修飾化人源粒細胞－集落刺激因子及其製備方法

2023-05-03 08:21:16

專利名稱:修飾化人源粒細胞－集落刺激因子及其製備方法
發明領域本發明涉及修飾化人源粒細胞—集落刺激因子(hG-CSF)，編碼上述多肽的基因，包含上述基因的載體，使用上述載體轉化的微生物以及使用上述微生物生產該修飾化hG-CSF的方法。
發明背景術語集落刺激因子(CSF)包括粒細胞/巨噬細胞-集落刺激因子(GM-CSF)，巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)和粒細胞集落刺激因子(G-CSF)，它們是由T細胞，巨噬細胞，成纖維細胞與內皮細胞產生的。GM-CSF刺激粒細胞或巨噬細胞的幹細胞以誘導粒細胞或巨噬細胞克隆的分化與增殖。M-CSF和G-CSF主要是分別誘導巨噬細胞與粒細胞克隆的形成。在體內，G-CSF誘導骨髓白細胞的分化並增強成熟粒細胞的功能，因此，它在治療白血病方面的醫學重要性已經被充分證實。
人源G-CSF(hG-CSF)是一個包含174或177個胺基酸的蛋白質，其中174個胺基酸的種類具有更高的嗜中性粒細胞-增強活性(Morishita，K.et al.，J.Biol.Chem.，262，15208-15213(1987))。包含174個胺基酸的hG-CSF的胺基酸序列如
圖1所示。通過對編碼上述hG-CSF的基因操作，已經進行了很多研究用以大量生產hG-CSF。
例如，Chugai Pharmaceuticals有限公司(日本)已經公開了hG-CSF的胺基酸序列與編碼基因(韓國專利公開號91-5624和92-2312)，並報導了通過基因重組方法製備具有hG-CSF活性蛋白的方法(韓國專利Nos.47178，53723和57582)。在該製備方法中，通過使用包含編碼hG-CSF多核苷酸的基因組DNA或cDNA，在哺乳動物細胞中產生糖基化hG-CSF。糖基化的hG-CSF含有一個O-糖苷鍵的糖鏈，但是，已知上述的糖鏈對hG-CSF的活性並不是必需的(Lawrence，M.et al.，Science，232，61(1986))。而且，眾所周知，使用哺乳動物細胞生產糖基化的hG-CSF需要昂貴的材料和設備，因此該方法在經濟上是不可行的。
與此同時，有許多通過使用微生物，例如大腸桿菌來生產非糖基化hG-CSF的嘗試。在這些研究中，由於微生物中所使用的ATG起始密碼子，獲得的是在其N端附加了一個蛋氨酸殘基的具有175或178個胺基酸的hG-CSF。但是，當重組hG-CSF被用藥時，這個附加的蛋氨酸殘基會在人體內引起不良免疫反應(歐洲專利發表No.256,843)。此外，在大腸桿菌中產生的大部分包含蛋氨酸的hG-CSF，作為不溶的包涵體沉澱在細胞中，它們必須通過一個產量損失很大的再摺疊過程轉變為有活性的形式。在此方面，五個存在於野生型hG-CSF中的半胱氨酸殘基，有四個參與形成二硫鍵，而剩餘的一個在再摺疊過程中參與hG-CSF產物的聚合，降低了產量。
近來，為了解決在微生物細胞中生產外源蛋白的問題，已經進行了很多努力，以得到一個基於目標蛋白跨過微生物細胞膜進入胞外區域的有效分泌的方法。
例如，在使用信號肽的方法中，目標蛋白以融合蛋白的形式表達，其中信號肽加在該蛋白的N端。當融合蛋白跨過細胞膜時，信號肽通過一個酶被除去，目標蛋白以成熟形式被分泌出來。這個分泌生產的方法是有利的，因為產生的胺基酸序列通常是與野生型一致的。然而，由於在跨膜運輸和隨後的純化過程中不能令人滿意的效率，使分泌生產方法的產量非常低。這與一個廣為人知的事實相符即在原核生物中以分泌形式生產哺乳動物蛋白，其產量非常低迄今為止，在N端沒有附加蛋氨酸殘基的可溶性hG-CSF的有效表達和分泌的微生物方法還沒有報導。
本發明人曾經報導過在hG-CSF生產方法中，通過修飾抗熱大腸桿菌腸毒素II的信號肽(韓國專利公開發表No.2000-19788)所製備的新型分泌信號肽的應用。具體地，製備一個由附加在修飾的抗熱大腸桿菌腸毒素II信號肽3』端的hG-CSF基因構成的表達載體，通過使用該表達載體轉化大腸桿菌表達有生物活性的，成熟的hG-CSF。但是，大部分表達的hG-CSF聚集在細胞質中，而不是在周質中。
本發明人進一步努力發展了一個在微生物中生產hG-CSF的有效分泌的方法，並發現通過用其他的胺基酸替代野生型hG-CSF的至少一個胺基酸，特別是第17個的半胱氨酸殘基，得到的修飾化hG-CSF保持野生型的生物活性，而且這個在N端沒有蛋氨酸殘基的修飾化hG-CSF，當使用合適的分泌信號肽時，能夠被微生物有效的表達和分泌。
發明概述因此，本發明的一個目的是提供可通過微生物進行有效生產的修飾化人源粒細胞—集落刺激因子(hG-CSF)..
本發明的另一個目的是提供編碼上述多肽的基因和包含上述基因的載體。
本發明的再一個目的是提供用上述載體轉化的微生物。
本發明還有一個目的是提供用上述微生物生產氨基端沒有附加蛋氨酸殘基的hG-CSF的方法。
依照本發明的一個方面，提供了一種修飾化hG-CSF，特徵在於野生型hG-CSF的第1，第2，第3和第17位胺基酸中至少有一個被其它胺基酸替換。
附圖簡述通過下面有關本發明的具體描述，結合下面的附圖，本發明前述的以及其它目的和特徵將更加明顯；附圖分別為圖1包含174個胺基酸殘基的野生型人源粒細胞刺激因子的核苷酸與胺基酸序列(SEQ ID NOS1和2)；圖2構建載體pT-CSF的流程；圖3構建載體pT14S1SG的流程；圖4構建載體pT14SS1SG的流程；圖5構建載體pT140SSG-4T22Q的流程；圖6構建載體pT14SS1S17SEG的流程圖7構建載體pTO1SG的流程；圖8構建載體pBADG的流程；圖9構建載體pBAD2M3VG的流程；
圖10a和10bwest blot分析的結果，肯定hG-CSF與重組細胞系中修飾化hG-CSF的表達以及表達蛋白各自的分子量；和圖11hG-CSF和產生於重組細胞系中的修飾化hG-CSF的細胞活性。
發明詳述本發明中的修飾化hG-CSF是通過用其它的胺基酸代替野生型hG-CSF(SEQ ID NO2)中一個或多個胺基酸，優選替換其中第1、第2、第3和第17位胺基酸而衍生得到的。更優選的是用在中性pH值下不帶電荷的胺基酸代替hG-CSF中的第17個胺基酸獲得的多肽。這些優選的修飾化hG-CSF的實例都有野生型hG-CSF的胺基酸序列，除了(a)第1個胺基酸為Ser(絲氨酸)；(b)第1個胺基酸為Ser(絲氨酸)以及第17個胺基酸為X；(c)第2個胺基酸為Met(蛋氨酸)以及第3個胺基酸為Val(纈氨酸)；(d)第2個胺基酸為Met(蛋氨酸)，第3個胺基酸為Val(纈氨酸)以及第17個胺基酸為X；或者(f)第17個胺基酸為X，其中X為中性pH值時不帶電荷的胺基酸，優選Ser(絲氨酸)，Thr(蘇氨酸)，Ala(丙氨酸)或Gly(甘氨酸)，更優選Ser(絲氨酸)。
hG-CSF中的五個半胱氨酸殘基中有四個參與形成二硫鍵，而第17位半胱氨酸殘基在自然狀態下保持非成鍵(狀態)。但是當大量的hG-CSF在重組細胞中表達時，第17位半胱氨酸殘基參與分子內二硫鍵的形成，導致在細胞質中積累凝聚化的hG-CSF。而本發明中修飾化hG-CSF在第17位的胺基酸不是半胱氨酸，因此沒有這種問題，而且能用適當轉化的微生物通過分泌方法進行有效生產。
本發明中修飾化hG-CSF可以被一個基因編碼，該基因包含根據遺傳密碼從修飾化hG-CSF的胺基酸序列推斷得到的核苷酸序列。眾所周知，由於密碼子的簡併性，幾個不同的密碼子可以編碼一個特定的胺基酸，因此本發明包括此範圍中從修飾化hG-CSF胺基酸序列推斷得到的所有的核苷酸序列。優選的是，修飾化hG-CSF基因序列包括一個或多個大腸桿菌偏愛的密碼子。
這樣，製備的基因可以插入到傳統的載體中獲得一個表達載體，隨後該載體可被轉入到合適的宿主中，例如大腸桿菌。表達載體可以進一步包含一個信號肽。典型的信號肽包括抗熱大腸桿菌腸毒素II信號肽(SEQID NO53)，修飾化抗熱大腸桿菌腸毒素II信號肽(SEQ ID NO54)，β-內醯胺酶信號肽(SEQ ID NO24)，基因III信號肽(SEQ ID NO42)或其修飾化信號肽，但在本發明中使用的信號肽沒有限制。本發明中製備表達載體所用的啟動子可以是任何能在微生物宿主中表達外源蛋白的啟動子。特別是當異源蛋白在大腸桿菌中表達時，lac，Tac和阿拉伯糖啟動子為優選。
本發明中示範的表達載體包括pT14SS1SG，pT14SS1S17SEG，pTO1SG，pTO1S17SG，pTO17SG，pTO17TG，pTO17AG，pTO17GG，pBAD2M3VG，pBAD17SG和pBAD2M3V17SG。
本發明中的表達載體可以根據傳統的轉化方法(Sambrook et al.，同上)轉入微生物，例如大腸桿菌BL21(DE3)(Novagen)，大腸桿菌XL-1blue(Novagen)，獲得轉化子大腸桿菌BL21(DE3)/pT14SS1SG(HM10310)，大腸桿菌BL21(DE3)/pT14SS1S17SEG(HM 10311)，大腸桿菌BL21(DE3)/pTO1SG(HM 10409)，大腸桿菌BL21(DE3)/pTO1S17SG(HM 10410)，大腸桿菌BL21(DE3)/pTO17SG(HM 10411)，大腸桿菌BL21(DE3)/pTO17TG(HM 10413)，大腸桿菌BL21(DE3)/pTO17AG(HM 10414)，大腸桿菌BL21(DE3)/pTO17GG(HM 10415)，大腸桿菌BL21(DE3)/pBAD2M3VG(HM 10510)，大腸桿菌BL21(DE3)/pBAD17SG(HM 10511)和大腸桿菌BL21(DE3)/pBAD2M3V17SG(HM 10512)。在這些轉化微生物中，優選轉化子大腸桿菌BL21(DE3)/pT14SS1S17SEG(HM 10311)，大腸桿菌BL21(DE3)/pTO1S17SG(HM10410)，大腸桿菌BL21(DE3)/pTO17SG(HM 10411)和大腸桿菌BL21(DE3)/pBAD2M3VG(HM 10510)，依據國際承認的用於專利程序的微生物保藏的布達佩斯條約中的條款，這些轉化子於1999年3月24日保藏在韓國微生物保藏中心(KCCM)(地址；食品工業系，工程學院，Yonsei University，Sodaemun-gu，漢城120-749，大韓民國)，保藏號分別為KCCM-10154，KCCM-10151，KCCM-10152和KCCM-10153。
本發明中的修飾化hG-CSF蛋白可以通過培養轉化子微生物，表達編碼修飾化hG-CSF蛋白的基因，分泌修飾化hG-CSF到周質並且從周質中回收修飾化hG-CSF蛋白來生產。轉化子微生物可根據傳統方法進行培養(Sambrook et al.，同上)。對微生物培養物可通過離心或過濾來收集那些分泌修飾化hG-CSF蛋白的微生物。轉化微生物可根據傳統的方法(Ausubel，F.M.et al.， Current Protocols in Molec μlar Biology，(1989))進行破碎以獲得周質溶液。例如，微生物可在低滲溶液，比如蒸餾水中，通過滲透壓進行破碎。在周質溶液中回收修飾化hG-CSF可通過傳統方法進行操作(Sambrook et al.，同上)，如離子交換層析，凝膠過濾柱層析或免疫柱層析。例如，hG-CSF可通過羧甲基-瓊脂糖凝膠(CM-Sepharose)柱層析與苯基-瓊脂糖凝膠(Phenyl Sepharose)柱層析的連續操作進行純化。
根據本發明所生產的修飾化hG-CSF蛋白在N端沒有蛋氨酸化，並具有等於或高於野生型hG-CSF的生物活性。因此它可以有很多用途。
以下的實施例將在不限定範圍的情況下進一步闡明本發明。實施例1製備編碼hG-CSF的基因使用hG-CSF的模板(RD系統，美國)，通過PCR製備編碼hG-CSF的cDNA基因。所用的引物是由美國專利No.4,810,643所描述的。
為了製備編碼成熟hG-CSF的cDNA基因，載體pUC19-G-CSF(Biolabs，美國)用引物SEQ ID NOS3和4進行PCR反應。設計的引物SEQ ID NO3在成熟hG-CSF第1位胺基酸(蘇氨酸)密碼子的上遊提供一個NdeI限制性內切酶位點(5』-CATATG-3』)，引物SEQ IDNO4在其終止密碼子的下遊提供一個BamHI限制性內切酶位點(5』-GGATCC-3』)。
擴增的hG-CSF基因用NdeI和BamHI酶切，以得到編碼成熟hG-CSF的基因。該hG-CSF基因插入到載體pET14b(Novagen，美國)的NdeI/BamHI部位，獲得載體pT-CSF。
圖2所示的是以上構建載體pT-CSF的流程。實施例2構建包含編碼大腸桿菌腸毒素II信號肽與修飾化hG-CSF基因的載體(步驟1)構建大腸桿菌腸毒素II信號肽基因為了製備大腸桿菌腸毒素II信號肽基因，根據大腸桿菌腸毒素II信號肽的核酸序列設計一對互補的寡核苷酸SEQ ID NOS5和6，用DNA合成儀(Model 380B，應用生物系統公司，美國)進行合成。
上述設計的寡核苷酸在大腸桿菌腸毒素II起始密碼子上遊提供一個BspHI限制性內切酶位點(與NcoI限制性內切酶位點互補)，並在另一端通過無意改變引入一個MluI限制性內切酶位點。
兩條寡核苷酸在95℃退火，獲得含有編碼大腸桿菌腸毒素II信號肽(STII基因)的核酸序列的平端DNA片段。
STII基因插入到載體pUC19(Biolabs，美國)的Smal位點，得到載體pUC19ST。(步驟2)製備編碼STII/hG-CSF的基因為了製備編碼STII/hG-CSF的基因，在製備實施例1中獲得的載體pT-CSF用引物SEQ ID NOS7和8進行PCR反應。引物SEQ ID NO7設計為用絲氨酸密碼子替代hG-CSF的第1個密碼子，而引物SEQ IDNO8在其終止密碼子的下遊提供一個BamHI限制性內切酶位點(5』-GGATCC-3』)。
擴增的DNA片段用MluI和BamHI酶切，然後插入到步驟1中所獲得的pUC19ST的MluI/BamHI部位，獲得載體pUC19S1SG。這樣獲得的載體pUC19S1SG包含一個編碼STII/hG-CSF的基因(被命名為STII-hG-CSF基因)。
載體pUC19S1SG用BspHI和BamHI酶切，獲得一個DNA片段(522bp)。該DNA片段插入到載體pET14b(Novagen，美國)的NcoI/BamHI部位，得到載體pT14S1SG。
圖3描述上述構建載體pT14S1SG的流程。
(步驟3)將大腸桿菌腸毒素II Shine-Dalgarno序列加入到STII-hG-CSF基因中步驟2中獲得的載體pT14S1SG用引物SEQ ID NOS9和10進行PCR反應。引物SEQ ID NO9設計為提供一個大腸桿菌腸毒素II Shine-Dalgarno序列(命名為STII SD序列)和XbaI限制性內切酶位點，而引物SEQ ID NO10在成熟hG-CSF的終止密碼子的下遊提供一個BamHI限制性內切酶位點，以獲得一個包含STII SD和STII-hG-CSF基因的DNA片段(STII SD-STII-hCSF)。
STII SD-STII-hCSF片段用XbaI和BamHI酶切，然後插入到載體pET14b(Novagen，美圍)的XbaI/BamHI部位，得到載體pT14SS1SG。
圖4描述上述構建載體pT14SS1SG的流程。
用載體pT14SS1SG轉化大腸桿菌BL21(DE3)(Stratagene，美國)，獲得轉化子，命名為大腸桿菌HM 10310。(步驟4)構建包含編碼STII/hG-CSF融合蛋白基因的載體依照定點突變，步驟3中所獲得的質粒pT14SS1SG中的修飾化hG-CSF的第1個密碼子被蘇氨酸替代(Papworth，C.et al.，Strategies，9，3(1996))，這是用含有修飾化核苷酸序列的正向引物(SEQ ID NO12)，互補的反向引物(SEQ ID NO13)和pfu(Stragene，美國)通過質粒的PCR反應得到的。
回收擴增的DNA片段，並加入限制性內切酶DpnI以除去未轉變的質粒。
大腸桿菌XL-1 blue(Novagen，美國)用修飾化的質粒進行轉化。從轉化的克隆中回收DNA，測定其鹼基序列，這樣得到的質粒pT14SSG含有hG-CSF的第1個胺基酸被蘇氨酸替代的基因(SEQ ID NO11)。
-5 -4 -3 -2 -1 +1 +2 +3 +4 +5Thr Asn Ala Tyr Ala Thr Pro Leu Gly Pro(SEQ ID NO11)-ACA-AAT-GCC-TAC-GCG-ACA-CCC-CTG-GGC-CCT(SEQ ID NO12)-TGT-TTA-CGG-ATG-CGC-TGT-GGG-GAC-CCG-GGA(SEQ ID NO13)
大腸桿菌BL21(DE3)(Stratagene，美國)用載體pT14SSG進行轉化，得到的轉化子命名為大腸桿菌HM 10301。(步驟5)構建包含編碼修飾化STII/hG-CSF基因的載體步驟4中獲得的載體pT14SSG用互補引物SEQ ID NOS15和16進行PCR反應，這兩個引物根據步驟4中的流程，設計為用蘇氨酸密碼子替代STII的第四個密碼子以獲得修飾化的質粒。
大腸桿菌XL-1 blue(Novagen，美國)用修飾化的質粒進行轉化。從轉化的克隆中回收DNA，測定其鹼基序列，這樣得到的質粒含有STII的第四個胺基酸被蘇氨酸替代的基因(SEQ ID NO14)。
Met Lys Lys Thr Ile Ala Phe Leu (SEQ ID NO14)5′-GG-TGT-TTT-ATG-AAA-AAG-ACA-ATC-GCA-TTT-CTT-C-3′ (SEQ ID NO15)3′-CC-ACA-AAA-TAC-TTT-TTC-TGT-TAG-CGT-AAA-GAA-G-5′ (SEQ ID NO16)這樣獲得的質粒用XbaI和MluI酶切，然後插入到步驟4中獲得的載體pT14SSG的XbaI/MluI部位，得到載體pT14SSG-4T。(步驟6)構建包含編碼修飾化STII/hG-CSF基因的載體步驟5中獲得的載體pT14SSG-4T用互補引物SEQ ID NOS18和19進行PCR反應，這兩個引物根據步驟4中的流程，設計為用穀氨醯胺密碼子替代STII的第22個密碼子以獲得修飾化的質粒。
大腸桿菌XL-1 blue(Novagen，美國)用修飾化的質粒進行轉化。從轉化的克隆中回收DNA，測定其鹼基序列，這樣得到的質粒pT14SSG-4T22Q含有STII的第22個胺基酸被穀氨醯胺替代的基因(SEQ ID NO17)。
ASN Ala Gln Ala Thr Pro Leu Gly (SEQ ID NO17)5′-CA-AAT-GCC-CAA-GCG-ACA-CCC-CTG-GGC-3′(SEQ ID NO18)3′-GT-TTA-CGG-GTT-CGC-TGT-GGG-GAC-CCG-5′(SEQ ID NO19)(步驟7)構建包含編碼修飾化STII SD和編碼修飾化STII/hG-CSF基因的載體步驟6中獲得的載體pT14SSG-4T22Q，用根據步驟4的流程得到的互補引物SEQ ID NOS20和21進行PCR反應，得到載體pT140SSG-4T22Q，該載體在STII SD序列(GAGG)和STII起始密碼子之間含有6個核苷酸序列(修飾化的STII SD，SEQ ID NO71)。
圖5描述上述構建載體pT140SSG-4T22Q的流程。
用載體pT140SSG-4T22Q轉化大腸桿菌BL21(DE3)，得到的轉化子命名為大腸桿菌HM 10302。實施例3構建含有編碼修飾化hG-CSF基因的載體為了製備修飾化hG-CSF基因，用DNA合成儀(Model380B，應用生物系統公司，美國)合成具有大腸桿菌偏愛密碼子和用絲氨酸代替hG-CSF的第17個胺基酸的S1寡核苷酸(SEQ ID NO22)和AS1寡核苷酸(SEQ ID NO23)。
0.5μl(50pmole)寡核苷酸在95℃反應15分鐘，然後在35℃溫育3小時。混合物用乙醇沉澱，並進行凝膠電泳(SDS-PAGE)以獲得一個粘端的雙鏈(ds)寡核苷酸。
在例2的步驟3中獲得的質粒pT14SS1SG用ApaI和BstXI酶切，然後與粘端的雙鏈寡核苷酸連接，獲得載體pT14SS1S17SEG。載體pT14SS1S17SEG含有一個在氨端有大腸桿菌偏愛密碼子和用絲氨酸分別代替hG-CSF第1個和第17個胺基酸的編碼hG-CSF的基因。
圖6所示的是上述構建載體pT14SS1S17SEG的流程。
用載體pT14SS1S17SEG轉化大腸桿菌BL21(DE3)，得到的轉化子命名為大腸桿菌HM 10311，它於1999年3月24日保藏在韓國微生物菌保中心(KCCM)，保藏號為KCCM-10154。實施例4構建包含編碼大腸桿菌OmpA信號肽和修飾化hG-CSF基因的載體按照以下步驟製備包含編碼Tac啟動子和OmpA信號肽(SEQ ID NO24)以及編碼修飾化hG-CSF基因的載體Met-Lys-Lys-Thr-Ala-Ile-Ala-Ile-Ala-Val-Ala-Leu-Ala-Gly-Phe-Ala-Thr-Val-Ala-Gln-Ala- (SEQ ID NO24)--GTT-GCG-CAA-GCT-TCT-CGA-- (SEQ ID NO25)--CAA-CGC-GTT-CGA-AGA-GCT-- (SEQ ID NO26)HindIII限制性位點在實施例1中獲得的載體pT-CSF用以絲氨酸密碼子代替hG-CSF第1個密碼子的引物(SEQ ID NO27)和另一個在其終止密碼子下遊提供EcoRI限制性內切酶位點(5』-GAATTC-3』)的引物(SEQ ID NO28)進行PCR反應，得到包含編碼修飾化hG-CSF基因的DNA片段。
該DNA片段用HindIII和EcoRI酶切，然後插入到載體pFlag.CTS(Eastman，美國)的HindIII/EcoRI部位，得到的載體pTO1SG包含編碼大腸桿菌OmpA信號肽和修飾化hG-CSF(SEQ ID NO29)的基因。
圖7所示的是上述構建載體pTO1SG的流程。
用載體pTO1SG轉化大腸桿菌BL21(DE3)(Stratagene，美國)，得到的轉化子命名為大腸桿菌HM 10409。實施例5構建包含編碼大腸桿菌OmpA信號肽和修飾化hG-CSF基因的載體通過用設計為用蘇氨酸密碼子代替hG-CSF的第1個密碼子的正向引物(SEQ ID NO30)和一個互補反向引物(SEQ ID NO31)對實施例4中獲得的質粒pTO1SG進行PCR反應，這樣在實施例4獲得的質粒pTO1SG中，修飾化hG-CSF基因的第1個密碼子根據定點突變被蘇氨酸密碼子替代(Papworth，C.et al.，Strategies，9，3(1996))。
用修飾化的質粒轉化大腸桿菌XL-1 blue(Novagen，美國)。從轉化的克隆中回收DNA，測定其鹼基序列，這樣得到的質粒pTOG含有hG-CSF的第1個胺基酸被蘇氨酸替代的基因。
用載體pT14SSG轉化大腸桿菌BL21(DE3)(Stratagene，美國)，得到的轉化子命名為大腸桿菌HM 10401。實施例6生產修飾化hG-CSF(a)生產[絲氨酸1，絲氨酸17]hG-CSF實施例4中獲得的載體pTO1SG用設計為以絲氨酸密碼子代替hG-CSF的第17個密碼子的正向引物(SEQ ID NO32)和一個根據實施例2中的步驟4所得到的互補反向引物(SEQ ID NO33)進行PCR反應，獲得一個修飾化質粒。
用修飾化質粒轉化大腸桿菌XL-1 blue(Novagen，美國)。從轉化的克隆中回收DNA，測定其鹼基序列，這樣得到的質粒pTO1S17SG含有hG-CSF的第1個和第17個胺基酸被絲氨酸替代的基因。
用載體pTO1S17SG轉化大腸桿菌BL21(DE3)(Stratagene，美國)，得到的轉化子命名為大腸桿菌HM 10410，它於1999年3月24日保藏在韓國微生物菌保中心(KCCM)，保藏號為KCCM-10151。(b)生產[絲氨酸17]hG-CSF實施例5中獲得的載體pTOG用設計為以絲氨酸密碼子代替hG-CSF的第17個密碼子的正向引物(SEQ ID NO32)和一個根據實施例2中的步驟4所得到的互補反向引物(SEQ ID NO33)進行PCR反應，獲得一個修飾化質粒。
用修飾化質粒轉化大腸桿菌XL-1 blue(Novagen，美國)。從轉化的克隆中回收DNA，測定其鹼基序列，這樣得到的質粒pTO17SG含有hG-CSF的第17個胺基酸被絲氨酸替代的基因。
用載體pTO17SG轉化大腸桿菌BL21(DE3)(Stratagene，美國)，得到的轉化子命名為大腸桿菌HM 10411，它於1999年3月24日保藏在韓國微生物菌保中心(KCCM)，保藏號為KCCM-10152。(c)生產[蘇氨酸17] hG-CSF實施例5中獲得的載體pTOG用設計為以蘇氨酸密碼子代替hG-CSF的第17個密碼子的正向引物(SEQ ID NO34)和一個根據實施例2中的步驟4所得到的互補反向引物(SEQ ID NO35)進行PCR反應，獲得一個修飾化質粒。
用修飾化質粒轉化大腸桿菌XL-1 blue(Novagen，美國)。從轉化的克隆中回收DNA，測定其鹼基序列，這樣得到的質粒pTO17TG含有hG-CSF的第17個胺基酸被蘇氨酸替代的基因。
用載體pTO17TG轉化大腸桿菌BL21(DE3)(Stratagene，美國)，得到的轉化子命名為大腸桿菌HM 10413。(d)生產[丙氨酸17]hG-CSF實施例5中獲得的載體pTOG用設計為以丙氨酸密碼子代替hG-CSF的第17個密碼子的正向引物(SEQ ID NO36)和一個根據實施例2中的步驟4所得到的互補反向引物(SEQ ID NO37)進行PCR反應，獲得一個修飾化質粒。
用修飾化質粒轉化大腸桿菌XL-1 blue(Novagen，美國)。從轉化的克隆中回收DNA，測定其鹼基序列，這樣得到的質粒pTO17AG含有hG-CSF的第17個胺基酸被丙氨酸替代的基因。
用載體pTO17AG轉化大腸桿菌BL21(DE3)(Stratagene，美國)，得到的轉化子命名為大腸桿菌HM 10414。(e)生產[甘氨酸17]hG-CSF實施例5中獲得的載體pTOG用設計為以甘氨酸密碼子代替hG-CSF的第17個密碼子的正向引物(SEQ ID NO38)和一個根據實施例2中的步驟4所得到的互補反向引物(SEQ ID NO39)進行PCR反應，獲得一個修飾化質粒。
用修飾化質粒轉化大腸桿菌XL-1 blue(Novagen，美國)。從轉化的克隆中回收DNA，測定其鹼基序列，這樣得到的質粒pTO17GG含有hG-CSF的第17個胺基酸被甘氨酸替代的基因。
用載體pTO17GG轉化大腸桿菌BL21(DE3)(Stratagene，美國)，得到的轉化子命名為大腸桿菌HM 10415。(f)生產[天冬氨酸17]hG-CSF實施例5中獲得的載體pTOG用設計為以天冬氨酸密碼子代替hG-CSF的第17個密碼子的正向引物(SEQ ID NO40)和一個根據實施例2中的步驟4所得到的互補反向引物(SEQ ID NO41)進行PCR反應，獲得一個修飾化質粒。
用修飾化質粒轉化大腸桿菌XL-1 blue(Novagen，美國)。從轉化的克隆中回收DNA，測定其鹼基序列，這樣得到的質粒pTO17APG含有hG-CSF的第17個胺基酸被天冬氨酸替代的基因。
用載體pTO17APG轉化大腸桿菌BL21(DE3)(Stratagene，美國)，得到的轉化子命名為大腸桿菌HM 10416。實施例7構建包含編碼大腸桿菌基因III信號肽和修飾化hG-CSF的載體(a)構建編碼阿拉伯糖啟動子和大腸桿菌基因III信號肽基因的載體按照以下步驟製備包含編碼阿拉伯糖啟動子和大腸桿菌基因III信號肽(SEQ ID NO42)以及修飾化hG-CSF基因的載體Met-Lys-Lys-Leu-Leu-Phe-Ala-Ile-Pro-Leu-Val-Val-Pro-Phe-Tyr-Ser-His-Ser- (SEQ ID NO42)-TAT-AGC-CAT-AGC-ACC-ATG-GAG- (SEQ ID NO43)-ATA-TCG-GTA-TCG-TGG-TAG-CTC- (SEQ ID NO44)NcoI限制性位點包含編碼阿拉伯糖啟動子和大腸桿菌基因III信號肽基因的質粒pBAD·gIIIA(Invitrogen，美國)用NcoI酶切，然後用Klenow DNA聚合酶除去單鏈DNA，得到平端雙鏈DNA，然後它用BglII酶切，得到含有一個平端和一個粘端的載體片段。
實施例1中得到的載體pT-CSF用設計為核苷酸序列編碼hG-CSF的第2到第九個胺基酸的正向引物(SEQ ID NO46)和根據實施例2中的步驟4所得到的互補反向引物(SEQ ID NO47)進行PCR反應，得到一個平端DNA片段，該片段包含hG-CSF基因，其羧端包含一個BamHI內切酶位點。然後該片段用BamHI酶切，獲得含有一個平端和一個粘端的hG-CSF基因片段。
Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu (SEQ TD NO 45)5′-C-CCC-CTG-GGC-CCT-GCC-AGC-TCC-CTG-3′(SEQ ID NO 46)3′-G-GGG-GAC-CCG-GGA-CGG-TCG-AGG-GAC-5′(SEQ ID NO 47)該hG-CSF基因片段插入到上述獲得的載體中，得到載體pBADG，該載體包含編碼大腸桿菌基因III信號肽和hG-CSF的基因(SEQ ID NO48)。
圖8描述上述構建載體pBADG的流程。
用載體pBADG轉化大腸桿菌BL21(DE3)(Stratagene，美國)，得到的轉化子命名為大腸桿菌HM 10501。(b)生產[蛋氨酸2，纈氨酸3] hG-CSF用NcoI和BglII酶切質粒pBAD·gIIIA(Invitrogen，美國)，得到含有兩個粘端的片段。
實施例1中獲得的載體pT-CSF用設計為含有編碼[蛋氨酸2，纈氨酸3] hG-CSF的第1個到第9個胺基酸的核苷酸序列的正向引物(SEQ IDNO49)與根據實施例2中的步驟4所得到的互補反向引物(SEQ ID NO51)進行PCR反應，獲得一個包含hG-CSF基因和羧端有一個BamHI位點的平端DNA片段，然後它用NcoI和BglII酶切，得到含有兩個粘端的hG-CSF基因片段。
Thr Met Val Gly Pro Ala Ser Ser Leu (SEQ ID NO49)5′-TAC-GCG-TCC-ATG-GTG-GGC-CCT-GCC-AGC-TCC-CTG-3′(SEQ ID NO50)3′-ATG-CGC-AGG-TAC-CAC-CCG-GGA-CGG-TCG-AGG-GAC-5′(SEQ ID NO51)NcoI限制性位點該hG-CSF基因片段插入到上述獲得的載體中，得到載體pBAD2M3VG，該載體包含一個編碼大腸桿菌基因III信號肽與分別用蛋氨酸和纈氨酸代替hG-CSF的第2及第3個胺基酸的基因(SEQ ID NO52)。
圖9所示的是上述構建載體pBAD2M3VG的流程。
用載體pBAD2M3VG轉化大腸桿菌BL21(DE3)(Stratagene，美國)，得到的轉化子命名為大腸桿菌HM 10510，它於1999年3月24日保藏在韓國微生物菌保中心(KCCM)，保藏號為KCCM-10153。(c)生產[絲氨酸17]hG-CSF在(a)中獲得的載體pBADG用設計為以絲氨酸密碼子代替hG-CSF的第17個密碼子的正向引物(SEQ ID NO32)和一個根據實施例2中的步驟4所得到的互補反向引物(SEQ ID NO33)進行PCR反應，獲得一個修飾化質粒。
用修飾化質粒轉化大腸桿菌XL-1 blue(Novagen，美國)。從轉化的克隆中回收DNA，測定其鹼基序列，這樣得到的質粒pBAD17SG含有hG-CSF的第17個胺基酸被絲氨酸替代的基因。
用載體pBAD17SG轉化大腸桿菌BL21(DE3)(Stratagene，美國)，得到的轉化子命名為大腸桿菌HM 10511。(d)生產[蛋氨酸2，纈氨酸3，絲氨酸17]hG-CSF在(b)中獲得的載體pBAD2M3VG用設計為以絲氨酸密碼子代替hG-CSF的第17個密碼子的正向引物(SEQ ID NO32)和一個根據實施例2中的步驟4所得到的互補反向引物(SEQ ID NO33)進行PCR反應，獲得一個修飾化質粒。
用修飾化質粒轉化大腸桿菌XL-1 blue(Novagen，美國)。從轉化的克隆中回收DNA，測定其鹼基序列，這樣得到的質粒pBAD2M3V17SG含有hG-CSF的第2個，第3個和第17個胺基酸分別被蛋氨酸，纈氨酸和絲氨酸替代的基因。
用載體pBAD2M3V17SG轉化大腸桿菌BL21(DE3)(Stratagene，美國)，得到的轉化子命名為大腸桿菌HM 10512。實施例8生產hG-CSF在實施例2到實施例7中製備的轉化子，使用LB培養基(1％細菌用-胰蛋白腖，0.5％細菌用-酵母提取物和1％氯化鈉)進行培養，然後在表達誘導物(IPTG)存在下溫育三個小時，或在沒有IPTG存在時培養15個小時以上。培養物在6000rpm離心20分鐘，沉澱菌體細胞，將沉澱懸浮在1/10體積的等滲溶液(20％蔗糖，含1mM EDTA的10mM Tris-Cl緩衝液，pH7.0)中。懸浮液在室溫靜止30分鐘，然後7000rpm離心10分鐘，收集菌體細胞。細胞在4℃重新懸浮在蒸餾水中，7000rpm離心10分鐘，得到的上清為周質溶液。周質溶液中的hG-CSF水平用hG-CSF的抗體(Aland，美國)根據ELISA方法(Kato，K.et al.，J.Immunol.，116，1554(1976))進行測定，計算每升培養物所產生的hG-CSF數量，結果如表1所示。
表1
實施例9純化hG-CSF在實施例6(b)中製備的轉化子大腸桿菌HM 10411在LB培養基中培養，培養物6000rpm離心20分鐘收穫細胞。重複實施例8中的流程，從細胞中製備周質溶液。
周質溶液調節pH到5.0～5.5，用預平衡到pH為5.3的CM-Sepharose(羧甲基-瓊脂糖凝膠)柱(Pharmacia公司，瑞典)吸收，然後用25mM的氯化鈉洗柱。順序加入包含50mM，100mM和200mM的氯化鈉柱緩衝液對hG-CSF進行洗脫，收集並合併包含hG-CSF的部分。
合併的部分進行Phenyl Sepharose(苯基-瓊脂糖凝膠)(Pharmacia公司，瑞典)柱層析，獲得純度為99％的[絲氨酸17]hG-CSF。
進一步，用實施例3，4，6(b)，6(c)，6(d)，6(e)，7(b)和7(d)中製備的轉化子大腸桿菌HM 10311，HM10409，HM 10411，HM10413，HM10414，HM10415，HM10510和HM10512分別重複進行上述流程。
每個純化的hG-CSF部分都進行十二烷基磺酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，測定hG-CSF的純度和大約濃度，然後進行ELISA，測定周質溶液中hG-CSF的確切濃度。Met-hG-CSF(Kirin amgen)作為對照。
圖10a所示的是SDS-PAGE結果，其中泳道1為Met-G-CSF，泳道2為轉化子大腸桿菌HM 10411的周質溶液，泳道3為純化的[絲氨酸17]hG-CSF。而從圖10b中可看到，[絲氨酸17]hG-CSF的分子量與野生型hG-CSF相同，而且轉化子大腸桿菌HM 10411的周質溶液中包含高水平的[絲氨酸17]hG-CSF。
進一步對hG-CSF的N端胺基酸序列進行測定，轉化子HM 10311，HM10409，HM 10411，HM10413，HM10414，HM10415，HM10510和HM10512所產生的編碼第1個到第32個胺基酸的核酸序列，分別以SEQID NOS56，58，60，62，64，66，68和70表示。結果表明，根據本發明所生產的修飾化hG-CSF在N末端是非蛋氨酸化的。
用blotting緩衝液(170mM甘氨酸，25mM Tris·HCl(pH 8)，20％甲醇)浸泡硝酸纖維素濾膜(Bio-Rad實驗室，美國)，在膠中分離的蛋白在硝酸纖維素濾膜(Bio-Rad實驗室，美國)上進行三個小時的western-blot。濾膜在1％的酪蛋白中放置1小時，然後用含0.05％吐溫20的PBS洗三次。濾膜放在以PBS稀釋的羊抗-G-CSF抗體(RD系統，AB-214-NA，美國)溶液中，室溫反應2小時。反應後濾膜用PBST溶液洗三次，以除去未反應的抗體。向其中加入以PBS稀釋的辣根過氧化物酶-連接的兔抗羊IgG(Bio-Rad實驗室，美國)，室溫反應2小時。濾膜用PBST衝洗，然後加入過氧化物酶底物試劑盒(Bio-Rad實驗室，美國)中的溶液進行顏色反應。上述western-blotting的結果如圖10b所示，其中泳道1代表陽性對照Met-hG-CSF，泳道2為純化的[絲氨酸17]hG-CSF。從圖10b可看出[絲氨酸17]hG-CSF的分子量等於野生型hG-CSF的分子量。實施例10hG-CSF和修飾化hG-CSF的細胞活性細胞系HL-60(ATCC CCL-240，來源於1個患有骨髓性白血病的36歲白種婦女患者的骨髓)在含有10％胎兒牛血清蛋白的RPMI 1640培養基中培養到2.2×105細胞/毫升，隨後加入DMSO(二甲亞碸，培養級/SIGMA)至濃度為1.25％(v/v)。將90μl的上述溶液加入到96孔板中(Coring/低蒸發96孔板)至2×104細胞/孔，37℃在5％的CO2中溫育48小時。
每個修飾化的[丙氨酸17]hG-CSF，[甘氨酸17]hG-CSF，[絲氨酸17]hG-CSF和[蘇氨酸17] hG-CSF用RPMI 1640培養基稀釋到濃度為500ng/ml，然後用二倍體積的RPMI 1640培養基連續稀釋10次。
上述溶液以10μl/孔加到各孔中，37℃溫育48小時。以商品化hG-CSF作為陽性對照(Jeil Phamaceutical.)。
根據在670nm測得的光密度值，用商品化的CellTiter96TM(Cat#G4100，Promega)檢測增加的細胞系水平。
從圖11可以看出，修飾化hG-CSF的細胞活性等於或高於作為陽性對照的野生型hG-CSF的活性。
雖然已經描述和圖示說明了本發明的實施例，但很顯然在不偏離所附權利要求
範圍所限定的本發明主旨的情況下，可以進行多種改變和修飾。
序列表110 Pharm.Co.，Ltd.120 修飾化人源粒細胞——集落刺激因子及其製備方法130 PCA00729/HMY160 71170 KOPATIN 1.0210 1211 522212 DNA213 人220221 CDS222 (1)..(522)400 1aca ccc ctg ggc cct gcc agc tcc ctg ccc cag agc ttc ctg ctc aag 48Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys1 5 10 15tgc tta gag caa gtg agg aag atc cag ggc gat ggc gca gcg ctc cag 96Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln20 25 30gag aag ctg tgt gcc acc tac aag ctg tgc cac ccc gag gag ctg gtg 144Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val35 40 45ctg ctc gga cac tct ctg ggc atc ccc tgg gct ccc ctg agc tcc tgc 192Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys50 55 60ccc agc cag gcc ctg cag ctg gca ggc tgc ttg agc caa ctc cat agc 240Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser65 70 75 80ggc ctt ttc ctc tac cag ggg ctc ctg cag gcc ctg gaa ggg ata tcc 288Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser85 90 95ccc gag ttg ggt ccc acc ttg gac aca ctg cag ctg gac gtc gcc gac 336Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp100 105 110ttt gcc acc acc atc tgg cag cag atg gaa gaa ctg gga atg gcc cct 384Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro115 120 125gcc ctg cag ccc acc cag ggt gcc atg ccg gcc ttc gcc tct gct ttc 432Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe130 135 140cag cgc cgg gca gga ggg gtc ctg gtt gct agc cat ctg cag agc ttc 480Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe145 150 155 160ctg gag gtg tcg tac cgc gtt cta cgc cac ctt gcg cag ccc 522Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro165 170210 2211 174212 PRT213 人400 2Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys1 5 10 15Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln20 25 30Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val35 40 45Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys50 55 60Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser65 70 75 80Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser85 90 95Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp100 105 110Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro115 120 125Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe
130 135 140Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe145 150 155 160Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro165 170210 3211 32212 DNA213 人工序列220223 hG-CSF N末端的寡核苷酸引物400 3cgccgccata tgacacccct gggccctgcc ag 32210 4211 36212 DNA213 人工序列220223 hG-CSF C末端的寡核苷酸引物400 4accgaattcg gatcctcagg gctgcgcaag gtggcg 36210 5211 72212 DNA213 人工序列220223 製備大腸桿菌腸毒素II信號肽的寡核苷酸400 5tcatgaaaaa gaatatcgca tttcttcttg catctatgtt cgttttttct attgctacaa 60atgcctacgc gt 72210 6211 72212 DNA213 人工序列220223 製備大腸桿菌腸毒素II信號肽的寡核苷酸400 6acgcgtaggc atttgtagca atagaaaaaa cgaacataga tgcaagaaga aatgcgatat 60tctttttcat ga 72210 7211 39212 DNA213 人工序列220223 編碼[Ser1]hG-CSF N端的寡核苷酸引物400 7acaaatgcct acgcgtctcc cctgggccct gccagctcc 39210 8211 42212 DNA213 人工序列220223 編碼[Ser1]hG-CSF C端的寡核苷酸引物400 8accgaattcg gatcctcagg gctgcgcaag gtggcgtaga ac 42210 9211 65212 DNA213 人工序列220223 編碼大腸桿菌腸毒素II Shine-Dalgarno序列的寡核苷酸引物400 9cggtttccct ctagaggttg aggtgtttta tgaaaaagaa tatcgcattt cttcttgcat 60ctatg 65210 10211 45212 DNA213 人工序列220223 包含BamHI限制性內切酶位點的寡核苷酸400 10accgaattcg gatcctcagg gctgcgcaag gtggcgtaga acgcg 45210 11211 10212 PRT213 人工序列220223 大腸桿菌腸毒素II信號肽的最後5個胺基酸加hG-CSF的第1到第5個胺基酸400 11Thr Asn Ala Tyr Ala Thr Pro Leu Gly Pro1 5 10210 12211 30212 DNA213 人工序列220223 製備[Thr1]hG-CSF的寡核苷酸400 12acaaatgcct acgcgacacc cctgggccct 30210 13211 30212 DNA213 人工序列220223 SEQ ID NO12的反意鏈400 13agggcccagg ggtgtcgcgt aggcatttgt 30210 14211 8212 PRT213 人工序列220223 以蘇氨酸作為第4個胺基酸的大腸桿菌腸毒素II信號肽的N末端序列400 14Met Lys Lys Thr Ile Ala Phe Leu1 5210 15211 33212 DNA213 人工序列220223 用蘇氨酸替換大腸桿菌腸毒素II信號肽的第4個胺基酸的寡核苷酸400 15ggtgttttat gaaaaagaca atcgcatttc ttc 33210 16211 33212 DNA213 人工序列220223 SEQ ID No15的反意鏈400 16gaagaaatgc gattgtcttt ttcataaaac acc 33210 17211 8212 PRT213 人工序列220223 以穀氨酸作為第22個胺基酸的大腸桿菌腸毒素II信號肽的C末端序列400 17Asn Ala Gln Ala Thr Pro Leu Gly1 5210 18211 26212 DNA213 人工序列220223 用穀氨酸替換大腸桿菌腸毒素II信號肽的第22個胺基酸的寡核苷酸400 18caaatgccca agcgacaccc ctgggc 26210 19211 26212 DNA213 人工序列220223 SEQ ID NO18的反意鏈400 19gcccaggggt gtcgcttggg catttg 26210 20211 24212 DNA213 人工序列220223 修飾化大腸桿菌腸毒素II Shine-Dalgarno序列的寡核苷酸400 20tctagaggtt gaggtgtttt atga 24210 21211 24212 DNA213 人工序列220223 SEQ ID NO20的反意鏈400 21tcataaaaca cctcaacctc taga 24210 22211 66212 DNA213 人工序列220223 含有大腸桿菌偏愛的編碼[Ser17]hG-CSF第6到第26個胺基酸的S1寡核苷酸序列400 22cagcctcttc tcttccacaa tctttccttc ttaagtctct tgaacaagtt agaaagatcc 60aaggcg 66210 23211 66212 DNA213 人工序列220223 SEQ ID NO22的反意鏈(AS1寡核苷酸)400 23ccgggtcgga gaagagaagg tgttagaaag gaagaattca gagaacttgt tcaatctttc 60taggtt 66210 24211 21212 PRT213 大腸桿菌220221 信號222 (1)..(21)223 大腸桿菌OmpA信號肽400 24Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile A la Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala1 5 10 15Thr Val Ala Gln Ala20210 25211 18212 DNA213 人工序列220223 含有Hind III識別位點的寡核苷酸400 25gttgcgcaag cttctcga 18210 26211 18212 DNA213 人工序列220223 SEQ ID NO25的反意鏈400 26tcgagaagct tgcgcaac 18210 27211 39212 DNA213 人工序列220223 [Ser1]hG-CSF N末端的寡核苷酸400 27gttgcgcaag cttctcccct gggccctgcc agctccctg 39210 28211 39212 DNA213 人工序列220223 含有EcoRI限制性酶切位點的寡核苷酸400 28accgaattct cagggctgcg caaggtggcg tagaacgcg 39210 29211 13212 PRT213 人工序列220223 大腸桿菌OmpA信號肽加[Ser1]hG-CSF的第1到第5個胺基酸400 29Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Ser Pro Leu Gly Pro1 5 10210 30211 30212 DNA213 人工序列220223 製備[Thr1]hG-CSF的寡核苷酸400 30accgttgcgc aagctacacc cctgggccct 30210 31211 30212 DNA213 人工序列220223 SEQ ID NO30的反意鏈400 31agggcccagg ggtgtagctt gcgcaacggt 30210 32211 33212 DNA213 人工序列220223 製備[Ser17]hG-CSF的寡核苷酸400 32agcttcctgc tcaagtcttt agagcaagtg agg 33210 33211 33212 DNA213 人工序列220223 SEQ ID NO32的反意鏈400 33cctcacttgc tctaaagact tgagcaggaa gct 33210 34211 33212 DNA213 人工序列220223 製備[Thr17]hG-CSF的寡核苷酸400 34agcttcctgc tcaagacctt agagcaagtg agg 33210 35211 33212 DNA213 人工序列220223 SEQ ID NO34的反意鏈400 35cctcacttgc tctaaggtct tgagcaggaa gct 33210 36211 33212 DNA213 人工序列220223 製備[Ala17]hG-CSF的寡核苷酸400 36agcttcctgc tcaaggcctt agagcaagtg agg 33210 37211 33212 DNA213 人工序列220223 SEQ ID NO36的反意鏈400 37cctcacttgc tctaaggcct tgagcaggaa gct 33210 38211 33212 DNA213 人工序列220223 製備[Gly17]hG-CSF的寡核苷酸400 38agcttcctgc tcaagggctt agagcaagtg agg 33210 39211 33212 DNA213 人工序列220223 SEQ ID NO38的反意鏈400 39cctcacttgc tctaagccct tgagcaggaa gct 33210 40211 33212 DNA213 人工序列220223 製備[Asp17]hG-CSF的寡核苷酸400 40agcttcctgc tcaaggactt agagcaagtg agg 33210 41211 33212 DNA213 人工序列220223 SEQ ID NO40的反意鏈400 41cctcacttgc tctaagtcct tgagcaggaa gct 33210 42211 18212 PRT213 大腸桿菌220221 信號222 (1)..(18)223 大腸桿菌基因III信號肽400 42Met Lys Lys Leu Leu Phe Ala Ile Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr Ser1 5 10 15His Ser210 43211 21212 DNA213 人工序列220223 含有Nco I限制性酶切位點的寡核苷酸400 43tatagccata gcaccatgga g 21210 44211 21212 DNA213 人工序列220223 SEQ ID NO43的反意鏈400 44ctccatggtg ctatggctat a 21210 45211 8212 PRT213 人工序列220223 hG-CSF的第2到第10個胺基酸400 45Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu1 5210 46211 25212 DNA213 人工序列220223 編碼hG-CSF的第2到第10個胺基酸加其5′端附加胞嘧啶的寡核苷酸引物400 46ccccctgggc cctgccagct ccctg 25210 47211 25212 DNA213 人工序列220223 SEQ ID NO46的反意鏈400 47cagggagctg gcagggccca ggggg 25210 48211 10212 PRT213 人工序列220223 大腸桿菌基因III信號肽加hG-CSF的第1到第5個胺基酸400 48Phe Tyr Ser His Ser Thr Pro Leu Gly Pro1 5 10210 49211 9212 PRT213 人工序列220223 [Met 2，Val3]hG-CSF的第1到第9個胺基酸400 49Thr Met Val Glv Pro Ala Ser Ser Leu1 5210 50211 33212 DNA213 人工序列220223 製備[Met 2，Val3]hG-CSF的寡核苷酸400 50tacgcgtcca tggtgggccc tgccagctcc ctg 33210 51211 33212 DNA213 人工序列220223 SEQ ID NO50的反意鏈400 51cagggagctg gcagggccca ccatggacgc gta 33210 52211 10212 PRT213 人工序列220223 大腸桿菌基因III信號肽加[Met2，Val3]hG-CSF的第1到第5個胺基酸400 52Phe Tyr Ser His Ser Thr Met Val Gly Pro1 5 10210 53211 23212 PRT213 大腸桿菌220221 信號222 (1)..(23)223 抗熱大腸桿菌腸毒素II信號肽400 53Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe Ser1 5 10 15Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala20210 54211 23212 PRT213 人工序列220223 修飾化抗熱大腸桿菌腸毒素II信號肽400 54Met Lys Lys Thr Ile A1a Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe Ser1 5 10 15Ile Ala Thr Asn Ala Gln Ala20210 55211 96212 DNA213 人工序列220223 編碼[Ser1，Ser17]hG-CSF第1到第32個胺基酸的核苷酸序列220221 CDS222 (1)..(96)400 55tct ccc ctg ggc cct gcc agc tcc ctg ccc cag agc ttc ctg ctc aag 48Ser Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys1 5 10 15tct tta gag caa gtg agg aag atc cag ggc gat ggc gca gcg ctc cag 96Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln20 25 30210 56211 32212 PRT213 人工序列400 56Ser Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys1 5 10 15Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln20 25 30210 57211 96212 DNA213 人工序列220223 編碼[Ser1]hG-CSF第1到第32個胺基酸的核苷酸序列220221 CDS222 (1)..(96)400 57tct ccc ctg ggc cct gcc agc tcc ctg ccc cag agc ttc ctg ctc aag 48Ser Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys1 5 10 15tgc tta gag caa gtg agg aag atc cag ggc gat ggc gca gcg ctc cag 96Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln20 25 30210 58211 32212 PRT213 人工序列400 58Ser Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys1 5 10 15Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln20 25 30210 59211 96212 DNA213 人工序列220223 編碼[Ser17]hG-CSF第1到第32個胺基酸的核苷酸序列220221 CDS222 (1)..(96)400 59aca ccc ctg ggc cct gcc agc tcc ctg ccc cag agc ttc ctg ctc aag 48Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys1 5 10 15tct tta gag caa gtg agg aag atc cag ggc gat ggc gca gcg ctc cag 96Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln20 25 30210 60211 32212 PRT213 人工序列400 60Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys1 5 10 15Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln20 25 30210 61211 96212 DNA213 人工序列220223 編碼[Thr17]hG--CSF第1到第32個胺基酸的核苷酸序列220221 CDS222 (1)..(96)400 61aca ccc ctg ggc cct gcc agc tcc ctg ccc cag agc ttc ctg ctc aag 48Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys1 5 10 15acc tta gag caa gtg agg aag atc cag ggc gat ggc gca gcg ctc cag 96Thr Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln20 25 30210 62211 32212 PRT213 人工序列400 62Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys1 5 10 15Thr Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln20 25 30210 63211 96212 DNA213 人工序列220223 編碼[Ala17]hG-CSF第1到第32個胺基酸的核苷酸序列220221 CDS222 (1)..(96)400 63aca ccc ctg ggc cct gcc agc tcc ctg ccc cag agc ttc ctg ctc aag 48Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys1 5 10 15gcc tta gag caa gtg agg aag atc cag ggc gat ggc gca gcg ctc cag 96Ala Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln20 25 30210 64211 32212 PRT213 人工序列400 64Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys1 5 10 15Ala Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln20 25 30210 65211 96212 DNA213 人工序列220223 編碼[Gly17]hG-CSF第1到第32個胺基酸的核苷酸序列220221 CDS222 (1)..(96)400 65aca ccc ctg ggc cct gcc agc tcc ctg ccc cag agc ttc ctg ctc aag 48Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys1 5 10 15ggc tta gag caa gtg agg aag atc cag ggc gat ggc gca gcg ctc cag 96Gly Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln20 25 30210 66211 32212 PRT213 人工序列400 66Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys1 5 10 15Gly Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln20 25 30210 67211 96212 DNA213 人工序列220223 編碼[Met2，Val3]hG-CSF第1到第32個胺基酸的核苷酸序列220221 CDS222 (1)..(96)400 67aca atg gtc ggc cct gcc agc tcc ctg ccc cag agc ttc ctg ctc aag 48Thr Met Val Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys1 5 10 15tgc tta gag caa gtg agg aag atc cag ggc gat ggc gca gcg ctc cag 96Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln20 25 30210 68211 32212 PRT213 人工序列400 68Thr Met Val Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys1 5 10 15Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln20 25 30210 69211 96212 DNA213 人工序列220223 編碼[Met 2，Val3，Ser17]hG-CSF第1到第32個胺基酸的核苷酸序列220221 CDS222 (1)..(96)400 69aca atg gtc ggc cct gcc agc tcc ctg ccc cag agc ttc ctg ctc aag 48Thr Met Val Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys1 5 10 15tct tta gag caa gtg agg aag atc cag ggc gat ggc gca gcg ctc cag 96Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln20 25 30210 70211 32212 PRT213 人工序列400 70Thr Met Val Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys1 5 10 15Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln20 25 30210 71211 10212 DNA213 人工序列220223 修飾化Shine-Dalgarno序列400 71gaggtgtttt 101
權利要求
1.一種修飾化人源粒細胞—集落刺激因子(hG-CSF)，特徵在於野生型hG-CSF(SEQ ID NO2)的第1個，第2個，第3個和第17個胺基酸中至少一個被其它胺基酸替代。
2.權利要求
1的修飾化hG-CSF，其胺基酸序列與野生型hG-CSF一樣，除了(a)第1個胺基酸為Ser(絲氨酸)；(b)第1個胺基酸為Ser(絲氨酸)以及第17個胺基酸為X；(c)第2個胺基酸為Met(蛋氨酸)以及第3個胺基酸為Val(纈氨酸)；(d)第2個胺基酸為Met(蛋氨酸)，第3個胺基酸為Val(纈氨酸)以及第17個胺基酸為X；或者(f)第17個胺基酸為X，其中X是一個中性pH值時不帶電荷的胺基酸。
3.權利要求
2的修飾化hG-CSF，其中X是絲氨酸，蘇氨酸，丙氨酸或甘氨酸。
4.權利要求
3的修飾化hG-CSF，其中X是絲氨酸。
5.一種編碼權利要求
1至4之一的修飾化hG-CSF的DNA。
6.權利要求
5的DNA，其中修飾化hG-CSF DNA的第1個到60個核苷酸的序列相應於SEQ ID NOS55，57，59，61，63，65，67和69中的一個。
7.一種包含權利要求
5的DNA的表達載體。
8.權利要求
7的表達載體，進一步包含在編碼修飾化hG-CSF的DNA的5』端附加一個信號肽的多核苷酸。
9.權利要求
8的表達載體，其中信號肽是大腸桿菌抗熱腸毒素II信號肽或修飾化大腸桿菌抗熱腸毒素II信號肽。
10.權利要求
9的表達載體，其中大腸桿菌抗熱腸毒素II信號肽的胺基酸序列為SEQ ID NO53。
11.權利要求
9的表達載體，其中修飾化大腸桿菌抗熱腸毒素II信號肽的胺基酸序列為SEQ ID NO54。
12.權利要求
9的表達載體，進一步包含核苷酸序列為SEQ ID NO71的修飾化大腸桿菌腸毒素II Shine-Dalgano序列。
13.權利要求
8的表達載體，其中信號肽是大腸桿菌β內醯胺酶信號肽或修飾化大腸桿菌β內醯胺酶信號肽。
14.權利要求
13的表達載體，其中大腸桿菌β內醯胺酶信號肽的胺基酸序列為SEQ ID NO24。
15.權利要求
8的表達載體，其中信號肽是大腸桿菌基因III信號肽或修飾化大腸桿菌基因III信號肽。
16.權利要求
15的表達載體，其中大腸桿菌基因III信號肽的胺基酸序列為SEQ ID NO42。
17.權利要求
7或8的表達載體，它是pT14SS1SG，pT14SS1S17SEG，pTO1SG，pTO1S17SG，pTO17SG或pBAD2M3V17SG。
18.一種用權利要求
7或8的表達載體轉化的微生物。
19.權利要求
18的微生物，它是轉化的大腸桿菌。
20.權利要求
19的微生物，其中轉化的大腸桿菌是大腸桿菌BL21(DE3)/pT14SS1SG(HM 10310)，大腸桿菌BL21(DE3)/pT14SS1S17SEG(HM 10311，KCCM-10154)，大腸桿菌BL21(DE3)/pTO1SG(HM10409)，大腸桿菌BL21(DE3)/pTO1S17SG(HM 10410，KCCM-10151)，大腸桿菌BL21(DE3)/pTO17SG(HM 10411，KCCM-10152)，大腸桿菌BL21(DE3)/pTO17TG(HM 10413)，大腸桿菌BL21(DE3)/pTO17AG(HM 10414)，大腸桿菌BL21(DE3)/pTO17GG(HM 10415)，大腸桿菌BL21(DE3)/pBAD2M3VG(HM 10510，KCCM-10153)，大腸桿菌BL21(DE3)/pBAD17SG(HM 10511)或大腸桿菌BL21(DE3)/pBAD2M3V17SG(HM 10512)。
21.一種在微生物中生產修飾化hG-CSF的方法，包括培養權利要求
18中的轉化微生物，從而生產和向周質分泌修飾化hG-CSF。
專利摘要
培養用包含一個編碼修飾化hG－CSF基因的表達載體轉化的微生物,生產修飾化人源粒細胞一集落刺激因子(hG－CSF),並將修飾化hG－CSF分泌到周質,上述修飾化hG－CSF是通過用其它的胺基酸代替野生型hG－CSF(SEQ ID NO:2)的第1個,第2個,第3個和第17個中至少一個胺基酸獲得的。
文檔編號C12P21/00GKCN1360636SQ00810094
公開日2002年7月24日 申請日期2000年7月7日
發明者權世昌, 鄭聖燁, 裴城敏, 李寬淳 申請人:韓美藥品工業株式會社導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan