用於擴增人的葡糖激酶基因的多重pcr引物的製作方法
2023-09-22 03:02:30 3
專利名稱：用於擴增人的葡糖激酶基因的多重pcr引物的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於擴增人的葡糖激酶基因的引物集，更具體地，本發明涉及通過多重PCR擴增人類葡糖激酶基因中的靶DNA序列的引物集。
背景技術：
人類基因組由大約3×109個核苷酸組成，因此很難分離並分析特定的人類基因。PCR技術就是為擴增特定序列而開發的。通過利用一組引物，包括與靶序列的兩個末端互補的引物，PCR能以較高的速度、特異性和敏感性擴增靶序列(Saiki等，Science 239487，1988)。
PCR廣泛用於分析疾病相關基因。特別是，通過PCR進行的基因擴增可用於分析醫學領域中疾病相關基因的遺傳變異。特定的疾病相關基因通過PCR擴增，並通過測序、雜交或單鏈構象多態性進行分析。當本文中提到基因的遺傳變異時，是指核苷酸序列中的改變，包括核苷酸序列的缺失、加入或倒位。特別是，基因的遺傳變異包括單核苷酸多態性。
在分析基因的遺傳變異時，如果靶基因較小，可能單次PCR就足以擴增整個基因。但是，如果靶基因較大，例如，為1kb或更大時，單次PCR可能就不足以擴增完整基因。因此，需要在完整基因的多個部位進行多次獨立的PCR，以便擴增出完整基因。在分析疾病相關基因的遺傳變異時，更經常使用的是多次PCR(multiple PCR)，而不是單次PCR，因為絕大多數疾病相關基因為1.5kb或更大。
但是，多次PCR需要大量樣品，例如，病人的DNA或血液。另外，多重PCR的成本較高，且耗費更多的時間和精力。
目前已經開發出一種多重PCR(multiplex PCR)以解決上述問題。多重PCR在一次反應中就能同時擴增一個基因的多個靶序列。因此，利用能擴增每種靶序列的引物集，就可通過單次PCR擴增多個靶序列。
用於多重PCR的一組引物應該能特異性結合靶序列，並且不應相互幹擾，從而擴增足夠量的靶序列。
利用這樣一組引物通過多重PCR擴增靶序列，比單次PCR節省時間、精力和成本。特別是，利用DNA晶片分析基因的遺傳變異時，多重PCR可在一個反應中擴增一種以上的DNA樣品。
已知人類葡糖激酶基因的變異(包括點突變)，可以導致青春晚期糖尿病(MODY)2(Matschinsky Magnuson，在『Molecular Pathogenesis ofMODYs』中，Karger，1998；美國專利5,541,060；WO9321343)。MODY 2是MODY病(MODY 1，2，3，4和5)的一種，在所有類型的II型糖尿病中，佔大約10-30％。因此，通過分析人類葡糖激酶基因的遺傳變異，有可能預見患糖尿病的傾向。因此，為了利用諸如DNA晶片等快速分析人的葡糖激酶基因，需要開發一組用於通過多重PCR擴增人類葡糖激酶基因的引物。
發明內容
本發明的一個目的是，提供一組能通過多重PCR擴增人類葡糖激酶基因的靶序列的引物。
本發明另一目的是，提供一種利用引物組對人類葡糖激酶基因能進行測序的方法。
本發明還有一個目的是，提供一種用於擴增靶序列的試劑盒。
本發明提供了一種用於擴增人類葡糖激酶基因的靶序列的引物集(primer pool)，它包括至少一組由序列3(SEQ ID NO.3)至序列24(SEQ IDNO.24)鑑定的、用於擴增人類葡糖激酶基因的靶序列的引物，以及它們的變體，這些引物選自(a)一組選自可被序列3(SEQ ID NO.3)和4(SEQ ID NO.4)鑑定的引物組的引物，或這組引物的變體，所述變體在所述引物的至少一個末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多達3個核苷酸與模板互補；(b)一組選自可被序列5(SEQ ID NO.5)和6(SEQ ID NO.6)鑑定的引物組的引物，或這組引物的變體，所述變體在所述引物的至少一個末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多達3個核苷酸與模板互補；
(c)一組選自可被序列7(SEQ ID NO.7)和8(SEQ ID NO.8)鑑定的引物組的引物，或這組引物的變體，所述變體在所述引物的至少一個末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多達3個核苷酸與模板互補；(d)一組選自可被序列9(SEQ ID NO.9)和10(SEQ ID NO.10)鑑定的引物組的引物，或這組引物的變體，所述變體在所述引物的至少一個末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多達3個核苷酸與模板互補；(e)一組選自可被序列11(SEQ ID NO.11)和12(SEQ ID NO.12)鑑定的引物組的引物，或這組引物的變體，所述變體在所述引物的至少一個末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多達3個核苷酸與模板互補；(f)一組選自可被序列13(SEQ ID NO.13)和14(SEQ ID NO.14)鑑定的引物組的引物，或這組引物的變體，所述變體在所述引物的至少一個末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多達3個核苷酸與模板互補；(g)一組選自可被序列15(SEQ ID NO.15)和16(SEQ ID NO.16)鑑定的引物組的引物，或這組引物的變體，所述變體在所述引物的至少一個末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多達3個核苷酸與模板互補；(h)一組選自可被序列17(SEQ ID NO.17)和18(SEQ ID NO.18)鑑定的引物組的引物，或這組引物的變體，所述變體在所述引物的至少一個末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多達3個核苷酸與模板互補；(i)一組選自可被序列19(SEQ ID NO.19)和20(SEQ ID NO.20)鑑定的引物組的引物，或這組引物的變體，所述變體在所述引物的至少一個末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多達3個核苷酸與模板互補；(j)一組選自可被序列21(SEQ ID NO.21)和22(SEQ ID NO.22)鑑定的引物組的引物，或這組引物的變體，所述變體在所述引物的至少一個末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多達3個核苷酸與模板互補；以及(k)一組選自可被序列23(SEQ ID NO.23)和24(SEQ ID NO.24)鑑定的引物組的引物，或這組引物的變體，所述變體在所述引物的至少一個末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多達3個核苷酸與模板互補。
本發明提供了一種擴增人的葡糖激酶基因的靶序列的方法，包括利用本發明所述的引物集對人的葡糖激酶基因的靶序列進行PCR。
本發明還提供了一種用於擴增人類葡糖激酶基因的靶序列的試劑盒，其包含本發明所述的引物集。
圖1的照片顯示，人類葡糖激酶基因的外顯子1-10，經過單次PCR和多重PCR所得產物的電泳結果。
圖2顯示，利用能擴增外顯子9的一組引物，經過單次PCR獲得的產物的核苷酸序列比較，其中所述外顯子9具有人類葡糖激酶基因的已知核苷酸序列。
圖3a和3b的照片顯示，用一組引物變體經過多重PCR獲得的產物的電泳結果。
圖4的照片顯示，利用用於擴增每種外顯子的每組引物作為探針，經過單次PCR和多重PCR獲得的產物的Southern印跡結果。
圖5a和5b顯示多重PCR產物的核苷酸序列的比較，所述多重PCR產物具有相應區域的已知核苷酸序列。
具體實施例方式
在開發用於經多重PCR擴增人類葡糖激酶基因的引物集時，考慮以下因素引物集的引物應當能結合人類葡糖激酶基因的靶序列，並且應當不相互幹擾，以便擴增足夠量的靶序列。引物集的每種引物應當具有相似的解鏈溫度，並且不應形成引物對二聚體。此外，引物集的每種引物不應形成發卡或引物的自身二聚體。引物序列應當不包括微衛星區和重複區(repetitive region)。
用於擴增人類葡糖激酶基因的靶序列的引物集，包括至少一組由序列3-24所鑑定的用於擴增人類葡糖激酶基因靶序列的引物及其變體，它們選自
(a)一組選自可被序列3(SEQ ID NO.3)和4(SEQ ID NO.4)鑑定的引物組的引物，或這組引物的變體，所述變體在所述引物的至少一個末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多達3個核苷酸與模板互補；(b)一組選自可被序列5(SEQ ID NO.5)和6(SEQ ID NO.6)鑑定的引物組的引物，或這組引物的變體，所述變體在所述引物的至少一個末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多達3個核苷酸與模板互補；(c)一組選自可被序列7(SEQ ID NO.7)和8(SEQ ID NO.8)鑑定的引物組的引物，或這組引物的變體，所述變體在所述引物的至少一個末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多達3個核苷酸與模板互補；(d)一組選自可被序列9(SEQ ID NO.9)和10(SEQ ID NO.10)鑑定的引物組的引物，或這組引物的變體，所述變體在所述引物的至少一個末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多達3個核苷酸與模板互補；(e)一組選自可被序列11(SEQ ID NO.11)和12(SEQ ID NO.12)鑑定的引物組的引物，或這組引物的變體，所述變體在所述引物的至少一個末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多達3個核苷酸與模板互補；(f)一組選自可被序列13(SEQ ID NO.13)和14(SEQ ID NO.14)鑑定的引物組的引物，或這組引物的變體，所述變體在所述引物的至少一個末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多達3個核苷酸與模板互補；(g)一組選自可被序列15(SEQ ID NO.15)和16(SEQ ID NO.16)鑑定的引物組的引物，或這組引物的變體，所述變體在所述引物的至少一個末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多達3個核苷酸與模板互補；(h)一組選自可被序列17(SEQ ID NO.17)和18(SEQ ID NO.18)鑑定的引物組的引物，或這組引物的變體，所述變體在所述引物的至少一個末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多達3個核苷酸與模板互補；(i)一組選自可被序列19(SEQ ID NO.19)和20(SEQ ID NO.20)鑑定的引物組的引物，或這組引物的變體，所述變體在所述引物的至少一個末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多達3個核苷酸與模板互補；(j)一組選自可被序列21(SEQ ID NO.21)和22(SEQ ID NO.22)鑑定的引物組的引物，或這組引物的變體，所述變體在所述引物的至少一個末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多達3個核苷酸與模板互補；以及(k)一組選自可被序列23(SEQ ID NO.23)和24(SEQ ID NO.24)鑑定的引物組的引物，或這組引物的變體，所述變體在所述引物的至少一個末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多達3個核苷酸與模板互補。
通過在引物的至少一個末端加入或缺失1-3個與模板上1-3個末端核苷酸互補的核苷酸，可獲得該引物的變體。因此，該引物變體除了至少一個末端部分以外，具有與其相應引物相同的核苷酸序列。
本發明用於擴增人類葡糖激酶基因的靶序列的試劑盒包含一個引物集。所述試劑盒可包含常規PCR試劑，如dNTP溶液，DNA聚合酶以及緩衝液等。
本發明將參照以下實施例進行更詳細說明。以下實施例旨在舉例，並非限定本發明的範圍。
實施例1製備用於擴增人類葡糖激酶基因的11種靶序列的引物將引物設計為能使每種PCR產物的大小相差至少5-10bp。在設計多重PCR的引物組時，考慮上述因素。此外，將每種引物設計為不包括連續4個或更多個相同的核苷酸。
使用HYBsimulatorTM(Advanced Gene Computing Technologies，Inc)分析所述引物。
為了提高PCR產物的擴增效力，在正向引物的5』端加入T7啟動子序列(序列1(SEQ ID NO.1))，在反向引物5』端加入T3啟動子序列(序列2(SEQID NO.2))。
每種引物的序列編號以及特徵見表1。
表1
F正向R反向實施例2通過單次PCR擴增人類葡糖激酶基因使用實施例1的每組引物，通過單次PCR擴增人類葡糖激酶基因的每種靶序列。PCR如下實現首先變性(95℃5分鐘)，然後以變性(95℃30秒)、退火(64℃15秒)和聚合(72℃30秒)為一個循環，共進行30個循環，最後延伸(72℃3分鐘)。PCR反應溶液的組成如下無菌且不含DNA酶和RNA酶的水12.8μldNTP混合物(每種核苷酸2.5mM) 2μl10x Taq聚合酶緩衝液 2μl一組引物(每種引物10pmol) 2μl基因組DNA(200-1.0μg) 1μlTaq聚合酶(5單位/μl) 0.2μlPCR產物通過在1.8％瓊脂糖凝膠上進行電泳來分析(圖1)。在圖1中，泳道1-11代表對應於外顯子1a，1b，1c，2，3，4，5和6，7，8，9和10的PCR產物。泳道12代表以下實施例3中的多重PCR產物，泳道13代表分子量標誌，是一個50bp的DNA序列梯。
如圖1所示，人類葡糖激酶基因的靶序列通過使用實施例1的一組引物經單次PCR來擴增。
分離用序列21和22這組引物通過單次PCR獲得的產物，應用自動測序方法進行測序。將所得核苷酸序列(稱為「query」)與人類葡糖激酶基因外顯子9的已知序列(稱為「Sbjct」)用DNAstar軟體(DNAstar Inc.)進行比較(圖2)。如圖2所示，所述PCR產物與人類葡糖激酶外顯子9的已知序列顯示98.3％的序列同源性。該序列對比中使用的缺口(gap)頻率0％。
除了外顯子9，還以如上所述的同樣方式對其它外顯子的單次PCR產物進行測序，並進行分析，每種PCR產物與相應的已知外顯子序列顯示95％或更高的同源性。
實施例3通過多重PCR擴增人的葡糖激酶基因使用實施例1的一組引物進行多重PCR。該反應如下進行首先變性(95℃5分鐘)，然後以變性(95℃30秒)、退火(64℃15秒)和聚合(72℃30秒)為一個循環，共進行30個循環，最後延伸(72℃3分鐘)。所有引物都加入一個反應管中。該反應溶液的組成如下無菌且不含DNA酶和RNA酶的水 16.4μldNTP混合物(每種核苷酸2.5mM) 5μl10x Taq聚合酶緩衝液 5μl一組引物(每種引物10pmol) 22μl基因組DNA(200-1.0μg)1μlTaq聚合酶(5單位/μl) 0.6μlPCR引物通過在1.8％的瓊脂糖凝膠上電泳來分析(圖1，泳道11)。如圖1所示，使用實施例1的上述一組引物進行多重PCR的結果是，人類葡糖激酶基因的所有11種靶序列(507，312，249，365，355，264，446，370，336，410和551bp)都得到擴增。
實施例4用一組引物變體通過多重PCR擴增人類葡糖激酶基因引物變體如下合成在4組引物(用於擴增外顯子1a，3，4和9的引物組)中每一種引物的一個末端增加3個與所述模板互補的核苷酸，在另一末端缺失3個核苷酸。按照與實施例1所述同樣的方法進行多重PCR，但其中使用上述4組引物中的一組，另3組使用表1所示的相應引物組(圖3a和3b)。
表2 F正向 R反向 從表1所示相應引物中刪除的核苷酸xxx向表1所示相應引物中加入的核苷酸圖3a的照片顯示，應用一組針對外顯子4的引物變體、表1中針對外顯子1a，3和9的引物組進行多重PCR，所得產物的電泳結果。圖3b的照片顯示，應用一組針對外顯子9的引物變體、表1中針對外顯子1a，3和4的引物組進行多重PCR，所得產物的電泳結果(應用針對外顯子1a和3的一組引物變體所得多重PCR產物的電泳結果未顯示)。在圖3a和3b中，左側第一泳道是分子量標誌，一個50bp的DNA序列梯，泳道1是用表1所示的一組引物獲得的多重PCR結果，泳道2是用表2所示一組針對外顯子4和9的引物變體獲得的多重PCR結果，泳道3是應用除了針對外顯子4或9的一組引物以外的上述另3組引物進行多重PCR的結果。
如圖3a和3b中所示，應用一組引物變體經過多重PCR擴增得到了基因的相應靶序列。
實施例5通過southern印跡分析鑑定多重PCR產物將實施例2和3中擴增的PCR產物在1.8％的瓊脂糖凝膠上電泳(圖1)。將所述凝膠加入變性溶液(0.5N NaOH+1.5M NaCl)中，攪拌15分鐘，使雙鏈DNA變性。經過兩次變性處理後，重複兩次，用蒸餾水洗凝膠，然後將凝膠加入中性溶液(3M NaCl，含0.5M Tris-HCl，pH7.5)中，溫和攪拌15分鐘，中和凝膠。經過兩次中和處理後，通過使凝膠與尼龍膜在20XSSC溶液中反應12.5小時，而將凝膠內的DNA轉移至尼龍膜上。DNA通過在120℃反應30分鐘而與尼龍膜交聯，然後洗膜1-2分鐘，乾燥。
將所得的結合了DNA的膜置於20ml雜交溶液中，於62℃預雜交約2小時，然後棄去所述溶液。將結合了DNA的膜以及5pmol/ml DIG(地高辛配基)標記的探針加入10ml新鮮雜交溶液袋中，於62℃反應約12小時。反應期間，DIG標記的探針與基因的互補區雜交。反應後，將膜在室溫下用2X洗滌溶液(2XSSC+0.1％SDS)洗2次，每次5分鐘，在62℃用0.5X洗滌溶液(0.5XSSC+0.1％SDS)洗兩次，每次15分鐘。
將上述膜置於20ml封閉溶液中約30-60分鐘，然後使膜與抗-DIG抗體在含1μl鹼性磷酸酶偶聯型綿羊抗-DIG抗體(Roche)的20ml封閉溶液中反應30分鐘。將膜用洗滌溶液(100mM順丁烯二酸，150mM NaCl，pH7.5室溫，0.3％Tween20)洗兩次，每次約15分鐘。為了證實DNA與探針在膜上雜交，將鹼性磷酸酶底物，CDP-Star與檢測緩衝液以1∶100混合，將膜用該溶液處理約5分鐘，然後將此膜曝光於X-線膠片。使膠片顯影，從而確定探針的位置(圖4)。如圖4中所示，外顯子1a，外顯子1b，外顯子3，外顯子4，外顯子8，外顯子9和外顯子10分別代表相應外顯子的單次PCR產物，m代表多重PCR產物。
如圖4中所示，所述探針與單次PCR產物和多重PCR產物在相同位置雜交，這說明所擴增的產物是相同的。
實施例6通過測序分析來鑑定多重PCR產物測序PCR通過用實施例3製備的多重PCR產物作為模板，用它們各自對應的擴增引物作為測序引物來進行。在PCR結果中，圖5代表用針對外顯子1c、外顯子5和6以及外顯子7的擴增引物作為測序引物進行測序PCR的結果。圖5顯示測序結果與人類葡糖激酶基因的相應已知外顯子序列的比較。如圖5中所示，通過本次多重PCR獲得的人類葡糖激酶基因外顯子1c、外顯子5和6以及外顯子7的序列有95％或更高的同源性。
用於擴增人的葡糖激酶基因的本發明引物集可有效用於通過多重PCR擴增相應基因。特別是，用於通過多重PCR擴增基因的引物集可用於利用DNA晶片分析疾病相關基因，因為多重PCR需要的樣品量相對較少。
用於擴增人的葡糖激酶基因的本發明引物集可應用在擴增或測序人類葡糖激酶基因的試劑盒中。
序列表110三星電子株式會社(Samsung Electronics Co.Ltd.)120用於擴增人的葡糖激酶基因的多重PCR引物16024170KopatentIn 1.71210121120212DNA213人工序列220223噬菌體T7啟動子序列4001taatacgact cactataggg 20210221119212DNA213人工序列220223噬菌體T3啟動子序列4002gtaaccctca ctaaaggga19210321122212DNA213人工序列220223外顯子1a的正向引物4003caggtcacag aagggagagg ac 22210421122212DNA213人工序列220223外顯子1a的反向引物4004tggggacagg caagcaaaca ct 22210521120212DNA213人工序列220223外顯子1b的正向引物4005agcagccgcc agctgagccc 20210621123212DNA213人工序列220223外顯子1b的反向引物4006ctcccagtgc aaagtcccta act 23210721121212DNA213人工序列220223外顯子1c的正向引物4007ccaggccagt ggcct taagg a 21210821121212DNA213人工序列220223外顯子1c的反向引物4008gcctgggaag aagaggttcc a 21210921121212DNA213人工序列220223外顯子2的正向引物4009gccctcggtg tgcagatgcc t 212101021121212DNA213人工序列220223外顯子2的反向引物40010ggtgcttctc ccagctaggc t 212101121121212DNA213人工序列220223外顯子3的正向引物40011tatccggctc agtcacctgg g 212101221121212DNA213人工序列220223外顯子3的反向引物40012cctcccgtca ggactagctg g 212101321122212DNA213人工序列220223外顯子4的正向引物40013catgccagat ggtcaccatg gc 222101421122212DNA213人工序列220223外顯子4的反向引物40014ttgaaggcag agttcctctg gg 222101521120212DNA213人工序列220223外顯子5和6的正向引物40015gccctagcac cctgcctcca 202101621121212DNA213人工序列220223外顯子5和6的反向引物40016agcctcggca gtctggaagg g 212101721120212DNA213人工序列220223外顯子7的正向引物40017ggaagcggca ggaaccaggc 202101821120212DNA213人工序列220223外顯子7的反向引物40018atggcccggc tcccatctgc 202101921121212DNA213人工序列220223外顯子8的正向引物40019cccggcttcc acctgcatga g 212102021122212DNA213人工序列220223外顯子8的反向引物40020ctgagaccaa gtctgcagtg cc 222102121121212DNA213人工序列220223外顯子9的正向引物40021ggactgtcgg agcgacactc a212102221122212DNA213人工序列220223外顯子9的反向引物40022atcttggagc ttgggaaccg ca 222102321122212DNA213人工序列220223外顯子10的正向引物40023agggcgcccg gtaatgaatg tg 222102421122212DNA213人工序列220223外顯子10的反向引物40024aagtcctgag tgagcaactc cc 2權利要求
1.一種用於擴增人類葡糖激酶基因的靶序列的引物集，其包括至少一組選自下組的引物(a)一組選自可被序列3和4鑑定的引物組的引物，和/或這組引物的變體，所述變體在所述引物的至少一個末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多達3個核苷酸與模板互補；(b)一組選自可被序列5和6鑑定的引物組的引物，和/或這組引物的變體，所述變體在所述引物的至少一個末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多達3個核苷酸與模板互補；(c)一組選自可被序列7和8鑑定的引物組的引物，和/或這組引物的變體，所述變體在所述引物的至少一個末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多達3個核苷酸與模板互補；(d)一組選自可被序列9和10鑑定的引物組的引物，和/或這組引物的變體，所述變體在所述引物的至少一個末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多達3個核苷酸與模板互補；(e)一組選自可被序列11和12鑑定的引物組的引物，和/或這組引物的變體，所述變體在所述引物的至少一個末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多達3個核苷酸與模板互補；(f)一組選自可被序列13和14鑑定的引物組的引物，和/或這組引物的變體，所述變體在所述引物的至少一個末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多達3個核苷酸與模板互補；(g)一組選自可被序列15和16鑑定的引物組的引物，和/或這組引物的變體，所述變體在所述引物的至少一個末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多達3個核苷酸與模板互補；(h)一組選自可被序列17和18鑑定的引物組的引物，和/或這組引物的變體，所述變體在所述引物的至少一個末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多達3個核苷酸與模板互補；(i)一組選自可被序列19和20鑑定的引物組的引物，和/或這組引物的變體，所述變體在所述引物的至少一個末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多達3個核苷酸與模板互補；(j)一組選自可被序列21和22鑑定的引物組的引物，和/或這組引物的變體，所述變體在所述引物的至少一個末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多達3個核苷酸與模板互補；以及(k)一組選自可被序列23和24鑑定的引物組的引物，和/或這組引物的變體，所述變體在所述引物的至少一個末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多達3個核苷酸與模板互補。
2.權利要求1的引物集，其中至少一種所述引物在其5』端包括T7啟動子序列或T3啟動子序列。
3.權利要求1的引物集，其中至少一種由序列3，5，7，11，13，15，17，19，21和23鑑定的引物在其5』端包括T7啟動子序列，且至少一種由序列4，6，8，10，12，14，16，18，20，22和24鑑定的引物在其5』端包括T3啟動子序列。
4.一種擴增人類葡糖激酶基因的靶序列的方法，包括用權利要求1-3中任一項所述引物集對人類葡糖激酶基因的靶序列進行PCR。
5.權利要求4的方法，還包括將0.1μM-1μM每一種所選引物與100ng-1μg模板DNA混合。
6.權利要求4的方法，其中所述PCR的條件是先在90℃-98℃變性1-5分鐘，然後，在90℃-98℃變性10秒-1分鐘、在60℃-65℃退火5秒-3分鐘、在70℃-75℃聚合5秒-5分鐘，最後在70℃-75℃延伸1分鐘-10分鐘。
7.一種利用權利要求1-3任一項所述引物集對人類葡糖激酶基因的靶核苷酸序列進行測序的方法。
8.一種用於擴增人類葡糖激酶基因的靶序列的試劑盒，包括權利要求1-3任一項所述的引物集。
全文摘要
本發明提供了一種引物集，尤其用於擴增人的葡糖激酶基因靶序列的引物集，它包括至少一組引物或其引物變體，每組引物通過起始於序列3而終止於序列24的兩種連續序列來鑑定。使用本發明的引物進行多重PCR，可以以高特異性、高速、高靈敏度和低花費擴增出人的葡糖激酶基因的靶序列，所述基因是與青春晚期糖尿病(MODY)2相關的基因。
文檔編號C12N15/09GK1467294SQ0214980
公開日2004年1月14日 申請日期2002年11月1日 優先權日2002年7月10日
發明者金美卿, 李娟受, 李貞男 申請人:三星電子株式會社