含有寡聚半乳糖醛酸和聚陽離子糖的組合物的製作方法

2023-05-15 02:50:41 1

專利名稱：：含有寡聚半乳糖醛酸和聚陽離子糖的組合物的製作方法含有寡聚半乳糖醛酸和聚陽離子糖的組合物發明領域本發明涉及含有一種或多種寡聚半乳糖醛酸((1—4)-oc-D-聚半乳糖醛酸或任何其他可呈"蛋盒(eggbox)"構象的寡糖(oligoguluronan)的"生物活性"組合物，該構象通過一種或多種聚陽離子糖來進一步穩定，聚陽離子糖優選殼聚糖寡糖或殼聚糖多糖。本發明還涉及製備該組合物的方法及其在醫學、藥物、農業、保健食品、食品、飼料、織物、化妝品、工業和/或環境應用中的用途。
背景技術：
：果膠和果膠片段天然多糖，如澱粉、纖維素、幾丁質、藻酸鹽和果膠具有很大的技術重要性，因為它們可以大量獲得並且具有通常在合成聚合物中不存在的特定特徵。'果膠構成緻密的分子網絡，這就是植物細胞壁的許多機械特性的原因。果膠的須狀區(鼠李聚糖半乳糖醛酸)與光滑的同型聚半乳糖醛酸(聚半乳糖醛酸)結構域共存，該結構域可以按照所謂的"蛋盒模型，，形成二聚物(Grant,FEBSletters,第32巻，p.195-198，1973)。通過圓二色性，已經證實了這種鉤的鏈間螯合作用的"蛋盒"構象的存在(POWELL等，JournalofMolecularBiologyvol.155，p.517-531，1982)。細胞壁中這樣的連接區域的程度主要取決於聚陰離子的電荷密度，二價陽離子的可用性，並受曱酯化和乙醯酯化的抑制(Liners等，PlantPhysiology,第90巻，p.1090-1104，1992)。果膠還是參與形態學過程和宿主-病原體相互作用的特許乾。蛋白水解酶釋放寡聚半乳糖醛酸，其可以調節細胞壁基質和原生質體內的不同生理過程。還已知在不同的濃度下，這些寡聚半乳糖醛酸可以改變細胞的生物活性。因此，這些寡聚半乳糖醛酸適用於處理植物，尤其在基於使用這些天然產物的生長和保護植物的方法中。更特別地，這些寡聚半乳糖醛酸適用於誘導提高的對抗病原體的先天植物防禦。VanCutsem和Messiaen(Planta，第208巻，p.246-256，1999)描述了在竟爭單價和二價陽離子(Na+，Ca2+)的存在下，聚胺對聚半乳糖醛酸的吸附。在聚胺中，測試了腐胺、亞精胺和精胺。作者表明植物細胞中由€&2+結合的(1—4)-cc-D-寡聚半乳糖醛酸啟動的信號轉導級聯被亞精胺和精胺所阻斷，但不被腐胺阻斷。猜測亞精胺和精胺對Ca2+誘導的果膠片段的超分子構象的破壞是果膠信號抑制的原因。因此，看起來聚胺可以通過調節果膠信號的轉導而作用於植物細胞生理學。其他寡糖如藻酸鹽可以具有這種"蛋盒"構象並可以作用於植物生理學。幾丁質和殼聚糖幾丁質是自然界廣泛分布的天然高分子量聚合物(纖維素之後的第二大主要生物聚合物)，並且是昆蟲和曱殼動物外殼的主要成分。幾丁質還是一些真菌和其他生物體的細胞壁的一部分。通過幾丁質的化學修飾在工業水平上產生殼聚糖，並且也在少數生物體中天然存在。殼聚糖是N-乙醯(D)-葡糖胺和(D)-葡糖胺的無規共聚物。國際專利申請W0G3/068824描述了殼聚糖的化學結構和獲得這種殼聚糖的各種方法。此外，該專利申請還描述了從真菌和酵母生物質分離細胞壁衍生物的方法以及從該方法獲得殼聚糖的方法。該專利申請還描述了殼聚糖在醫學、藥物、農業、保健食品、食品、織物、化妝品、工業和/或環境應用中的用途。然而，殼聚糖仍然具有一些缺陷，如獲得生理效應所需的高濃度(超過lg/升)，並且在這樣的高濃度下可能是有毒的。果膠和殼聚糖混合物US5919574描述了從果膠和殼聚糖製造的生物可降解疊層薄膜。該專利闡述了殼聚糖的陽離子特性提供了利用與陰離子的部分脫甲基果膠的靜電相互作用的機會。該專利的發明人稱在果膠的羧酸根基團和殼聚糖的質子化氨基之間存在氫鍵結合和靜電力的組合且相適水活度使得果膠膜和殼聚糖膜之間可以存在穩定的界面。該專利還描述了所獲得的疊層薄膜在許多應用，包括醫學應用(貼劑、生物可降解的藥袋或包的生產、活細胞的包膠等)中的用途。國際專利申請W001/82724描述了含有氨基多糖和負電荷多糖的組合物。在測試的氨基多糖中，發明人描述了與負電荷多糖，如果膠的結合殼聚糖和殼聚糖衍生物。然而，這些文獻中沒有一篇描述可以改善果膠片段(寡聚半乳糖醛酸)的生物活性。也沒有一篇描述殼聚糖分子對鈣誘導的聚半乳糖醛酸的生物活性構象的任何作用。更特別地，這些文獻中沒有一篇描述對於果膠和殼聚糖片段的組合的誘導劑(elicitor)或肥料作用。已知傳統上通過使用合成的化學藥品實現植物生產，而合成的化學藥品通常對環境不利並且通常是昂貴的。化學藥品的用量，使得產生合適的有機農業並最小化農業的環境影響。在過去的數十年中，有機產品的銷售顯示出每年增加至少20%。有機食品和飲料零售業中增長最快的部門大約為128億美元。有機食品也正在一些國家內獲得國際認可，如日本和德國，變成重要的國際有機食品市場。發明目的本發明的第一個目的是提供具有改良特性的聚半乳糖醛酸的組合物，改良特性如穩定的蛋盒構象，優選通過2F4抗體可檢測的(F.LINERS,J.-J.LETESSON，C.DIDEMBOURG和P.VANCUTSEM(1989)Monoclonalantibodiesagainstpectin:recognitionofaconformationinducedbycalcium(對抗果膠的單克隆抗體由鉤誘導的構象的識別)，PlantPhysiol.91，1419-1424),尤其是對於植物生長和保護的改善的生物活性。本發明的另一個目的是提出由天然產物製得的組合物。本發明的再一個目的是提供一種組合物，其對於寡聚半乳糖醛酸具有新特性，並且其可以用於醫學、藥物、保健食品、食品、織物、化妝品、工業和/或環境應用中。發明概迷本發明涉及含有一種或多種寡聚半乳糖醛酸(優選(1—4)-a-D-寡聚半乳糖醛酸、oligoguluronan(如藻酸鹽的寡聚物)或任何可以呈現"蛋盒"構象的寡聚物(添加一種或多種陽離子(Ca2+、Na+……)的組合物，該構象優選通過2F4來檢測，並且有利地通過(添加)一種或多種聚陽離子糖來進一步穩定。聚陽離子糖意指具有多個正電荷，優選至少6(六)個電荷的糖。有利地，這些糖是天然產物(不同於合成的聚合物或寡聚物)，這表示它們獲自天然可再生來源，具有很少或沒有改變。有利地，聚陽離子糖是寡糖或多糖，優選殼聚糖寡糖或殼聚糖聚合物。更優選，所用的殼聚糖寡糖或多糖具有低於50%的乙醯化程度，優選包括0至約50%，和高於5(五)的聚合度。此外，根據本發明的組合物中存在的寡聚半乳糖醛酸優選具有高於8(八)的聚合度(DP),優選包括9(九)至20(二十)或9(九)至15(十五)。本發明人出人意料地發現了這樣的組合物的特徵在於協同效應，這意味著其改善了寡聚半乳糖醛酸和/或可能的oligoguluronan(例如，藻酸鹽寡聚物)或其他寡糖的特徵(尤其是農藝學特性)，而且還減輕了聚陽離子糖可能的副作用，尤其是如果這些聚陽離子糖是殼7聚糖寡糖或殼聚糖聚合物。特別地，這樣的組合物出人意料地降低了殼聚糖分子可能的毒性，因此控制和減少了細胞死亡(由這些高濃度的殼聚糖分子引起的)。該組合物協同提高了每種寡糖在各種領域中的生物活性並且結合了它們各自的在各個領域中的增強效應，這些領域包括醫學、藥物、農業、保健食品、食品、飼料、織物、化妝品、工業、織物或紙張生長和/或環境應用。可以通過共價或非共價連接將該組合物結合到固體支持物表面上。特別地，該組合物是可以用於保護植物(提高對抗病原體的天然植物防禦)以及用於刺激植物生長和分化的誘導劑組合物。誘導可以解釋為基本上所有生物體的細胞和組織應答並適應外部環境條件的變化的機制。在許多情況下，這些機制使用特定化學藥品的特異性受體的途徑。當這樣的化學藥品接觸細胞表面時，它們特異性地結合特定的受體。這種結合引發了細胞內事件的級聯，包括基因的上調和下調以及細胞內特定途徑的激活或抑制。這些過程導致細胞生理學的實質性改變。因此，這些誘導劑是顯著的生理應答的引發劑。此外，非常少量的引發劑分子常常足以引起分子生理學的重要變化。基於誘導劑活性的實例包括植物或動物中免疫或抗性應答的誘導。通過膜滲透性的變化以及導致Ca'+和『流入和C1—和r流出的特定離子通道的激活來顯示出對誘導劑最早的應答(Cervone等，(1997)，"Perceptionoffungalelic"orsandsignaltransduction"(真菌誘導劑和信號轉導的接收)，AducciP編輯，Signaltransductioninplants(植物中的信號轉導),Basel,Switzerland:BirkhaiiserVerlag，153-177)。該步驟的特徵還在於跨膜勢能的快速變化。在多種情況下，注意到了膜的去極化(Kuchitsu等，(1993),"N-acetylchitooligosaccharides，bioticelicitorforphytoalexinproduction，inducetransientmembranedepolarizationinsuspension-culturedricecells"(N-乙醯殼寡糖，用於植物抗毒素產生的生物誘導劑，誘導懸浮液培養的水稻細)，Protoplasma174，79-81)。這些位於膜的作用之後為氧化爆發，植物抗毒素的合成和防禦基因的激活(Templeton和Lamb,(1988)，"Elicitorsanddefensegeneactivation，，(誘導劑和防禦基因激活)，Plant,CellandEnvironment11，395-401)。過去，使用現有的作為疾病防治的實用方法的刺激抗性的方法已經遇到了問題。這些問題包括植物毒性(變黃、壞死和一般的植物病)、缺乏顯著水平的疾病防治和缺乏再現性/可持續性。本發明的組合物有利地緩解了這些限制。另外，該組合物是肥料組合物，可以用來提高，例如，植物的產量，通過增加的(莖、葉、根……的)高度、厚度、生物量或每林植物的花/水果的數量。已知"生物量"的量度與作物產量直接相關，生物量基本上是植物生命的密度或量。然而，根據本發明的組合物還可以含有其他成分，如其他寡糖、生長調節劑(或生長因子)、礦物質、離子、營養素、食品添加劑、調味劑、色素、維生素、礦物質、香料、植物營養素和用於提高該組合物生物活性的其他生物活性分子，尤其是每種寡糖在這些不同應用中的生物活性。因此，根據本發明的組合物相當於藥物組合物，(包括疫苗)、佐劑、化妝品組合物、食品或飼料組合物(包括功能食品或功能飼料)、食品添加劑、飲料(尤其是葡萄酒、啤酒或果汁)或飲料添加劑、防治植物病害的產品(優選殺真菌組合物)、肥料、誘導劑，或這些產品的助劑。例如，根據本發明的組合物可以用於從所述飲料、有機顆粒、微生物、膠體、蛋白質、重金屬、殘餘的殺蟲劑、真菌毒素和內毒素回收。根據本發明的組合物還可以用作天然食品添加劑，用於獲得對抗各種真菌(包括酵母)和細胞的抗微生物和抗真菌活性，還可以用作佐劑，用於常規的食品防腐劑和抗褐變劑，作為適用於水果/蔬菜保藏的透氣性可食膜的成分，作為增稠劑、穩定劑或乳化劑，作為觸變劑或作為天然香精填充劑。還可以用於各種飼料加工中，因為例如，可以用作起泡劑、增稠劑或穩定劑。根據本發明組合物的抗微生物和抗真菌活性(用於保護植物種子或水果)可以用於食品或伺料工業中，用於獲得延長的保存期限、延遲的成熟和水果或蔬菜的腐爛，用於肉、甲殼動物(牡蠣)、水果、蔬菜和成品的保藏，可能與常規的防腐劑(亞^^酸鹽或苯甲酸鈉)結合或作為這些防腐劑的替代品。根據本發明的組合物還可以用於織物纖維，以薄膜的形式或通過將該纖維或薄紗浸入含有根據本發明組合物的溶液中。因此，可以改進織物纖維的特性(提高的抗細菌和/或抗真菌特性)。該織物還對應於用於治療傷口的醫用織物。根據本發明組合物的化妝品應用特別適用於皮膚護理劑(霜劑、化妝水)或頭髮護理劑(作為噴霧、香波或香波後製劑)，用於化妝組合物或牙骨中，並且還可以因為它們的抗uv特性而得到使用，用於除臭劑的製備中，用於口腔衛生的組合物中和用於色素包膠的組合物中。有利地，由於其非動物來源，可以使用該組合物，而沒有誘導過敏的風險。在環境應用中，根據本發明的組合物可以用作螯合劑(螫合重金屬)或用於處理廢水，尤其是用於分離有機化合物和重金屬的水純化技術中。它們還可以用於沉澱特定的廢棄化合物或其他汙染物，如DDT和聚氯苯，或用於固定自由基。有利地，根據本發明的組合物還可以用於紙張的製造過程中。它們可以替代一些氨基取代物，如樹膠或多聚合成的多糖，並且適用於減少化學添加劑的使用和用於提高產量。還可能的是通過使用根據本發明的組合物獲得的紙張具有更光滑的表面和更好的抗水性。它們還可以用於生產衛生紙、包裝紙和紙板。根據本發明組合物的另一種有利應用是在醫學和藥物應用中。由於這些良好的生物粘附特性，根據本發明的組合物可以用作抗粘連外科助劑，以防止外科手術過程中組織之間的粘連，以及由於良10好的粘液粘附，將其用作疫苗的佐劑。因此，本發明還涉及含有根據本發明的組合物的任何生物材料，由於本發明的化合物在胃中不消化(延遲釋放)，用於在腸內釋放化合物的特定醫學、診斷或研究應用中。本發明可以配製成用於口服和非腸道受控釋放應用的添加劑，並且還可以通過化學修飾以及藥物和其他生物功能分子的結合來提高口服載體的功效，並且還可以用於提高已知化合物的薄膜和凝膠形成特性，並可以用於製造經過皮膚的膜。其粘液粘附特性還可以用於獲得與皮膚層的良好接觸，和用於改善創新的通過局部和全身給藥的藥物傳送系統。它們還可以用於製備片劑形成、粉末的顆粒化、乳濁液製備中的賦形劑，或作為潤溼劑和塗層劑。還可以使用其各種有利的特徵，如生物粘附性以及在藥物系統中形成複合(陰離子、陽離子或兩性離子)藥物和聚合物的能力，用於提高水溶性差的藥物的溶解度，用於增強藥物穿過黏膜組織的吸收和用於加強(改善或調節)疫苗的免疫應答(作為疫苗的佐劑)。殼聚糖已知的藥物特性，尤其在傷口癒合中的特性，使得可以使用該組合物來防止或治療傷口中纖維蛋白塊的形成，防止皰痕的形成和支持細胞再生。該組合物還可以用於組織工程化、細胞移才直和細胞孩走嚢化。可以用於透氣薄膜中，以支持細胞再生，同時保護組織免受微生物侵略，以形成縫合和繃帶，用於製造重建組織和器官和/或細胞移植的體系中的人造皮膚(可以生物(降解)的縫合和繃帶)。因此，這些藥物應用可以有利地結合已知的化合物，用於組織修復，如生物材料，該生物材料含有骨顆粒或軟骨顆粒、離子和鹽、生長因子和激素和血漿衍生物，如纖維蛋白原、凝血因子、血小板，包括富含血小板的血漿和血小板少的血漿(PRP和PPP)、抗生素、維生素、分化因子、細胞因子、幹擾素、軟組織蛋白(如軟骨、彈性蛋白、纖維蛋白或其前體)等。根據本發明的組合物具有有利的水合特徵、傷口癒合特性、再生特性和抗微生物和/或抗真菌特性。根據本發明的組合物可以以各種形式存在，尤其是液體形式(例如，水溶液)，顆粒形式(納米顆粒、微球體，及其懸浮液或乳液，丸劑)，以及多孔或無孔固體形式。當考慮本發明組合物的農業和農用化肥應用時，它通常將含有另外的成分，已知這些成分對於將物質施加到生長的作物中是有用的，如一種或多種載體物質、用於pH控制的緩沖物質等。通常將水用作載體，但是也可以使用其他常規載體。將認識到處理作物所需的溶液量將取決於待處理的特定作物。這樣的用量是本領域技術人員容易確定的。根據本發明的組合物還可以容易地用於農業和農用化肥系統中，用於水果、蔬菜和作物時，作為防腐的塗層劑和生物穩定劑，作為肥料，作為提高有用土壤微生物數量和減少有害微生物數量的試劑("生物防治")。生物防治意指通過人以外的一種或多種生物體來實現接種物量的減少或病原體產生疾病活性的降低(Harman等，"Enzymes,BiologicalControlandCommercialApplications,，，(酶、生物防治和商業應用)，Trichoderma和Gliocladium，第2巻，第6章(1998))。生物防治菌林是本領域已知的，並且在多種生境和對抗各種病原體中是有效的(Harman等，參見上文)。生物防治生物體的實例可以是所鑑定的對植物疾病的生物防治有用的那些中的任一種，包括但不限於，來自以下屬的那些木黴屬(rr/c/(cre/7na)、膠黴屬(67/oc7ad/w)、腐$屬(戶/^/wz7)、疫#屬(戶力j^op/^力ora)、絲核菌屬(7力/zoc^"/s)、鐮刀菌屬(屍"^W咖)、葡萄孢屬(^^r/"s)和核盤菌屬(^c/e/^〃/7/a)(Harman等，參見上文，和美國專利No.5，474，926和6，512，166)。可以將植物種子浸泡在才艮據本發明組合物的水溶液中以防止真菌和/或微生物感染和增加植物生產。本發明的組合物還可以用於獲得種子的有效塗覆。在合適的濃度下，本發明的組合物可以通過系統和/或局部施用用於引發植物對抗寄生物感染和侵害的防禦機制(誘導劑作用)。可以通過用本發明的組合物處理的植物中誘導的某些酶活性來測量這樣的12誘導劑作用，某些酶活性如葡聚糖酶、幾丁質酶和苯丙氨酸氨裂解酶(PAL)活性。除了其誘導劑、生物穩定劑、肥料和/或防腐劑特性，根據本發明的組合物還可以用於使植物根增強和植物莖增厚。本發明的組合物還可以用作植物激素替代品、增強劑或調節劑。本發明的組合物還可以用於刺激通過植物自身合成保護劑，用於促進植物的發芽和生長。通過植物合成的保護劑實例是一氧化氛(NO)、活性氧種類(ROS)、水楊酸、茉莉酮酸、發病機理相關蛋白和植物抗毒素。可以通過噴霧、噴淋、浸泡、浸蘸、注射和通過加肥灌溉系統將根據本發明的組合物施加於植物的種子，葉、花/水果和,/或根。作為肥料，本發明的組合物可以通過土壤施肥或葉面施肥平常地施用本發明的組合物，以促進植物的發芽和生長。可以以幹形式或作為溶液的稀釋液來散布本發明的組合物。作為誘導劑，可以以噴霧形式，或作為固體來使用所需的本發明組合物，其中誘導劑與農業上可接受的粘附栽體一起存在，並作為粉末來使用，粘附載體例如為曱基纖維素或阿拉伯樹膠。可以根據本領域技術人員公知的技術來進行製劑的施用，如通過用於施用至生長中作物的噴霧。將認識到處理作物所需的溶液量將取決於待處理的特定作物。本領域技術人員可以容易地確定這樣的含量。所涉及的植物是雙子葉植物和單子葉植物，優選經濟上重要的植物，選自番茄、胡蘿蔔、黃瓜、豌豆、生菜、辣椒、甜菜、馬鈴薯、小麥、玉米、水稻、苜蓿、大麥、黑麥、棉花、向日葵、花生、甘薯、豆、菊苣、苦苣、巻心菜、孢子甘藍、防風草、蕪菁、花菜、花椰菜、蘿蔔、菠菜、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、倭瓜、南瓜、西葫蘆、蘋果、梨、甜瓜、柑桔、草莓、葡萄、樹莓、菠蘿、大豆、菸草、高粱和甘蔗。合適的觀賞植物實例是非洲堇、矮牽牛、天竺葵、一品紅、菊花、康乃馨、百日菊和草衝草。本發明的組合物還可以用於獲得已知的防治植物病害產品，如殺真菌劑、殺蟲劑、除草劑等的塗層。由於其改善的特徵，它可以用於獲得通常用於處理這些植物的殺蟲劑量的減少。(化學、冶金、電子、紡織等)中，用於塗覆固體。支持物。、'本發明的另一個方面涉及根據本發明的組合物的製備方法，其中將足量的一種或多種聚陽離子糖加入寡聚半乳糖醛酸(或任何其他合適的可以具有"蛋盒"構象的寡糖(oligoguluronan)中。有利地根據最初存在的寡聚半乳糖醛酸(或所述其他寡糖)的濃度和這些糖的聚合物來限定該足夠的含量。在根據本發明的組合物的製備方法中，將各種成分混合，只要獲得均勻的水溶液，即，沒有觀察到聚合物或凝膠的形成。此外，應用時，優選將組合物的pH維持於約5.0至約6.0(用於獲得成分的有效溶解和用於維持所處理植物的安全性)。例如，可以通過將儲液稀釋於水中或任何其他合適的溶劑中，或通過將固體形式的組合物混入水中或任何其他合適的溶劑中來製備本發明的組合物。這樣製備的組合物適用於通過局部或全身給藥途徑傳送。對於該製備方法，為了獲得優選通過2F4抗體可檢測的這種蛋盒構象，還存在適量的離子。因為不同的成分含有單價和二價離子，二價/單價摩爾比優選為約1/50至約1/300(或約1/25至約1/250毫當量)，可以將它們用於獲得這些寡聚半乳糖醛酸(或其他寡糖)的生物活性"蛋盒"構象，該構象通過加入這些糖得到進一步的穩定。在非生理學條件下(如ELISA)，可以降低二價/單價陽離子的比例，或在其中例如高Na+濃度是有害的生理學條件下(如細胞培養物)，可以升高二價/單價陽離子的比例。優選將Ca2+用作二價離子。其他二價離子也是合適的(Mn2+,Zn2+、Cu2+...)。對於具有高聚合度(高於8)的寡聚半乳糖醛酸，加入較高含量的聚陽離子糖。還根據聚陽離子糖中存在的正電荷量來限定該濃度。該濃度的特徵在於所加入的聚陽離子糖的聚合度。優選，加入的寡糖具有高於5的聚合度。有利地，根據待獲得的組合物的特徵來限定兩種成分的舍量，優選用於獲得"蛋盒"構象所需的有效穩定，該構象優選特徵在於其結合由植物探針公司(英國)(www,plantprobes.co.uk)銷售的特異性(鼠IgGl)抗體PP-2F4的能力。本發明的另一個方面涉及混合物的熟化，以提高如下舉例說明的生物活性構象中聚半乳糖醛酸分子的比例。藻酸鹽糖(oligoguluronan)在合作過程中結合Ca2+離子，該過程已經根據《蛋盒模型》進行了解釋。本領域技術人員可以使用殼聚糖寡糖或其他聚陽離子聚合物(聚胺或聚陽離子糖)穩定這些藻酸鹽蛋盒。本發明的另一個方面涉及該組合物在上述應用中，尤其是在醫學、藥物、保健食品、食品、飼料、織物、化妝品、工業、農藝和/或環境應用中，尤其是在其中觀察到組合物的兩種成分的協同效應的應用中，或在其中降低了一種或兩種單獨成分可能的缺陷的應用中的用途；例如，用於調節由單獨的成分誘導的細胞死亡，用於獲得由加入單獨的成分誘導的氧化應激反應的降低(例如，用於獲得活性氧種類如過氧化強較低的累積)和用於獲得細胞系統中提高的活性(如涉及防禦的苯丙氨酸氨裂解酶活性，該防禦對抗由病原體誘導的生物應激)。本發明的再一方面是提高植物抗病性的方法。該方法包括在有效提高植物抗病性的條件下將本發明的組合物施用於植物。如上所述進行所需的本發明組合物的應用，使用足量的所需的本發明組合物，本發明的組合物是根據選定的應用方式合適地製備的。本發明的再一方面是提高植物產量的方法，通過增加的(莖、葉、根……的)高度、厚度、生物量或每林植物的花/水果的數量。該方法包括在有效獲得較高產量的條件下將本發明的組合物施用於植物。如上所述進行所需的本發明組合物的應用，使用足量的所需的本發明組合物，本發明的組合物是根據選定的應用方式合適地製備的。參照附圖，在所附的實施例中將更詳細地描述本發明，該實施例是本發明各種實施方案的非限制性說明。實施例實施例1:殼寡糖的製備通過在pH約為5.5的約0.175M醋酸鹽緩衝液中在室溫過夜振蕩溶解濃度為約10.Og/L的殼聚糖。將該殼聚糖溶液(約90mL)與10mLPectinexUltraSPL(NovozymesA/S,Bagsvaerd，Denmark)混合。將反應混合物在約37。C孵育約24小時。通過中性殼聚糖水解產物在90%甲醇中的選擇性沉澱來分離殼寡糖。所獲得的殼寡糖組的組成列於表l中。表l:通過酶水解製備的並通過在90%曱醇中的選擇性沉澱分級分離的具有6或更高聚合度(DP)的殼寡糖的MALDI-TOF-MS光譜的指定離子組成。7B々離子組成類型1007'4(GlcN)6[M+Na]+1023,4[M+K]+1049,9(GlcN)5-GlcNAc[M+Na]十1109,9(GlcN)3-(GlcNAc)3[M+H]+1168，4(GlcN)7[M+Na]+1184，4[M+K]十1210,7(GlcN)6-GlcNAc[M+Na]+1226，4[M+K〗+1270，7(GlcN)4-(GlcNAc)3[M+H]+1329，5(GlcN)8[M+Na]+1345，5[M+K]+1371，8(GlcN)7-GlcNAc[M+Na]+1387，5[M+K]+1490，5(GlcN),[M+Nar1506，5[M+K]+1532,8(GlcN)「GlcNAc[M+Na]+1651，6(GlcN)10[M+Na]+1812，7(GlcN)[M+Na]+實施例2:寡聚半乳糖醛酸的製備通過聚半乳糖醛酸的酶水解獲得果膠寡聚物。用約10mL(1:3000)PectinexUltraSPL溶液在60分種過程中水解PGA溶液(約2%w/v，pH6.0，90mL)。將溶液煮沸約IO分鐘後，通過其鋇鹽的選擇性沉澱將果膠寡糖分級分離。所獲得的寡聚半乳糖醛酸的組成列於圖1中，其是來自果膠水解產物的寡聚半乳糖醛酸混合物的HPAEC-PAD洗脫模式。按照它們相應的聚合度來標記峰值。實施例3:蛋盒構象穩定化殼寡糖能夠穩定由鈣離子誘導的寡聚半乳糖醛酸的蛋盒構象。這種作用取決於殼寡糖聚合度、乙醯化程度(DA)和混合物中/半乳糖醛酸摩爾比。使用了單克隆抗體(稱為2F4)，其識別鈣誘導的果膠蛋盒構象。使用抗鼠免疫球蛋白覆蓋微孔將50uL抗鼠免疫球蛋白(完整分子，SIGMA)(50mMpH9.5的碳酸鹽緩沖液中約0.05mg/mL)分散至NUNC高結合能力微平板(MAXISORP)的每個孔中，並使其在4。C過夜。通過用約250mL來自牛血清的白蛋白(在含有約0.5mMCaCl2和約150mMNaCl的pH5.7的50mM醋酸鹽緩衝液中製備的約30mg/mL)在約37。c將孔孵育約2小時來阻斷非特異性結合。該溶液，以毫當量表示時，對應於l毫當量鈣，因為鈣是二價陽離子，和對應於150毫當量鈉，因為鈉是單價陽離子。除去過量白蛋白後，將竟爭溶液加入孔中。竟爭溶液的製備和使用抗體的孵育在上述含有Ca"Na+溶液的醋酸鹽緩衝液中使用100inL2F4腹水稀釋177倍來製備竟爭溶液，並用約100yL果膠物質和殼寡糖的混合溶液在約25。c預孵育約30分鐘。在將上清液分散至覆蓋抗鼠免疫球蛋白的微孔中並如上所述進行阻斷之前，將這些寡糖-抗體混合物離心在約7500g約IO分鐘。在約37°C將含有竟爭測試上清液的微平板孵育約60分鐘。在37。c加入約50jjL辣根過氧化物酶標記的綿羊抗鼠免疫球蛋白(在上述含有Ca27Na+溶液的50mM醋酸鹽緩衝液中約1:5000)約60分鐘之前，用如上所述的含有CaVNa+溶液並進一步含有約0.1%吐溫20的緩沖液將微平板洗滌八次。第二次洗滌循環後，通過約lOOiaL增強的K-藍TMB底物(NeogenCorporation,Lexington,KY，USA)在室溫黑暗中孵育約20分鐘來顯示抗體的結合。通過約50|aLINHC1來停止顯示過程。15分鐘後用TitertekmulUscan⑧在405nm測量溶液的吸收值。圖2表示通過低DA和不同聚合度的殼寡糖來穩定鈣誘導的寡半乳糖醛酸(DP9-DP15)二聚化作用。用寡聚半乳糖醛酸和不同濃度的具有DA~10%的低和高DP的殼寡糖來孵育2F4單克隆抗體。將所得到的混合物離心並將上清液分散至抗鼠Ig-覆蓋的微孔中。將結果表示為沒有殼寡糖的對照的吸收值的百分比。實施例4:體外實驗A.果膠分子阻止擬南芥(Jra6/cTo;^/sMa//a7L3)細胞懸浮液中由高濃度的完全去乙醯化的殼寡糖誘導的細胞死亡。將細胞生活力表示為細胞蛋白含量的函數(mg蛋白質/鮮重(F")。圖3表示用殼寡糖(完全去乙醯化的，5至9的DP)、寡聚半乳糖醛酸(DP高於8)及其混合物處理24小時後，擬南芥細胞懸浮液重的蛋白含量。數據是來自兩個獨立實驗中一個代表性實驗的重複三份樣品的平均土SD。將來自擬南芥林L-固l生態型Landsbergerecta葉子的懸浮液培養的細胞生長於Murashige和Skoog培養基中(約4.43g/L),該培養基含有蔗糖(約30g/L)，約0.5mg/mLMA和約0.05jag/mL激動素，pH5.7。將培養物維持於16小時/8小時光/暗光周期下，在約25'C，在100rpm的旋轉搖床上。每7天，將細胞在新鮮培養基中稀釋10倍。將待測試的殼寡糖溶解於250mL蒸餾水中，通過0.22jam膜濾器(MILLIPORE)過濾，並無菌加入約lOnil培養了三天的懸浮液細胞中，並在溫和攪拌下在約25。C孵育約24小時。將5ml反應混合物在約100g18和約4。C離心約5分鐘，以收集細胞。在約4。C將約lml約0.1M的含有約2mM巰基乙醇的硼酸鹽緩沖液(pH8.8)中的細胞均質。將均質物在約4'C在4000rpm離心約10分鐘。通過Bradford蛋白測試(BIO-RAD)測定提，物的蛋白濃度。B.殼寡糖結合寡聚半乳糖醛酸刺激了胡蘿蔔細胞懸浮液中的細胞生長。如上所述進行該實驗，但是使用胡蘿蔔("ai/CMcaro")懸浮液。通過重量測量細胞密度(細胞g/mL)。圖4表示用殼寡糖(完全去乙醯化的，5至9的DP)、寡聚半乳糖醛酸(DP高於8)及其混合物處理24小時後，胡蘿蔔細胞懸浮液的細胞密度。數據是來自兩個獨立實驗中一個代表性實驗的重複三份樣品的平均±SD。C.寡聚半乳糖醛酸和殼寡糖的特定組合比單獨的寡糖具有更高的植物防禦反應的誘導劑活性。如上所述進行該實驗。在約1.37ml補充約60raML-苯丙氨酸的約0.1M硼酸鹽緩衝液存在下(pH8.8)，在0.125ml上清液中測定PAL(EC4.3.1.5)活性，如Beaudoin-Eagan和Thorpe(Plant.Physiol78:438-441，1985)中所述的，並表示為每mg蛋白質每小時產生的肉矽酸的微摩爾量。圖5表示用殼寡糖(完全去乙醯化的，5至9的DP)、寡聚半乳糖醛酸(DP高於8)及其混合物處理24小時後，擬南芥細胞懸浮液中PAL活性的誘導。數據是來自兩個獨立實驗中一個代表性實驗的重複三份樣品的平均土SD。D.寡半乳糖醛酸和殼寡糖的特定組合比單獨應用這些寡糖誘導植物中更低的氣化應激。細胞培養條件與上述的相似。&02測量將待測試的殼寡糖溶解於約50nL蒸餾水中，通過0.22pm膜濾器(MILLIPORE)過濾，並加入約5mL培養了三天的懸浮液細胞中，並在攪拌下在約25。C孵育。在30分鐘的過程中每4分鐘取出約100jaL的等份試樣，快速旋轉離心並根據供應商的說明使用AmplexRed過氧化氫/過氧化物酶測試試劑盒(MOLECULARPROBES)測量上清液中的H力2濃度。圖6表示用殼寡糖(完全去乙醯化的，5至9的DP)、寡聚半乳糖醛酸(DP高於8)及其混合物處理24小時後，擬南芥細胞懸浮液中的過氧化氫蓄積。數據是來自兩個獨立實驗中一個代表性實驗的重複三份樣品的平均±SD。實施例5:通過番茄種子吸收寡聚半乳糖醛酸和殼寡糖的特定組合併刺激植物生長。將品種為"Moneymaker"的番恭(Zyc0/e"/cwz7escy/e/fy/z)植物的種子浸入在適於誘導果膠二聚物形成的離子條件下(Ca2+/Na+陽離子，約0.5mMCa2+/150mMNa+比例)含有寡聚半乳糖醛酸和殼寡糖混合物的溶液或除了寡糖混合物以外含有混合物所有成分的溶液(對照)中4小時。所用的殼寡糖具有25%的乙醯化程度。然後，將種子乾燥，接著種植並在6-腔種子床中的土壤中25。C下以16小時白天/8小時黑暗的狀況栽培30天。圖7表示從用殼寡糖、寡聚半乳糖醛酸及其混合物處理的種子獲得的30天大的番茄植物的生物量(新鮮的和幹的)，表示為對照植物生物量的百分比。報告了平均土SE的值(n=3)。大寫字母和小寫字母指兩個獨立的AN0VA檢驗。使用相同字母的數據沒有統計學差異(P<0.05)。實施例6:寡聚半乳糖醛酸和殼寡糖的特定組合的葉面施用協同誘導番茄植物中的防禦反應。在受控的條件下將品種"moneymaker"的番茄植物在土壤中栽培，受控條件為各自16小時/8小時亮/暗狀況，在25。C，20天，接著噴霧含有寡聚半乳糖醛酸和殼寡糖混合物的溶液，該混合物以250mg.L-l溶解於pH5.5的含有約0.01%吐溫20和約0.5mMCa2+/150mMNa+比例的溶液中。混合物中所用的殼寡聚物具有25%的乙醯化程度(DA)。作為對照，將含有約0.01%吐溫20的水噴在葉面上。24小時後，收集來自通過噴霧處理的植物的真葉，並在液氮中研磨。將粉末狀的葉片在50mM含有約5mMEDTA,約14mM0-巰基乙醇和約1.OMNaCl的pH5.2的醋酸鹽緩沖液中提取，緩沖液與葉片的比例為約lg粉末狀葉片/2ml緩沖液。然後將提取物在12000g4r離心15分鐘。分析上清液的兩種致病機理相關蛋白的活性葡聚糖酶(活性表示為釋放的葡萄糖mg/蛋白mg.分鐘)(Boudart等，(1998)Planta206:86-94)和幾丁質酶(活性表示為釋放的p-硝基酚皮摩爾/蛋白mg.分鐘)(幾丁質酶測定試劑盒，Sigma)。圖8表示葉面施用寡聚半乳糖醛酸和殼寡糖混合物24小時後，番茄植物中葡聚糖酶和幾丁質酶活性的誘導。報告了平均土SE的值(n=3)。ANOVA檢驗表示用對照溶液和混合物處理的植物之間的統計學顯著差異(P<0.05)。實施例7:寡聚半乳糖醛酸和殼寡糖的特定組合協同誘導擬南芥植物中的防禦反應。將擬南芥植物以16小時白天/8小時黑暗的狀況在25。C下生長於半固體培養基上，該培養基含有約4.4g/LMurashige和Skoog營養素、約30g/L蔗糖和約0.3g/L瓊脂。從培養基中取出成熟的植物，用pH5.7的約0.05M的MES緩衝液洗滌並轉移至含有Ca27Na+陽離子的相同緩沖液中，離子比例為約0.5mMCa2+/150mMNa+，該緩衝液含有單獨的寡聚半乳糖醛酸(DP9-10)、單獨的殼寡聚物(DP5-9，DA25%)，或寡聚半乳糖醛酸和殼寡聚物的混合物。在24小時後測試苯丙氨酸氨裂解酶(PAL)活性(產生的肉矽酸微摩爾/mg蛋白.小時)。圖9表示用寡聚半乳糖醛酸、殼寡聚物及其混合物處理的擬南芥植物中PAL活性的誘導。報告了平均±SE的值(n=3)。ANOVA檢驗表示用殼寡聚物或混合物處理的植物之間的統計學顯著差異(P<0.05)。實施例8:鉀流出和培養基鹼化將源自擬南芥株L-MM1生態型h/2&6ei^erec"葉子的懸浮液培養細胞生長於Murashige和Skoog培養基中(約4.43gL—，該培養基含有蔗糖(約30gL-1)、約0.5mgmL—1NAA、約0.05ugmL—"激動素，pH5.7。將培養物維持在16小時/8小時亮/暗光周期下，在約25。C，在100rpm的旋轉搖床上。每七天將細胞在新鮮培養基中稀釋10-倍。將七天大的細胞用於實驗。將殼寡糖(約30mgL1)、寡聚半乳糖醛酸(約40mgL—1)以及約70mgL^的兩種寡糖的混合物溶解於含有10mM蔗糖、約0.5mMCa2+、約50raMNa+和約0.5mMMES的溶液中，用Tris-(幾甲基)-氨基曱烷將溶液pH調節至5.7。將等份的洗滌過的細胞(100mg鮮重(FW)mL—1)置於玻璃瓶中，並將孵育培養基換成等體積的測試溶液，並在150rpm的旋轉搖床上攪拌。測定等份孵育培養基中的胞外pH和K+濃度，該培養基是通過Miracloth(Calbiochem)的細月包快速過濾獲得的。用pH電極監控胞外pH變化，並使用原子吸收分光光度計(PU9200X，Pye-Unicam，Cambridge,UK)在INHC1中測定胞外K+濃度。圖10顯示了鉀從用殼寡聚物、寡聚半乳糖醛酸或混合物處理的擬南芥懸浮液細胞中流出。混合物將鉀流出控制降低至接近寡聚半乳糖醛酸單獨的值。圖11顯示了用殼寡聚物、寡聚半乳糖醛酸或混合物處理的擬南芥懸浮液細胞的培養基鹼化。混合物誘導了持續的培養基鹼化，而單獨的成分只在處理後不到一小時內有作用。圖12表示用殼寡聚物、寡聚半乳糖醛酸或混合物處理後24小時，擬南芥懸浮液細胞的培養基鹼化。混合物比單獨的成分誘導了明顯更好的培養基鹼化。實施例9:蛋白組/基因組/轉錄組分析為了這些分析，如上所述進行擬南芥的細胞培養。A,不同表達蛋白的蛋白組分析。用對照緩衝液、寡聚半乳糖醛酸、殼寡糖或混合物孵育4小時後，通過離心收集細胞，並提取蛋白，通過二維凝膠電泳來分析，使用Valot等2005所述的實驗方案(PlantMolecularBiology59:565-580)。蛋白組分析顯示出與其他三個相比較在至少一個處理中存在59種顯著相關的蛋白。在這59種蛋白中，鑑定了44種。超表達蛋白主要與防禦機制相關，如PAL(苯丙氨酸氨裂解酶)。令人感興趣地看到四分之一受調控的蛋白與能量代謝相關。顯著地，密切相關的單種成分誘導細胞的可溶蛋白表達模式:處理間表達水平不同的蛋白實例列於表2中表2:tableseeoriginaldocumentpage23用星號(*)標記彼此間表達水平顯著不同的蛋白。B.差異表達基因的轉錄組分析通過cDM微矩陣技術對用誘導劑處理4小時後取樣的擬南芥細胞進行轉錄組分析。使用QIAGENRNeasyMini試劑盒(DarlingtonLab)提取擬南芥處理細胞的總RNA。在3個處理(寡聚半乳糖醛酸，殼寡糖，兩者的混合物)的至少2個中，擬南芥轉錄組分析顯示出96個顯著相關的基因(P<0.05)，具有至少3倍的比例。與蛋白組分析相反，轉錄組分析揭示了用殼聚糖寡聚物或用混合物處理培養細胞誘導了非常相似的應答。用果膠寡聚物處理似乎誘導了有限的應答，與對照培養物接近。用殼聚糖寡聚物、果膠寡聚物或其混合物處理各自調節了95個(57個下調，38個上調)，25個(16個下調，9個上調)和92個(56個下調。36個上調)基因的表達。在受調控的基因中，根據處理，幾個呈現出截然不同的表達模式。那些基因中的一些列於表3中，其中按照超過對照中表達水平的比例來給出基因表達的水平。用星號表示統計學顯著差異。表3名稱登錄#殼絲組合物寡聚半乳糖醛酸Clavata3/ESR-相關-1AUg73165-3.60*-1.153.35*脯氨酸-富集-伸展蛋白樣家族At5g490803.152.51*-3.68*WD-40重複家族蛋白At5g權03.38*1.77-2,24*防禦相關蛋白At3g448705.46*-2.06*-1.15共分子伴侶grpE家族At4g26780-1.153.16*1.03AMP-結合蛋白Atlg759601.613.87*1.95實施例10:誘導蘋果秧苗對蘋果黑星菌(「e/7"r/s//ze《i/a/2V)的抗性用漂白劑消毒後，將品種《GoldenDelicious》的蘋果種子(大約1400粒)置於4'C進行春化處理90或120天。然後以40粒種子/床的密度將種子播種在表層土中。然後每床用表層土覆蓋、澆水並在接近l(TC的溫度孵育一周，然後轉移至18。C的溫室。通過噴霧對照溶液(水加0.OIV土溫20)或水溶液中的誘導劑(在"3-葉期"0.25g.L-l的本發明的組合物，在接種蘋果黑星菌(150，000個活的分生孢子/mL)前10和3天)來處理40棵秧苗的組。接種後14天時對誘導劑處理前產生的最後一片葉子(Fl)和用誘導劑處理後產生的第一片葉子(F0)進行形成孢子的表面積百分比的評價。將結24果表示為Fl和F0的形成孢子的葉片表面積的百分比(每次處理200棵秧苗的平均土SD)，如圖13中所示的。實施例11:KH2P04與寡聚半乳糖醛酸和殼寡糖混合物的組合物的殺真菌特性。將三個20iaL含有2.104個擴展青黴(化/2/"7/"邁<^7<3/^咖)孢子的點接種於39g.I/馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)的培養皿上，瓊脂塗布以下一種溶液水+O.01%吐溫20(對照)、寡聚半乳糖醛酸和殼寡糖(0，5g.1/1)的混合物、KH2P04(5g.I/1)、寡聚半乳糖醛酸和殼寡糖(0，5g.L1)+KH2P04(5g.L1)。將培養皿在25。C孵育48小時，並使用Neubauer計數池將所得到的孢子計數。圖14中顯示了以3個實驗的平均值表示的結果。權利要求1.含有一種或多種寡聚半乳糖醛酸的組合物，該寡聚半乳糖醛酸具有高於8的聚合度並具有通過一種或多種聚陽離子糖進一步穩定的二聚蛋盒構象。2.權利要求l的組合物，其中通過2F4抗體檢測二聚蛋盒構象。3.根據權利要求1或2的組合物，其中聚陽離子糖是殼聚糖寡糖或殼聚糖多糖。4.根據權利要求3的組合物，其中殼聚糖寡糖或多糖具有高於5的聚合度。5.根據權利要求3或4的組合物，其中殼聚糖寡糖或多糖具有低於50%的乙醯化程度。6.根據在前任一項權利要求的組合物，其是水溶液。7.根據在前任一項權利要求的組合物，其進一步含有一種或多種選自下組的成分其他糖類、生長調節劑或生長因子、礦物質、離子、營養素、食品添加劑、調味劑、色素、維生素和植物營養素。8.根據在前任一項權利要求的組合物，其是選自下組的產品藥物組合物、保健食品組合物、食品或飼料組合物，包括功能食品或功能飼料，控制植物病害的產品、誘導劑、肥料，或這些產品的助劑。9.權利要求8的組合物，其中控制植物病害的產品是殺真菌劑。10.含有根椐在前任一項權利要求的組合物的生物材料。11.含有權利要求1至9的組合物的織物。12.根據在前任一項權利要求的組合物在食品、飼料、織物、化妝品、工業和/或環境應用中的用途。13.根據權利要求1至10的組合物誘導植物對抗植物病原體感染的保護的用途。14.根據權利要求1至11的組合物作為生長促進劑的用途。15.根據權利要求1至11的組合物作為種子塗層的用途。16.根據權利要求1至10的組合物作為抗真菌助劑的用途。17.根據在前任一項權利要求的組合物用於製造處理傷口癒合的藥物的用途。全文摘要本發明涉及含有一種或多種寡聚半乳糖醛酸((1→4)-α-D-聚半乳糖醛酸)或任何其他可能呈「蛋盒」構象的寡糖(oligoguluronan)的「生物活性」組合物，該構象通過一種或多種聚陽離子糖來進一步穩定，聚陽離子糖優選為殼聚糖寡糖或殼聚糖多糖。本發明還涉及製備該組合物的方法及其在醫學、藥物、農業、保健食品、食品、飼料、織物、化妝品、工業和/或環境應用中的用途。文檔編號C08L5/06GK101558114SQ200780043299公開日2009年10月14日申請日期2007年11月28日優先權日2006年11月28日發明者J·C·皮諾卡布雷拉,P·范庫特塞姆申請人:和平聖母大學