抗血栓劑的製作方法

2023-05-14 23:55:06 4

專利名稱：抗血栓劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種可以防止在溫血動物中形成凝血塊的凝血酶抑制劑。具體地說，本發明涉及L-氮雜環丁烷-2-羧酸和L-精氨酸醛的二肽的N-苯基丙氨醯和N-苯基甘氨醯的衍生物，以及涉及它們的衍生物及其鹽類。
為了抑制凝血酶，目前的治療方法是服用肝素和香豆素，例如苄丙酮香豆素。這些藥劑的作用機理已經成為廣泛的研究課題。肝素是通過胃腸外給藥的藥物，它的用量必須小心地加以控制，以便防止在病人體內出現不必要的出血現象。香豆素通過阻止或抑制凝血酶原的生成而起作用，通常需要經過一定時間才能見效。有一種治療(例如靜脈炎)方法是先使用肝素，接著再使用香豆素。雖然這兩種藥物都很有效，但是仍然需要凝血酶抑制劑，它們能迅速地防止血塊的形成並且不會妨礙血纖維蛋白溶酶在溶解已存在的血塊方面的作用，也不妨礙已服用的溶解血塊藥物如組織纖維蛋白溶酶原激活劑。
本發明提供的凝血酶抑制劑可用下列的通式1表示。
其中，A是1)一種如下面通式的基團
其中R是如下面通式的苯基
其中，a和a′任意地為氫、低級烷基、低級烷氧基、滷原子、三氟甲基、羥基、羥甲基、氨基、或氨甲基;而n是0或1;或者，R是噻吩基、呋喃基、萘基、或者被低級烷基、低級烷氧基、滷原子、氨基、一或二(低級烷基)氨基、或羥基進行一或二取代的萘基;或者，R是環己二烯基、環己烯基、環己基或環戊基;
R1是氫、甲基或乙基;
B是低級烷基、低級烷氧基、羥基或者一種如下列通式的氨基其中，R2和R3任意地是氫或低級烷基，或者R2是氫，而R3是C1-C6的烷醯基、滷代的C2-C6的烷醯基，或者一種如下列通式的氧羰基其中，R4是C1-C6的烷基、C2-C6的鏈烯基、C3-C7的環烷基、苄基、硝基苄基、二苯基甲基，或者如上面所定義的苯基;但前提條件是，當R1是甲基或乙基時，B不能是甲基或乙基;
2)由下列通式2所代表的雙環基團
其中，Q是一個由
、-CH2-或
所代表的含一個碳的基團，或者由-CH2-CH2-、
或
所代表的含兩個碳的基團;
Y是一個由-CH2-或
所代表的含一個碳的基團，或者由
所代表的含兩個碳的基團;其假定條件是，在Q和Y中，只能有一個而不能兩個都是
或
;另外還有一個前提條件是，Q和Y中只有一個是含兩個碳的基團;
R5是氫或一個如上面所定義的氧羰基R4-OC(O)-;以及R6是氫、低級烷基、低級烷氧基、滷原子、羥基、三氟甲基、羧基、氧基甲醯基或氨基磺醯基;而六元環中的虛線表示它是一個芳環或全氫環;
以及涉及藥物學上可接受的，無毒性的上述化合物的鹽類。
由上述式1代表的肽類是有用的抗血栓劑，並且它們還可用作組織纖維蛋白溶酶原激活劑(tPA)、鏈激酶或尿激酶中的添加劑。
本發明還包含由下列通式所代表的通式1的化合物的中間體
其中，A的定義與上述通式1所給的定義相同，而P是一種氨基保護基團，例如碳酸苄酯基、碳酸叔丁酯基、對甲苯磺醯基等類似基團。
上述的化合物可用常規的偶合方法來製備。例如，使Boc-D-苯基精氨酸與一種由L-氮雜環丁烷-2-羧酸和精氨酸的環狀內醯胺形成的二肽進行偶合反應，以形成一種具有氨基保護基團的Boc-D-Phg-Azt-Arg內醯胺。其中的Arg內醯胺環可以通過還原作用來打開，而精氨酸上的氨基保護基團也可以除去，以生成一種Boc-D-Phg-Arg醛。上述的肽類可以轉化成合適的鹽類，例如乙酸鹽、鹽酸化物和硫酸鹽。
本發明還提供了一種用於防止在人類和動物體內形成凝血塊的方法以及在該方法中所用的藥物製劑。
由通式1所代表的本發明的化合物是三肽類化合物，當AC(O)-是一個諸如D-苯基甘胺醯或D-苯基丙胺醯之類的胺基酸殘基時，以及當A是一個胺基酸殘基以外的基團，例如，當B是一個氨基或烷基氨基以外的基團時，該化合物就是氮雜環丁烷-2-羧酸和精氨酸醛(Azt-Arg-H)所生成二肽的N-醯基衍生物。在通式1中的A(C＝O)部分的不對稱中心最好是R或RS，而氮雜環丁烷和精氨酸醛部分的不對稱中心是L;但是，A(C＝O)的不對稱中心也可以是S。
在通式1中所使用的符號的定義如下Arg是精氨酸，Pro是脯氨酸，Phe是苯基丙氨酸，Phg是苯基甘氨酸，以及Azt是氮雜環丁烷-2-羧酸。
低級烷基是指直鏈或支鏈的C1-C4烷基，如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基等。
低級烷氧基是指C1-C4的烷氧基，如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基等。
滷原子是指氟、氯、溴或碘。
一或二(低級烷基)氨基是指諸如甲基氨基、乙基氨基、二甲基氨基、甲基乙基氨基、二乙基氨基、正丁基氨基、正丙基氨基之類的基團。
術語「C1-C6烷醯基」是指C1-C6羧酸的醯基部分，例如甲醯基、乙醯基、丙醯基、丁醯基、己醯基之類的基團。「滷原子取代的C2-C6烷醯基」是指至多由三個滷原子取代的上述的C2-C6烷醯基、氟乙醯基、4-溴丁醯基、3，3，3-三氟丙醯基、3，4-二氯丁醯基、3，3-二氯己醯基之類由氟、氯或溴取代的C1-C6烷醯基。「C1-C6烷基」是指直鏈和支鏈的烷基，例如前面所定義的C1-C4烷基，以及正戊基、異戊基、正己基、異己基等。「C2-C6鏈烯基」是指諸如乙烯基、烯丙基、丁烯基、異戊烯基和己烯基之類的烯烴基因。「C3-C7環烷基」是指具有3至7個碳原子環的環狀烴類基團，例如環丙基、環丁基、環戊基、環己基和環庚基。
按照在通式1中的定義，當A是一種(R)(R1)(B)C-基團時，R可以是一或二取代的苯基或苄基(n＝1)。這類基團的例子有苯基(a和a′＝H)、苄基(a和a′＝H，n＝1)、4-甲基苯基、3-乙基苯基、4-甲氧基苯基、3-甲氧基苯基、3-乙氧基苯基、2-甲氧基苯基、3-異丙氧基苯基、4-羥基苯基、4-羥基苄基、4-氯苯基、4-氯苄基、3-氯苯基、2-氟苯基、3-氟苯基、3-溴苯基、4-氟苯基、3-三氟甲基苯基、4-三氟甲基苯基、3-三氟甲基苄基、4-羥甲基苯基、2-羥甲基苯基、3-氨基苯基、4-氨基苯基、3-氨基-4-氯苯基、2，4-二甲基苄基、3，4-二氯苯基、3-羥基-4-氟苯基、3-羥基-4-甲基苯基、3-甲氧基-4-羥基苯基、3-氯-4-乙氧基苯基之類的一或二取代的苯基。
當R是萘基或一或二取代的萘基時，R基的例子有1-萘基、2-萘基、6-甲氧基-2-萘基、8-羥基-1-萘基、8-氨基-2-萘基、4-甲基-1-萘基、6-氯-2-萘基、4-羥基-6-乙氧基-2-萘基、8-甲氧基-4-氯-2-萘基、6，8-二甲氧基-2-萘基、6-乙基-1-萘基、4-羥基-1-萘基、3-甲氧基-1-萘基等類似的萘基基團。
當B是一個氨基-N(R2)(R3)時，通式1所代表的基團的例子有氨基(R2＝R3＝H)、甲氨基、乙氨基、異丙氨基、二甲氨基之類的氨基;當R2是氫而R3是C1-C6的烷醯基或滷原子取代的C2-C6烷醯基時，這類基團的例子有乙醯基、丙醯基、己醯基、2-甲基丙醯基、三氟乙醯基、三氯乙醯基、2，3-二溴丙醯基等類似基團;當R2是氫，R3是一種氧羰基R4-O-C(O)-時，這類基團的例子有C1-C6烷氧羰基氨基，例如甲氧基羰基氨基、乙氧基羰基氨基、叔丁氧基羰基氨基、異戊氧基羰基氨基等;C2-C6鏈烯基氧羰基氨基，例如乙烯基氧羰基氨基、烯丙基氧羰基氨基、2-丁烯基氧羰基氨基等;C3-C7環烷基氧羰基氨基，例如環丙基氧羰基氨基、環戊基氧羰基氨基、環乙基氧羰基氨基等。由符號B所代表的氧羰基氨基還包括，例如苄氧基羰基氨基、4-硝基苄氧基羰基氨基、二苯基甲氧基羰基氨基、苯氧基羰基氨基，或者是一種取代的苯氧基羰基氨基，其中取代的苯基部分是如上所定義的苯基，等等。
在通式1中，當A是一種通式為(R)(R1)BC-的基團(基團1)時，基團A(C＝O)的例子有苯基甘氨醯基、苯基丙氨醯基、3-甲氧基苯基甘氨醯基、4-甲氧基苯基甘氨醯基、4-氯苯基甘氨醯基、3，4-二氯苯基甘氨醯基、4-氯苯基丙氨醯基、3-三氟甲基苯基甘氨醯基、N-(叔丁基氧羰基)苯基甘氨醯基、α-甲基苯乙醯基、α-乙基苯乙醯基、α-甲氧基苯乙醯基、異丙氧基苯乙醯基、1-萘基甘氨醯基、2-萘基甘氨醯基、N-(叔丁氧基羰基)-2-萘基甘氨醯基、2-噻吩基甘氨醯基、3-噻吩基甘氨醯基、N-(環戊基氧羰基)-2-噻吩基甘氨醯基、2-呋喃基甘氨醯基、N-乙基-2-呋喃基甘氨醯基、扁桃醯基、4-氯扁桃醯基、3-甲氧基扁桃醯基、α-羥基-α-(2-萘基)乙醯基、α-羥基-α-(2-噻吩基)乙醯基、1，4-環己二烯基甘氨醯基、1-環己烯基甘氨醯基、N-(叔丁氧基羰基)-1，4-環己二烯基甘氨醯基、環己基甘氨醯基之類的A(CO)基團。
當A是一種由上面通式2所代表的雙環基團時，這時由通式1所代表的肽類的例子有D-1，2，3，4-四氫異喹啉-1-基羰基(D-1-Tiq-Azt-Arg-H)，D-1，2，3，4-四氫異喹啉-3-基羰基、D-全氫異喹啉-1-基羰基，以及如下式所示的Azt-Arg-H的D-全氫異喹啉-3-基羰基衍生物、
2，3-二氫吲哚-3-基羰基、二氫異吲哚-1-基羰基(異吲哚-1-羰基)和六氫異吲哚-1-羰基以及如下式所示的Azt-Arg-H類的六氫異吲哚-3-羰基衍生物
符號R6和R5定義同上。R5最好是氫，而R6最好是氫、甲氧基、乙氧基、氯或甲基。
通式1所代表的化合物以酸加成鹽的形式製備和使用，這是由於鹽類具有較高的穩定性。較理想的應該是藥物學上可接受的無毒性的鹽類。
本發明中，肽類的藥物學上可接受的鹽包括那些使用無機酸和羧酸製得的酸加成鹽。用於形成鹽的無機酸有屬於氫滷酸的鹽酸和氫溴酸;以及磷酸和硫酸。羧酸鹽由乙酸、丙酸、丙二酸、馬來酸、檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸、苯甲酸、富馬酸之類的羧酸製備。這些酸加成鹽可按常規的方法來製備，例如可用酸來中和化合物1的游離鹼來製備。較佳的酸加成鹽是硫酸鹽和鹽酸鹽。
本發明的較佳實施方案是由通式1所代表的化合物。其中，A是
其中的R是如下式所示的苯基
R1是氫，B是一個氨基-N(R2)(R3)。更理想的化合物是，其中的R2是氫而R3是一個氧羰基。R4O-C(O)-，還有一些較佳的化合物是，其中的R是萘基或取代的萘基，並且B和R1是如上所述的較佳基團。再有一些公式1所代表的較佳的化合物是，其中的B是氨基-N(R2)(R3)，R2是氫，R3是低級烷基，特別是甲基;R2是氫，R3是二氟乙醯基;R1是氫，R是一個如上所示的苯基，其中的n是0或1。
本發明的特別理想的實施方案包括當其中的A是一個雙環基團(2)時的通式1的化合物。該實施方案的較佳的化合物是那些由通式1所代表的並且具有如下特徵的化合物，即通式1中的A(C＝O)是1，2，3，4-四氫異喹啉-1-基羰基和1，2，3，4-四氫異喹啉-3-基羰基。另外一個特別理想的實施方案包括由通式1所代表的並且具有如下特徵的化合物，即其中的A是(R)(R1)(B)-C-，其中的R是如上所定義的，其中的n＝0或1的苯基;R1是甲基或乙基，B是一個氨基-N(R2)(R3)。
由通式1所代表的化合物可按肽偶合的現有方法來製備。根據這種方法，先製備出一種環狀丙醯胺形式的精氨酸(b)，然後將它與一個在下式中示出的有氨基保護的氮雜環丁烷-2-羧酸(a)進行偶合反應，以獲得一種二肽化合物(C)
其中的R代表一個氨基保護基團，如氨基甲酸苄酯(Cbz)基、氨基甲酸叔丁酯(BOC)基、對甲苯磺酸基等。所使用的氨保護基團最好是可以通過氫化作用或通過以中等強度的酸(例如三氟乙酸)或強酸(例如HF)來處理而除去的基團。不穩定的鹼性保護基是不理想的。其他適用的氨基保護基團的例子記載於「Protective Groups In Organic Synthesis」，Second Edition，by Theodore W.Greene and Peter G.M.Wuts，第7章，第309-405頁(1991)，John Wiley Sons，Inc.，出版，此處將其列為參考。將Boc，或其他合適的保護基團從氮雜環丁烷環上的氮原子處除去，然後用一種所需的醯基或一種在通式1中以A(C＝O)表示的胺基酸醯基將所說的氮原子醯化，以獲得如下所示的三肽(d)
用氫化鋰鋁在一種隋性溶劑中將偶合的Arg(P)內醯胺產品(d)還原，以除去內醯胺環並獲得一種由通式表示的精氨酸醛形式的三肽，式中的Arg(P)-H表示一個氨基保護的精氨酸醛。
內醯胺形式的精氨酸可以通過氨基保護的精氨酸[Arg-OH]在分子內的偶合來獲得。例如，首先用一種氯甲酸酯，例如氯甲酸乙酯或氯甲酸異丁酯將一種由下式所代表的Boc-Arg(Cbz)OH
轉變成一種活潑的酯，例如一種活潑的混合酐。生成酯的反應是在有叔胺，例如N-甲基嗎啉，存在下進行的。加入一種較強的叔胺，例如三乙胺，來進行內醯化反應，以獲得一種如下式所示的內醯胺形式的二氨基保護的精氨酸
在使用如上圖所示的氮雜環丁烷-2-羧酸來進行偶合反應之前，首先用三氟乙酸將Bco保護基選擇性地除去，以獲得所需的自由氨基。
另一種可供選擇的用於製備本發明化合物的方法是用2-氮雜環丁烷羧酸來偶合ACOOH酸。然後用一種按上述的方法製備的，內醯胺形式的氨基保護的精氨酸來與所獲的二肽偶合。再將所獲的三肽還原，以打開內醯胺環得到一種如上所述的氨基保護的精氨酸的三肽。這一系列的偶合反應的具體例子列入下面的實施例3中。
當A是一個胺基酸的殘基時，為了進行ACOOH化合物的偶合反應，必須首先將胺基酸上的氨基保護起來。可以使用一般用作臨時性保護的或掩蔽氨基的常見氨基保護基。這類保護基的例子包括烷氧基、鏈烯氧基、環烷氧基、芳烷氧基和芳氧基羰基，例如乙氧基羰基、叔丁氧基羰基、環己氧基羰基、金剛烷氧基羰基、三氯乙氧基羰基、苄氧基羰基、二苯基甲氧基羰基等。
當A是基團(R)(R1)(B)C-，而B是一個氨基-N(R2)(R3)，並且其中的R2是氫而R3是低級烷基時，由通式1所代表的化合物就可以使用一種其中的B是氨基的相應化合物，通過已知的烷基化的方法來製備。例如，N-甲基-D-苯基甘氨醯基-L-氮雜環丁烷基-L-精氨酸醛可以用甲醛通過還原烷基化反應來製備。如果用乙醛、丙醛或丁醛來代替甲醛，就可以獲得N-乙基、N-正丙基和N-正丁基的烷基衍生物。還原烷基化反應是在惰性溶劑中和在有氫化催化劑，例如5%Pd/C，存在的條件下進行的，並且最好是在比較適中的溫度與壓力的條件下進行。還原烷基化反應可以按下述的方式進行，即將一種L-氮雜環丁烷基-L-精氨酸內醯胺，或者將L-氮雜環丁烷-2-羧酸偶合到胺基酸A(C＝O)-OH，例如，苯基甘氨酸或苯基丙氨酸的以及N-烷基衍生物分子上，然後再將所獲的二肽與Arg(內醯胺)進行偶合。
當A是(R)(R1)(B)C-，而其中的R是環己二丁烯基或環己基，B是烷基氨基-N(R2)(R3)時，由通式1所代表的化合物就可以用氫氰硼化鈉來還原一種由低級烷基醛形成的亞胺的方法來製備。同樣，這類N-烷基化反應可以使用一種低級烷基碘和氫化鈉來進行。
當A是一個雙環的基團(2)時，通式1的化合物可以使用與上述相同的偶合方法來製備。例如，當A代表1，2，3，4-四氫異喹啉-1-基(通式2，其中的Q＝-CH2CH2-，Y＝-CH-，R5＝R6＝H)時，通式1的肽可通過使用L-Arg(內醯胺)來醯化二肽D-1，2，3，4-四氫異喹啉-1-醯基-L-氮雜環丁烷-2-羧酸的方法來製備。適用於偶合反應的較佳羧基衍生物是活潑的酯類，例如那些按常規的方法，用羥基苯並三唑或2，4，5-三氯苯酚來製得的酯類。其他可供使用的活潑衍生物包括一些醯基滷例如氯化物或溴化物，以及醯基疊氮。在醯化偶合反應中，四氫異喹啉(通式2，R5＝H)環上的氮要保護起來。例如，一種用氯甲酸異丁酯製得的N-Boc-1，2，3，4-四氫-1-羧基異喹啉的活潑酯可用於L-氮雜環丁烷-2-羧酸的醯化反應。然後將所獲產品上的內醯胺基團轉化成如上所述的醛的形式，以獲得通式1的化合物，即Boc-1，2，3，4-四氫異喹啉-1-基羰基-Azt-Arg-H。
上述的偶合反應在冷的環境中進行，較佳溫度範圍在約-20℃至約15℃之間。偶合反應是在諸如二甲基甲醯胺、二甲基乙醯胺、四氫呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷等普通的惰性有機溶劑中進行。當使用一種醯化酸的活潑酯時，偶合反應通常要在無水的條件下進行。
當A是基團(R)(R1)(B)C-，而R1是甲基或乙基時，由通式1所代表的化合物就可使用一種二苯酮亞胺衍生物(其中的B是氨基)在有一種18-冠醚化合物存在的情況下與甲基碘或乙基碘和氫化鉀一起進行反應的方法來製備。例如，將苯基甘氨酸甲酯與二苯酮亞胺反應，生成一種由(C6H5)(H)([C6H5]2C＝N-)C-COOCH3所代表的甘氨酸酯的二苯基甲基亞胺。然後在一種惰性溶劑中，在18-冠-6醚存在的情況下，使用一種至少為一當量的甲基碘或乙基碘和氨基鉀來將所獲的酯烷基化。然後將這種由(C6H5-)(CH3-)([C6H5]2C＝N-)C-COOCH3所代表的烷基化產物在6N HCl中水解，得到D-α-甲基或α-乙基-甘氨酸。
將本發明的化合物以酸加成鹽的形式分離出來由上述酸製得的通式1化合物的鹽類可作為藥物上可接受的鹽使用，以用於抗血栓劑的給藥以及用來製成這類藥物的製劑。可以製備出其他酸的加成鹽並將其用於肽類化合物的分離與純化過程中。例如，與諸如甲磺酸、正丁磺酸、對甲苯磺酸與萘磺酸等磺酸類形成的鹽就可以這樣使用。
用於純化通式1所代表的化合物並同時用於製備一種所需穩定鹽類的較佳方法記載於共同申請的，申請號為no.790884，申請日為1991年11月12日的申請文件中。根據該方法，採用C18反相色譜法來初步純化所獲的穩定的硫酸鹽和鹽酸合物，在該反相色譜法中，採用pH2.5的含硫酸或鹽酸的水溶液作為水相，而以乙腈作為有機相。使用一種羥基型陰離子交換樹脂(例如Bio-RadAG-IX8)來將酸性洗脫液的pH值調節到約為4-6之間。在調節好pH值之後，將硫酸三肽或鹽酸三肽的溶液冷凍乾燥，以獲得一種乾燥粉末形式的純鹽。在該操作過程的一個實施例中，將粗的D-Phg-L-Azt-L-Arg-H的硫酸鹽溶於水中，再將此水溶液裝載於一個Vydac C18RP-HPLC50cm×50cm的色譜柱中。A相對於B的濃度梯度為2-10%(A＝0.01%H2SO4;B＝乙腈)操作10小時。多級收集餾分並將含有產品的餾分匯集起來，用一種分析用RP-HPLC儀來測定。用一種羥基型的AG-1×8樹脂(Bio-Rad，3300Ragatta Blvd.，Richmond，CA94804)來將匯集的餾分的pH值調節到pH4.0-4.5。將溶液過濾，然後將濾液凍幹以獲得一種硫酸鹽形式的純D-，L-，L-，三肽。
由本發明所提供的化合物(通式1)能抑制人體和動物體內的凝血酶的作用。對凝血酶的這種抑制作用可用在試管測試的方法來證明，在此測試程序中，將凝血酶水解成一種顯色的基質，N-苯甲醯基-D-苯丙氨醯基-L-異戊氨醯基-L-精氨醯基-對硝基醯苯胺，結果表明，凝血酶的醯胺酶活性受到抑制。
測試是在50μl的緩衝液(0.03MTris，0.15MNaCl，pH7.4)和25μl的凝血酶溶液(由0.21mg/ml的凝血酶粉末溶解於0.06MTris和0.3MNaCl的溶液中，pH7.4)以及150μl的一種濃度為0.25mg/ml的顯色基質的水溶液。按不同的濃度加入這些被測試化合物的溶液(25μl)。通過在405nm處監測釋放對硝基苯醯氨的反應來測定該基質的水解速率。將自由的凝血酶濃度對水解速率作圖，繪製標準曲線。在具體的分析步驟中，藉助於標準曲線將被測試化合物的水解速率轉換成「自由凝血酶」的濃度。從每一次分析中所用的凝血酶的已知初始含量減去在該次分析中所測得的自由凝血酶(結合到被測試的化合物上)的數量。從加入的抑制劑(被試驗的化合物)的摩爾數中減去被結合的凝血酶的摩爾數，於是求得在每次分析中的自由抑制劑的數量。Kass值是在凝血酶與被試驗化合物(Ⅰ)之間的反應的一個假想平衡常數。
Kass＝ ([凝血酶I])/([(凝血酶)x(I)])Kass值是針對被試驗化合物的某一個濃度範圍求得的，而求得的平均值的單位為L/mol。
在上述的分別使用Boc-D-Phe-L-Azt-L-Arg-H和Boc-D-Phg-L-Azt-L-Arg-H的分析方法中，所測得的本發明化合物的凝血酶抑制活性以Kass值來表示時分別為6.5×107和14.9×107(L/mol)。
下面的表1列出了由通式1所代表的具體化合物所測得的Kass值表1凝血酶抑制水平化合物1Kass×106(L/mol)TFA-D-Phg(α-Et)-Azt-Arg-H 226Boc-D-Phg-Azt-Arg-H 149TFA-D-Phg(α-Me)-Azt-Arg-H 127Boc-D-Phe-Azt-Arg-H 65Ac-D-Phg(α-CH3)-Azt-Arg-H 70Boc-D-Phg(α-CH3)-Azt-Arg-H 61D-3-Tiq-Azt-Arg-H 35DL-1-Tiq-Azt-Arg-H 27Ac-Phg(α-CH3)-Azt-Arg-H 15Boc-DL-Phg(α-CH3)-Azt-Arg-H 11D-Phg＝苯基甘氨醯基Azt＝氮雜環丁基3-Tiq＝1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羰基1-Tiq＝1，2，3，4-四氫異喹啉-1-羰基AC＝乙醯基TFA＝三氟乙醯基本發明的化合物能抑制凝血塊的形成，但不含明顯地影響機體原有的溶解凝血塊的能力，例如，該化合物僅輕微抑制血纖維蛋白溶解作用。
在某一方面，本發明提供了一種用於抑制在人體內和動物體內形成凝血塊的方法，該方法包括按能夠有效地抑制凝血塊的形成但不會產生毒性的劑量給所說的人或動物服用由通式1所代表的化合物。這種抗凝血化合物可以通過口服、胃腸外的方法給藥，例如可以通過靜脈輸液(iv)、肌肉注射(im)或皮下注射(sc)的方式給藥。根據具體的情況，例如根據患者的條件，看患者是需要緊急的處理或者是需要長期的治療，可以決定給藥方式是採用P.O或者i.V.。
抑制凝血塊的一次有效劑量在約5-1000mg之間。這種劑量制度是可以變化的，例如，對於預防的目的來說，可以將一日的劑量作為一次服用，也可以將日劑量分成多次，例如分成3次或5次服用。在需要進行緊急治療的情況下，可以將本發明的一種化合物以約0.1mg/Kg/h至約50mg/Kg/h，最好以約1.0mg/Kg/h至約20mg/Kg/h的速率進行靜脈輸液。
本發明的方法也可以與一些血塊溶解劑，例如與組織纖維蛋白溶解酶原激活劑(tPA)、改進的tPA、鏈激素或尿激素結合使用。在已經形成了凝血塊並且已經堵塞了動脈或靜脈的情況下，不管是部分地堵塞或者全部堵塞，通常都必須使用凝血塊溶解劑。本發明的一種化合物可以與血塊溶解劑一起服用，也可以在服用血塊溶解劑之後服用，以防止凝血塊再生。
在實施該方法時，最好使用本發明較佳的一種化合物。例如可以使用如上所述的一種較佳化合物。特別理想的是N-Boc-D-苯基甘氨醯基-L-氮雜環丁基-L-氮雜環丁基-L-精氨酸醛。
本發明還提供了一種用於上述治療方法的藥物製劑。本發明的藥物製劑包含抑制血塊有效量的由通式1所代表的化合物以及一種藥物學可接受的載體。對於口服藥，可將抗凝血酶化合物製成膠囊或片劑，其中可能含有賦形劑(例如粘結劑)、潤滑劑、霧化劑等。對於胃腸外給藥來說，可將抗凝血酶化合物配在一種藥物學上可接受的稀釋劑中，例如配製在重量鹽水(0.9%)、5%葡萄糖、Ringer′s溶液等稀釋劑中。
本發明的抗凝血酶化合物可以製成單位劑量的製劑，所含的劑量可在約1mg至約1000mg之間。最好該化合物是以藥物學上可接受的鹽的形式使用，例如它可以是硫酸鹽、乙酸鹽或磷酸鹽。一單位劑量製劑的一個例子是在一個10ml的無菌玻璃安瓿瓶中含有5mg的N-Boc-D-苯基甘氨醯基-L-氮雜環丁基-L-精氨酸醛的硫酸鹽。一單位劑量製劑的另一個例子是在一個無菌安瓿瓶內的20ml等滲鹽水中含有約10mg的N-甲基-D-苯丙氨醯基-L-氮雜環丁基-L-精氨酸醛的硫酸鹽。
下面的實施例可用來進一步解釋本發明，但不能認為是對本發明的限定。
在下列實施例中，所有的Rf值皆是用矽膠薄層色譜法來測定的，測定時使用Kieselgel60F-254(Merck，Darmstadt)在下列的溶劑體系中(A)三氯甲烷-甲醇-乙酸，135∶15∶1，V∶V∶V(B)乙酸乙酯-乙酸-無水乙醇，90∶90∶10，V∶V∶V(C)三氯甲烷-甲醇-乙酸，90∶30∶5，V∶V∶V在各實施例中，使用分析用的HPLC來監測色譜餾分、測定停留時間以及產品的純度。測定方法如下使用一種Vydar C18反相色譜柱(0.46cm×10cm)的Water600E。採用A＝0.01M乙酸銨或者B＝乙腈的濃度梯度，在一臺Pharmacia UV-M儀於214nm處進行監測。Pharmacia公司的地址為800Centennial Ave.，Piscataway，N.J.08854。
在各實施例中使用的縮寫符號具有下列意義。
胺基酸Arg＝精氨酸;Azt＝氮雜環丁烷;Pro＝脯氨酸;Phg＝苯基甘氨酸;1-Tiq＝1，2，3，4-異喹啉-1-羰基Boc＝叔丁氧基羰基Bzl＝苄基Cbz＝苄氧基羰基DCC＝二環己基碳化二醯亞胺DMF＝二甲基甲醯胺DMSO＝二甲基亞碸FAB-MS＝快原子轟擊質譜FD-MS＝場解吸質譜THF＝四氫呋喃TLC＝薄層色譜EtOAc＝乙酸乙酯n-BuOH＝正丁基乙醇實施例1N-(N-叔丁氧基羰基-D-苯基甘氨醯基)-L-氮雜環丁基-L-精氨酸醛的二乙酸鹽1)t-Boc和Cbz雙保護基的精氨酸將N-(叔丁氧基羰基)精氨酸的鹽酸合物[Boc-Arg(HCl)-OH]，(82.1g，250mmole)溶解於在一個三頸圓底燒瓶內的5NNaOH(240ml)中。將溶液冷卻至-5℃，然後在55分鐘內往其中滴加氯甲酸苄酯(143ml，1.0mole，4eq)。同時用5NNaOH(25ml)調節PH值在13.2-13.5之間。在滴加操作結束後以100ml水將其稀釋，然後將反應混合物在-5℃下攪拌1小時。往其中加入乙醚(500ml)進行萃取，然後分離出水層，再用500ml一份的乙醚將水相萃取兩次。用3N硫酸(560ml)將水層酸化至pH3.0，然後用550ml乙酸乙酯萃取。將水層再用乙酸乙酯萃取，然後將各次萃取液合併，用水洗滌，用硫酸鎂將其乾燥，然後在真空中將其蒸發至幹，獲得66.1g的雙保護基精氨酸，Boc-Arg(Cbz)-OH(1)。
TLC Rf(C)0.43FD-MS408(M+)1HNMR(CDCl3)δ1.42(s，9H)，1.61-1.91(m，4H)，3.23-3.41(m，2H)，4.17(d，1H)，5.21(s，2H)，5.62(d，1H)，7.30-7.42(m，6H)，8.37(m，1H)。
2)Boc-Arg(Z)-內醯胺將在上述步驟中製得的雙保護基精氨酸(66.0g，0.162mole)溶解於230ml無水THF中，然後將此溶液在冰-丙酮浴中冷卻至-10℃。往此溶液中加入三乙胺(23.5ml，1.05eq)，接著加入氯甲酸異丁酯(22.5ml，1.05eq)，然後將此混合物在-10℃下攪拌5分鐘。接著加入N-甲基嗎啉(18.7ml，1.05eq)並將反應混合物在-10℃下攪拌1小時，再在室溫下攪拌1小時。將反應混合物倒入1升的冰水中並濾出生成的沉澱物，將沉澱物用冷水洗滌然後在真空中乾燥。將所獲產品，Boc-Arg(Z)-內醯胺(2)置於乙酸乙酯中重結晶，得到38.05g產品(60%產率)TLC Rf(A)0.77FD-MS391(MH+)1HNMR(CDCl3)δ1.48(s，9H)，1.78-1.98(m，2H)，2.50(m，1H)，3.41(m，1H)，4.43(m，1H)，4.90(m，1H)，5.16(s，2H)，5.27(m，1H)，7.28-7.45(m，6H)，9.41(m，1H)，9.68(m，1H)。
3)Arg(Z)-內醯胺三氟乙酸鹽將按上述步驟製得的Boc保護的Arg內醯胺(2)(38.0g，0.097mole)用三氟乙酸(200ml)和20ml的苯甲醚處理並在0℃下攪拌1小時。將反應混合物在不加熱的情況下真空濃縮，然後往濃縮液中加入400ml乙醚。將固體濾出，再用乙醚洗滌，然後在真空中乾燥，獲得40.5g的產品3。
TLC Rf(C)0.29FD-MS291(MH+)4)N-(叔丁氧基羰基)氮雜環丁烷-2-羧酸Boc-Azt-OH將L-氮雜環丁烷-2-羧酸(5g，0.0495mole)溶解於一種含有50ml2NNaOH(0.099mole)的50ml叔丁醇中。往所獲溶液中加入碳酸氫二叔丁酯(12.9g，0.0594mole)，然後將反應混合物在室溫下攪拌過夜。將反應混合物用水和乙醚稀釋並分離出水層。將水層用3NHCl酸化至pH2.3，然後用乙酸乙酯萃取。將萃取液用MgSO4乾燥，然後在真空中蒸發濃縮，得到一種油狀物。將此油狀物置於乙醚/石油醚中結晶，得到8.6g的產品4(產率87%)。
FAB-MS202(MH+)[α]D＝-120°(C＝0.5CH3OH)對C9H15NO4的元素分析理論值C，53.72;H，7.51;N，6.96實測值C，53.62;H，7.63;N，6.835)Boc-Azt-Arg(Z)-內醯胺將Boc-Azt-OH(4)(1.51g，7.5mmole)溶解於20mlDMF中，將此溶液冷卻至-15℃，先加入0.83ml(7.5mmol)的N-甲基嗎啉，接著再加入氯甲酸異丁酯(0.93ml，7.5mmol)。將此溶液在-15℃下攪拌2分鐘。
在另一個容器中，將Arg(Z)-內醯胺三氟乙酸鹽(3)(3.03g，7.5mmol)溶解於10mlDMF中，將此溶液冷卻至0℃，然後往此溶液中加入N-甲基嗎啉(0.83ml，7.5mmol)。將此溶液在0℃下攪拌2分鐘，然後將其與上述所獲的溶液混合。將反應混合物在-15℃下攪拌2小時，然後放置過夜使其慢慢升溫至室溫。往其中加入5%的碳酸氫鈉溶液(5ml)並用175ml乙醚和150ml水稀釋該反應混合物。分出有機層，先後用5%NaHCO3、水、1.5N檸檬酸和水洗滌該有機相。將洗滌過的有機層用MgSO4乾燥並在真空中蒸發濃縮，得到3.5g的一種非晶形固體產品5(產率99%)TLC Rf(A)0.71FD-MS474(MH+)
1HNMR(CDCl3)δ1.45(s，9H)，1.55-1.65(m，2H)，1.80-2.00(m，2H)，2.40-2.60(m，3H)，3.45(m，1H)，3.80(q，1H)，3.95(q，1H)，4.68(m，1H)，4.90(m，1H)，5.15(s，2H)，7.30-7.42(m，5H)6)Azt-Arg(Z)內醯胺三氟乙酸鹽將Boc-Azt-Arg(Z)-內醯胺(5)(3.4g，7.2mmole)用25ml三氟乙酸和5ml苯甲醚處理(在0℃下攪拌30分鐘)。在不加熱的情況下將該反應混和物在真空中蒸發濃縮，然後用100ml乙醚處理該濃縮物。過濾出固體並用乙醚洗滌，然後將其在真空中乾燥，得到3.5g的產品6(100%產率)。
FD-MS374(MH+)7)Boc-D-Phg-Azt-Arg(Z)內醯胺將Boc-D-苯基甘氨酸(0.88g，3.5mmole)和Azt-Arg(Z)內醯胺三氟乙酸鹽(6)(1.71g，3.5mmole)溶解於10ml DMF中並將此溶液冷卻至0℃。往該溶液中加入N，N-二異丙基乙基胺(0.73mL，4.2mmol)，接著再加入1-羥苯三唑水合物(0.47g，3.5mmol)和二環己基碳化二亞胺(0.72g，3.5mmol)。將反應混合物在0℃下攪拌4小時，再在室溫下攪拌3天。將混合物過濾，然後將濾液溶解於200ml乙酸乙酯和100ml的5%NaHCO3中。分出有機層並先後用水、1.5N檸檬酸(100ml)、H2O(150ml)洗滌，然後用MgSO4乾燥。將該有機相在真空中蒸發濃縮至幹，獲得1.2g固體狀的產品7(產率57%)。
TLC Rf(A)0.65
FAB-MS607(MH+)8)Boc-D-Phg-L-Azt-L-Arg-(Z)-H將Boc-D-Phg-L-Azt-L-Arg(Z)-內醯胺(7)(1.16g，1.9mmole)溶解於100ml無水THF中。將此溶液在N2氣氛中冷卻至-15℃，然後在3分鐘內往其中滴加1M氫化鋰鋁的THF(1.9ml，1.9mmole)溶液。將反應混合物升溫至0℃並攪拌1小時。在10分鐘內慢慢地滴加5mlTHF和5ml的0.5NH2SO4。將反應混合物用100ml乙酸乙酯和50ml水稀釋，然後將有機層分出並用MgSO4乾燥。將乾燥的有機層在真空中濃縮，得到0.97g產品(產率84%)FAB-MS609(MH+)按下述的方法用化合物8來製備標題化合物。往含有化合物8(0.95g，1.56mmol)的120mlTHF和30ml水的溶液中加入乙酸(0.19ml，2eq)和0.5g的10%Pd/C催化劑。經由一根通氣管將氮氣通過懸浮液鼓泡5分鐘，接著通入氫氣鼓泡4小時，再通氮鼓泡5分鐘。用濾墊將催化劑濾去。將濾液在真空中濃縮至體積為20ml並將此濃縮物冷凍乾燥，獲得0.822g固體狀態的粗標題化合物肽。
將此標題化合物在一個5×25cm的C-18反相HPLC柱上(Vydac C-18，Separation Group，17434Mojave St.，Hesperia，CA92345)進行色譜分離，使用濃度梯度為10-50%乙腈/0.01M乙酸銨混合溶液分離9小時。將流出液分成多級收集並根據反相HPLC的分析曲線匯集所需的級分。將匯集的級分凍幹，得到0.303g(41%產率)的純標題化合物。
FAB-MS475(MH+)[α]D＝-146.2°(C＝0.5，在1M乙酸中)停留時間RP-HPLC在5-50%乙腈的60分鐘內＝48.5分鐘實施例2N-(N-叔丁氧基羰基)-D-苯丙氨醯基-L-氮雜環丁基-4-精氨酸醛二乙酸鹽採用在實施例1中所用的操作步驟、反應條件以及試劑，並用D-苯基丙氨酸代替實施例1中的D-苯基甘氨酸。可獲得標題化合物。
FAB-MS489(MH+)停留時間40.9分鐘實施例3DL-1，2，3，4-四氫異喹啉-1-醯基-L-氮雜環丁基-L-精氨酸醛硫酸鹽1)DL-1，2，3，4-四氫異喹啉-1-羧酸。
將異喹啉-1-羧酸(12.5g，0.072mmol)在185ml冰乙酸中的溶液在一個Parr氫化裝置中在室溫下氫化24小時，在氫化時使用2g氧化鉑催化劑和60磅/英寸2的氫氣壓力。將反應混合物通過一個過濾墊(硅藻土)過濾，將濾液在真空中蒸發至幹。將固體的產品殘渣用水研碎，過濾並乾燥，獲得8g(63%產率)的純產品1。
FD-MS178(MH+)1HNMR(DMSO)δ2.80-3.00(m，3H)，3.10-3.20(m，1H)，3.30-3.40(m，2H)，7.05-7.25(m，4H)，7.65-7.75(m，1H)。
2)叔丁氧基羰基-DL-1，2，3，4-四氫異喹啉-1-羧酸二環己基氨鹽(Boc-DL-Tiq DCHA)往1，2，3，4-四氫異喹啉-1-羧酸(1)(7.08g，0.040mole)的2NNaOH(40ml，0.080mole)溶液中加入40ml叔丁醇和碳酸氫二叔丁酯(10.5g，0.048mole)。在室溫下約24小時後大部分的叔丁醇已從反應混合物中蒸發掉，將所獲的水相用乙醚洗滌一次。將水層用2NHCl酸化至pH2.0，然後用乙酸乙酯萃取。將萃取液用MgSO4乾燥並在真空中蒸發至幹。將殘渣(油狀)溶解於乙醚中並向所獲溶液中加入二環己基胺，DCHA，(7.9ml，0.040mole)。將溶液在4℃下放置4小時，將沉澱出來的鹽過濾出來，用乙醚洗滌並在真空中乾燥，獲得15.7g(86%產率)的純DCHA鹽2。
FD-MS459(MH+)對C27H42N2O4作元素分析理論值C，70.71;H，9.23;N，6.11實測值C，71.07;H，9.37;N，5.873)叔丁氧基羰基-DL-1，2，3，4-四氫異喹啉-1-醯基-氮雜環丁烷-2-羧酸。(Boc-DL-1-Tiq-AztOH)。
將DCHA鹽(2)(13.7g，30mmol)懸浮於200ml乙酸乙酯中，先後用1.5N檸檬酸和水洗滌該懸浮液，然後用MgSO4乾燥。在真空中將該懸浮液蒸發至幹並將油狀殘渣溶解於100ml乙酸乙酯中。將此溶液冷卻至0℃，加入2，4，5-三氯苯酚(5.91g，30mmol)，隨後再加入DCC(6.18g，30mmol)。將反應混合物在0℃下攪拌5分鐘，然後升溫至室溫再攪拌1.5小時。將反應混合物冷卻至0℃，濾去沉澱並將母液在真空中蒸發至幹。將油狀殘渣溶解於80ml吡啶中並往此溶液中加入2-氮雜環丁烷-2-羧酸(3.0g，30mmole)和4.2ml(30mmole)三乙胺。將反應混合物在室溫下攪拌48小時並在真空中蒸發至幹。將殘渣溶解於乙酸乙酯/水中並用2NNaOH將溶液的pH值調節至9.5。分離出水層，用2NHCl將其酸化至pH2.0，然後用乙酸乙酯萃取。萃取液用MgSO4乾燥並在真空中蒸發至幹，獲得10g的產品3。
將產品(3)溶解於三氯甲烷∶己烷(1∶1，V∶V)混和溶劑中，然後將此溶液加入Water′s Prep500A儀中已預先用己烷平衡過的矽膠柱中。用增加乙酸乙酯濃度梯度的方法洗脫產品(3)。收集各個流出液級分並根據TLC曲線分離出產品。將各級分合併，蒸發至幹，獲得4.8g(44%產率)的純產品3。
TLC Rf(A)0.35FAB-MS361(MH+)[α]D＝-20.6°(C＝0.5CH3OH)4)叔丁氧基羰基-DL-1，2，3，4-四氫-1-異喹啉醯基-L-氮雜環丁基-L-精氨酸(Cbz)內醯胺(4)(Boc-DL-1-Tiq-Azt-Arg(Z)-內醯胺)。
在第一個燒瓶中將Boc-DL-1-Tiq-Azt(3)(5.3g，15mmol)溶解於50mlDMF中並將此溶液冷卻至-15℃。加入N-甲基嗎啉(1.65ml，15mmole)並將反應混合物在-15℃下攪拌2分鐘。
在第2個燒瓶中將Arg(Z)-內醯胺以三氟乙酸鹽(TFA)的形式(6.06g，15mmol)溶解於20mlDMF中並將此溶液冷卻至0℃。向此冷溶液中加入N-甲基嗎啉(1.98ml，在0℃下攪拌2分鐘。然後將第2個燒瓶的內容物倒入第1個燒瓶中並將此反應混合物在-15℃下攪拌3小時。將此混合物放置過夜使其慢慢升溫至室溫，然後將其在真空中蒸發，得到一種油狀物。往此油狀物中加入乙酸乙酯(175ml)和1NNaHCO3(100ml)。分出有機層，先後用水、1.5N檸檬酸、水洗滌。將所獲溶液用MgSO4乾燥並在真空中蒸發至幹，獲得6.9g(73%產率)的一種無定形固體狀的產品4，Boc-DL-1-Tiq-Azt(Z)-內醯胺。
TLC Rf(A)0.64FAB-MS633(MH+)[α]D-62.5°(C＝0.5CHCl3)5)Boc-DL-1-Tiq-Azt-Arg(Z)-H(5)將Boc-DL-1-Tiq-Azt-Arg(Z)-內醯胺(4)(6.3g，10mmole)的85ml無水THF溶液在氮氣氛中冷卻至-15℃，然後在30分鐘內往其中滴加1M氫化鋰鋁的THF(10ml，10mmol)溶液。在氫化物滴加完畢後，將反應混合物在-15℃下攪拌30分鐘。接著在5分鐘內往反應混合物中滴加10mlTHF和3.0ml0.5NH2SO4的混合溶液。將此混合物用200ml乙酸乙酯和200ml水稀釋，分離出有機相，用MgSO4乾燥並在真空中蒸發至幹，得到6.0g(95%產率)的無定形固體狀產品5。
TLC Rf(A)0.186)DL-1-Tiq-Azt-Arg-H硫酸鹽往產品(5)(5.9g，9.3mmole)的60mlTHF和30ml水的溶液中加入10ml的1NH2SO4和2.0g的5%Pd/C催化劑。用一根氣體導管將氮氣通過該懸浮液鼓泡5分鐘，接著用氫氣鼓泡1.5小時，再用氮鼓泡5分鐘。將催化劑濾出，並用Bio-Rad AG1-×8樹脂(羥基型)將濾液的pH值調至4.0。將樹脂濾掉並將濾液冷凍乾燥得到4.5g乾燥的固體。將此固體在0℃下用20ml三氟乙酸和5ml苯甲醚處理10分鐘。將反應混合物攪拌10分鐘，然後在不加熱的情況下蒸發濃縮。往此濃縮物中加入乙醚(100ml)，收集生成的沉澱物並加以乾燥，得到4.8g粗產品。將粗產品(4.8g)溶液於0.01%H2SO4中並將所獲溶液加入串聯在一起的兩個5×25cm VydacC18樹脂柱中。用濃度梯度不斷增加的乙腈(2%至25%)溶液從吸附柱上將肽鹽洗脫下來。根據上述分析用RP-HPLC來收集各流出液級分並匯集起來。使用羥基型的AG1-×8樹脂(Bio Rad陰離子交換樹脂，50-100目)將匯集的各級分溶液的pH值調節至pH4.0。將樹脂濾出並將濾液凍幹，得到1.36g(30%產率)純的標題硫酸鹽。
FAB-MS401(MH+)HPLC停留時間23.1分鐘實施例4D-1，2，3，4-四氫異喹啉-3-醯基-L-氮雜環丁烷-2-醯基-L-精氨酸醛硫酸鹽。(D-3-Tiq-Azt-Arg-H)按照實施例3的步驟來製備標題化合物，不同之處是以1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酸來代替實施例3中的1，2，3，4-四氫異喹啉-1-羧酸。
FAB-MS401(MH+)停留時間18.5分鐘實施例5-8表2中列出了本發明的代表性化合物的質譜數據與HPLC停留時間，其中的A是(R)(R1)(B)C-並且其中的R1是甲基，這些化合物是按照上述的實施例中的一般的偶合方法製備的。
表2實施例 停留時間序號化合物1FAB-MS(MH+) (分)25 N-Acetyl-D-Phg(α-CH3)-Azt-Arg-H 431 20.46 N-Boc-D-Phg(α-CH3)-Azt-Arg-H 489 36.37 N-Acetyl-DL-Phg(α-CH3)-Azt-Arg-H 431 21.68 N-Boc-DL-Phg(α-CH3)-Azt-Arg-H 489 39.01)硫酸鹽2)通過如上所述的分析的RP-HPLC方法測得。
實施例9N-[N-三氟乙醯基-D-(α-甲基)苯基甘氨醯基]-L-氮雜環丁基-L-精氨酸醛鹽酸合物TFA-D-Phg(α-Me)-Azt-Arg-H·HCl按照實施例1中的步驟1和2中的操作程度來製備Boc-Arg(Z)-內醯胺3)HCl-Arg(Z)-內醯胺將Boc-Arg(Z)-內醯胺(2)(641g，1.64mol)在3小時內在-10℃下溶解於CH2Cl2(3L)中，然後向所獲溶液中在30分鐘內滴加經HCl(氣)飽和過的EtOAc(7.2L)溶液。往其中加入乙醚(12L)，將沉澱物濾出並用乙醚洗滌，然後在真空中乾燥，得到580g標題化合物(理論值的108%)TLC Rf(C)0.29;FD-MS291(MH+)。
4)甲基-Nα二苯基亞甲基-DL-苯基甘氨酸酯將二苯酮亞胺(53.8g，297mmol)溶液於二氯甲烷(500ml)中並在室溫下攪拌。往此溶液中加入DL-苯基甘氨酸甲酯鹽酸合物(59.9g，297mmol)並在室溫下攪拌反應48小時。將反應混合物用水(200ml)洗滌3次。分離出有機層，用MgSO4乾燥，然後過濾並將濾液在真空中濃縮，得到一種透明的油狀物。將此油狀物置戊烷中結晶，得到標題化合物(98.5g，100%)FAB-MS330(MH+);
對C22H19NO2作元素分析理論值C，80.22;H，5.81;N，4.25實測值C，80.50;H，5.93;N，4.145)甲基-Nα二苯基亞甲基-DL-(α-甲基)苯基甘氨酸酯將甲基-Nα二苯基亞甲基-DL-苯基甘氨酸酯(4)(14.8g，44.8mmol)的無水THF(200ml)溶液滴加入由18-冠-6(11.8g，44.8mmol)、氫化鉀(11.2g，67.3mmol)、THF(100ml)組成的混合物中，並在氮氣氛中攪拌。往此反應混合物中滴加甲基碘(6.0ml，89.7mmol)的THF(20ml)溶液。在滴加完畢後將反應混合物在室溫下再攪拌1.5小時。往此反應混合物中滴加冰乙酸HOAc(7.0ml)、水(25ml)和THF(30ml)混合溶液。將反應混合物用乙酸乙酯和水稀釋。將有機層分出，用水洗滌3次，然後用MgSO4乾燥。將濾液在真空中濃縮，得到一種油狀物。將這種粗的油狀物置己烷中結晶，得到標題化合物(10.2g，66%)FAB-MS344(MH+);
對C23H21NO2作元素分析理論值C，80.44;H，6.16;N，4.08，實測值C，80.40;H，6.26;N，4.036)DL-(α-甲基)苯基甘氨酸將甲基-Nα二苯基亞甲基-DL-(α-甲基)苯基甘氨酸酯(5)(72.4g，211mmol)的5NHCl(400ml)溶液回流(24小時)。將此溶液冷卻至室溫後過濾，用稀NH4OH溶液將濾液的pH值調節至pH5.8。將此水溶液在真空中濃縮直至開始結晶為止。將反應混合物在5℃下保存過夜，將沉澱物濾出，得到了標題化合物(22g，63%)FAB-MS166(MH+)7)三氟乙醯-DL-(α-甲基)苯基甲氨酸往DL-(α-甲基)苯基甘氨酸(6)(21.9g，133mmol)的三氟乙酸(250ml)溶液中加入三氟乙酸酐(33.5g，159mmol)，然後將此反應混合物回流(2小時)。將反應混合物在真空中濃縮，得到一種油狀物，將此油狀物用EtOAc/H2O稀釋。將有機層分出並用水洗滌3次，用MgSO4乾燥，然後將所獲濾液在真空中濃縮，得到一種白色固體狀的標題化合物(25.3g，73%)，FAB-MS262(MH+)。
8)三氯乙醯基-DL-(α-甲基)苯基甘氨酸-Azt-OH將三氟乙醯基-DL-(α-甲基)苯基甘氨酸(7)(8.0g，31mmol)溶解於EtOAc(80ml)中並將此溶液冷卻至0℃。往此溶液中加入2，4，5-三氯苯酚(6.1g，31mmol)和二環己基碳化二亞胺(6.3g，31mmol)。將反應混合物在0℃下攪拌1小時，然後再在室溫下攪拌1.5小時。濾去沉澱物並將濾液在真空中濃縮，得到一種油狀物。將此油狀物溶解於吡啶(60ml)中，並往其中加入L-氮雜環丁烷-2-羧酸(3.1g，31mmol)和三乙胺(4.3ml，31mmol)。將反應混合物在室溫下攪拌24小時。在真空中除去反應溶劑，得到一種油狀物。將此油狀物溶解於水(100ml)和乙醚(50ml)中並用2N NaOH將所獲溶液的pH值調節至9.0。將分出的水相用乙醚萃取2次。分離出水層，往其中加入EtOAc(150ml)，用3N HCl將溶液的pH值調至3.0。分出有機層，用MgSO4乾燥，將濾液在真空中蒸發濃縮，得到一種無定形的固體(9.3g，88%);FD-MS345(MH+);[α]D＝-80°(C＝0.5/CHCl3)。
9)三氟乙醯-D-(α-甲基)苯基甘氨酸-Azt-Arg(Z)-內醯胺在燒瓶1中將三氟乙醯-DL-(α-甲基)-苯基甘氨酸-Azt-OH(8)(6.7g，19.9mmol)溶解於DMF(50ml)中，冷卻至-15℃，然後加入N-甲基喹啉(2.5ml，21.9mmol)並接著加入氯甲酸異丁酯(2.6ml，19.9mmol)。將反應混合物在-15℃下攪拌2分鐘。
在燒瓶2中將HCl·Arg(Z)-內醯胺(3)(6.5g，19.9mmol)溶解於DMF(40ml)中，冷卻至0℃，並往其中加入二異丙基-乙胺(7.0ml，39.9mmol)。將反應混合物在0℃下攪拌2分鐘。
取部分燒瓶2的內容物加入燒瓶1中，然後將反應混合物在-15℃下攪拌4小時。然後在24小時內讓反應混合物慢慢地升溫至室溫。往反應混合物中加入1NNaHCO3(18ml)並在室溫下攪拌3分鐘。用EtOAc(200ml)和水(100ml)稀釋反應混合物，分離出有機層，將此有機層先後用1NNaHCO3、水和0.1NHCl洗滌。將有機層乾燥(MgSO4)並蒸發濃縮，獲得一種無定形固體狀的粗的標題化合物(11.5g，93%)。將粗的固體物質(11.5g)加入一臺Water′s Prep500A型色譜儀內的兩個矽膠柱中。使用一種由(A)CH2Cl2和(B)EtOAc組成的具有濃度梯度的體系來洗脫純的化合物。所用的濃度梯度是指將EtOAc的濃度從0%增加至20%。分級收集流出液並根據TLC給出的曲線匯集所需的級分。將這些合併的級分在真空中濃縮，得到一種無定形固體狀的標題化合物(3.02g，25%)TLC Rf(D)0.45;FAB-MS617(MH+);[α]D＝-95.9°(C＝0.5CHCl3)。
10)三氟乙醯基-D-(α-甲基)苯基甘氨酸-Azt-Arg(Z)-H在氮氣氛下將三氟乙醯基-D-(α-甲基)苯基甘氨醯基-Azt-Arg(Z)-內醯胺(9)(2.9g，4.8mmol)溶解於無水THF(60ml)中並將其裝入一個燒瓶中。將反應混合物冷卻至-70℃。往反應混合物中加入1M氫化鋰鋁的THF(5.0ml，5.0mmol)溶液，然後在5分鐘內滴加THF(10ml)以將其稀釋。將反應混合物在-70℃下攪拌30分鐘，然後往其中慢慢滴加5mlTHF和5ml0.5NH2SO4的混合溶液。將反應混合物用EtOAc(100ml)和水(100ml)稀釋，然後分離出有機層。將有機層乾燥(MgSO4)並在真空中濃縮至幹，得到一種無定形固體狀的標題化合物(2.39g，81%)FAB-MS619(MH+);
對C29H33N6O6作元素分析理論值C，56.31;H，5.38;N，13.58實測值C，56.10;H，5.51;N，13.3011)三氟乙醯基-D-(α-甲基)苯基甘氨酸-Art-Arg-H·HCl將三氟乙醯基-D-(α-甲基)苯基甘氨酸-Azt-Arg(Z)(10)(2.35g，3.8mmol)溶解於乙醇(110ml)、水(40ml)、1N HCl(5.7ml)溶液中，在有5%Pd/C催化劑(1.9g)的存在下和在室溫及常壓下氫化1.5小時。在反應結束後，過濾除去催化劑。在真空中將濾液濃縮至100ml。再往反應混合物中加入50ml水和100ml正丁醇。分出有機層並用正丁醇將水相萃取2次。將合併的有機萃取液在真空中濃縮至幹。再往反應混合物中加入一種乙醚與異丙醚體積比1∶1的混合物(100ml)。濾出沉澱物並在真空中乾燥，得到純的標題化合物(1.4g，71%)FAB-MS485(MH+);[α]D＝-77.6°(C＝0.5/0.1HCl)。
權利要求
1.一種用於製備如下通式化合物的方法
其中，A是1)一種如下面通式的基團
其中，R是一個如下通式的苯基
其中，a和a′任意地是氫、低級烷基、低級烷氧基、滷原子、三氟甲基、羥基、羥甲基、氨基、或氨甲基；以及n是0或1；或者R是噻吩基、呋喃基、萘基、或者被低級烷基、低級烷氧基、滷原子、氨基、一或二(低級烷基)氨基、或羥基進行一或二取代的萘基；或者R是環己二烯基、環己烯基、環己基或環戊基；R1是氫、甲基或乙基；B是低級烷基、低級烷氧基、羥基、或者是如下通式的一個氨基其中，R2和R3可任意地是氫或低級烷基，或者R2是氫，而R3是C1-C6烷醯基、滷原子取代的C2-C6烷醯基、或者是如下通式的氧羰基其中，R4是C1-C6烷基、C2-C6鏈烯基、C3-C7環烷基、苄基、硝基苄基、二苯基甲基、或者一個如上述定義的苯基；前提條件是，當R1是甲基或乙基時，而B不能是甲基或乙基；2)如通式2的一個雙環基團
其中，Q是一個由
、-CH2-或
所代表的含一個碳的基團，或者由-CH2-CH2-、-CH2
或CH2
所代表的含兩個碳的基團；Y是一個由-CH2-或
所代表的含一個碳的基團，或者由
所代表的含兩個碳的基團；其前提條件是，在Q和Y中，只能有一個而不能兩個都是
或
；另外還有一個條件是，Q和Y中只有一個是含兩個碳的基團；R5是氫或一個如上面所定義的氧羰基R4-OC(O)-；R6是氫、低級烷基、低級烷氧基、滷原子、羥基、三氟甲基、羧基、氨基甲醯基或氨基磺醯基；而六元環中的虛線表示它是一個芳環或全氫環；其特徵在於該方法包含從如下通式的化合物中除去氨基保護基P
2.按權利要求1用於製備一種化合物的方法，在該化合物中，A是一個如下式的基團
其中，B是一個通式為-N(R2)(R3)的氨基，其中，R2是氫或C1-C4烷基，R3是一個氧羰基R4-O-C(O)-，其中，R4是C1-C6烷基，其中的R則是如下通式的一個基團
3.按權利要求1用於製備N-Boc-D-苯基甘氨醯基-L-氮雜環丁基-L-精氨酸醛的方法。
4.按權利要求1用於製備N-甲基-D-苯基甘氨醯基-L-氮雜環丁基-L-精氨酸醛的方法。
5.按權利要求1用於製備N-Boc-D-苯基丙氨醯基-L-氮雜環丁基-L-精氨酸醛的方法。
6.按權利要求1用於製備N-甲基-D-苯基丙氨醯基-L-氮雜環丁基-L-精氨酸醛的方法。
7.按權利要求1用於製備N-乙基-D-苯基甘氨醯基-L-氮雜環丁基-L-精氨酸醛的方法。
8.按權利要求1用於製備化合物的方法，在該化合物中，A是如下通式的一個雙環基團
其中，Q是-CH2-CH2-或CH2
，以及Y是
或-CH2-。
9.按權利要求8用於製備如下通式化合物的方法
10.按權利要求8用於製備如下通式化合物的方法
11.按權利要求8用於製備如下通式化合物的方法
12.按權利要求8用於製備如下通式化合物的方法
13.按權利要求1用於製備一種化合物的方法，在該化合物中，A是
R1是甲基或乙基，R2是氫，R3是C1-C6烷醯基、滷原子取代的C2-C6烷醯基，或者一個氧羰基R4-O-C(O)-。
14.按權利要求13的方法，其中的化合物是N-乙醯基-D-Phg(α-CH3)-L-Azt-L-Arg-H。
15.按權利要求13的方法，其中的化合物是N-Boc-D-Phg(α-CH3)-L-Azt-t-Arg-H。
16.按權利要求13的方法，其中的化合物是三氟乙醯基-D-(α-甲基)苯基甘氨醯基-L-氮雜環丁基-L-精氨酸醛。
17.按權利要求13的方法，其中的化合物是三氟乙醯基-D-(α-甲基)苯基甘氨醯基-L-氮雜環丁基-L-精氨酸醛。
18.一種用於製備藥物製劑的方法，該方法包括，將一種或多種藥物學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑與一種如下通式的化合物摻合
其中，A是1)一種如下面通式的基團
其中，R是如下通式的一個苯基
其中，a和a′可任意地是氫、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、滷原子、三氟甲基、羥基、羥甲基、氨基、或氨甲基;n是0或1;或者R是噻吩基、呋喃基、萘基、或者被C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、滷原子、氨基、一或二(C1-C4烷基)氨基、或羥基進行一或二取代的萘基;或者R是環己二烯基、環己烯基、環己基或環戊基;R1是氫、甲基或乙基;B是C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、羥基、或者具有如下通式的一個氨基其中，R2和R3可任意地是氫或C1-C4烷基，或者R2是氫，而R3是C1-C6烷醯基、滷原子取代的C2-C6烷醯基、或者是如下通式的氧羰基其中，R4是C1-C6烷基、C2-C6鏈烯基、C3-C7環烷基、苄基、硝基苄基、二苯基甲基、或者一個如上述定義的苯基;其前提條件是，當R1是甲基或乙基時，B不能是甲基或乙基;2)如下列通式的一個雙環基團
其中，Q是一個由
、-CH2-或
所代表的含一個碳的基團，或者由-CH2-CH2-、
或
所代表的含兩個碳的基團;Y是一個由-CH2-或
所代表的含一個碳的基團，或者由
所代表的含兩個碳的基團;其前提條件是，在Q和Y中，只能有一個而不能兩個都是
或
;另外還有一個前提條件是，Q和Y中只能有一個是含兩個碳的基團;R5是氫或一個如上面所定義的氧羰基R4-OC(O)-;R6是氫、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、滷原子、羥基、三氟甲基、羧基、氨基甲醯基或氨基磺醯基;而六元環中的虛線表示它是一個芳環或全氫環;或者是由它們製備的一種藥物學上可接受的無毒性的鹽。
全文摘要
提供了由通式所代表的凝血酶抑制劑，其中的A是，例如，苯基甘氨醯基、和苯基丙氨醯基、α-甲基苯基丙氨酸和α-甲基苯基甘氨酸(其中的氨基最好是被低級烷基、烷醯基或低級烷氧基羰基所取代)，或者是一個雙環基團，如1，2，3，4-四氫異喹啉-1-基。另外還提供了一種用於在人類和動物體內抑制形成凝血塊的方法，和該方法所使用的藥物製劑以及生產該抑制劑的中間產物。
文檔編號C07K5/06GK1074438SQ9211438
公開日1993年7月21日 申請日期1992年11月11日 優先權日1991年11月12日
發明者R·T·舒曼 申請人:伊萊利利公司