一種β-地中海貧血突變螢光定量PCR檢測試劑盒的製作方法

2023-04-25 06:36:16

專利名稱：一種β-地中海貧血突變螢光定量PCR檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉 及分子生物學領域，具體涉及一種檢測基因突變的螢光定量PCR試劑盒，尤其涉及一種β -地中海貧血突變螢光定量PCR檢測試劑盒。
背景技術：
地中海貧血(thalassem ia)簡稱「地貧」，是世界上最常見的血液遺傳病之一。地中海貧血臨床表型多樣，由輕到重，可以從正常到反覆輸血，甚至危及生命，導致患者在未成年即夭折甚至胎死腹中，給家庭和社會帶來巨大的精神及經濟負擔。而且，目前醫學上尚無有效的治療措施；因此，控制和降低地貧患兒的出生率才能有效地監控此類疾病的發生。通過人群篩查和遺傳諮詢，對那些攜有地貧基因的育齡夫婦所孕胎兒實施產前診斷和基因診斷，是現實條件下控制重症地貧患兒出生最有效的途徑。地中海貧血是自體隱性遺傳疾病，因珠蛋白鏈的合成障礙所產生，表現為紅細胞體積較小和壽命縮短。通常根據珠蛋白鏈的種類將地中海貧血分為α、β、Y、δ β等類型，其中以α、β地中海貧血最為常見,而β地中海貧血危害最大。其中，地中海貧血是一種以珠蛋白膚鏈合成缺陷為特徵的遺傳性溶血性貧血，主要為β珠蛋白基因點突變、小的缺失或插入。目前全世界已發現的地中海貧血突變約170種，在中國人中已發現21種。大量的研究結果表明β_地中海貧血基因突變及頻率分布具有明顯的種族特徵及地域差異。醫學統計發現中國人常見的突變依次為⑶41-42缺失突變(41.6%)、IVS-2nt654(C —T)突變(21.8%)、CD17 (A — T)無義突變(18. 0%)、ΤΑΤΑ 盒 nt_28 (A —G)突變(8%)、CD71-72 (+A)移碼突變(3. 9%),TATA盒nt_29突變(I. 2%);這六種突變的基因頻率佔中國人地貧基因的94%以上，其中⑶41-42缺失突變是中國人最常見的突變類型。因此，對相關基因型進行準確的診斷，對於地中海貧血診斷和和防治具有重大的意義。現有技術中已有的β地中海貧血常用分子診斷方法包括PCR結合特異寡核苷酸探針(PCR-ASO)斑點雜交法、反向雜交(RDB)法、突變寡聚核苷酸延伸擴增PCR(mutant oligonu2cleo tide extension amplification, MOEA)技術、多重等位基因特異 PCR(multiplex allele specific PCR, MAS-PCR)法、等位基因特異性擴增技術(allelespecific, A SPCR)、基因晶片法等。其中，PCR結合特異寡核苷酸探針(PCR-ASO)斑點雜交法一次檢測只針對一種突變，一般完成未知樣品的診斷通常需多次重複檢測，所以頗為費時費力。反向雜交(RDB)法存在PCR擴增不良，雜交膜條上探針太弱或膜條洗滌不充分等原因，會導致假陽性或假陰性結果的出現。突變寡聚核苷酸延伸擴增PCR技術較適於檢測已知DNA點突變的β地中海貧血，需進行電泳，較費時費力。基因晶片法簡便、快速、微量化、自動化、一次能平行篩查更多甚至全部已知突變類型的新方法，但需購進昂貴的儀器設備進行檢測，難以推廣普及。實時突光定量PCR 技術(real-time fluorescent quantitative PCR, FQ-PCR)於1996年由美國Applied Biosystems公司推出，它是一種在PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的突光探針,該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告突光基團和一個淬滅螢光基團。探針完整時，報告基團發射的螢光信號被淬滅基團吸收；剛開始時，探針結合在DNA任一一條單鏈上；PCR擴增時，Taq酶的5』端一 3』端外切酶活性將探針酶切降解，使報告螢光基團和淬滅螢光基團分離，從而螢光監測系統可接收到螢光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個螢光分子形成，實現了螢光信號的累積與PCR產物形成完全同步。該技術不僅實現了對DNA模板的定量，而且具有靈敏度高、特異性和可靠性更強、能實現多重反應、自動化程度高、無汙染性、具實時性和準確性等特點，目前已廣泛應用於分子生物學研究和醫學研究等領域。因此，結合螢光定量PCR技術的諸多優點，開發出一種能夠快速、準確、高敏感度的檢測β -地中海貧血基因特定位點突變的螢光定量PCR檢測試劑盒是業界亟待解決的技術問題。

發明內容
為了克服現有技術的缺陷，本發明所解決的技術問題在於提供一種β_地中海貧 血突變螢光定量PCR檢測試劑盒，能夠快速、準確、高敏感度地檢測β -地中海貧血基因的突變情況，尤其是針對中國人常見的6種β-地中海貧血基因特定位點突變。本發明的β -地中海貧血突變螢光定量PCR檢測試劑盒，包括PCR混合反應液、陽性對照品和用於檢測β -地中海貧血突變基因型的螢光探針，所述PCR混合反應液中包含擴增突變位點所處基因區段的PCR引物。優選地，所述突變位點包括β -珠蛋白基因第41/42位胺基酸對應的鹼基缺失突變、β -珠蛋白基因第二個內含子的第654位對應的C — T鹼基突變、β -珠蛋白基因第17位胺基酸對應的A — T鹼基突變、β -珠蛋白基因啟動子上遊第28位對應的A — G鹼基突變、β -珠蛋白基因第71/72位胺基酸對應的+A鹼基插入突變、β -珠蛋白基因第一個內含子的第5位對應的G — C鹼基突變中的至少一種。其中，所述PCR引物包括以下兩組引物對中的至少一組針對β-珠蛋白基因第41/42位胺基酸對應的突變位點所處區域的引物對，其PCR正向引物的序列如SEQ ID NO: I所示，PCR反向引物的序列如SEQ ID NO: 2所示:Al :5，-CATAACAGCATCAGGAGTGGACAG-3，(SEQ ID NO:I);Α2 :5』 -ACTGACTCTCTCTGCCTATTGGTCTATT-3』 (SEQ ID NO:2);針對β-珠蛋白基因第二個內含子的第654位對應的突變位點所處區域的引物對，其PCR正向引物的序列如SEQ ID Ν0:5所示，PCR反向引物的序列如SEQ ID Ν0:6所示:BI :5』 -TGGTAGCTGGATTGTAGCTGCTATTA-3』 (SEQ ID NO:5);B2:5』 -TTGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGA-3』 (SEQ ID NO:6)；針對β-珠蛋白基因啟動子上遊第28位對應的突變位點所處區域的引物對，其PCR正向引物的序列如SEQ ID Ν0:9所示，PCR反向引物的序列如SEQ ID NO: 10所示:Cl :5』 -CTCCTTAAACCTGTCTTGTAACCTTGATA-3』 (SEQ ID NO:9)；C2:5， -TGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTG-3， (SEQ ID NO:10)；針對β -珠蛋白基因第17位胺基酸對應的突變位點所處區域的引物對，其PCR正向引物的序列如SEQ ID NO: 13所示，PCR反向引物的序列如SEQ ID NO: 14所示:Dl :5』 -GTGTCAGAAGCAAATGTAAGCAATAGAT-3』 (SEQ ID NO:13)；
D2:5， -TGTCATCACTTAGACCTCACCCTGT-3』 (SEQ ID NO:14)；針對β -珠蛋白基因第71/72位胺基酸對應的突變位點所處區域的引物對，其PCR正向引物的序列如SEQ ID NO: 17所示，PCR反向引物的序列如SEQ ID NO: 18所示:El :5，-GCCCTTGAGGTTGTCCAGGT-3，(SEQ ID NO:17)；E2:5， -TATGGGCAACCCTAAGGTGAAG-3， (SEQ ID NO:18)；針對β-珠蛋白基因第一個內含子的第5位對應的突變位點所處區域的引物對，其PCR正向引物的序列如SEQ ID Ν0:21所示，PCR反向引物的序列如SEQ ID Ν0:22所示:Fl :5』 -TGTCTCCACATGCCCAGTTTC-3』 (SEQ ID NO:21)；
F2:5， -CCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTA-3』 (SEQ ID NO:22)。優選地，所述螢光探針包括如SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7, SEQ IDNO:8,SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20, SEQ ID N0:23和SEQ ID N0:24所示的核苷酸序列中的至少一種A3 :5，-HEX-AGGACTCAAAGAACCT-MGB-3』 (SEQ ID NO:3，野生型)；A4 :5』 -FAM-AAGGACTCAACCTCT-MGB-3』(SEQ ID NO:4，突變型)；B3 :5，-HEX-TGCTATTGCCTTAACC-MGB-3，(SEQ ID NO:7，野生型)；B4 :5，-FAM-TTGCTATTACCTTAACCC-MGB-3』(SEQ ID NO:8，突變型)；C3 :5，-HEX-CCACGTTCACCTTGCCCCACAG-TAMRA-3，(SEQ ID NO: 11，野生型)；C4 :5，-FAM-CCACGTTCACCTAGCCCCACAGG - TAMRA-3』 (SEQ ID NO: 12，突變型)；D3 :5，-HEX-TGCCCTGACTTTTATGCCCAGCC-TAMRA-3』 (SEQ ID NO: 15，野生型)；D4 :5，-FAM-TGCCCTGACTTCTATGCCCAGCC - TAMRA-3』 (SEQ ID NO: 16，突變型)；E3 :5，-HEX-CAGGCCATCACTAAAGGCACCGAG-TAMRA-3』 (SEQ ID NO: 19，野生型)；E4 :5，-FAM-CAGGCCATCACTTAAAGGCACCGA - TAMRA-3』 (SEQ ID NO: 20，突變型)；F3 :5，-HEX-CCTTGATACCAACCTG-MGB-3』 (SEQ ID NO:23，野生型)；F4 :5，-FAM-CCTTGATAGCAACCTG-MGB-3』(SEQ ID NO: 24，突變型)。優選地，所述螢光探針包括以下探針組合中的至少一組檢測β -珠蛋白基因第41/42位胺基酸對應的突變位點和對應區域的野生型基因的探針組合 SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4 ；檢測β-珠蛋白基因第二個內含子的第654位對應的突變位點和對應區域的野生型基因的探針組合SEQ ID Ν0:7和SEQ ID Ν0:8 ；檢測β -珠蛋白基因啟動子上遊第28位對應的突變位點和對應區域的野生型基因的探針組合 SEQ ID SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12 ；檢測珠蛋白基因第17位胺基酸對應的突變位點和對應區域的野生型基因的探針組合 SEQ ID NO: 15 和 SEQ ID NO: 16 ；檢測β -珠蛋白基因第71/72位胺基酸對應的突變位點和對應區域的野生型基因的探針組合 SEQ ID NO: 19 和 SEQ ID NO:20 ；檢測珠蛋白基因第一個內含子的第5位對應的突變位點和對應區域的野生型基因的探針組合SEQ ID NO: 23和SEQ ID NO: 24。優選地，所述陽性對照品為存在β -珠蛋白基因突變的質粒DNA，β -珠蛋白的基因突變位點包括珠蛋白基因第41/42位胺基酸對應的鹼基缺失突變、β-珠蛋白基因第二個內含子的第654位對應的C — T鹼基突變、β-珠蛋白基因第17位胺基酸對應的A-T鹼基突變、β -珠蛋白基因啟動子上遊第28位對應的A — G鹼基突變、β -珠蛋白基因第71/72位胺基酸對應的+A鹼基插入突變、β -珠蛋白基因第一個內含子的第5位對應的G — C鹼基突變中的至少一種。其中，檢測野生型β -珠蛋白基因第41/42位胺基酸對應鹼基的野生型探針A3 5』-HEX-AGGACTCAAAGAACCT-MGB-3』 (SEQ ID N0:3)，檢測 β -珠蛋白基因第 41/42 位胺基酸對應的鹼基缺失的探針 Α4 :5』-FAM-AAGGACTCAACCTCT-MGB-3』 (SEQ ID NO:4)，因此，當所述螢光探針包括如SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4—種或者兩種時，所述陽性對照品是存在β -珠蛋白基因第41/42位胺基酸對應的鹼基缺失突變的質粒DNA。同理，檢測野生型珠蛋白基因第二個內含子的第654位對應鹼基的野生型探針 Β3 :5』-HEX-TGCTATTGCCTTAACC-MGB-3』(SEQ ID N0:7)，檢測 β-珠蛋白基因第二個內含子的第 654 位鹼基突變的探針 Β4 :5』-FAM-TTGCTATTACCTTAACCC-MGB-3』 (SEQ ID N0:8),當所述螢光探針包括如SEQ ID N0:7和SEQ ID NO:8 —種或者兩種時，所述陽性對照品是 存在β -珠蛋白基因第二個內含子的第654位對應的C — T鹼基突變的質粒DNA。檢測野生型β -珠蛋白基因第17位胺基酸對應鹼基的野生型探針C3 :5』-HEX_CCACGTTCACCTTGCCCCACAG-TAMRA-3』 (SEQ ID NO: 11)，檢測 β-珠蛋白基因第 17 位胺基酸對應的鹼基突變的探針 C4 :5』-FAM-CCACGTTCACCTAGCCCCACAGG-TAMRA-3』 (SEQ ID NO: 12)，當所述螢光探針包括如SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12 —種或者兩種時，所述陽性對照品是存在β -珠蛋白基因第17位胺基酸對應的A — T鹼基突變的質粒DNA。檢測野生型β -珠蛋白基因啟動子上遊第28位鹼基的野生型探針D3 :5』-HEX_TGCCCTGACTTTTATGCCCAGCC-TAMRA-3』(SEQ ID NO: 15)，檢測 β -珠蛋白基因啟動子上遊第 28位鹼基突變的探針 D4 :5』-FAM-TGCCCTGACTTCTATGCCCAGCC-TAMRA-3』 (SEQ ID NO: 16)，當所述螢光探針包括如SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 16—種或者兩種時，β-珠蛋白基因啟動子上遊第28位對應的A — G鹼基突變的質粒DNA。檢測野生型β -珠蛋白基因第71/72位胺基酸對應鹼基的野生型探針Ε3 :5』_ΗΕΧ-CAGGCCATCACTAAAGGCACCGAG-TAMRA-3』(SEQ ID NO: 19)，檢測 β -珠蛋白基因第71/72位胺基酸對應的鹼基突變的探針 Ε4 :5』 -FAM-CAGGCCATCACTTAAAGGCACCGA - TAMRA-3』 (SEQ IDNO: 20)，當所述螢光探針包括如SEQ ID Ν0:19和SEQ ID NO: 20—種或者兩種時，β -珠蛋白基因第71/72位胺基酸對應的+A鹼基插入突變的質粒DNA。檢測野生型珠蛋白基因第一個內含子的第5位鹼基的野生型探針F3:5』-HEX-CCTTGATACCAACCTG-MGB-3』 (SEQ ID N0:23)，檢測 β -珠蛋白基因第一個內含子的第 5 位鹼基突變的探針 F4 :5』 -FAM-CCTTGATAGCAACCTG - MGB-3』 (SEQ ID NO: 24)，當所述螢光探針包括如SEQ ID NO: 23和SEQ ID NO: 24—種或者兩種時，β-珠蛋白基因第一個內含子的第5位對應的G — C鹼基突變的質粒DNA。優選地，所述螢光探針的5』端標記有螢光報告基團，螢光探針的3』端標記有螢光猝滅基團。需要說明的是，上述探針序列SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:7,SEQ IDNO:8,SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20,SEQ ID Ν0:23和SEQ ID NO:24是序列表中對應核苷酸序列在標記螢光報告基團和螢光淬滅基團後的具體實現方式。在本發明的優選實施方式中，如上述探針序列所示，(O螢光探針SEQ ID N0:A3的5'端標記HEX螢光報告基團，3』端標記MGB螢光淬滅基團；螢光探針SEQ ID N0:A4的Y端標記FAM螢光報告基團，3』端標記MGB螢光淬滅基團。(2)螢光探針SEQ ID N0:B3的5'端標記HEX螢光報告基團，3』端標記MGB螢光淬滅基團；螢光探針SEQ ID N0:B4的5'端標記FAM螢光報告基團，3』端標記MGB螢光淬滅基團。(3)螢光探針SEQ ID N0:C3的5'端標記HEX螢光報告基團，3』端標記TAMRA螢光淬滅基團；螢光探針SEQ ID NO: C4的5'端標記FAM螢光報告基團，3 』端標記TAMRA螢光淬滅基團。
(4)螢光探針SEQ ID N0:D3的5'端標記HEX螢光報告基團，3』端標記TAMRA螢光淬滅基團；螢光探針SEQ ID N0:D4的Y端標記FAM螢光報告基團，3』端標記TAMRA螢光淬滅基團。(5)螢光探針SEQ ID N0:E3的5'端標記HEX螢光報告基團，3』端均記TAMRA螢光淬滅基團；螢光探針SEQ ID N0:E4的Y端標記FAM螢光報告基團，3』端標記TAMRA螢光淬滅基團。(6)螢光探針SEQ ID N0:F3的5'端標記HEX螢光報告基團，3』端標記MGB螢光淬滅基團；螢光探針SEQ ID N0:F4的5'端標記FAM螢光報告基團，3』端標記MGB螢光淬滅基團。當然在本發明的其他實施中，標記不同的螢光報告基團是為了螢光定量PCR能夠採集到不同波長的螢光已便區分，因此採用其他本領域技術已公開的螢光報告基團和螢光 淬滅基團，在不影響檢測效果的情況下，也應當理解為屬於本發明的保護範圍。從原理上講，地中海貧血突變螢光定量PCR檢測試劑盒是採用螢光定量PCR方法對地中海貧血基因突變進行檢測。針對地中海貧血基因突變位點分別特異設計野生型TaqMan探針和突變型TaqMan探針各一對，當遇到野生型核苷酸序列時，野生型TaqMan探針能與之完全結合，在PCR擴增過程中發出相應螢光信號而被檢測到；而當遇到突變型核苷酸序列時，突變型TaqMan探針可與之完全結合，螢光報告基團因酶解分離而發出螢光，能夠實時檢測相應螢光信號的積累，從而實現檢測地中海貧血基因相應位點突變狀態的目的。本發明提供的兩端都標有突光發光基團的特異性突光探針，在探針完整時，兩基團在空間結構上距離相互靠近，5'端報告基團發出的螢光因為螢光共振能量轉移(FRET)而被3'端淬滅基團淬滅，所以體系中沒有螢光信號的變化。而一旦它與突變後的模板特異性的結合，其結合位點在兩條引物之間，隨著引物的延伸，Taq DNA聚合酶在鏈延伸過程中遇到與模板相結合的探針，其5' -3'外切酶活性就會將探針切斷，螢光報告基團遠離螢光淬滅基團，這樣就破壞了兩螢光基團之間的FRET，報告基團所釋放出來的螢光就可以被內置在定量檢測儀內的螢光計檢測到。PCR每經過一個循環，螢光信號也和目的片段一樣，有一個同步指數增長的過程，螢光信號的強弱就代表了模板DNA的拷貝數的多少。因此本發明不僅可用於簡單的定性檢測，亦可用做突變樣本具體含量的定量檢測。相比於現有檢測方法，本發明採用螢光定量PCR技術檢測β -地中海貧血基因的突變具有以下優勢I、檢測靈敏度高，特異性好本發明針對野生型和突變型位點分別設計了兩條特異性螢光探針，提高檢測敏感性和特異性，假陽性低。2、線性關係好，可定量檢測，由於螢光信號的強弱與模板擴增產物的對數呈線性關係，通過螢光信號的檢測對樣品初始模板濃度進行定量，誤差小，目前的其他檢測方法只能進行定性檢測，而FQ-PCR可以實現真正的定量檢測。3、本技術對標本DNA獲取的質量要求較低，無論是石蠟組織還是新鮮組織，都能取得理想的檢測結果，PCR-ASO、RDB法等對標本的要求均較高，往往須經歷多個繁瑣的處理步驟。4、檢測時間短，從標本送檢到得出結果可在12個小時以內完成；而且，沒有後處理，不用雜交、電泳、拍照。5、操作簡單，自動化程度高，FQ-PCR技術對PCR產物的擴增和檢測在閉管的情況下一步完成，不需要開蓋，交叉汙染和汙染環境機會少，因此也就降低了結果偏差的機率。6、結果判讀明確、直觀；若需要亦可對結果進行定量分析。直接測序法結果的判讀需將測序峰形圖人工讀出序列，再將所讀出的序列結合基因庫中的原始序列一起分析，從而得到結果，螢光定量PCR法結果的判讀在域值線以上有擴增曲線的標本均為陽性標本，結果判讀非常簡單，直觀。7、檢測的樣本量大，通過高通量PCR儀，一次最多可檢測384例。
8、安全整個體系中不包含有毒有害物質，對操作員和環境都無危害。


圖I是螢光定量PCR檢測β -珠蛋白基因第41/42位胺基酸對應的鹼基缺失突變(⑶41-42缺失突變)的擴增曲線圖；圖2是通過直接測序法檢測β -珠蛋白基因第41/42位胺基酸對應的鹼基缺失突變(CD41-42缺失突變)的結果圖；圖3是螢光定量PCR檢測珠蛋白基因第二個內含子的第654位鹼基突變(IVS-11-654 (C — Τ)的擴增曲線圖；圖4是通過直接測序法檢測β -珠蛋白基因第二個內含子的第654位鹼基突變(IVS-11-654 (C - Τ)的結果圖；圖5是螢光定量PCR檢測珠蛋白基因第17位胺基酸對應的鹼基突變(CD17(A — T))的擴增曲線圖；圖6是通過直接測序法檢測β_珠蛋白基因第17位胺基酸對應的鹼基突變(CD17(A — T))的結果圖；圖7是螢光定量PCR檢測珠蛋白基因啟動子上遊第28位鹼基突變(TATA boxnt-28 (A — G))的擴增曲線圖；圖8是通過直接測序法檢測β -珠蛋白基因啟動子上遊第28位鹼基突變(ΤΑΤΑbox nt-28 (A — G))的結果圖；圖9是螢光定量PCR檢測珠蛋白基因第71/72位胺基酸對應的鹼基突變(CD71-72(+A))的擴增曲線圖；圖10是通過直接測序法檢測β -珠蛋白基因第71/72位胺基酸對應的鹼基突變(CD71-72(+A))的結果圖；圖11是螢光定量PCR檢測珠蛋白基因第一個內含子的第5位鹼基突變(IVS-I-5 (G — C))的擴增曲線圖；圖12是通過直接測序法檢測β_珠蛋白基因第一個內含子的第5位鹼基突變(IVS-I_5(G —C))的結果圖；圖13是螢光定量PCR檢測β_珠蛋白基因突變陰性樣品的擴增曲線圖。
具體實施例方式為使本發明更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。樣本說明下來實施例中所用陽性樣本收集自中山大學附屬腫瘤醫院病理科臨床病理診斷為β_地中海貧血特定位點突變的蠟塊組織。從蠟塊中提取基因組DNA供以下的實驗應用。實施例I : β -珠蛋白基因第41/42位胺基酸對應的鹼基缺失突變(⑶41_42缺失突變)的檢測樣本說明陽性樣本收集自中山大學附屬腫瘤醫院病理科臨床病理診斷為β_地中海貧血特定位點突變的蠟塊組織。從蠟塊中提取基因組DNA供以下的實驗應 用。設計能特異性檢測β -珠蛋白基因第41/42位胺基酸對應的鹼基缺失的探針及公用引物各一對其中，PCR正向引物的序列如SEQ ID NO: I所示，PCR反向引物的序列如SEQ IDNO:2所示Al :5，-CATAACAGCATCAGGAGTGGACAG-3，(SEQ ID NO:I);A2 :5， -ACTGACTCTCTCTGCCTATTGGTCTATT-3』 (SEQ ID NO:2);突光探針為A3 :5，-HEX-AGGACTCAAAGAACCT-MGB-3』(SEQ ID NO:3);A4 :5』 -FAM-AAGGACTCAACCTCT-MGB-3』(SEQ ID NO:4);其中，檢測野生型β_珠蛋白基因第41/42位胺基酸對應鹼基的探針A3 5』-HEX-AGGACTCAAAGAACCT-MGB-3』 (SEQ ID NO: 3)，檢測 β -珠蛋白基因第 41/42 位胺基酸對應的鹼基缺失的探針 Α4 :5』-FAM-AAGGACTCAACCTCT-MGB-3』 (SEQ ID Ν0:4)，螢光探針SEQ ID Ν0:3的5'端標記HEX螢光報告基團，3』端標記MGB螢光淬滅基團；螢光探針SEQ ID Ν0:4的5'端標記FAM螢光報告基團，3』端標記MGB螢光淬滅基團。然後優化反應體系進行FQ-PCR的檢測反應體系為15 μ I,正、反引物各O. 15 μ I(20μΜ)，探針各 O. 2μ I (20 μ Μ)，樣品模板 DNA 2· 5 μ I (100_300ng/μ I)，2*Taqmanuniversal PCR Master Mix (購自美國應用生物公司)7. 5 μ 1，ddH20 4. 3 μ L· PCR 反應條件95°C預變性30sec ;並按95°C 5秒，64°C 33秒，擴增反應45個循環。。同時在螢光定量試驗中，需要檢測樣品的同時，還需要設置樣品參考品，以確定試驗的有效性，當所述螢光探針包括如SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4—種或者兩種時，所述陽性對照品是存在β -珠蛋白基因第41/42位胺基酸對應的鹼基缺失突變的質粒DNA。如圖I所示，左邊灰色曲線為CD41-42突變型樣本對應檢測孔螢光定量PCR擴增曲線，右邊黑色曲線為CD41-42突變型樣本非對應檢測孔的螢光定量PCR擴增曲線，即正常和突變基因均有檢出，因此樣本為雜合突變型。另外，將上述實施例I中的樣品進行測序驗證，發現在本實施例中由上述螢光定量檢測試驗檢測出β_珠蛋白基因第41/42位胺基酸對應的鹼基缺失突變的樣本。如圖2所示，通過測序結果可以看出確實在該位點發生相應的基因突變，其與螢光定量檢測試驗的結果完全一致。以此發現採用本發明的β_地中海貧血突變螢光定量PCR檢測試劑盒能夠準確地確定β -珠蛋白基因第41/42位胺基酸對應的鹼基缺失突變情況。實施例2 : β -珠蛋白基因第二個內含子的第654位鹼基突變(IVS-II-654(C —T))的檢測設計能特異性檢測β -珠蛋白基因第二個內含子的第654位鹼基突變的探針及公用引物各一對其中，PCR正向引物的序列如SEQ ID NO:5所示，PCR反向引物的序列如SEQ IDNO:6所示BI :5』 -TGGTAGCTGGATTGTAGCTGCTATTA-3』 (SEQ ID NO:5);B2:5』 -TTGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGA-3』 (SEQ ID NO:6)；
突光探針為B3 :5』 -HEX-TGCTATTGCCTTAACC-MGB-3』 (SEQ ID NO:7);B4 :5』 -FAM-TTGCTATTACCTTAACCC-MGB-3』(SEQ ID NO:8);其中，檢測野生型β -珠蛋白基因第二個內含子的第654位對應鹼基的探針Β3 5』-HEX-TGCTATTGCCTTAACC-MGB-3』 (SEQ ID N0:7)，檢測 β -珠蛋白基因第二個內含子的第 654 位鹼基突變的探針 Β4 :5』-FAM-TTGCTATTACCTTAACCC-MGB-3』 (SEQ ID N0:8)，螢光探針SEQ ID N0:7的5'端標記HEX螢光報告基團，3』端標記MGB螢光淬滅基團；螢光探針SEQ ID N0:8的5'端標記FAM螢光報告基團，3』端標記MGB螢光淬滅基團。然後優化反應體系進行FQ-PCR的檢測反應體系為15 μ I,正、反引物各O. 15 μ I(20μΜ)，探針各 O. 2μ I (20 μ Μ)，樣品模板 DNA 2· 5 μ I (100_300ng/μ I)，2*Taqmanuniversal PCR Master Mix (購自美國應用生物公司)7. 5 μ 1，ddH20 4. 3 μ L· PCR 反應條件95°C預變性30sec ;並按95°C 5秒，64°C 33秒，擴增反應45個循環。。同時在螢光定量試驗中，需要檢測樣品的同時，還需要設置樣品參考品，以確定試驗的有效性，當所述螢光探針包括如SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8—種或者兩種時，所述陽性對照品是存在β -珠蛋白基因第二個內含子的第654位對應的C — T鹼基突變的質粒DNA。如圖3所示，右邊灰色曲線為IVS-II_654(C — T)突變樣本對應檢測孔的螢光定量PCR擴增曲線，左邊黑色曲線為IVS-II-654(C —T)突變樣本非對應檢測孔的螢光定量PCR擴增曲線。另外，將上述實施例2中的樣品進行測序驗證，發現在本實施例中由上述螢光定量檢測試驗檢測出β_珠蛋白基因第二個內含子的第654位鹼基突變的樣本。如圖4所示，通過測序結果可以看出確實在該位點發生相應的基因突變，其與螢光定量檢測試驗的結果完全一致。以此發現採用本發明的β_地中海貧血突變螢光定量PCR檢測試劑盒能夠準確地確定β -珠蛋白基因第二個內含子的第654位鹼基突變情況。實施例3 β -珠蛋白基因第17位胺基酸對應的鹼基突變(⑶17 (Α — Τ))的檢測設計能特異性檢測β -珠蛋白基因第17位胺基酸對應的鹼基突變的探針及公用引物各一對PCR正向引物的序列如SEQ ID Ν0:9所示，PCR反向引物的序列如SEQ ID NO: 10所示Cl :5』 -CTCCTTAAACCTGTCTTGTAACCTTGATA-3』 (SEQ ID NO:9)；
C2:5』 -TGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTG-3』 (SEQ ID NO:10)；突光探針為C3 :5』 -HEX-CCACGTTCACCTTGCCCCACAG-TAMRA-3』 (SEQ ID NO:11)；C4 :5』 -FAM-CCACGTTCACCTAGCCCCACAGG-TAMRA-3』 (SEQ ID NO:12)；其中，檢測野生型珠蛋白基因第17位胺基酸對應鹼基的探針C3 :5』-HEX_CCACGTTCACCTTGCCCCACAG-TAMRA-3』(SEQ ID NO: 11)，檢測 β -珠蛋白基因第 17 位胺基酸對應的鹼基突變的探針 C4 :5』-FAM-CCACGTTCACCTAGCCCCACAGG-TAMRA-3』 (SEQ ID NO: 12)，螢光探針SEQ ID NO: 11的5'端標記HEX螢光報告基團，3』端標記TAMRA螢光淬滅基團；螢光探針SEQ ID NO: 12的Y端標記FAM螢光報告基團，3』端標記TAMRA螢光淬滅基團。然後優化反應體系進行FQ-PCR的檢測反應體系為15 μ I,正、反引物各O. 15 μ I(20μΜ)，探針各 O. 2μ I (20 μ Μ)，樣品模板 DNA 2· 5 μ I (100_300ng/μ I)，2*Taqman universal PCR Master Mix (購自美國應用生物公司)7. 5 μ 1，ddH20 4. 3 μ L· PCR 反應條件95°C預變性30sec ;並按95°C 5秒，64°C 33秒，擴增反應45個循環。。同時在螢光定量試驗中，需要檢測樣品的同時，還需要設置樣品參考品，以確定試驗的有效性，當所述螢光探針包括如SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12 —種或者兩種時，所述陽性對照品是存在β -珠蛋白基因第17位胺基酸對應的A — T鹼基突變的質粒DNA。如圖5所示，左邊灰色曲線為⑶17 (A —Τ)突變樣本對應檢測孔的螢光定量PCR擴增曲線，右邊黑色曲線為CD17 (Α — Τ)突變樣本非對應檢測孔的螢光定量PCR擴增曲線。另外，將上述實施例3中的樣品進行測序驗證，發現在本實施例中由上述螢光定量檢測試驗檢測出β_珠蛋白基因第17位胺基酸對應的鹼基突變的樣本。如圖6所示，通過測序結果可以看出確實在該位點發生相應的基因突變，其與螢光定量檢測試驗的結果完全一致。以此發現採用本發明的地中海貧血突變螢光定量PCR檢測試劑盒能夠準確地確定β -珠蛋白基因第17位胺基酸對應的鹼基突變情況。實施例4 :β-珠蛋白基因啟動子上遊第28位鹼基突變(TATA box nt_28(A —G))的檢測設計能特異性檢測β -珠蛋白基因啟動子上遊第28位鹼基突變的探針及公用引物各一對其中，PCR正向引物的序列如SEQ ID NO: 13所示，PCR反向引物的序列如SEQ IDNO: 14所示Dl :5，-GTGTCAGAAGCAAATGTAAGCAATAGAT-3，(SEQ ID NO:13)；D2:5， -TGTCATCACTTAGACCTCACCCTGT-3』 (SEQ ID NO:14)；突光探針為D3 :5，-HEX-TGCCCTGACTTTTATGCCCAGCC-TAMRA-3』 (SEQ ID NO:15)；D4 :5』 -FAM-TGCCCTGACTTCTATGCCCAGCC-TAMRA-3』 (SEQ ID NO:16)；檢測野生型β -珠蛋白基因啟動子上遊第28位鹼基的探針D3 :5』-HEX-TGCCCTGACTTTTATGCCCAGCC-TAMRA-3』(SEQ ID NO: 15)，檢測β -珠蛋白基因啟動子上遊第28位鹼基突變的探針 D4 :5』-FAM-TGCCCTGACTTCTATGCCCAGCC-TAMRA-3』 (SEQ ID NO: 16)，螢光探針SEQ ID NO: 15的5'端標記HEX螢光報告基團，3』端標記TAMRA螢光淬滅基團；螢光探針SEQ ID NO: 16的Y端標記FAM螢光報告基團，3』端標記TAMRA螢光淬滅基團。
然後優化反應體系進行FQ-PCR的檢測反應體系為15 μ I,正、反引物各O. 15 μ I(20μΜ)，探針各 O. 2μ I (20 μ Μ)，樣品模板 DNA 2· 5 μ I (100_300ng/μ I)，2*Taqmanuniversal PCR Master Mix (購自美國應用生物公司)7. 5 μ 1，ddH20 4. 3 μ L· PCR 反應條件95°C預變性30sec ;並按95°C 5秒，64°C 33秒，擴增反應45個循環。。同時在螢光定量試驗中，需要檢測樣品的同時，還需要設置樣品參考品，以確定試驗的有效性，當所述螢光探針包括如SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 16—種或者兩種時，β-珠蛋白基因啟動子上遊第28位對應的A — G鹼基突變的質粒DNA。如圖7所示，左邊灰色曲線為TATA box nt-28 (A — G)突變樣本對應檢測孔螢光定量PCR擴增曲線，右邊黑色曲線為TATA box nt-28 (A - G)突變樣本非對應檢測孔的螢光定量PCR擴增曲線。另外，將上述實施例4中的樣品進行測序驗證，發現在本實施例中由上述螢光定量檢測試驗檢測出β_珠蛋白基因啟動子上遊第28位鹼基突變的樣本。如圖8所示，通過 測序結果可以看出確實在該位點發生相應的基因突變，其與螢光定量檢測試驗的結果完全一致。以此發現採用本發明的β_地中海貧血突變螢光定量PCR檢測試劑盒能夠準確地確定β -珠蛋白基因啟動子上遊第28位鹼基突變情況。實施例5 β -珠蛋白基因第71/72位胺基酸對應的鹼基突變(⑶71_72 (+Α))的檢測設計能特異性檢測β -珠蛋白基因第71/72位胺基酸對應的鹼基突變的探針及公用引物各一對其中，PCR正向引物的序列如SEQ ID NO: 17所示，PCR反向引物的序列如SEQ IDNO: 18所示El :5，-GCCCTTGAGGTTGTCCAGGT-3，(SEQ ID NO:17)；E2:5， -TATGGGCAACCCTAAGGTGAAG-3， (SEQ ID NO:18)；突光探針為E3 :5，-HEX-CAGGCCATCACTAAAGGCACCGAG-TAMRA-3』 (SEQ ID NO:19)；E4 :5』 -FAM-CAGGCCATCACTTAAAGGCACCGA - TAMRA-3』 (SEQ ID NO:20)；檢測野生型β -珠蛋白基因第71/72位胺基酸對應鹼基的探針Ε3 :5』-HEX-CAGGCCATCACTAAAGGCACCGAG-TAMRA-3』(SEQ ID NO: 19)，檢測 β -珠蛋白基因第71/72位胺基酸對應的鹼基突變的探針 Ε4 :5』-FAM-CAGGCCATCACTTAAAGGCACCGA-TAMRA-3』 (SEQ ID NO:20)，螢光探針SEQ ID NO: 19的5'端標記HEX螢光報告基團，3』端均記TAMRA螢光淬滅基團；螢光探針SEQ ID N0:20的Y端標記FAM螢光報告基團，3』端標記TAMRA螢光淬滅基團。然後優化反應體系進行FQ-PCR的檢測反應體系為15 μ I,正、反引物各O. 15 μ I(20μΜ)，探針各 O. 2μ I (20 μ Μ)，樣品模板 DNA 2· 5 μ I (100_300ng/μ I)，2*Taqmanuniversal PCR Master Mix (購自美國應用生物公司)7. 5 μ 1，ddH20 4. 3 μ L· PCR 反應條件95°C預變性30sec ;並按95°C 5秒，64°C 33秒，擴增反應45個循環。同時在螢光定量試驗中，需要檢測樣品的同時，還需要設置樣品參考品，以確定試驗的有效性，當所述螢光探針包括如SEQ ID N0:19和SEQ ID NO:20—種或者兩種時，β-珠蛋白基因第71/72位胺基酸對應的+A鹼基插入突變的質粒DNA。如圖9所示，右邊藍色曲線為⑶71-72 (+Α)突變樣本對應檢測孔的螢光定量PCR擴增曲線，左邊黑色曲線為CD71-72(+A)突變樣本非對應檢測孔的螢光定量PCR擴增曲線。另外，將上述實施例5中的樣品進行測序驗證，發現在本實施例中由上述螢光定量檢測試驗檢測出β_珠蛋白基因第71/72位胺基酸對應的鹼基突變的樣本。如圖10所示，通過測序結果可以看出確實在該位點發生相應的基因突變，其與螢光定量檢測試驗的結果完全一致。以此發現採用本發明的β_地中海貧血突變螢光定量PCR檢測試劑盒能夠準確地確定β -珠蛋白基因第71/72位胺基酸對應的鹼基突變情況。實施例6 : β -珠蛋白基因第一個內含子的第5位鹼基突變(IVS-I_5(G — C))的檢測設計能特異性檢測β_珠蛋白基因第一個內含子的第5位鹼基突變的探針及公用引物各一對
其中，PCR正向引物的序列如SEQ ID Ν0:21所示，PCR反向引物的序列如SEQ IDNO:22所示Fl :5』 -TGTCTCCACATGCCCAGTTTC-3』 (SEQ ID NO:21)；F2:5』 -CCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTA-3』 (SEQ ID NO:22)。突光探針為F3 :5』 -HEX-CCTTGATACCAACCTG-MGB-3』 (SEQ ID NO:23)；F4 :5』 -FAM-CCTTGATAGCAACCTG-MGB-3』(SEQ ID NO:24)。檢測野生型β -珠蛋白基因第一個內含子的第5位鹼基的探針F3 :5』 -HEX-CCTTGATACCAACCTG-MGB-3』 (SEQ ID N0:23)，檢測 β -珠蛋白基因第一個內含子的第 5 位鹼基突變的探針 F4 :5』-FAM-CCTTGATAGCAACCTG-MGB-3』 (SEQ ID NO: 24)，螢光探針SEQ ID NO:23的5'端標記HEX螢光報告基團，3』端標記MGB螢光淬滅基團；螢光探針SEQ ID NO: 24的5'端標記FAM螢光報告基團，3』端標記MGB螢光淬滅基團。然後優化反應體系進行FQ-PCR的檢測反應體系為15 μ I,正、反引物各O. 15 μ I(20μΜ)，探針各 O. 2μ I (20 μ Μ)，樣品模板 DNA 2· 5 μ I (100_300ng/μ I)，2*Taqmanuniversal PCR Master Mix (購自美國應用生物公司)7. 5 μ 1，ddH20 4. 3 μ L· PCR 反應條件95°C預變性30sec ;並按95°C 5秒，64°C 33秒，擴增反應45個循環。同時在螢光定量試驗中，需要檢測樣品的同時，還需要設置樣品參考品，以確定試驗的有效性，當所述螢光探針包括如SEQ ID N0:23和SEQ ID NO:24—種或者兩種時，β-珠蛋白基因第一個內含子的第5位對應的G — C鹼基突變的質粒DNA。如圖11所示，左邊灰色曲線為IVS-I_5(G — C)突變樣本對應檢測孔的螢光定量PCR擴增曲線，右邊黑色曲線為IVS-I-5(G —C)突變樣本非對應檢測孔的螢光定量PCR擴增曲線。另外，將上述實施例6中的樣品進行測序驗證，發現在本實施例中由上述螢光定量檢測試驗檢測出β_珠蛋白基因第一個內含子的第5位鹼基突變的樣本。如圖12所示，通過測序結果可以看出確實在該位點發生相應的基因突變，其與螢光定量檢測試驗的結果完全一致。以此發現採用本發明的β_地中海貧血突變螢光定量PCR檢測試劑盒能夠準確地確定β-珠蛋白基因第一個內含子的第5位鹼基突變情況。實施例7 陰性樣品的檢測分別用實施例1-6中的反應液對陰性樣品進行螢光，定量PCR檢測，檢測結果如圖7所示，右邊藍色六條曲線為樣本對應檢測孔的螢光定量PCR擴增曲線，左邊六條黑色曲線為樣本非對應檢測孔的螢光定量PCR擴增曲線。從檢查結果可以看出，樣本中未檢出CD41-42、IVS-II-654(C — T)、CD17(A — Τ)、TATA box nt-28 (A — G)、CD71_72(+A)、IVS-I-5 (G — C) 6 種突變基因型中的任何一種，可確定為地中海貧血陰性。最後所應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非對本發明保護範圍的限制，儘管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當 理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和範圍。
權利要求
1.ー種β-地中海貧血突變螢光定量PCR檢測試劑盒，其特徵在於，包括PCR混合反應液、陽性對照品和用於檢測β -地中海貧血突變基因型的螢光探針，所述PCR混合反應液中包含擴增突變位點所處基因區段的PCR引物。
2.根據權利要求I所述的β_地中海貧血突變螢光定量PCR檢測試劑盒，其特徵在幹，所述突變位點包括β -珠蛋白基因第41/42位胺基酸對應的鹼基缺失突變、β -珠蛋白基因第二個內含子的第654位對應的C — T鹼基突變、β -珠蛋白基因第17位胺基酸對應的A-T鹼基突變、β -珠蛋白基因啟動子上遊第28位對應的A — G鹼基突變、β -珠蛋白基因第71/72位胺基酸對應的+A鹼基插入突變、β -珠蛋白基因第一個內含子的第5位對應的G — C鹼基突變中的至少ー種。
3.根據權利要求I所述的β_地中海貧血突變螢光定量PCR檢測試劑盒，其特徵在幹，所述PCR引物包括以下兩組引物對中的至少ー組 針對珠蛋白基因第41/42位胺基酸對應的突變位點所處區域的引物對，其PCR正向引物的序列如SEQ ID NO: I所示，PCR反向引物的序列如SEQ ID Ν0:2所示; 針對β_珠蛋白基因第二個內含子的第654位對應的突變位點所處區域的引物對，其PCR正向引物的序列如SEQ ID Ν0:5所示，PCR反向引物的序列如SEQ ID Ν0:6所示; 針對β -珠蛋白基因啟動子上遊第28位對應的突變位點所處區域的引物對，其PCR正向引物的序列如SEQ ID Ν0:9所示，PCR反向引物的序列如SEQ ID Ν0:10所示; 針對珠蛋白基因第17位胺基酸對應的突變位點所處區域的引物對，其PCR正向引物的序列如SEQ ID NO: 13所示，PCR反向引物的序列如SEQ ID NO: 14所示； 針對β -珠蛋白基因第71/72位胺基酸對應的突變位點所處區域的引物對，其PCR正向引物的序列如SEQ ID NO: 17所示，PCR反向引物的序列如SEQ ID NO: 18所示; 針對β -珠蛋白基因第一個內含子的第5位對應的突變位點所處區域的引物對，其PCR正向引物的序列如SEQ ID NO:21所示，PCR反向引物的序列如SEQ ID NO:22所示。
4.根據權利要求I所述的β-地中海貧血突變螢光定量PCR檢測試劑盒，其特徵在於，所述螢光探針包括如 SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO: IUSEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 16,SEQ ID NO: 19,SEQ ID NO:20,SEQ IDΝΟ:23和SEQ ID ΝΟ:24所示的核苷酸序列中的至少ー種。
5.根據權利要求4所述的β-地中海貧血突變螢光定量PCR檢測試劑盒，其特徵在幹，所述螢光探針包括以下探針組合中的至少ー組 檢測β_珠蛋白基因第41/42位胺基酸對應的突變位點和對應區域的野生型基因的探針組合 SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4 ； 檢測β -珠蛋白基因第二個內含子的第654位對應的突變位點和對應區域的野生型基因的探針組合SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8 ； 檢測β -珠蛋白基因啟動子上遊第28位對應的突變位點和對應區域的野生型基因的探針組合 SEQ ID SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12 ； 檢測β_珠蛋白基因第17位胺基酸對應的突變位點和對應區域的野生型基因的探針組合 SEQ ID NO: 15 和 SEQ ID NO: 16 ； 檢測β-珠蛋白基因第71/72位胺基酸對應的突變位點和對應區域的野生型基因的探針組合 SEQ ID NO: 19 和 SEQ ID NO:20 ；檢測β-珠蛋白基因第一個內含子的第5位對應的突變位點和對應區域的野生型基因的探針組合 SEQ ID NO:23 和 SEQ ID NO:24。
6.根據權利要求4所述的β-地中海貧血突變螢光定量PCR檢測試劑盒，其特徵在幹，所述陽性對照品為存在珠蛋白基因突變的質粒DNA，β-珠蛋白的基因突變位點包括β -珠蛋白基因第41/42位胺基酸對應的鹼基缺失突變、珠蛋白基因第二個內含子的第654位對應的C — T鹼基突變、β -珠蛋白基因第17位胺基酸對應的A — T鹼基突變、β -珠蛋白基因啟動子上遊第28位對應的A — G鹼基突變、β -珠蛋白基因第71/72位胺基酸對應的+A鹼基插入突變、β -珠蛋白基因第一個內含子的第5位對應的G — C鹼基突變中的至少ー種。
7.根據權利要求5所述的β-地中海貧血突變螢光定量PCR檢測試劑盒，其特徵在幹 當所述螢光探針包括如SEQ ID Ν0:3和SEQ ID NO:4 —種或者兩種時，所述陽性對照品是存在β -珠蛋白基因第41/42位胺基酸對應的鹼基缺失突變的質粒DNA ； 當所述螢光探針包括如SEQ ID Ν0:7和SEQ ID NO:8 —種或者兩種時，所述陽性對照品是存在β -珠蛋白基因第二個內含子的第654位對應的C — T鹼基突變的質粒DNA ；當所述螢光探針包括如SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12 —種或者兩種時，所述陽性對照品是存在β -珠蛋白基因第17位胺基酸對應的A — T鹼基突變的質粒DNA ； 當所述螢光探針包括如SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 16—種或者兩種時，β-珠蛋白基因啟動子上遊第28位對應的A — G鹼基突變的質粒DNA ； 當所述螢光探針包括如SEQ ID Ν0:19和SEQ ID NO: 20—種或者兩種時，β-珠蛋白基因第71/72位胺基酸對應的+A鹼基插入突變的質粒DNA ； 當所述螢光探針包括如SEQ ID ΝΟ:23和SEQ ID NO:24—種或者兩種時，β-珠蛋白基因第一個內含子的第5位對應的G — C鹼基突變的質粒DNA。
8.根據權利要求I所述的β_地中海貧血突變螢光定量PCR檢測試劑盒，其特徵在幹，所述螢光探針的5』端標記有螢光報告基團，螢光探針的3』端標記有螢光猝滅基團。
全文摘要
一種β-地中海貧血突變螢光定量PCR檢測試劑盒，包括PCR混合反應液、陽性對照品和用於檢測β-地中海貧血突變基因型的螢光探針，PCR混合反應液中包含擴增突變位點所處基因區段的PCR引物。突變位點為β-珠蛋白基因第41/42位胺基酸對應的鹼基缺失突變、β-珠蛋白基因第二個內含子的第654位對應的C→T鹼基突變、β-珠蛋白基因第17位胺基酸對應的A→T鹼基突變、β-珠蛋白基因啟動子上遊第28位對應的A→G鹼基突變、β-珠蛋白基因第71/72位胺基酸對應的+A鹼基插入突變、β-珠蛋白基因第一個內含子的第5位對應的G→C鹼基突變中的至少一種。本發明的方案能夠快速、準確、高敏感度地檢測β-地中海貧血基因的突變情況，尤其是針對中國人常見的6種β-地中海貧血基因特定位點突變。
文檔編號C12Q1/68GK102851366SQ20121032040
公開日2013年1月2日 申請日期2012年8月31日 優先權日2012年8月31日
發明者邵琦 申請人:廣州達健生物科技有限公司