吸作用，多肽鏈緊密的吸附在複合膠束的疏水受限空腔表面，從而抑制了多肽鏈自發調節復性(圖1，過程iii)。但是，當底物為帶負電的包涵體蛋白時，帶負電荷的高分子複合膠束能夠很好的發揮促使其復性作用(原理同圖1，過程ii)。

本發明的優點是：

由兩種雙親性嵌段共聚物形成的核-殼-冠結構的複合膠束，能夠在水體系中穩定存在，同時表面具有疏水性質和電荷性質可調節的受限空腔；針對不同特性的包涵體蛋白，通過加入相應的複合膠束，可以顯著提高包涵體蛋白的復性效率；當變性蛋白復性完成時，可以自發的從膠束表面的受限空腔內解離，從而其能夠連續多次的發揮作用；其製備方法及復性工藝簡單、易於操作，適用底物蛋白範圍廣，復性設備成本低，效率高，易於推廣應用。

附圖說明

圖1為複合膠束促使包涵體蛋白復性作用機制原理圖。

圖2為peg/p(ni-co-ntb-co-gua)複合膠束輔助變性溶菌酶復性動力學圖。

圖3為peg/p(ni-co-ntb-co-aac)複合膠束輔助變性碳酸酐酶復性動力學圖。

具體實施方式

以下通過非限定性實例進一步詳細說明本發明。

實施例1：peg/p(ni-co-ntb-co-gua)複合膠束輔助變性溶菌酶復性

採用raft和rop的方法合成了嵌段共聚物pcl82-b-peg114和pcl78-b-p(ni60-co-ntb18-co-gua9)，室溫下將兩種嵌段共聚物超聲溶解在超幹四氫呋喃中，過夜，共聚物溶液濃度均為5mg/ml，按照pcl-b-peg溶液和pcl-b-p(ni-co-ntb-co-gua)溶液體積比1:6均勻混合兩種共聚物溶液，充分混勻後將上述混合溶液快速加入到適量冰水中，冰浴狀態下超聲10min後將上述混合溶液用冰水進行透析以除去四氫呋喃，透析完畢後，加水定容，最後製得嵌段共聚物的濃度為0.5mg/ml的peg/p(ni-co-ntb-co-gua)高分子複合膠束溶液。

將溶菌酶加入到變性緩衝溶液中製得變性溶菌酶溶液，具體為稱取5mg溶菌酶、0.5732g鹽酸胍、5μl1mdtt、40μl0.5mph＝8.0tris-cl溶液，然後用滅菌超純水定容至1ml，37℃變性12h備用。

製備含有高分子複合膠束的復性緩衝溶液。具體為取1850μlpeg/p(ni-co-ntb-co-gua)複合膠束、80μl0.5mph＝8.0tris-cl溶液、10μl1medta、20μl150mmgsh、20μl50mmgssh，將上述溶液混合均勻後40℃下溫浴20min，然後取20μl上述已變性的溶菌酶溶液快速稀釋到上述復性緩衝溶液中，於40℃下進行復性實驗。室溫下隨時間監測酶的活性。對照組將peg/p(ni-co-ntb-co-gua)複合膠束替換成滅菌超純水，其餘步驟一樣。

溶菌酶的活性測試以容壁微球菌為底物，稱取3mg容壁微球菌，用10ml66mmph＝6.5的磷酸緩衝溶液溶解，向500μl容壁微球菌溶液中加入50μl復性溶液，快速混合，室溫檢測反應液在450nm處的吸光值變化，1min內的吸光值下降速率(扣除空白實驗中底物水解速率後)，與酶活性成正比，求出變化斜率，與100％酶活性相比得到相對酶活性。

測試結果如圖2所示，測試結果表明：peg/p(ni-co-ntb-co-gua)複合膠束能夠顯著提高溶菌酶的復性產率，復性完成時，實驗組的復性產率高達97％，而對照組僅僅為34％。結果表明，帶正電荷的peg/p(ni-co-ntb-co-gua)複合膠束能夠高效率的促使帶正電荷的包涵體蛋白復性。

實施例2：peg/p(ni-co-ntb-co-aac)複合膠束輔助變性碳酸酐酶復性

採用raft和rop的方法合成了嵌段共聚物pcl82-b-peg114和pcl78-b-p(ni54-co-ntb16-co-aac8)，室溫下將兩種嵌段共聚物超聲溶解在超幹四氫呋喃中，過夜，共聚物溶液濃度均為5mg/ml，按照pcl-b-peg溶液和pcl-b-p(ni-co-ntb-co-aac)溶液體積比1:6均勻混合兩種共聚物溶液，充分混勻後將上述混合溶液快速加入到適量冰水中，冰浴狀態下超聲10min後將上述混合溶液用冰水進行透析以除去四氫呋喃，透析完畢後，加水定容，最後製得嵌段共聚物的濃度為0.5mg/ml的peg/p(ni-co-ntb-co-aac)高分子複合膠束溶液。

將碳酸酐酶加入到變性緩衝溶液中製得變性溶菌酶溶液，具體為稱取5mg碳酸酐酶、0.5732g鹽酸胍、40μl0.5mph＝8.0tris-cl溶液，然後用滅菌超純水定容至1ml，37℃變性12h備用。

製備含有高分子複合膠束的復性緩衝溶液。具體為取4750μlpeg/p(ni-co-ntb-co-aac)複合膠束、200μl0.5mph＝7.5tris-cl溶液，將上述溶液混合均勻後40℃下溫浴20min，然後取50μl上述已變性的溶菌酶溶液快速稀釋到上述復性緩衝溶液中，於40℃下進行復性實驗。室溫下隨時間監測酶的活性。對照組將peg/p(ni-co-ntb-co-aac)複合膠束替換成滅菌超純水，其餘步驟一樣。

碳酸酐酶的活性測試以4-硝基苯基乙酸酯(pnpa)為底物為底物，稱取0.0725gpnpa，用5ml重蒸處理過的乙腈溶液溶解，取20μlpnpa溶液，加入600μl復性溶液，快速混合，室溫檢測反應液在400nm處的吸光值變化，1min內的吸光值升高速率(扣除空白實驗中底物水解速率後)，與酶活性成正比，求出變化斜率，與100％酶活性相比得到相對酶活性。

測試結果如圖3所示，測試結果表明：peg/p(ni-co-ntb-co-aac)複合膠束能夠明顯提高碳酸酐酶的復性產率，復性完成時，實驗組的復性產率達58％，而對照組僅僅為30％。結果表明，帶負電荷的peg/p(ni-co-ntb-co-aac)複合膠束能夠高效率的促使帶負電荷的包涵體蛋白復性。