對生物傳感器表面上的抗原的實時結合分析的製作方法

2023-05-02 22:08:16

專利名稱：對生物傳感器表面上的抗原的實時結合分析的製作方法
技術領域：
本發明涉及包括檢測與抗體、抗體片段或噬菌體特異性結合的抗 原的生物傳感器和方法的領域。
背景技術：
檢測噬菌體與哺乳動物細胞之間結合的能力是發現治療性和診斷 性抗體的主要部分。鑑別潛在的治療性和診斷性抗體的典型路線包括 (1)可溶性蛋白或細胞相關蛋白(以可溶性形式或在細胞上表達的形式) 的噬菌體展示和噬菌體淘選試驗；(2)對可溶性蛋白進行的噬菌體 ELISA(對於細胞目標 -所述細胞相關蛋白的肽或蛋白;^莫擬物)；(3)所述噬菌體基因組中的展示基因通過分子生物學技術亞克隆到表達可溶性抗體片段的質粒中；(4)所述抗體片段隨後進行表達和純化；(5) — 旦經純化，測試抗體片段在ELISA、 FACS、 Guava或FMAT中的細胞 功能性結合；(6)分析所述主要抗體片段(Lead antibody fragment)的結 合動力學；和(7)然後將所述最主要的抗體(top antibody lead)克隆到 完整的抗體表達載體中進行大規模生產，動力學分析和體內有效性模 型。用於噬菌體和與細胞相關的蛋白目標的功能性結合分析的典型試 驗包括完整的哺乳動物細胞或細菌細胞的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、 流式細胞術(螢光激活細胞分類儀，FACS)、 Guava微型流式細胞術產 品(Guava Technologies, Hayward, CA)以及焚光微量分析技術(FMAT)。 ELISA具有較高的噬菌體背景結合，這是因為細胞很複雜且噬菌體具 有非特異性結合的趨勢。在ELISA中的背景結合由於結合信號的倍增 而加強。細胞ELISA同樣因為在步驟間需要許多清洗步驟而較難，如 果所述細胞為非粘附性的而在每次清洗間需要離心旋轉，則所述清洗 步驟將是非常繁瑣的。通常粘附性細胞必須固定，從而在手動清洗或 者洗板機清洗時，保持所述細胞吸附在所述ELISA板上。所述固定可 改變細胞上所述蛋白的天然表位。在FAC和Guava中的噬菌體結合同 樣困難，這是因為每個噬菌體克隆需要經過純化得到信號所需的足夠 噬菌體。目前，大多數研究者花費大量時間和精力克隆噬菌體上的片段和/ 或完整IgG展示，以研究與細胞的功能性結合。花費在鑑別潛在治療 性抗體上的時間越多，則有效的治療性抗體進入醫學臨床所需時間越 長。因此，在所述噬菌體展示領域需要鑑別抗體與哺乳動物細胞功能 性結合的快速路徑。發明內容本發明的一個實施方案提供了檢測結合伴侶與噬菌體結合的方 法。所述方法包括在生物傳感器上固定粗噬菌體製劑(preparation)、未 經濃縮的噬菌體製劑、非均勻噬菌體製劑或其組合，並使所述生物傳 感器與所述結合伴侶相接觸。檢測所述結合伴侶與固定在所述生物傳 感器上的噬菌體的結合。所述結合伴侶可以是小分子、碳水化合物、聚合物、肽、可溶性蛋白、細胞受體、細胞受體的抗原;漠擬物、細胞、 哺乳動物細胞或哺乳動物細胞表面蛋白。所述噬菌體製劑和抗原並非 必須包括可檢測標記。所述噬菌體製劑可以是噬菌體展示庫。所述噬:有特異:生的抗體固定在所述生物Si器i。通過與結合在所述生物傳感器上的蛋白質相結合可以將所述抗體或抗體片段固定在所迷生物 傳感器上。如果所述抗體或抗體片段帶有標籤，則可通過對所述標籤所述生物傳感器可以是比色共;展反射生物傳感器或基於倏逝^:;生物傳感器(evanescent wave-based biosensor )。本發明另 一 實施方案提供了確定抗體群中抗體的表位分類(epitope classes)的方法。所述方法包括將展示噬菌體、抗體或抗體片段固定到 生物傳感器，並在適於結合伴侶(bindingpartner)與所述展示噬菌體、抗 體或抗體片段相結合的條件下使所述生物傳感器與所述結合伴侶相接 觸，所述結合伴侶特異性地與固定在所述生物傳感器之上的所述展示 噬菌體、抗體或抗體片段相結合。使所述抗體群與所述生物傳感器相 接觸。所述抗體群與所述結合伴侶相結合產生的可檢測信號指示出在 所述抗體群中而不是所述被固定的展示噬菌體、抗體或抗體片段中存 在不同表位分類。所述抗體群、結合伴侶和被固定的展示噬菌體、被群包括噬菌體克隆、抗體片段、完整抗體、展示完整抗體的噬菌體(phage displaying a full antibody)、展示抗體片段的噬菌體、來自雜交瘤的抗體 和來自噬菌體展示篩選的抗體。所述展示噬菌體可以是經純化的噬菌 體製劑、粗製噬菌體製劑、未經濃縮的噬菌體製劑或者非均勻噬菌體 製劑。所述結合伴侶可以是小分子、碳水化合物、肽、可溶性蛋白、 細胞受體、細胞受體的抗原才莫擬物、哺乳動物細胞或哺乳動物細胞表 面蛋白。所述哺乳動物細胞表面蛋白可以是膜相關蛋白 (membrane-associated protein)、 單跨膜蛋白(single transmembrane protein)、 多3爭月莫蛋白(multi-transmembrane protein)或蛋白通道。所述生 物傳感器可以是比色共振反射生物傳感器(colorimetric resonant reflectance biosensor)或基於^f務逝波的生物傳感器。因此，本發明提供了諸如溶解低濃度結合伴侶、對蛋白親和力排序、分析含有複雜混合物的樣品以及進行解離速率排序分析等的方法。


圖1A C描述了抗體和抗體片段、F(ab)和scFv。圖1A顯示了完 整的IgG抗體和所述IgG的結構域。圖1B顯示了 F(ab)。圖1C顯示了 scFV。圖2顯示了 GA3BIND 生物傳感器上的細菌病毒的滴定。圖3A~B顯示了從TIO BIND 生物傳感器上的周質提取物^降獲 F(ab)。圖3A顯示了 sF(ab)特異性俘獲表面的形成和sF(ab)的俘獲。圖 3B顯示了在圖3A中記錄的sFab的俘獲的示意圖。圖4A D顯示了從TI0 BIND 生物傳感器上的周質提取物4孚獲 scFv。圖5A顯示了 scFv特異性俘獲表面的形成和含有6xHis和c-myc 標籤的scFv的俘獲。圖4B顯示了摻入(spiked)PBS和周質提取物的經 純化的scFv的俘獲。圖4C顯示了在圖4B中記錄的scFv的4孚獲的示 意圖。圖4D顯示了在圖4B中記錄的scFv的俘獲的示意圖。圖5A C顯示了從SA1 BIND 生物傳感器上的周質提取物俘獲 scFv。圖5A顯示了表達6xhis標籤的蛋白的特異性俘獲表面的形成。 圖5B顯示了摻入PBS和周質培養物的scFv的俘獲。圖5C顯示了摻 入PBS和周質提取物的經純化的scFv的scFvJ孚獲的示意圖。圖6A C顯示了從GA1 BIND 生物傳感器上的周質提取物俘獲 scFv。圖6A顯示了用於含有c-myc標籤的蛋白的特異性俘獲表面的形 成。圖6B顯示了摻入PBS和周質提取物的經純化的scFv的俘獲。圖 6C顯示了從PBS和周質提取物中俘獲scFv的示意圖。圖7A E顯示了採用抗-FcTIOBIND⑧生物傳感器乂人雜交瘤上清 液中俘獲IgG。圖7A顯示了特異性小鼠IgG俘獲表面的形成。圖7B 顯示了特異性小鼠IgG俘獲表面的形成。圖7C顯示了從雜交瘤培養基 俘獲IgG。圖7D顯示了抗原、親代細胞系和表達抗原的細胞繫結合俘 獲在生物傳感器表面上的IgG的圖示。圖7E顯示了抗原、親代細胞系 和表達抗原的細胞繫結合俘獲在生物傳感器表面上的IgG的列表圖示， 並將該結合歸一化為在生物傳感器表面上俘獲的IgG的量。圖8A E顯示了採用抗-FcTIOBIND⑧生物傳感器/人血清中4孚獲 IgG。圖8A顯示了特異性小鼠IgG結合表面的形成。圖8B顯示了從血清中俘獲IgG。圖8C顯示從血清中俘獲IgG。圖8D顯示了在圖8B 中記錄的sFab的俘獲的示意圖。圖8E顯示了在圖8C中記錄的sFab 的俘獲的示意圖。圖9A C顯示了採用GA1 BIND 生物傳感器在血清中的藥物一 抗藥物試驗。圖9A顯示了用於IgG、抗藥物的俘獲的表面的形成。圖 9B顯示了在20 jiig/ml藥物表面從PBS、 11%和30%血清中俘獲所述抗 藥物。圖9C顯示了在0 (Lig/ml藥物表面從PBS、 11%和30%血清中俘 獲所述抗藥物。圖10A-C顯示了採用抗-Fc TIO BIND 生物傳感器從血清中俘 獲IgG。圖10A顯示了用於抗藥物俘獲的藥物表面的形成。圖10B顯 示了在50 pg/ml藥物表面從PBS、 11%和30%血清中俘獲所述抗藥物。 圖10C顯示了在0pg/ml藥物表面從PBS、 11%和30%血清中俘獲所述 抗藥物。圖IIA-D顯示了在抗-FC TIO BIND 生物傳感器上抗體分級 (binning)的終點分析和夾心式抗體對的鑑別。圖11A顯示小鼠IgG特 異性表面的形成。圖IIB顯示層l(抗體)的俘獲。圖11C顯示層2(通過 抗體對抗體)的俘獲。圖11D顯示層3(抗體對抗體-抗原複合物)的俘獲。
具體實施方式
生物傳感器在一個實施方案中，本發明的方法包括生物傳感器的用途，所述 生物傳感器尤其可用於檢測無機或有機材料諸如蛋白、DNA、小分子、 病毒、細胞和細菌，而無需可檢測標記如螢光或放射性標記。大量適 宜的生物傳感器可以使用在本發明的方法中，包括但不限制於光子晶 體生物傳感器(例如，比色共振反射生物傳感器、銀納米顆粒陣列生物 傳感器)、千涉測量生物傳感器(例如，RIfS,雙偏振幹涉儀、哈特曼 幹涉儀)、MEMS生物傳感器(例如，懸臂、共振膜)、聲學生物傳感器 (例如，石英諧振器)、微波生物傳感器(例如，介電波譜)、表面等離子 體共振(SPR)生物傳感器(例如，kreitchman SPR生物傳感器、成像 SPR生物傳感器、光柵耦合成像SPR生物傳感器)，波導生物傳感器(例 如，入射光柵耦合器生物傳感器、啁啾波導光柵生物傳感器)，基於倏 逝波的生物傳感器和任何加入有光波導的生物傳感器，正如在美國專利4,815,843、美國專利5,071,248和美國專利5,738,825所描迷，將其 以引用的方式整體引入。本發明的方法尤其可應用於藥物研究(例如，初篩、高通量篩選、 復篩、質量控制、細胞毒性、臨床試驗評價)、生命科學研究(例如，蛋 白質組學、蛋白相互作用分析、DNA-蛋白相互作用分析、酶-底物相互 作用分析、細胞-蛋白相互作用分析)、診斷測試(例如蛋白存在、細胞 鑑別)和環境檢測(病毒和孢子的檢測和鑑別)領域。之前的專利申請和公開文本描述了比色共振反射生物傳感器表面 聯合高解析度成像裝置是如何採用僅有納升的樣品材料，用作在單個 表面上平行進行多個生物化學測試的平臺，參見例如美國專利公開文 本No. 2002/0168295、 2002/0127565、 2004/0132172、 2004/0151626、 2003/0027328 、 2003/0027327 、 2003/017581 、 2003/0068657 、 2003/0059855 、 2003/0113766 、 2003/0092075 、 2003/0026891 、 2003/0026891 、 2003/0032039 、 2003/0017580 、 2003/0077660 、 2004/0132214。比色共振反射生物傳感器包括亞波長結構表面。亞波長結構表面 是一類能模擬薄膜塗層效果的衍射光器件。參見例如Peng & Morris, "Resonant scattering from two-dimensional gratings,，，丄Op/. 5V c.爿m.」, Vol. 13, No. 5, p. 993, May 1996; Magnusson, & Wang, "New principle for optical filters, "jpp/.屍/^& Z^"., 61, No. 9， p. 1022, August, 1992; Peng & Morris, "Experimental demonstration of resonant anomalies in diffraction from two-dimensional gratings, ，， 0/ "'cs丄e〃e^， Vol.21, No. 8， p. 549, April, 1996。本發明的光子晶體生物傳感器的光柵具有相 比入射光的波長而言較短的光柵周期，因此除所述反射和透射零級之 外沒有其他衍生級次被允許。光子晶體生物傳感器包括光柵，它由具 有高介電常數的介電材料構成或者塗覆，夾在基底層與填充所述光柵 槽的覆蓋層之間。任選地，不使用覆蓋層。所述光柵結構選擇性地耦 合具有窄帶波長的光。該高度選擇性的耦合條件可對反射輻射譜產生 共振光柵效應，從而產生窄帶的反射或透射波長。所述光柵的深度或 周期小於所述共振光線效應的波長。比色共振反射生物傳感器結構的反射或透射顏色可以通過加入分 子而改變。所加入的分子增加了通過所述生物傳感器結構的入射輻射的光路長度，並因此改變了發生最大反射或透射時的波長。當用白光照射時，比色共振反射生物傳感器僅僅反射單波長或窄 帶波長。當分子粘附在所述生物傳感器表面時，由於耦合入所述光柵 的光的光路發生變化，所反射的波長(顏色)發生偏移。通過固定分子， 諸如與生物傳感器表面的特異性結合物質，無需使用任何種類的可檢 測標記諸如螢光探針或顆粒標記即可檢測互補結合伴侶分子。可以用 浸在液體的或者乾燥的生物傳感器表面進行所述檢測技術。當用平行白光和反射光照射比色共振反射生物傳感器時，僅有窄 帶的波長或者單帶的波長被反射。所述窄帶波長被描述為波長"峰"。 當分子沉積在所述生物傳感器表面或者從此移除時，"波長峰值，，(PWV)發生變化。讀出儀器指出平行白光在所述生物傳感器表面上的不同位置，並收集平行反射光。所收集的光集中進入波長分光計以進行PWV檢測。基於倏逝波的生物傳感器可包括由基材支撐的波導膜；在所述波 導膜(和任選地作為所述基材的一部分)之間是衍射光柵。參見例如美國 專利No. 4，815,843。低k介電材料，諸如低k納米孔材料可用於衍射 光柵或聯合的低k納米孔材料和基材。波導包括波導膜和基材。所述 波導膜可以是例如氧化錫、五氧化鉭、硫化鋅、二氧化鈦、氮化矽或 其組合，或者聚合物諸如聚苯乙烯(polystryrole)或聚碳酸酯。衍射光 柵位于波導膜和基材的交界處或者在波導膜內。衍射光柵包括低k材 料諸如低k納米孔材料。波導膜的折射率高於相鄰介質(即基材和測試 樣品)的折射率。基材可以是例如塑料、玻璃或環氧樹脂。特異性結合 物質可以固定在波導膜的表面上並將測試樣品添加到所述表面上。通 過全內反射雷射在所述波導膜內傳播。分子與之結合所導致的所述波 導膜的折射率變化可以通過觀察發射的向外耦合的光的角度變化而檢 測。本發明的生物傳感器包括內表面例如裝有液體的容器的底表面。 裝有液體的容器可以是例如樣t量滴定板孔、試管、培養亞或微流通道。 本發明的一個實施方案是裝入任何類型的微量滴定板的生物傳感器。 例如，生物傳感器可以通過將所述反應容器的壁組裝覆蓋所述共振反 應表面從而裝在微量滴定板的底表面，由此每個反應"點"可暴露於 不同的測試樣品。因此，每個單獨的樣滴定板孔可用作獨立的反應容的相互混合，並且化學上不同的測試溶液可加到不同孔中。藥物高通量篩選實驗室、分子生物學研究實馬全室和診斷測試實驗 室的最常見的測試形式是微量滴定板。所述板是標準尺寸的塑料盒，含有網格排列的96、 384或者1536個孔。由於這些板的標準機;械構造， 可設計液體分配、自動板處理和4企測系統與該通用形式共同運作。本 發明的生物傳感器可裝入標準微量滴定板的底表面。由於所迷生物傳 感器表面可大面積製造，並且由於所述讀出系統並不與所述生物傳感 器表面發生物理接觸，因此可以限定任何數量的獨立生物傳感器面積， 其僅僅受到所述照射光學器件的聚焦解析度和能橫掃所述生物傳感器 表面而對所述照射/檢測探針進行掃描的x-y範圍的限制。噬菌體製劑噬菌體是細菌病毒並且是種特異性的。對於該具體討論，對兩種 大腸桿菌噬菌體M13和X進行了討論。在其他細菌噬菌體和/或哺乳動 物病毒的情況下應用相同的前提。噬菌體群，尤其是非均勻的，粗製 的和/或未經濃縮的噬菌體群，諸如噬菌體展示庫可用在本發明的方法 中。非均勻的噬菌體製劑包括含有一種或多種類型的噬菌體的製劑， 例如噬菌體展示庫，其中每種噬菌體展示出不同結合分子。粗製噬菌 體製劑是在由噬菌體感染的細菌所生長的培養基中含有一種或多種類 型的噬菌體的製劑。在M13的情況下，所述噬菌體經膜融合且所述細 胞沒有溶解。在X的情況下，所述細胞被溶解，則所述培養基將含有 細胞組分。在此情況下，所述粗製噬菌體製劑將通過離心過濾細菌細 胞和膜組分。粗製噬菌體製劑在培養基組分和分泌的細胞代謝副產物 的存在下，含有低濃度的一種或多種類型的噬菌體。未經濃縮的噬菌體製劑是其中所述噬菌體並未沉澱的噬菌體制 劑。當噬菌體被沉澱時，移除培養基並將所述噬菌體重新懸浮在確定 的緩衝液諸如PBS中。在M13噬菌體的純化過程中，噬菌體通常用 PEG溶液沉澱一次或兩次並4呆存在PBS甘油中。在所迷過程中，所述 噬菌體再次懸浮於較培養基初始體積更小體積的緩沖液中。通常1-2 升的培養基將再次懸浮於最終體積為約2~5 ml的PBS中，提供經純 化並濃縮的噬菌體儲備物。噬菌體的固定噬菌體製劑被固定在生物傳感器上。噬菌體製劑可被動地固定於 生物傳感器表面。噬菌體表面可以被封閉，並就與所述被固定的噬菌 體相結合對抗原(例如小分子、碳水化合物、聚合物、肽、可溶性蛋白、 細胞受體的抗原模擬物或哺乳動物細胞)進行篩選。抗原特異性地與噬 菌體的結合可通過由該結合事件產生的信號變化而進行測量，通常通 過光學、電子或視覺手段。與噬菌體結合的抗原可通過所述噬菌體的 濃度、抗原的解離速率和噬菌體功能性地結合細胞的能力進行評定。採用特異性抗體固定可以將噬菌體製劑固定在生物傳感器表面。 結合噬菌體外殼蛋白的抗體能固定於生物傳感器表面。抗體或者通過特異性表面諸如蛋白A或者蛋白A加上抗-Fc表面被動地固定在生物 傳感器表面。所述表面可由封閉劑進行封閉。噬菌體與表面的特異性 地結合可通過由該結合事件產生的信號變化而進行測量，通常通過光 學、電子或視覺手段。在噬菌體(病毒)上的展示物可以是肽、小蛋白和 /或抗體片段或者不存在。隨後同源配體的結合可通過由該結合事件產 生的信號變化而進行測量，通常通過光學、電子或視覺手段。配體可 以是例如小分子、碳水化合物、聚合物、肽、可溶性蛋白、細胞受體 的抗原模擬物或細胞表面上的蛋白。在細胞表面上表達的蛋白可以是 例如膜相關蛋白、單跨膜或多跨膜蛋白或蛋白通道。通過與生物傳感器表面相結合的抗原可以將噬菌體製劑固定在生 物傳感器表面。以被動的或者特異性表面諸如不幹擾被篩選的所希望 的結合表位的抗原，從而將抗原(諸如小分子、碳水化合物、聚合物、 肽、可溶性蛋白或細胞受體的抗原模擬物)固定在生物傳感器表面。抗 原表面可以被封閉。噬菌體製劑特異性地與抗原結合可以通過由該結 合事件產生的信號變化而進行測量，通常通過光學、電子或視覺手段。 在噬菌體上的展示物可以是例如肽、小蛋白和/或抗體片段。與抗原相 結合的噬菌體可以通過抗原的濃度和噬菌體的解離速率進行評定。抗體片段(和蛋白)通過融合在其N-端或C-端區域的生物素或蛋 白質標籤(多組氨酸、c-myc或FLAG、 MBP、 GST等)被特異性捕獲於 生物傳感器的表面。依據針對所述標籤的抗體可以在生物傳感器表面 形成特異性表面。作為另外一種選擇，抗體片段可以通過恆定區(CH1)被特異性地俘獲。利用抗-人、抗-k、抗-X和抗-k的混合物和/或抗F(ab，)2 抗體，依據針對該區域的抗體可在生物傳感器上形成特異性表面。該 表面可以神皮封閉。抗體片段特異性地與抗體結合可以通過由該結合事 件產生的信號變化而進行測量，通常通過光學、電子或視覺手段。抗 體片段的固定可來自於純的或粗製的(全細胞提取物、周質提取物，或 用過的培養基)樣品。隨後同源配體的結合可通過由該結合事件產生的 信號變化而進行測量，通常通過光學、電子或視覺手段。所述配體可 以是例如小分子、碳水化合物、聚合物、肽、可溶性蛋白、細胞受體 的抗原衝莫擬物或細胞表面上的蛋白。在細胞表面上表達的蛋白可以是 例如膜相關蛋白、單跨膜或多跨膜蛋白或蛋白通道。雖然對於特異性結合物質或結合伴侶而言無需包含可檢測標記，伴;。當本發;的特異性結合物^:結合伴倡不具有檢測標記Ih它 們仍然可以包含其它類型的標記和標誌，用於測試靈敏度的增強，特 異性結合伴侶與生物傳感器表面的固定，特異性結合物質與其結合伴 倡的結合或雜交的增強，或者其他目的。分子可以被固定在生物傳感器表面上，因此它們將不會被沖洗步 驟沖洗掉，並因此與溯'J試樣品中的分子的結合將不會受到生物傳感器 表面的阻礙。已實現分子與例如用於多類微陣列和生物傳感器的玻璃 的共價結合的幾種不同類型的表面化學方法。這些相同的方法可容易 地適用於本發明的生物傳感器。通過物理吸附(即沒有使用化學接頭)或者通過化學結合(即使用化 學接頭)可以將一種或多種類型的分子結合在生物傳感器表面上。化學 結合可形成分子在生物傳感器表面上的更強結合，並提供所述表面結 合分子的確定取向和構象。其他類型的化學結合包括例如胺活化、醛活化和鎳活化。這些表 面可用於將幾種不同類型的化學接頭結合在生物傳感器表面上。胺表 面可用於結合幾種類型的接頭分子，而醛表面可用於直接結合蛋白而 無需其他的接頭。鎳表面可用於結合已嵌入組氨酸("his")標籤的分子。 採用鎳活化表面檢測"his-標籤的，，分子在本領域廣為人知(Whitesides, ^wa/. C/ze肌68, 490, (1996》。特異性結合物質在塑料、環氧樹脂或高折射率材料上的固定可基本按照所描述的在玻璃上的固定而進行。然而，在酸洗步驟將破壞特 異性結合物質所固定的材料時，可省略酸洗步驟。抗原例如通過物理吸附或通過化學結合可以將一種或多種特異性結合 物質固定在生物傳感器表面。特異性結合物質可以是例如有機分子諸如核酸、多肽、抗原、多克隆抗體、單克隆抗體、單鏈抗體(scFv)、 F(ab)片段、F(ab')2片段、Fv片段、小有機分子、細胞、病毒、噬菌體、 細菌、聚合物、肽溶液、單鏈或雙鏈DNA溶液、RNA溶液、含有來 自於組合化學庫的化合物的溶液，或生物樣品；或無機分子。生物樣 品可以是例如血液、血漿、血清、胃腸分泌物、組織或腫瘤勻漿、滑 液、糞便、唾液、痰、嚢液、羊水、腦脊液、腹腔液、肺灌洗液、精 液、淋巴液、淚液或前列腺液。優選地，抗體、抗體片l殳、抗原或噬 菌體被固定在生物傳感器上。該特異性結合物質可以如此處所描述直 接固定，或者通過特異性表面間接固定。例如，含有蛋白質標籤(例如 組氨酸、c-myc或FLAG、 MBP、 GST等)的抗體或蛋白可通過與所述 標籤結合的抗體固定在生物傳感器上。結合伴侶是與特異性結合物質 特異性地結合的物質。結合伴侶可以是如以上對於特異性結合物質所 描述的任何類型的樣品或分子。方法本發明的方法可用於例如通過從小鼠和噬菌體展示技術篩選雜 交瘤、人類抗體，篩選mRNAT7噬菌體展示庫開發治療性和診斷性抗 體；和用於滴定細菌病毒以及哺乳動物病毒的不含有哺乳動物的和細 菌的細胞的系統。在此文檔中將討論結合分子，尤其是抗體片段和/或 完整抗體，例如圖1。本發明的方法可用於滴定病毒。通常，病毒的滴定要求分別用於 哺乳動物病毒和細菌病毒的活體哺乳動物細力包和細菌細J包。死亡或緩 慢生長的細胞的循環被計數。採用本發明的方法，與哺乳動物病毒或 細菌病毒結合的抗體粘附在生物傳感器上，並通過抗體和外殼蛋白的相互作用檢測完整蛋白的稀釋度。此外，釆用GA3高密度戊二醛生物 傳感器通過噬菌體的直接固定可滴定M13噬菌體，參見圖2。用PBS 使GA3生物傳感器水化30分鐘，然後從每毫升1.0el4~ 1.3ell個嗜菌 斑1:2系列稀釋來製備在20%甘油中的純化M13，並將其加入在20% 甘油和PBS中的傳感器上。噬菌體溶液與傳感器溫育2小時。未結合 的噬菌體被衝洗掉，記錄通過噬菌體外殼蛋白上的游離胺固定的噬菌 體的量的終點讀數。本發明的方法也可用於以哺乳細胞病毒為中心的生物研究(受體 結合、進入細胞、中和抗體的篩選等)。例如，病毒被固定在生物傳感 器上，並就抗體或蛋白增加或減少病毒與哺乳動物細胞融合的能力對 其進行篩選。本發明的方法也可用於檢測毒素、病毒和其他生物恐怖劑。例如， 可以用噬菌體展示庫針對目標諸如已知的毒素、病毒或其他生物恐怖 劑或由其衍生的抗原進行淘選。這些庫可以展示肽、抗體片段、蛋白 骨架或蛋白結構域。在所述淘選過程中，就結合目標的能力而富集噬 菌體。在噬菌體的篩選階段，鑑別出先導候選物。在此點，本發明的 方法可用於通過將噬菌體固定在生物傳感器上從而檢測毒素、病毒或 其他生物恐怖劑。這將替代合成肽或進行在噬菌體上展示的蛋白或抗 體片段的分子克隆的繁瑣工作。本發明的方法可用於篩選大量陽性結合的潛在結合展示噬菌體(在 噬菌體淘選或選擇試驗之後)。由於形成特異性結合表面的能力，噬菌 體可從確定的或不確定的溶液諸如細菌提取物和用過的培養基中特別 地取出，並被固定在生物傳感器上。當採用噬菌體展示技術鑑別治療性或診斷性抗體時，本發明的方 法也可用於在篩選的噬菌體水平早期對抗體親合性進行評定。例如， 展示抗體片段的噬菌體可以直接或者通過與外殼蛋白結合的抗體固定 在生物傳感器上。每孔中所固定的噬菌體的量的信號被記錄。展示在 噬菌體上的抗體的抗原:故加入，並記錄信號。抗原的信號/孔除以噬菌 體的信號/孔可以確定評定等級。通過該計算，抗原信號被歸一化為每 個測試(孔)中的噬菌體單位。無需使用分子生物學技術來克隆抗體片段 的基因，即可就其單價親和性對噬菌體上的抗體片段進行評定。該技 術能對抗體片段進行評定而無需克隆基因、表達抗體片段、純化抗體片段，然後評定與抗原的結合。本發明的方法可用於確定噬菌體上的展示物與相應抗原的解離速 率。例如，噬菌體被固定在生物傳感器上，清洗，然後抗原結合。在 每次清洗步驟後，讀取生物傳感器。如果抗原從生物傳感器上的噬菌 體上釋放，則信號將會有損失。在多次清洗中檢測生物傳感器，並將 解離速率計算為信號相對時間的損失。採用該技術，通過將細胞組分結合在生物傳感器上，然後加入與細胞組分相對應的蛋白伴侶或含有DNA序列的噬菌體可以鑑別結合伴 侶。測試樣品，諸如含有結合伴侶的細胞裂解物可加到本發明的生物 傳感器上，然後清洗去掉未結合的物質。與生物傳感器相結合的結合 伴估隨後從生物傳感器上洗脫下來並通過例如質譜進行鑑定。噬菌體 DNA展示庫可加到本發明的生物傳感器上，隨後清洗去掉未結合的物 質。與生物傳感器相結合的各個噬菌體顆粒可被分離，並且隨後這些 噬菌體顆粒中的插入物可被測序以確定結合伴倡的特性。抗體可以陣 列形式固定在生物傳感器上，然後與含有結合伴侶諸如蛋白的所研究 測試樣品相接觸。僅有與固定在生物傳感器上的抗體特異性地結合的 蛋白依然結合在生物傳感器上。這樣的方法基本上是大規模形式的酶 聯免疫吸附試驗；然而，酶或螢光標記的使用並非必需。本發明的方法提供了較傳統噬菌體展示和噬菌體淘選方案更好的 幾個優點，包括例如(1)固定於生物傳感器的噬菌體上的展示物與 細胞或其他結合伴侶之間的無標記和直接的結合併不會受到蛋白標記 和第二信號的放大的影響；(2)從粗製樣品中的噬菌體特異性抽取(即 噬菌體在生物傳感器上的固定)和無需過分清洗的細胞或其他結合伴侶 的結合更快速地檢測哺乳動物細胞的功能性結合；和(3)高通量，因 此提供了最有效的和快速的噬菌體篩選方法。此外，採用噬菌體展示確定抗體與哺乳動物細胞的功能性結合的 傳統方案需要大量時間和工作去克隆與片段和/或完整IgG結合的噬菌 體上的展示物以研究與細胞的功能性結合。本發明的方法不再需要純 化噬菌體從而簡化了所述方法，並可按照本文所述的高通量篩選處理。 因此，此處描述的本發明的方法提供了允許研究者直接從噬菌體淘選 試驗轉向測試哺乳動物細胞上的展示物(功能性抗原)的功能性活性的 益處。尤其是，由於本發明的方法是高通量的，因而細胞結合可在第一結合試驗而非常規研發途徑中的後續步驟中得到研究。由於與細胞 的結合是鑑別治療性抗體的關鍵測試，因此本發明的方法使研究者能 更早地獲得關鍵信息，從而加速治療性發現。在許多情況下，本發明 的方法可使發現研究人員在鑑定治療性抗體方面節省最高達三個月至 六個月。對於上述應用，尤其是蛋白質組學應用，選擇性結合諸如來自本 發明生物傳感器上的測試樣品的結合伴侶等物質的能力，以及從所述 生物傳感器的獨特位置選擇性地移除所結合的材料進行進一步分析的 能力是具有優勢的。本發明的生物傳感器也能通過測量光的反射波長 的偏移，檢測和量化結合在生物傳感器陣列獨特位置的樣品中的結合 伴侶的量。此外，在一個獨特生物傳感器位置的波長偏移能與位於其 他獨特生物傳感器位置的陽性對照和陰性對照相比較，從而確定結合 在生物傳感器陣列獨特位置處的結合伴侶的量。/gG弄我#々度^本發明的方法可用於從複雜培養基諸如例如周質提取物、雜交瘤 上清液、血漿或血清中俘獲抗體和抗體片段。參見例如圖3~圖10。 通過替代以下實例中的兔抗小鼠Fc、兔抗人Fc、兔抗人F(ab，)2或兔 抗小鼠-F(ab，)2對以下特異性表面進行修飾以俘獲完整IgG或F(ab)。 以下步驟是用於在圖3中所描述的摻入PBS和周質培養物的sF(ab)的 俘獲的步驟。用於sFab的特異性俘獲表面在SRU BIND TIO生物傳 感器上形成，圖3(A)。水化的TIO BIND⑧生物傳感器用溶於PBS的 20嗎/ml蛋白A包被30分鐘、清洗並記錄沉積的蛋白A的量的終點讀 數。用1%牛奶對所述生物傳感器封閉30分鐘、清洗並記錄沉積的牛 奶的量的終點讀數。然後將20 pg/ml的特異性俘獲試劑兔抗小鼠 F(ab，)2特異性IgG進行溫育30分鐘、清洗並記錄沉積的兔抗小鼠 F(ab，)2特異性IgG的量的終點讀數。剩餘的蛋白A位點用50昭/ml的 兔lgG封閉30分鐘。此時，形成針對小鼠sF(ab)的特異性俘獲表面。 在此實例中，0.33、 1.0和3.0嗎/ml經純化的多克隆小鼠sF(ab)被摻入 到PBS中和不表達sF(ab)的大腸桿菌周質製劑中，圖3(A)和4(B)。圖4顯示了從TIO BIND⑧生物傳感器上的周質提取物俘獲scFv。 水化的TIO BIND⑧生物傳感器用溶於PBS的20嗎/ml蛋白A包被30分鐘、清洗並記錄沉積的蛋白A的量的終點讀數。然後用1%牛奶對所 述生物傳感器封閉30分鐘、清洗並記錄沉積的牛奶的量的終點讀數。 然後，將20 pg/ml的特異性俘獲劑兔抗小鼠-Fc溫育30分鐘、清洗並 記錄沉積的兔抗小鼠Fc特異性IgG的量的終點讀數。形成兩種俘獲抗 體表面，(1) 25 fig/ml抗-his和25 ^g/ml抗-cmyc和(2) 50 jig/ml抗 -cmyc,溫育30分鐘、清洗並記錄沉積的俘獲抗體的量的終點讀數。 此時，形成scFv俘獲表面，圖4(A)。純化的scFv (5 jtig/ml)摻入PBS 和不含編碼svFv的質粒的大腸桿菌周質提取物。所述scFv溫育小時、 清洗並記錄沉積的scFv的量的終點讀數。scFv的量列在圖4(B)中並圖 示在圖4(C)和4(D)中。圖5顯示了從SA1 BIND 生物傳感器上的周質提取物4孚獲scFv。 水化的SA1 BIND 生物傳感器抗生蛋白鏈菌素與50 pg/ml生物素-抗 -his溫育一小時、清洗並記錄沉積的生物素-抗-his的量的終點讀數，圖 5(A)。每毫升八微克的scFv摻入PBS和不含編碼scFv的質粒的大腸 桿菌的周質提取物。將所述scFv溫育l小時、清洗並記錄沉積的scFv 的量的終點讀數。scFv的量列在圖5(B)中並圖示在圖5(C)中。圖6顯示了從GA1 BIND 生物傳感器上的周質提取物俘獲scFv。 水化的GA1 BIND 生物傳感器戊二醛與50 ^g/ml抗-cmyc溫育一'J、 時、清洗並記錄沉積的抗-cmyc的量的終點讀數，圖6(A)。每毫升兩百 微克的中性抗生物素蛋白(neutravidin)與所述BIND⑧生物傳感器溫 育1小時以封閉任何殘餘的戊二醛活性基團、清洗並記錄沉積的中性 抗生物素蛋白的量的終點讀數。每毫升五微克的scFv摻入PBS和不含 編碼scFv的質粒的大腸桿菌的周質提取物。將所述scFv溫育1小時、 清洗並記錄沉積的scFv的量的終點讀數。scFv的量列在圖6(B)中並圖 示在圖6(C)中。在圖7中，通過雜交瘤技術形成的小鼠IgG從雜交瘤上清液中俘 獲，然後測試其結合可溶性抗原和在細胞上表達的抗原的能力。在SRU BIND TIO生物傳感器上形成小鼠IgG的特異性俘獲表面，圖7(A) 和7(B)。水化的TIO BIND 生物傳感器用溶於PBS的20 jug/ml蛋白 A包^皮30分鐘、清洗並記錄沉積的蛋白A的量的終點讀數。用1%牛 奶對所述生物傳感器封閉30分鐘、清洗並記錄沉積的牛奶的量的終點 讀數。然後，用20 pg/ml的特異性俘獲劑兔抗小鼠-Fc特異性IgG溫育30分鐘、清洗並記錄沉積的兔抗小鼠Fc特異性IgG的量的終點讀數。 剩餘的蛋白A位點用50pg/ml兔IgG封閉30分鐘。此時形成小鼠IgG 的特異性俘獲表面。板15用於測試表達抗原的轉染細胞系和親代細胞 系的結合。板16用於測試抗原結合。圖7(C)顯示了測量來自板15和 板16上的雜交瘤上清液的小鼠IgG的俘獲的偏移值(nm)。圖7(D)顯 示了與BIND 生物傳感器上的俘獲IgG相結合的抗原和細胞。圖7(E) 顯示了所述抗原和細胞結合的偏移(nm)以及抗原信號除以IgG信號的 比率和細胞結合信號除以IgG信號的比率。這些比率可用於評定所述 IgG。抗體22、 25、 26、 28、 30、 31、 34、 36和37可分類為抗原結合 劑(抗原結合除以IgG結合)，且37具有最高的抗原親和性，比率為 0.13。抗體22、 25和26具有相似的親和性並構成笫二類結合劑，比率 為0.10。剩餘的抗體(28、 30、 31、 34和36)具有低4艮多的親和性， 其比率少於0.04。在抗體30的情況下，IgG也可被分類為通用細胞結 合劑，其親代細胞系除以IgG的比率為0.11且抗原呈遞細胞除以IgG 的比率為0.16。第二細胞結合分類對在細胞上表達的抗原具有特異性， 正如抗體25和26 —^f,這兩種抗體其抗原呈遞細胞除以IgG的比率 分別為0.49和0.30,親代細胞系除以IgG的比率分別0.00和0.01。其 餘的抗體是非細胞結合劑，其親代細胞系除以IgG和抗原呈遞細胞除 以IgG的結合比率小於0.04。圖8顯示了釆用抗-FcTIOBIND⑧生物傳感器乂人血清中俘獲抗體。 在SRUBIND TIO生物傳感器上形成小鼠IgG的特異性俘獲表面，圖 8(A)。水化的TIO BIND 生物傳感器用溶於PBS中的20 pg/ml蛋白 A包被30分鐘、清洗並記錄沉積的蛋白A的量的終點讀數。然後用 1%牛奶對所述生物傳感器封閉30分鐘、清洗並記錄沉積的牛奶的量的 終點讀數。然後用20嗎/ml的特異性俘獲劑兔抗-小鼠-Fc溫育30分鐘、 清洗並記錄沉積的兔抗-小鼠Fc的量的終點讀數。剩餘的蛋白A位點 用50 ^g/ml兔IgG封閉30分鐘。此時形成小鼠IgG的特異性俘獲表 面。圖8 (B)和(C)顯示了摻入PBS和50/0、 10%、 20%、 40%和100% 血清的小鼠IgG的俘獲(0.1 ^ig/ml 6.4]Lig/ml系列稀釋)。圖8(D)和8(E) 是圖8(B)和8(C)中的列表數據的圖示。圖9顯示了採用GA1 BIND 生物傳感器的血清藥物一抗藥物試 驗。IgG是治療性抗體藥物的模擬物，抗-藥物是F(ab，)2,它被摻入PBS和小鼠血清以模擬使用GA1 BIND⑧生物傳感器在來自於臨床分離物 的人血清中發現的。水化的GA1 BIND⑧生物傳感器與20 pg/ml IgG溫 育1小時、清洗並記錄沉積在所述表面上的IgG的量的終點讀數。通 過將所述傳感器與100貼/ml非免疫兔IgG溫育2小時，保留在所述 GA1 BIND⑧生物傳感器表面上的游離醛被固定。所述IgG(藥物)rlgG 表面同樣被來自Pierce的START Block封閉1小時。圖9(A)顯示了藥 物特異性表面的形成的偏移(nm)。通過將所述抗藥物1:3系列稀釋入 PBS或11%和30%小鼠血清，在所述生物傳感器上形成0~7.1 jxg/ml 的抗藥物滴定曲線。抗-藥物與20 pg/ml (圖9(B))和0 ^g/ml的藥物 表面(圖9(C))的結合以圖例進行表示。相比PBS,在11%血清中俘 獲了相同量的抗藥物。在30%血清中俘獲更少量的抗-藥物，但所述抗 藥物是可以檢測到的。圖10顯示了採用抗TIOBIND⑧生物傳感器的血清中的藥物-抗藥 物試驗的開發。IgG是治療性抗體藥物的模擬物，抗-藥物是F(ab')2， 它被摻入PBS和小鼠血清以模擬在來自於臨床分離物的人血清中發現 的IgG。圖IO(A)顯示了在用於俘獲小鼠IgG的特異性表面形成中所測 量的偏移。水化的TIO BIND 生物傳感器用20 ^g/ml蛋白A包被。 百分之一的牛奶用於封閉未被蛋白A填充的TIO上任何剩餘的結合位 點。在牛奶封閉步驟以後，所述表面與20 pg/ml兔抗-人-Fc進行溫育。 50 |Lig/ml的兔IgG用於封閉未被兔抗-小鼠-Fc填充的任何蛋白A結合 位點。在該試驗階段，每種試劑與所述表面溫育30分鐘，清洗所述表 面並記錄沉積在所述表面上的每種試劑的量的終點讀數。每毫升五十 微克的藥物(IgG)與所述特異性表面溫育1小時、清洗並記錄沉積在所 述表面上的每種藥物的量的終點讀數。通過將抗藥物1:3系列稀釋入 PBS或11%和30%小鼠血清，在所述生物傳感器上形成0-7.1 pg/ml 的抗藥物滴定曲線。抗-藥物與50 itig/ml和0 pg/ml藥物表面的結合分 別顯示在圖IO(B)和11(C)。在11%和30%血清中俘獲更少量的抗-藥物， ^旦所述抗藥物是可以;險測到的。4^#乂，^^《在為、類^確定在抗體篩選(抗體或抗體片段)或噬菌體篩選中的表位分類可以採 用本發明的方法進行確定。在實例中，待分類的結合分子可以是抗體或展示噬菌體或二者的組合。第一結合分子被動地或者特異性地固定 在生物傳感器上。優選地，生物傳感器包括微量滴定板的底表面。該 表面由封閉劑封閉。抗原(諸如碳水化合物、聚合物、肽、可溶性蛋白 或細胞受體的抗原模擬物)被展示噬菌體、抗體或抗體片段表面特異性 地俘獲。待分類的各個噬菌體克隆、抗體或抗體片段加入到孔中。當 固定在孔中的展示噬菌體、抗體或抗體片段結合至與待分類的噬菌體、 抗體或抗體片段相同的表位內時，則將沒有可檢測到的信號，這是由 於所述結合位點已被固定的噬菌體、抗體或抗體片段所填充。當固定 在孔中的展示噬菌體、抗體或抗體片段識別與待分類的噬菌體、抗體 或抗體片段不同的表位結合位點，那麼可檢測的信號將被記錄。圖11顯示了採用比色共振反射生物傳感器用於表位作圖的單克隆抗體結合目標肽的終點分析。圖ll(A)顯示了在用於俘獲小鼠IgG的特 異性表面形成中所測量的偏移。水化的TIO BIND 生物傳感器用20 (ig/ml蛋白A包被。所述蛋白A用作可特異性俘獲小鼠IgG的兔抗-小 鼠-Fc的俘獲表面。百分之一的牛奶用於封閉未被蛋白A填充的TIO 上任何剩餘結合位點。在所述牛奶封閉步驟以後，所述表面與20pg/ml 兔抗-小鼠-Fc進行溫育。50 pg/ml的兔IgG用於封閉未被兔抗-小鼠-Fc 填充的任何蛋白A結合位點。在該試驗階段，每種試劑與所述表面溫 育30分鐘，清洗所述表面並記錄沉積在所述表面上的每種試劑的量的 終點讀數。在圖11(B)中，記錄了四種小鼠IgG被蛋白A:牛奶:兔抗-小 鼠-Fc:兔IgG表面俘獲。每毫升IO微克的IgG與所述特異性表面溫育 30分鐘。為確保第二層小鼠IgG通過抗原而不是兔抗-小鼠-Fc結合， 來自Pierce的非免疫小鼠IgG以50 pg/ml加入以填充任何未^L佔據的 兔抗-小鼠-Fc結合位點，圖ll(A)。圖11(C)記錄了當加入抗原來俘獲 小鼠IgG時所測量的偏移。Ab-4不結合抗原，所述4種IgG可分類為 抗原結合劑(Ab-1、 Ab-2和Ab-3)和抗原非結合劑(Ab-4)。所述抗原 結合抗體也可通過將所述BIND⑧生物傳感器測量的抗原偏移除以所述 抗體偏移而進行評定。Ab-2具有最高的抗原親和性，比率為0.56。 Ab-3 具有比Ab-l略高的抗原親和性，每抗體偏移的抗原結合比率分別為 0.38和0.35。圖ll(D)顯示了通過在層1和層3加入相同小鼠IgG而形 成的圖表。如果在同一孔中的兩種IgG結合了抗原的相同區域，則沒 有一皮才企測的信號。例如可以將相同抗體分兩次加入到同一孔中。自身竟爭導致在對角線上不能觀察到信號Ab-l和Ab-l得到0.016 nm; Ab國2和Ab醫2得到0,063 nm;以及Ab-3和Ab-3得到0.050 nm。 Ab-l 和Ab-3屬於同一結合類別，並且由於Ab-l和Ab-3得到0.033 nm偏 移，而相反取向的Ab-3和Ab-l得到0.024 nm偏移，因而不能用作夾 心式配對。如果一個孔內的兩種IgG能同時結合抗原，則它們屬於不 同的結合類別並可用作夾心式配對。Ab-2屬於第二結合類別並可用作 Ab-l和Ab-3的夾心式伴侶Ab-l和Ab-2為0.138; Ab-2和Ab-l為 0.150; Ab-3和Ab-2為0.203;以及Ab-2和Ab-3為0.212。在所固定 的第一和/或第二抗體是噬菌體上的展示物或者可溶性抗體(純化或粗 制樣品)時，該技術能適用。組合包括噬菌體噬菌體、噬菌體:抗體片 段、抗體片段:噬菌體、抗體片段抗體片段、完整抗體:噬菌體、噬菌 體:完整抗體、完整抗體:完整抗體、抗體片段完整抗體和抗體抗體 片段。這也可以用於雜交瘤和噬菌體展示篩選以及在其他宿主諸如小鼠中製得的人抗體。在本文中任何地方所引用的所有專利、專利申請以及其他科學或 技術著作以引用的方式整體引入。此處所描述的方法和組合物作為優 選實施方案的典型代表是示例性的，且並非旨在限制本發明的範圍。 其中的變化和其他用途對於本領域技術人員而言是顯而易見的，並包 括在本發明的精神之中。此處經說明性地描述的本發明可合適地在缺 乏此處未明確公開的任何一種或多種要素、 一種或多種限制的情況下 付諸實施。因此，例如，在此處每種情況下，任一術語"包括"、"基 本由......組成，，和"由......組成"可由另兩個術語中的任一個替換而保留了其普通含義。已採用的術語和表達方式是用作描述性術語，而 非限制性的，並且沒有任何意圖在使用這些術語和表達方式時排除任 何已顯示的和已描述的等同特徵或者其一部分，但應當意識到在所宣 稱的本發明的範圍內可作出各種修改。因此，應當理解雖然已經通過 實施方案和可選的特徵詳細公開了本發明，yf旦此處所公開的 一既念的修 改和變化也應被視為在所述描述和所附權利要求所界定的本發明的範 圍之內。此外，當本發明的特徵和方面根據馬庫什分類或其他替代性分類 進行描述時，本領域技術人員將認識到本發明也因此可根據所述馬庫 什分類或其他分類的任何獨立成員或成員亞分類進行描述。
權利要求
1.檢測結合伴侶與噬菌體的結合的方法，所述方法包括(a)在生物傳感器上固定粗製噬菌體製劑、未經濃縮的噬菌體製劑、非均勻噬菌體製劑、濃縮噬菌體製劑或其組合；(b)使所述生物傳感器與所述結合伴侶相接觸；(c)檢測所述結合伴侶與固定在所述生物傳感器上的噬菌體的結合。
2. 如權利要求1所述的方法，其中所述結合伴侶是小分子、碳水 化合物、聚合物、肽、可溶性蛋白、細胞受體、細胞受體的抗原沖莫擬 物、細月包、哺乳動物細l包或哺乳動物細月包表面蛋白。
3. 如權利要求1所述的方法，其中所述噬菌體製劑和抗原不包括 可檢測標記。
4. 如權利要求l所述的方法，其中噬菌體製劑是噬菌體展示庫。
5. 如權利要求1所述的方法，其中所述噬菌體製劑是被動固定在 所述生物傳感器上的。
6. 如權利要求1所述的方法，其中通過噬菌體外殼蛋白特異性抗 體或噬菌體外殼蛋白特異性抗體片段將所述噬菌體製劑固定在所述生 物傳感器上。
7. 如權利要求6所述的方法，其中所述抗體或抗體片段通過與結 合在所述生物傳感器上的蛋白相結合而固定在所述生物傳感器上。
8. 如權利要求6所述的方法，其中所述抗體或抗體片段包括標籤。
9. 如權利要求8所述的方法，其中所述抗體或抗體片段通過所述 標籤的特異性抗體固定在所述生物傳感器上。
10. 如權利要求1所述的方法，其中所述生物傳感器是比色共振反 射生物傳感器或基於倏逝波的生物傳感器。
11. 如權利要求1所述的方法，其中所述噬菌體製劑被固定在所述 生物傳感器表面上的一處或多處，固定在孔中，或者孔中的一處或多 處。
12. 確定抗體群中抗體的表位分類的方法，所述方法包括(a) 將展示噬菌體、抗體或抗體片段固定在生物傳感器上；(b) 在適於結合伴侶與所述展示噬菌體、抗體或抗體片段相結合的條件下使所述生物傳感器與所述結合伴侶相接觸，所述結合伴侶特異 性地與固定在所述生物傳感器之上的所述展示噬菌體、抗體或抗體片段相結合；(c)使所述抗體群與所述生物傳感器相接觸；其中，所述抗體群與所述結合伴侶相結合產生的可檢測信號指示 出在所述抗體群中而非所述被固定的展示噬菌體、抗體或抗體片段中 存在不同表位分類。
13. 如權利要求12所述的方法，其中所述抗體群包括噬菌體克隆。
14. 如權利要求12所述的方法，其中所述抗體群包括抗體片段、 完整抗體、展示完整抗體的噬菌體、展示抗體片段的噬菌體。
15. 如權利要求12所述的方法，其中所述抗體群包括來自雜交瘤 的抗體。
16. 如權利要求12所述的方法，其中所述抗體群包括來自噬菌 體展示篩選的抗體。
17. 如權利要求12所述的方法，其中所述展示噬菌體是粗製噬菌 體製劑、未經濃縮的噬菌體製劑、濃縮噬菌體製劑或非均勻噬菌體製劑。
18. 如權利要求12所述的方法，其中所述結合伴侶是小分子、碳 水化合物、聚合物、肽、可溶性蛋白、細胞受體、細胞受體的抗原模 擬物、哺乳動物細胞或哺乳動物細胞表面蛋白。
19. 如權利要求18所述的方法，其中所述哺乳動物細胞表面蛋白 是膜相關蛋白、單跨膜蛋白、多跨膜蛋白或蛋白通道。
20. 如權利要求12所述的方法，其中所述生物傳感器是比色共振 反射生物傳感器或基於倏逝波的生物傳感器。
21. 如權利要求12所述的方法，其中所述抗體群、結合伴倡和固 定的展示噬菌體、固定抗體或固定抗體片段不含可檢測標記。
全文摘要
本發明提供了用生物傳感器檢測噬菌體和抗原或者抗原和抗體之間的相互作用的方法。
文檔編號G01N33/68GK101336376SQ200680052005
公開日2008年12月31日 申請日期2006年11月29日 優先權日2005年11月30日
發明者J·格爾斯藤邁爾, L·馬迪森 申請人:Sru生物系統公司