Tau蛋白病治療用疫苗的製作方法

2023-04-24 22:25:06

專利名稱：Tau蛋白病治療用疫苗的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種表達可以用於Tau蛋白病(tauopathy)的預防或治療的突變體Tau蛋白的載體及該載體作為醫藥品的用途。
背景技術：
Tau(tau)蛋白質是在正常腦內以結合於細胞內的微管的狀態存在的可溶性的磷酸化蛋白質，有助於微管的聚合促進和穩定化，並且在重複進行與微管的結合和解離時保持平衡狀態。該平衡狀態因磷酸化/脫磷酸化酶異常等崩潰時，細胞質中的游離Tau蛋白增加，並導致聚集或纖維化。在以阿爾茨海默氏病或額顳葉型痴呆症為主的高齡者的痴呆症的大多數中，將其中不一定伴隨澱粉樣蛋白的積累的Tau蛋白聚集體的積累被認為是特徵性的病變的神經變性疾病總稱為Tau蛋白病(非專利文獻I)。在我國，在65歲以上高齡者中約7%被認為是痴呆症，加上輕度痴呆症達到約 10%。其中7成被認為是Tau蛋白病型痴呆症，患者數約為200萬人。關於痴呆症的研究開發迄今為止先施行對P澱粉樣蛋白(AP)蛋白的研究，通過P澱粉樣蛋白的肽免疫進行臨床試驗，但在試驗中途，接種患者的6%發生脊髓腦膜炎，因此試驗中止(非專利文獻2)。雖然該試驗中止，但根據對疫苗接種後引起腦炎並康復、隨後因其它疾病而死亡的患者的病例報告，確認疫苗接種具有消除老人斑或神經變性突起的效果(非專利文獻3)。另夕卜，根據對疫苗接種患者的後續的隨訪，在疫苗接種後，疾病甚至在通過屍檢確認老人斑消失的患者中進展，暗示該疫苗不具有對疾病進展的預防效果(非專利文獻4)。另外，在迄今為止的研究中也得知，對由P澱粉樣蛋白的抗體引起的被動免疫是有效的，但關於抑制疾病進展的效果不明顯(非專利文獻5)。而且，也驗證了在腺伴隨病毒(AAV)載體上搭載有P澱粉樣蛋白的口服疫苗的效果。在小鼠的實驗中，雖然觀察到該AAV載體的口服施用具有對經由腸管黏膜的P澱粉樣蛋白產生抗體的效果、學習功能改善的效果(非專利文獻6)，但在其後的猴的實驗中，可以確認老人斑的減少，卻不能確認明確的病情進展的抑制效果。與此相對，關於Tau蛋白，以前沒有作為阿爾茨海默氏病等的治療的目標被重視，近年來，Tau蛋白替代P澱粉樣蛋白作為阿爾茨海默氏的治療藥的目標，正在成為伴有Tau蛋白過量積累的Tau蛋白病的治療及疫苗的目標(非專利文獻7)。作為與本發明有關的治療劑，雖然報導有在腺伴隨病毒上搭載有編碼P澱粉樣蛋白的基因的阿爾茨海默氏病治療劑(專利文獻1、2、非專利文獻8)、通過Tau蛋白的接種治療阿爾茨海默氏病及Tau蛋白病的方法(專利文獻3、非專利文獻9)等，但在Tau蛋白接種的Tau蛋白病模型小鼠中確認有協調運動/運動學習的改善效果，卻在社交性的缺乏、記憶力下降的痴呆症患者中，沒有確認有被看作特徵性的症狀的改善效果。現有技術文獻專利文獻I :日本特表2008-536476專利文獻2 :日本特開2005-021149
專利文獻 3 US2008/0050383A非專利文獻I :齊藤裕子，臨床檢查，Vol. 50，No. 10，p. 1121-1129(2006)(日本)非專利文獻2 0rgogozo, J. M. et al. , Neurology, 61 :46-54(2003)非專利文獻3 :Nicoll, J. A. et al. , Nature Medicine, 9 :448-452 (2003)非專利文獻4 Holmes, C. et al.，Lancet, 372 :216-223(2008)非專利文獻5 :松岡康治，實驗醫學，Vol. 26，No. 16，p. 2572-2576 (2008)(日本)非專利文獻6 :田平武，老年精神醫學雜誌第20卷增刊號，p. 68-74(2009)(日本)非專利文獻7 Martin-Jones, Z and Lasagna-Reeves, C. , Alzheimer Disease Associate Disorder,22(2) :111(2008)非專利文獻8 Mouri, A. et al.，The FASEB Journal, 21 :2135-2148(2007)非專利文獻9 Asuni, A. A. et al. , J. Neurosci. ,27 :9115-9129(2007)發明概述本發明的目的在於提供一種Tau蛋白病、尤其是Tau蛋白病型痴呆症的預防或治療用疫苗。本發明人等發現，通過使用Tau蛋白病模型小鼠的試驗，確認含有編碼突變體Tau蛋白的核酸的載體與該蛋白質相比具有長期的持續的抗體誘導作用，而且，該載體具有Tau蛋白病、尤其是Tau蛋白病型痴呆症的顯著的改善作用，從而完成了本發明。因此，本發明概括為包含以下的特徵。本發明在其第I方面中提供一種Tau蛋白病的預防或治療用疫苗，該疫苗，其是含含有編碼連接於分泌信號序列的突變體Tau蛋白的核酸的載體作為有效成分，其中，該突變體Tau蛋白包含在Tau蛋白的胺基酸序列中對應於選自由序列號I的257位、260位、266位、272 位、279 位、280 位、284 位、296 位、301 位、303 位、305 位、315 位、317 位、320 位、335位、336位、337位、342位、352位、369位、389位及406位構成的組中的至少I個位置的位置的胺基酸殘基的突變，並且與突變體Tau蛋白的直接施用相比，該載體在受試者中可以更持續地誘導對Tau蛋白(任選地磷酸化的)的抗體。在該實施方式中，所述突變為選自由K257T、I260V、L266V、G272V、N279K、K280 A、L284L、N296 A、N296H、P301L、P301S、P301T、G303V、S305N、L315R、K317M、S320F、G335S、6335￥、03361 、￥337]\^342￥、53521、1(3691、63891 及1 4061(在此，A 為缺失)構成的組中的至少I種突變。在其它的實施方式中，所述突變為至少包含P301L、P301S或P301T的突變。在其它的實施方式中，所述分泌信號序列為澱粉樣前體蛋白信號序列或CD59分泌信號序列。在其它的實施方式中，所述載體為仙臺病毒載體。在其它的實施方式中，所述載體為質粒載體。 在其它的實施方式中，所述疫苗被配製為用於鼻內施用。在其它的實施方式中，所述疫苗具有改善Tau蛋白病型痴呆症的作用。在其它的實施方式中，所述疫苗在受試者中具有改善記憶力下降和/或社會行為異常、焦慮行為異常及記憶障礙的至少I種症狀的作用。在其它的實施方式中，所述疫苗具有將受試者的腦內的小神經膠質細胞進行活化、由此抑制突變體Tau蛋白的積累的作用。在其它的實施方式中，Tau蛋白(包含突變體Tau蛋白)是任選地磷酸化的。本發明的疫苗對於有Tau蛋白病的受試者，具有改善痴呆症的記憶カ下降和/或社會行為異常和/或焦慮行為異常和/或記憶障礙的顯著的效果，尤其具有在現有的疫苗中無效的、抑制(或延遲)Tau蛋白病的症狀進展的作用。本說明書包含在作為本申請的優先權的基礎的日本專利申請2010-3424號的說明書和/或附圖中所記載的內容。附圖簡述圖I表示通過搭載GFP的F基因缺失型仙臺病毒載體(Sev-GFP)的經鼻施用對於Tau蛋白病模型小鼠(P301S Tau轉基因小鼠)的感染效率的研究結果。用多功能顯微鏡(BZ-9000, Keyence)進行螢光成像(A)和亮視場像(B)的拍攝，對Sev-GFP接種小鼠的腦進行GFP表達分析。圖2表示對Tau蛋白病模型小鼠接種搭載Tau蛋白的F基因缺失型仙臺病毒載體(Sev-TauP301S)並進行關於磷酸化Tau蛋白表達抑制效果的分析的結果。作為對照，使用Sev-GFP (在此，GFP表示編碼綠色螢光蛋白的核酸)。在接種後第5個月，在小鼠海馬冠狀剖面上通過抗磷酸化Tau蛋白抗體(AT8, Innogenetics)進行免疫染色。箭頭表示Tau病變。免疫染色後，用多功能顯微鏡(BZ-9000，Keyence)附屬分析軟體測定在海馬CA3區域內積累的區域的面積。對於Sev-GFP接種組、SeV-TauP301S接種組，分別用學生t檢驗進行平均值土標準誤差、統計學的分析。圖3的(A)表示在野生型小鼠(Non-Tg)或Tau蛋白病模型小鼠(Tg)上經鼻接種Sev-TauP301S或Sev_GFP、用蛋白質印跡法評價接種5個月後整個海馬中的磷酸化Tau蛋白(pTAU)的積累的結果。而且,就蛋白量而言，(B)表示用圖像分析軟體(NIH Image,Ver. I. 63,NIH,US)測定條帶的信號強度、取得作為內部對照蛋白的￠-肌動蛋白和信號強度之比並定量化的結果。對於Sev-GFP接種組、SeV-TauP301S接種組，分別用學生t檢驗進行平均值土標準誤差、統計學的分析。用於試驗的小鼠組及對照如下所述。Non-Tg/Sev-GFP :對野生型小鼠經鼻接種 Sev-GFP 的組，Non-Tg/Sev_TauP301S 對野生型小鼠經鼻接種Sev-TauP301S的組，Tg/Sev-GFP :對Tau蛋白病模型小鼠經鼻接種Sev-GFP的組，Tg/Sev-TauP301S :對Tau蛋白病模型小鼠經鼻接種Sev_tauP301S的組，-陰性對照(從野生型小鼠中提取的蛋白質)、+ :陽性對照(從不進行任何施用的tau蛋白病模型小鼠海馬中提取的蛋白質)。圖4的(a)表示對Tau蛋白病模型小鼠或野生型小鼠接種Sev_TauP301S後、採取血清並基於各自的小鼠的海馬組織(白盒部分)中的反應性對血清中與組織Tau反應的抗體的效價進行評價的結果。將施用Sev_TauP301S的小鼠的血清分別稀釋為30倍、100倍、300倍、1000倍、3000倍，在4°C下反應過夜，將作為2次抗體的Alexa546標記的抗小鼠IgG抗體在室溫下反應I小時。(b)表示作為對照、不便Tau蛋白病模型小鼠與抗體反應而進行免疫染色的結果。(C)表示對接種Sev-GFP或Se v_TauP301S的Tau蛋白病模型小鼠的血清中抗體效價用觀察到與組織的反應的最大稀釋倍率進行評價的結果。對Sev-GFP接種組、Sev-TauP301S接種組，分別由曼-惠特尼U檢驗進行平均值+/_標準誤差、統計學的分析。圖5表示對Sev_TauP301S接種引起的腦內的小神經膠質細胞的活化進行分析的結果。接種SeV-TauP301S，施用5個月後，使用識別接種小鼠的海馬的組織中的活化小神經膠質細胞的抗Ibal抗體進行免疫染色(A)。作為對照，接種Sev-GFP(B)。箭頭表示不與IgG共同存在的小神經膠質細胞。圖6表示對野生型小鼠或Tau蛋白病模型小鼠的Sev-GFP或SeV_TauP301S的接種引起的血清中的抗磷酸化Tau抗體的產生及腦脊髓液中磷酸化Tau蛋白的產生進行分析的結果。關於抗體產生的分析，使用接種Sev-GFP或SeV-TauP301S的小鼠的血清，進行以重組突變體Tau蛋白(TAUP301S)為抗原的ELISA。關於磷酸化Tau蛋白的產生，使用接種Sev-GFP或SeV_TauP301S的小鼠的腦脊髓液，進行與抗磷酸化Tau抗體(AT8抗體)的結合的ELISA。
(a)表示接種Sev-GFP或Sev_TauP301S後第5個月的血清中的對人P301S突變Tau蛋白的抗體效價。(b)表示接種Sev-GFP或Sev_TauP301S後第5個月的CSF中的磷酸化Tau的量。圖7的⑷表示對野生型小鼠或Tau蛋白病模型小鼠接種Sev-GFP或Sev_TauP301S、進行社會行為測定實驗(Social interaction test)的結果。在tau蛋白病患者中確認有許多社會行為的異常，因此，進行與社會行為有關的「Social interactiontest(社會行為測定實驗)」(在箱中放入2隻小鼠，測定10分鐘期間的接觸時間)。(B)進ー步根據Crawley’s Social Interaction test (記憶力及社會行為測定實驗)，通過測定在籠子的附近的停留時間來評估對最初見到的小鼠具有多大接近的興趣。圖8表示對野生型小鼠或Tau蛋白病模型小鼠接種Sev-GFP或Sev_TauP301S、進行了高架十字迷宮實驗(焦慮行為的實驗)的結果。在接種Sev-TauP301S或Sev-GFP的小鼠中，對從迷宮中心向4個方向的每ー個方向的總進入次數(A)、向沒有柵欄的方向的進入次數的比例(B)、小鼠的總移動距離(C)、在沒有柵欄的場所的停留時間的比例⑶觀察10分鐘，使用Image EP軟體自動地測量。就統計學的分析而言，單因素方差分析，事後比較檢驗用 Fisher 的 Protected Least Signicicant Difference (PLSD)法進行。圖9表示對野生型小鼠或Tau蛋白病模型小鼠接種重組Tau蛋白、進行了曠場實驗(用於測定活動量或情緒性的實驗)的結果。接種重組Tau蛋白(TAUP301S)，在接種後第一個月進行曠場實驗。關於接種小鼠的移動距離(A)、伸腰的次數(B)、在曠場中央的停留時間(C)、刻板行為(D)，觀察120分鐘的自由行為並進行評價。

圖10表示對野生型小鼠或Tau蛋白病模型小鼠接種重組Tau蛋白、進行了高架十字迷宮實驗(焦慮行為的實驗)的結果。將重組Tau蛋白(TAUP301S) IOOiig/只/次、每2周一次總計3次皮下施用接種的Tau蛋白病模型小鼠及野生型小鼠分別在迷宮中心的正方形的部分(5X5cm)以朝向閉合臂的方向的方式放置，記錄10分鐘行為。作為對照，接種Sev-GFP。使用Image EP軟體自動地測量從迷宮中央向4個方向的每ー個方向的總進入次數(A)、向沒有柵欄的方向的進入次數的比例(B)、小鼠的總移動距離(C)、在沒有柵欄的場所的停留時間的比例(D)。就統計學的分析而言，單因素方差分析，事後比較檢驗用Fisher的 Protected Least Signicicant Difference (PLSD)法進オ於。圖11表示對野生型小鼠或Tau蛋白病模型小鼠接種pcDNA3. l_CD59_TauP301S(ATG-)(以下為cDNA-Tau P301S)、進行曠場試驗的結果。接種cDNA-Tau P301S，在接種後第一個月進行曠場試驗。關於接種小鼠的移動距離(A)、伸腰的次數(B)、在曠場中央的停留時間(C)、刻板行為(D)，觀察120分鐘的自由行為並進行評價。圖12表示對野生型小鼠或Tau蛋白病模型小鼠接種cDNA_Tau P301S、進行社會行為測定實驗(Social interaction test)的結果。在Tau蛋白病患者中經常觀察到社會行為的異常，因此，進行與社會行為有關的「 Social interaction test (社會行為測定實驗)」(在箱中放入2隻小鼠，測定10分鐘期間的接觸時間)。圖13表示cDNA-Tau P301S的結構和插入序列(序列號12)。圖14的(a)表示對於P301S，Tau蛋白的最長同種型中的序列號中第301位 的胺基酸的突變。Sev/AF表示仙臺病毒的F基因缺失的情況。(b)表示澱粉樣前體蛋白(APP)信號序列從人突變體Tau蛋白(P301S，同種型1N4R)的N末端連接於缺失蛋氨酸的位點。C表示pcDNA3-APP-TauP301S中的插入序列(序列號13)。在此的APP信號序列用 NT_011512. 11、NW_001838706. I、NM_201414. I、NM_201413. I、NM_000484. 2、NM_001136130. 1、NM_001136129. I的登錄號碼註冊於序列資料庫。及P301S Tau的序列以用NM_001123067. 2的登錄號碼註冊於序列資料庫的序列為基礎加以突變。圖15的(A)表示對於接種Sev-GFP或Sev_TauP301S的野生型小鼠及Tau蛋白病模型小鼠的巴恩斯迷宮試驗(空間記憶)的結果。放入筒中，對小鼠進行蒙眼並固定在規定的位置，取下筒使其自由地行走，在正解的孔上安裝暗箱，使其記住暗箱的場所(訓練)。
(B):訓練後，記錄在卸下暗箱的孔(靶點)的周圍的停留時間(探測試驗)。測定在訓練期間至到達靶點的時間、在探測試驗中至到達靶點的時間、在各孔的周圍停留的時間。圖16表示對於接種Sev-GFP或Sev_TauP301S的野生型小鼠及Tau蛋白病模型小鼠的恐怖條件反射試驗(情景記憶)的結果。在箱中對小鼠使用聲音和電休克組合以對小鼠進行條件反射、再放入同一箱中，對引起的凍結(フリージング)(畏縮行為)的出現比例進行評價。圖17表示對於接種Sev-GFP或Sev_TauP301S的野生型小鼠及tau蛋白病模型小鼠的身體測定(體重(A)、體溫(B)、握力(C)、鋼絲繩懸掛實驗(D))的結果。圖18表示對於接種有Sev-GFP或Sev_TauP301S的野生型小鼠及Tau蛋白病模型小鼠的社會行為測定實驗(接觸的總持續時間(A)、接觸次數(B)、活躍接觸的總持續時間
(C)、接觸的持續時間的平均值(D)、總移動距離(E))的結果。圖19表示對於接種Sev-GFP或Sev_TauP301S的野生型小鼠及Tau蛋白病模型小鼠的前脈衝抑制試驗(驚愕反應(A)、前脈衝引起的驚愕反應的抑制效果(B))的結果。通過首先使其聽到弱的聲音、比較其後聽到大的聲音時的驚愕反應的抑制效果而進行評價。圖20表示對於接種Sev-GFP或Sev_TauP301S的野生型小鼠及Tau蛋白病模型小鼠的曠場實驗的結果。(A)表示總移動距離，(B)表示垂直方向的活動量，(C)表示在中心部的停留時間，(D)表示刻板行為次數。圖21表示對於野生型小鼠及Tau蛋白病模型小鼠的曠場實驗的結果。(A)表示總移動距離，(B)表示垂直方向的活動量，(C)表示在中心部的停留時間，(D)表示刻板行為次數。
圖22表示對於野生型小鼠及Tau蛋白病模型小鼠的高架十字迷宮實驗的結果。
(A)表示侵入於開放臂的數，(B)表示侵入於開放臂的比例，(C)表示移動距離，(D)表示停留在開放臂上的時間。圖23表示對於野生型小鼠及Tau蛋白病模型小鼠的前脈衝抑制試驗的結果。(A)表示由聲音的不同引起的驚愕反應的不同，(B)表示前脈衝抑制的比例(預先發出小的聲音、其後發出大的聲音時存在驚愕反應的抑制效果的比例)。圖24的⑷ ⑶4個月齡的Tau蛋白病模型小鼠，(E) ⑶4個月齡的野生型小鼠，(A)、(E):外側淡蒼白球，(B), (F):大腦皮質扁桃核、(C), (G):聽覺皮質，(CA3 ;D、H):腹側海馬。行為學的分析後的6個月齡的小鼠的分析，(I 、L):扣帶回皮質，(J，M) 大腦皮質扁桃核，(CA3 ;K，N):海馬。紅的染色部位表示磷酸化Tau，藍的染色部位表示細胞核。箭頭表示磷酸化Tau蛋白的積累，圓圈表示對血管的抗小鼠IgG抗體的非特異反應。圖25表示對於13周齡的野生型小鼠及Tau蛋白病模型小鼠的一般的身體測定的結果。(A)表示體重，(B)表示直腸溫度，(C)表示握力，(D)表示鋼絲繩懸掛實驗的結果。圖26表示社會行為測定實驗的結果。(A)表示接觸的繼續時間，(B)表示接觸次數，(C)表示活躍接觸的持續時間，(D)表示毎次接觸的平均持續時間，(E)表示實驗中的總移動距離。圖27表示對於野生型小鼠及Tau蛋白病模型小鼠的恐怖條件反射試驗(情景記憶)的結果。圖28表示對野生型小鼠及Tau蛋白病模型小鼠的巴恩斯迷宮試驗(空間記憶)的結果。(A) (C)表示訓練期間的分析結果，(D)表示訓練後的探測試驗的結果。發明的最佳實施方式對本發明進ー步詳細地進行說明。本發明的特徵在於，使用含有編碼突變體Tau蛋白的核酸的載體作為有效成分的疫苗用於Tau蛋白病的預防或治療。本說明書中使用的「Tau蛋白病」是指在中樞神經系統中磷酸化的Tau蛋白異常地積累、與神經障礙(神經變性等)有關的疾病群。 本說明書中使用的「核酸」是指DNA或RNA。本說明書中使用的「受試者」是指哺乳動物，優選靈長類，進ー步優選人。〈突變體Tau蛋白〉Tau蛋白為微管相關結合蛋白的I種，也稱為MAPT (microtubule-associatedprotein tau),存在通過Tau基因的選擇性剪接而產生的6種同種型，根據C末端側的微管結合位點的重複次數，分類為3次重複型Tau和4次重複型Tau(齊藤裕子，臨床檢查，Vol. 50，No. 10，p. 1121-1129(2006)(日本))。人MAPT存在於17號染色體上(NG_007398. I),例如轉錄變體(transcript variant) I 6 分別以註冊■號碼 NM_016835. 3、NM_005910. 4、NM_016834. 3、NM_016841. 3、NM_001123067. 2、NM_001123066. 2 註冊於序列資料庫(美國)。Tau蛋白可以是3次重複型Tau、4次重複型Tau的任ー種，尤其是眾所周知4次重複型Tau為在人腦中表達最多的同種型。「Tau蛋白」優選為人Tau蛋白。
本發明的突變體Tau蛋白包含在Tau蛋白的胺基酸序列中對應於選自由序列號I (NM_005910. 4 ;同種型 2N4R 型)的 257 位、260 位、266 位、272 位、279 位、280 位、284 位、296 位、301 位、303 位、305 位、315 位、317 位、320 位、335 位、336 位、337 位、342 位、352 位、369位、389位及406位構成的組中的至少I個位置的位置的胺基酸殘基的突變。優選的突變位置為在Tau蛋白的胺基酸序列中對應於序列號I的257位、260位、272位、279位、296位、301位、303位、305位、335位、337位、342位、369位、389位或406位的位置，更優選的突變位置為在Tau蛋白的胺基酸序列中對應於序列號I的至少301位的位置。該情況是指突變位置可以為僅對應於序列號I的301位的位置，或者，除對應於序列號I的301位的位置之外，可以含有對應於選自由上面指定的序列號I的257位、260位、266位、272位、279 位、280 位、284 位、296 位、303 位、305 位、315 位、317 位、320 位、335 位、336 位、337 位、342位、352位、369位、389位及406位構成的組中的至少I個位置的位置的胺基酸殘基的突變。所述突變為取代或缺失。取代的情況，Tau蛋白的所述位置的胺基酸殘基取代為其它胺基酸殘基、優選在自然突變體中被認定的胺基酸殘基的，這種取代的例子在序列號I的胺基酸序列中為 K257T、I260V、L266V、G272V、N279K、L284L、N296H、P301L、P301S、G303V、 S305N、L315R、K317M、S320F、G335S、G335V、Q336R、V337M、E342V、S352L、K369I、G389R 或R406W的胺基酸取代。另外，缺失的情況，為在自然突變體中被認定的缺失、例如序列號I的280位的K或296位的N的缺失。在本發明中，所述突變由所述位置中的I個或多個(例如數個(例如2 10的整數))突變構成。本發明中優選的突變為所述301位的胺基酸殘基的取代，例如P301S、P301L或P301T的胺基酸取代。關於本說明書中使用的胺基酸取代，例如「P301S」這樣的記載是指序列號I的胺基酸序列的301位的脯氨酸殘基(P)被絲氨酸殘基(S)取代。關於301位的突變，已知有額顳葉型痴呆的患者的發病年齡比較小、發病時進展快速(Sperfeld AD et al, Ann Neurol. 1999Nov ；46 (5) :708-715 ；Yasuda M et al.，Neurology, 55 :1224-1227，2000)等，因此，作為起因於該301位的突變的青少年年齡中的發病或(一旦發病時)進展快速的Tau蛋白病的治療或預防的靶點，301位的突變是重要的，本發明的疫苗對這種Tau蛋白病是有效的。本發明的載體包含編碼上面說明的突變體Tau蛋白的核酸。在該突變體Tau蛋白的N末端側上連接有分泌信號序列，由此，被載入細胞內的載體表達該核酸，利用細胞內的翻譯機構翻譯成突變體Tau蛋白前體後，轉移至細胞膜，利用信號肽酶切斷信號序列，該突變體Tau蛋白分泌到細胞外。編碼連接於分泌信號序列的突變體Tau蛋白的DNA可以使用常用的基因重組技術進行合成。這種技術記載於例如 J. Sambrook et al.，Molecular Cloning A LaboratoryManual, 2nd Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) > F. M. Ausubel et al.,Short Protocols in Molecular Biology,5th Ed. , John ffiley&Sons(2002)等。編碼突變體Tau蛋白的DNA可以通過如下方法來製備，S卩，例如由利用Tau蛋白基因編碼的mRNA，使用逆轉錄酶合成cDNA，將該cDNA編入適當的質粒載體中，以所得的載體為模板，且使用導入有目的突變的引物進行聚合酶鏈式反應(PCR)，將含有該突變的編碼Tau蛋白的序列部分進行擴增，進行限制酶處理，取得含有該序列部分的片段，將該片段編入用同一限制酶進行處理的質粒載體中，以所得載體為模板，使用可以擴增Tau蛋白編碼序列全長的引物同樣地進行PCR並擴増。PCR包含將由變性、退火及擴增構成的3個步驟設定為I個循環、將其進行約20 45個循環。變性是使雙鏈DNA變成單鏈的步驟，在92 98°C的溫度下熱處理約30秒 2分鐘。退火是在單鏈DNA上結合引物的步驟，在50 65°C的溫度下處理約10秒 60秒。擴增是以結合有引物的單鏈DNA為模板合成互補鏈的步驟，在約72°C的溫度下處理約10秒 7分鐘。在開始循環之前，可以在約94°C下熱處理約30秒 5分鐘，另外，在循環結束後，在約72°C下進行約I分鐘 10分鐘的擴增反應。反應是使用PCR緩衝液、dNTP(N =A，T，C，G)、耐熱性DNA聚合酶進行的。作為耐熱性DNA聚合酶，可以使用Taq聚合酶、Pfu聚合酶等市售的聚合酶。使用如用於自動地進行PCR的熱循環儀等市售的PCR裝置(寶酒 造、Applied Biosystems、Perkin-Elmer、Bio-Rad 等)非常便利。分泌信號序列為利用存在於人細胞內的信號肽酶可切斷的任何信號序列。在這種信號序列中也包含細胞特異的信號序列。分泌信號序列的非限制性例子是編碼澱粉樣前體蛋白(APP)的信號序列的 DNA(NT_011512. 11、NW_001838706. I、NM_201414. I、NM_201413. 1、NM_000484. 2、NM_001136130. 1NM_001136129. I) :5』 ggtctagaatgctgcccggtttggcactgctcctgctggccgcctggacggctcgggcgctt-3』 (序列號 2)(在此，實際的 APP 信號序列由起始密碼子atg(下劃線)開始。另外，其5』側的tctaga序列為限制酶位點。)、編碼 CD59 的信號序列的 DNA (NMJ)Ol 127227. 1、NM_001127226. 1、NM_000611. 5、NM_203331. 2、NM_001127225. 1、NM_203329. 2、NM_203330. 2、NM_001127223. I) :5』-atgggaatccaaggagggtctgtcctgttcgggctgctgctcgtcctggctgtcttctgccattcaggtcatagc-3> (序列號 J)等。由5』側依次連接編碼分泌信號序列的DNA和編碼突變體Tau蛋白的DNA，以該連接體為模板進行PCR擴增，在用適當的限制酶進行消化之後，在質粒載體上進行亞克隆。在上述方法中能夠使用的質粒載體可以是克隆用載體的任ー種。這種載體的非限制性例子是pBluescript系、pUC系、pBR系、pET系等。就用於搭載編碼連接有如上述那樣得到的分泌信號的突變體Tau蛋白的核酸的載體而言，只要是可以在人細胞等哺乳動物細胞內表達該核酸的載體，可以為任ー種載體，包含例如基因治療用的質粒、病韋載體等。非限制性基因治療用質粒含有例如pBK-CMV、pcDNA3. I、pZeoSV(Invitrogen公司、Stratagene 公司)、pCAGGS(Gene Bridges 公司)等。非限制性基因治療用病毒載體含有例如仙臺病毒(SeV)載體、腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、慢病毒載體、單純皰疹病毒載體、複製缺陷逆轉錄病毒載體、麻疹病毒載體、狂犬病病毒載體、流感病毒載體、呼吸道合胞病毒(RSV)載體、水皰性口炎病毒(VSV)載體、牛痘病毒載體、辛德畢斯病毒載體等。優選這些載體的複製缺陷型等安全性高的載體。在本發明中，上述的任一種載體都可以使用，可以優選使用的載體為質粒載體、仙臺病毒載體、腺病毒載體、腺伴隨病毒載體或慢病毒載體，其中，特別優選的病毒載體為仙臺病毒載體。在載體上可插入在外來DNA的表達所需要的真核生物細胞內可以工作的啟動子、例如CMV IE、dectin-l、dectin-2、人CDllc、F4/80、MHC II類等各啟動子。除該元件之外，可以在載體中含有增強子、複製起始點、核糖體結合位點、終止子、多聚腺苷酸化位點等調節序列、藥物抗性基因等選擇標記等。另外，所述載體可以是作為目的核酸能夠組成地、自主地或誘導地表達的任ー種載體，但在安全性方面，優選自主地表達核酸的載體。仙臺病毒載體不僅基因表達率比較高，而且具有不存在染色體插入突變引起的致癌危險的高的安全性。該載體在細胞質內進行複製而不進入細胞核內，可以以高的外來蛋白質水平進行表達。眾所周知，在仙臺病毒中參與自主複製的基因是NP、P/C及L基因，另外，參與傳播性的基因為M、F及HN基因。在利用該病毒作為載體的情況下，其可以具備所述的基因類型，或其中一部分基因例如F基因、M基因、HN基因等也可以缺失(蛋白質 核酸 酶Vol. 51，27-37,2006)。特別是通過缺失作為參與侵入宿主細胞的膜融合蛋白的F蛋白的基因，確保高的安全性(日本特開2009-268471、日本特表2008-536476、WO 00/70070)。 仙臺病毒的所述基因的核苷酸序列註冊於如下所述序列資料庫等(日本特表2008-536476)。關於NP 基因，M29343、M30202、M30203、M30204、M51331、M55565、M69046、X17218
坐寸。關於P 基因，M30202、M30203、M30204、M55565、M69046、X00583、X17007、X17008
坐寸。關於L 基因，D00053、M30202、M30203、M30204、M69040、X00587、X58886 等。關於M 基因，D11446、K02742、M30202、M30203、M30204、M69046、U31956、X00584、X53056 等。關於F 基因，D00152、D11446、D17334、D17335、M30202、M30203、M30204、M69046、X00152、X02131 等。關於HN 基因，D26475、M12397、M30202、M30203、M30204、M69046、X00586、X02808、X56131 等。另タ卜，仙臺病毒基因組cDNA可以按照例如Y u, D. et al. , Genes Cells2 457-466，1997、Hasan, M. K. et al.，J. Gen. Virol. 78 :2813-2820,1997 等中所記載的方法構建。而且，來自該cDNA的病毒的重建可以按照W097/16539;W0 97/16538 ；W000/70055 ；W0 00/70070 ；W0 01/18223 ；W0 03/025570 ;日本特表 2008-536476 ；Tokusumi,T. et al.，Virus Res. 86 :33-38 (2002) ；Li, H. et al.，J. Virol. 74 :6564-6569 (2000)等中所記載的方法進行。作為可以用於重建病毒載體的宿主細胞，已知有例如來自猴腎臟的LLC-MK2細胞(ATCC CCL-7)及CV-1細胞(例如ATCC CCL-70)、來自倉鼠腎臟的BHK細胞(例如ATCC CCL-10)等培養細胞、來自人的293T細胞等，而且，為了得到大量的病毒載體，可以使雞胚感染由上述的宿主細胞得到的病毒載體並對其進行擴增，然後純化(日本特表2008-536476、W000/70055、WO 00/70070)。被回收的病毒的滴度可以通過測定例如CIU (Cell-Infectious Unit，細胞感染単位)或紅細胞凝集活性(HA)來確定(W000/70070)。關於F基因缺失型仙臺病毒載體的重建，也可以按照WO 00/70055.W0 00/70070、日本特表2008-536476等中所記載的方法進行。此時，建立表達仙臺病毒F蛋白的輔助細胞株，使用其由F基因缺失基因組回收感染病毒粒子。根據後述的實施例，參考上述的方法，並用限制酶NotI消化F基因缺失型仙臺病毒載體(Z株)的cDNA，在仙臺病毒核殼體(NP)蛋白質基因的轉錄起始序列和翻譯區域(ORF)之間的非翻譯區域內插入分泌信號序列(例如APP信號序列或⑶59信號序列)和突變體Tau蛋白(TAU(P301S))的結合片段，由此，構建搭載突變體Tau基因的F基因缺失型仙臺病毒載體(Sev-TauP301S)。實際上構建的仙臺病毒載體重建用質粒為pcDNA3-APP-TauP301S(圖14)，在分泌信號序列的5』末端上結合起始密碼子(atg)，而且，可以在起始密碼子之前連接科茲(kozak)的共有序列(例如gccacc或ccacc)。為了載體的重建，使用表達仙臺病毒F蛋白的輔助細胞株(W0 00/70070)。在腺病毒載體的情況下，可以使用El區域缺失型腺病毒載體。除El區域之外，E3區域也可以缺失，但E3區域的缺失不一定是必須的。關於腺病毒載體，記載於日本特開2008-017849、日本特開 2000-166581、日本特表 2003-518915、Hitt, M.等，「Construction and propagation of human adenovirus vectors，，In Cell Biology A LaboratoryHandbook (Celis, J. E. ed. ) , Third Ed. , Vol. I, Academic Press (2005) > Hitt, M.等，「Techniques for human adenovirus vector construction and characterization，，InMethods in Molecular Genetics (Adolph, K. ff. ed. ), Vol. 7, Academic Press (1995)等。關於其它病毒載體，在基因治療用中被改良的載體記載於文獻中，因此，可以用於本發明。〈疫苗〉本發明的疫苗可以用於tau蛋白病的預防或治療。與突變體Tau蛋白的直接施用相比，該疫苗在受試者中可以更持續地誘導對於Tau蛋白(任選地磷酸化的)的抗體(參照圖4、圖6)。本發明的疫苗將受試者的腦內的小神經膠質細胞進行活化，由此吞噬突變體Tau蛋白。作為tau蛋白病的原因物質的突變體Tau蛋白利用小神經膠質細胞被清除，由此，阻礙該蛋白質的積累，抑制tau蛋白病的症狀的進展。根據tau蛋白病模型小鼠(P301S Tau轉基因小鼠)中的體內試驗得知本發明的疫苗具有改善tau蛋白病、尤其是tau蛋白病型痴呆症的作用。即，被認為痴呆症的記憶力下降或社交性的缺乏通過接種本發明的疫苗而得以改善，但在接種重組突變體Tau蛋白時，沒有看到該改善效果，因此，確認本發明的疫苗的優越性。另外，與重組突變體Tau蛋白一祥，觀察到本發明的疫苗對痴呆症中經常觀察到的多動性(喪失沉著)的改善效果。這樣，本發明的疫苗具有改善痴呆症中觀察到的記憶カ下降和/或社會行為異常和/或焦慮行為異常和/或記憶障礙的效果。就本發明的疫苗而言，由於具有上述的功效，可以用於tau蛋白病、尤其是阿爾茨海默氏病、FTDP-17(伴有與第17號染色體有關的帕金森的額顳葉型痴呆症)、唐氏症候群、匹克病、帕金森病-痴呆症複合病、神經原纖維變化優越型痴呆症、拳擊手痴呆症、進行性核上性麻痺、嗜銀顆粒性痴呆症、大腦皮質基底核變性症、腦炎後帕金森症、亞急性硬化性全腦炎、肌肉緊張性營養不良、福山型肌肉營養不良、關島肌肉萎縮性側索硬化症-帕金森病複合病、伴有紀伊半島的神經原纖維變化的肌肉萎縮性側索硬化症等疾病的預防或治療。本發明的疫苗可以根據需要含有藥學上允許的載體及添加剤，例如生理鹽水、林格液、緩衝液、植物油、懸浮劑、表面活性剤、穩定劑、防腐劑等。另外，可以在疫苗中添加用於提高免疫原性的佐劑。作為佐劑，包含例如鋁鹽(alum)、皂甙類、胞壁醯(ニ)肽、細胞因子類(IL-2、4、6等)、霍亂毒素、沙門氏菌毒素等免疫促進劑。本發明的疫苗的接種可以通過皮下、皮內、鼻內、肌肉內、靜脈內、腹腔內等施用路徑來進行。優選的製劑為注射劑、吸入劑等。吸入劑被封入於可以通過量取用量而吸入的吸入裝置內。施用量應該根據受試者(哺乳動物、優選人)的症狀、嚴重度、年齡、性別、體重等而從臨床醫學方面適當判斷，可以根據疫苗的形態或施用方法等而變動，對於病毒載體的情況，非限制的量是例如IO4 IO14Pfu(噬菌斑形成単位)、優選IO5 IO13Pfiu更優
選IO6 IO11Pfu或IO5 IO9CIU (細胞感染單位)，另外，對於質粒載體的情況，為例如約I ii g 500ii g,無論如何,只要發揮疫苗效果,可以在上述的範圍外。另外，為了促進細胞膜的透過，也可以利用脂質體。作為脂質體優選的物質為陽離子性脂質體。已顯示陽離子性脂質體介導質粒DNA的細胞內運送(Nature 337387(1989))。陽離子性脂質體還可以通過結合膜透過性肽而容易進行細胞內運送。關於脂質體，可以參照例如 Brigham 等，Am. J. Med. Sci.，298 278 (1989)、Osaka 等，J. Pharm.Sci.，85 (6) :612-618(1996)、San 等，Human Gene Therapy, 4 :781-788 (1993), Senior等，Biochemica et Biophysica Acta,1070 :173-179(1991)、Kabanov and Kabanov,Bioconjugate Chem. 1995 ；6 :7_20、Remy 等，Bioconjugate Chem. ,5 :647-654(1994)；Behr, J-P. , Bioconjugate Chem. ,5 :382-389 (1994)、Wyman 等，Biochem. ,36 3008-3017(1997)等文獻。
實施例以下，列舉實施例具體地說明本發明，但本發明的範圍不受這些實施例限制。[實施例I]搭載突變體Tau基因的F基因缺失型仙臺病毒載體的構建I)分泌信號序列和表達Tau蛋白的仙臺病毒載體的構建分泌型信號序列以澱粉樣前體蛋白(APP，序列資料庫登錄號NT_011512. 11、Nff_001838706. I、麗_201414. I、NM_201413. I、麗_000484. 2、麗_001136130. I、NM_001136129. I)為基礎，使用以下的序列。5』 -ggtctagaatgctgcccggtttggcactgctcctgctggccgcctggacggctcgggcgctt-3(序列號 2)突變體Tau蛋白(TauP301S)的cDNA以在人1N4R型Tau蛋白(序列資料庫登錄號NM_001123067. 2)的鹼基序列上加入了突變的序列[從記載於NM_001123067. 2的胺基酸序列的272位(對應於序列號I的301位的位置)的脯氨酸(P)密碼子向絲氨酸(S)密碼子的突變；序列號13的884 886位的絲氨酸密碼子(tcg)]為模板，使用以下的引物用PCR進行擴增。5 』 側正向引物gctgagccccgccaggag (序列號 4)3』 側反向引物tcacaaaccctgcttggccag(序列號 5)
將APP分泌信號和用PCR進行擴增的Tau蛋白的cDNA結合，以其為模板，使用以下的引物進行PCR。5』 側正向引物aaagaattcggcttggtctagaatgctgcccggtttggcac (序列號 6)3』 側反向引物aaagaattctcacaaaccctgcttggccag(序列號 7)將所得的PCR產物用限制酶EcoRI進行消化，接著，在pcDNA3 (Invitrogen)上進行亞克隆。搭載突變體Tau基因的F基因缺失型仙臺病毒載體的構建按照Li等的報導(Li Het al. J. Virology. 74. 6564-6569 (2000) ；W0 00/70070)中記載的方法進行。將 F 基因缺失型仙臺病毒載體(Z株)的cDNA用限制酶NotI進行消化，將分泌信號序列和突變體Tau蛋白的結合片段插入於仙臺病毒核殼體(NP)蛋白基因的轉錄起始序列和翻譯區域之間的 非翻譯區域，由此，構建搭載突變體Tau基因的F基因缺失型仙臺病毒載體。另外，用作対照的表達EGFP的F基因缺失型仙臺病毒載體也使用pTRES2-EGFP載體(Clonetech)的EGFP部分進行構建。2)搭載突變體Tau基因的F基因缺失型仙臺病毒載體的重建和擴增缺失有F基因的仙臺病毒載體的重建以上述的Li等的報導(Li H et al. J. Virology. 74. 6564-6569(2000) ；W0 00/70070)為參考來實施。由於該仙臺病毒載體為F基因缺失型，因此，使用表達F蛋白的包裝細胞，製備搭載突變體Tau基因的F基因缺失型仙臺病毒載體(以下稱為「Sev-TauP301S」)及搭載EGFP基因的F基因缺失型仙臺病毒載體(以下稱為 「Sev-GFP」)。
[實施例2]搭載有突變體Tau基因的質粒載體的構建I)分泌信號序列和表達Tau蛋白的質粒載體的構建分泌信號序列使用⑶59蛋白(序列資料庫登錄號NM_001127227. I、NM_001127226. I、麗_000611. 5、NM_203331. 2、NM_001127225. I、NM_203329. 2、NM_203330. 2、NM_001127223. I)的鹼基序列中的以下的序列。5』 -atgggaatccaaggagggtctgtcctgttcgggctgctgctcgtcctggctgtcttctgccattcaggtcatagc-3』 (序列號 3)突變體Tau蛋白(TauP301S)的cDNA以在人1N4R型Tau蛋白(序列資料庫登錄號NM_001123067. 2)的序列上加入了突變的序列[從記載於NM_001123067. 2的胺基酸序列的272位(對應於序列號I的301位的位置)的脯氨酸(P)密碼子向絲氨酸(S)密碼子的突變；序列號12的898 900位的絲氨酸密碼子(agt)]為模板，使用以下的引物用PCR進行擴増。另外，為了對搭載於本質粒載體的突變體Tau與搭載於仙臺病毒載體的突變體Tau進行區別，使其具有不同的絲氨酸密碼子的序列。5』 側正向引物gctgagccccgccaggag(序列號 8)3』 側反向引物tcacaaaccctgcttggccag(序列號 9)將⑶59分泌信號和用PCR進行擴增的Tau蛋白的cDNA結合，以其為模板，使用以下的引物進行PCR。5』 側正向引物ttgaattcgccaccatgggaatccaaggag(序列號 10)3』 側反向引物aattctcgagtcacaaaccctgcttggc (序列號 11)
將所得的PCR產物用限制酶EcoRI和XhoI進行消化，接著，將pcDNA3. I (+)質粒載體(Invitrogen)的多克隆位點用限制酶EcoRI和XhoI進行消化,插入於各自的切斷位點間。2)搭載突變體Tau基因的質粒載體的擴增質粒載體的擴增以Invitrogen公司發行的pcDNA3. I製品使用說明書為基礎,按照以下的要領進行。將大腸桿菌DH5ci株用質粒載體轉化。接著，播種於LB-氨苄青黴素培養基，對每個單ー克隆進行少量培養並純化。用Nucleobond質粒純化試劑盒(MACHEREY-NAGEL)提取質粒，進行測序以確認是否正確地複製，選擇有效的克隆。接種於小鼠的質粒載體的擴增通過選擇的克隆的大量培養進行，在質粒的提取中使用無內毒素等級的Nucleobond質粒純化試劑盒。[實施例3] 利用搭載突變體Tau基因的F基因缺失型仙臺病毒載體的體內試驗I)表達GFP的F基因缺失型仙臺病毒載體對小鼠的經鼻施用使用3個月齡的Tau蛋白病模型小鼠(P301S Tau轉基因小鼠)(由Yoshiyama，Y，et al. Neuron 53, 337-351 (2007) !University of Pennsylvania Dr. Tro janowski 提供)，進行本發明的搭載GFP的F基因缺失型仙臺病毒載體(以下稱為「Sev-GFP」)的經鼻施用，並進行感染效率的探討。每I只小鼠施用Sev-GFP 5xl06CIU，用多功能顯微鏡(BZ-9000，Keyence)進行螢光成像和亮視場像的拍攝，對I周后鼻黏膜中的GFP的表達進行分析。分析的結果，在鼻黏膜的寬廣的範圍看到GFP的表達，確認仙臺病毒載體的經鼻施用是有效的(圖I)。2) Sev-TauP301S接種對磷酸化Tau蛋白表達的抑制效果(其I)對3個月齡的Tau蛋白病模型小鼠經鼻(鼻內)施用SeV_TauP301S 5 X IO6CIU/只，在施用5個月後進行解剖，製備海馬冠狀的組織切片。作為對照疫苗，使用Sev-GFP。另夕卜，在上述2個組中，分別對13隻、11隻tau蛋白病模型小鼠進行接種。為了測定磷酸化Tau的表達水平，對海馬的組織切片進行免疫染色。在小鼠海馬冠狀剖面中使抗磷酸化Tau蛋白質抗體(AT8, Innogenetics)反應並清洗後,進行使用作為2次抗體的生物素標記的馬抗小鼠IgG抗體(Vector)的免疫染色。免疫染色後，用多功能顯微鏡(BZ-9000，Keyence)附屬分析軟體測定在海馬CA3區域內積累的區域的面積。用學生t檢驗進行Sev-GFP組、Sev-TauP301S組各自的平均值土標準誤差、統計學的分析。作為結果，與Sev-GFP施用組相比，在Sev-TauP301S施用組中，暗示了海馬中磷酸化Tau的表達的抑制(圖2)。3) Sev-TauP301S接種對磷酸化Tau蛋白表達的抑制效果(2)關於Sev-TauP301S或Sev-GFP接種對Tau蛋白表達的抑制效果，使用來自海馬的蛋白質利用免疫印跡法進行分析。免疫印跡法的方法如下所述。用RAB-HS緩衝液將海馬組織均質化後，在4°C下用50，OOOXg,進行40分鐘離心分離，將上清液進行SDS處理，用15 y g/樣品在SDS-PAGE上電泳。電泳後，進行PVDF膜轉移，與抗磷酸化Tau蛋白質抗體(AT8, Innogenetics)反應，清洗後，使用作為2次抗體的HR 標記的綿羊抗小鼠IgG抗體(GE Healthcare)，利用ECL(GE Healthcare)的化學發光進行檢測。磷酸化Tau蛋白的評價後，用Strippingsolution(Nakalai)剝離抗體,然後使用抗P _肌動蛋白抗體(SIGMA)再次用同樣的方法進行檢測。就積累的磷酸化Tau蛋白質量而言，用圖像分析軟體(NIH Image, Ver. I. 63,NIH,US)測定條帶的信號強度，取得作為內部對照蛋白質的￠-肌動蛋白和信號強度之比，並進行定量化。對照疫苗(Sev-GFP)接種組、Tau疫苗(Sev-TauP301S)接種組各自的平均值土標準誤差、統計學的分析用學生t檢驗進行。作為結果得知，與Sev-GFP接種組相比，在Sev-TauP301S接種組中，抑制了海馬中磷酸化Tau的表達(圖3)。4)與海馬中磷酸化Tau反應的抗體的誘導血清中與組織Tau反應的抗體效價用相對於沒有施用Sev_TauP301S的Tau蛋白病模型小鼠海馬組織的反應性進行評價。將施用有Sev_TauP301S或Sev-GFP (各5 X IO6CIU/只)的小鼠的血清分別稀釋30倍、100倍、300倍、1000倍、3000倍，在4°C下放置一晩，與Tau蛋白病模型小鼠海馬組織切片反應後，使Alexa546標記的抗小鼠IgG抗體 (Invitrogen)在室溫下用I小時反應並進行檢測。各小鼠的抗體效價用觀察到與組織反應的最大稀釋倍率進行評價。用Mann-Whitney的U檢驗進行Sev-GFP接種組、Sev_TauP301S接種組各自的平均值土標準誤差、統計學的分析。作為結果，與來自施用有Sev-GFP的小鼠的血清相比，使來自SeV_TauP301S接種小鼠的血清反應時，在海馬中進行反應的抗體效價顯著地高。由以上的結果確認，通過接種Sev_TauP301S,在血清中所產生的抗體與表達磷酸化Tau的海馬進行反應(圖4a、4c)。5)Sev-TauP301S接種對腦內的小神經膠質細胞的活化進行實驗以確認SeV-TauP301S接種引起的腦內的神經免疫活性細胞小神經膠質細胞的變化。對3個月齡的Tau蛋白病模型小鼠接種Sev-TauP301S 5X IO6CIU/只，接種5個月後取出腦組織，製備海馬的組織切片，如下進行免疫染色。在小鼠海馬冠狀剖面中使抗Ibal抗體(WAKO)在4°C下反應ー晚，清洗後，與作為二次抗體的Alexa488標記的山羊抗兔IgG抗體(Invitrogen)和檢測組織中小鼠IgG的Alexa546標記的抗小鼠IgG抗體(Invitrogen)的組合在室溫下反應I小時，用突光雙重免疫染色進行檢測。免疫染色後，用多功能顯微鏡(BZ-9000，Keyence)對海馬CA3區域拍攝螢光成像。其結果，與作為對照的Sev-GFP施用組相比，就Sev-TauP301S施用組而言，在海馬中看到許多Ibal陽性細胞，這些陽性細胞的許多與抗小鼠IgG抗體共染色。報導Ibal (Ionized calcium binding adapter molecule I)伴隨小神經膠質細胞的活化而增加其表達量，因此，Ibal是與小神經膠質細胞的活化有關的分子(Ito D. et al.，Brain Res.Mol. Brain Res. 57. 1-9，1998)，而且認為，小鼠IgG識別組織中的TauP301S，因此認為，通過Sev-TauP301S的接種，活化小神經膠質細胞與TauP301S的反應(圖5)。關於由Tau疫苗接種引起的小神經膠質細胞的活化增加，暗示如下可能性1)在外周血中，巨噬細胞受到抗原呈遞而活化，通過血腦屏障聚集於腦，成為活化小神經膠質細胞，吞噬突變體Tau蛋白；或2)突變體Tau蛋白通過血腦屏障，在腦內小神經膠質細胞直接受到抗原呈遞而活化，吞噬突變體Tau蛋白。6)以重組磷酸化Tau蛋白為抗原的ELISA
為確認接種Sev_TauP301S導致的血清中所產生的抗體是否為磷酸化Tau特異的抗體，因此，進行了以重組突變體Tau蛋白(TAUP301S)為抗原的ELISA。重組突變體Tau蛋白的製備基於坂上等(Sakaue F et al. J. Biol.Chem. 280. 31522-31529,2005)的方法進行。具體而言，使插入有TauP301S (1N4R型)的PRK172載體在大腸桿菌(BL21-DE3株)中表達，由菌體利用磷酸纖維素柱(Pll)、50%硫酸銨沉澱、熱處理、進而反相HPLC純化，並進行冷凍乾燥，在4°C下保存。
關於血清中的抗磷酸化Tau抗體的產生，利用以下的ELISA法進行分析。將用前述的方法製備的重組TAUP301S蛋白質(lug/ml/孔)在96孔板上、在4°C下過夜進行固相化。在臨接種Sev-TauP301S或Sev-GFP之前及接種後第I個月採集血清，使用將從接種小鼠上採取的血清稀釋了 50倍的血清，在室溫下放入平板上2小時並使其反應。反應後，經過清洗，使HR標記的綿羊抗小鼠IgG抗體(GE Healthcare)在室溫下反應I小時。反應後進行清洗，用Opti-EIATMB Substrate Reagent Set (BD)進行顯色,通過450nm的波長中的吸光度測定進行定量化。在測定的陽性對照血清中使用皮下接種有重組TAUP301S蛋白質的小鼠血清進行系列稀釋，使用將血清原液中的抗體滴度作為1，000単位製備的吸光度-単位間的標準曲線，將吸光度變換為単位。根據這樣求出的每個小鼠的接種後單位量評價抗體效價的增加。該ELISA的結果可以確認,通過接種Sev-TauP301S,在血清中較多地產生抗磷酸化Tau抗體(圖6a)。在接種有重組蛋白質的小鼠中顯著產生Tau特異的抗體，認為是因為進行接種後早期的血液中存在大量突變體Tau蛋白，因而大量抗原呈遞細胞暴露於突變體Tau蛋白。另外，腦脊髓液中的磷酸化Tau蛋白的量利用以下的方法進行測定。96孔板預先用3 V- g/ml抗磷酸化抗體(AT8抗體)在4°C下包覆處理過夜。將從接種有Sev-TauP301S或Sev-GFP的小鼠上採取的腦脊髓液(CSF)稀釋50倍，添加於各孔並使其反應。作為陽性對照，將14個月齡的Tau蛋白病模型小鼠的腦進行均質化，使用將所得的液體系列稀釋為100 102400倍的液體。作為2次抗體，使兔抗人Tau蛋白抗體、其後過氧化物酶標記的綿羊抗兔IgG F(ab』 ) 2抗體反應,使用Tetramethyl Benzidone液體進行顯色。450nm 的吸光度利用自動平板檢測儀(Model 353 ；Thermo Scientific, Japan)進行測量。作為結果，在進行了 Sev-TauP301S接種的Tau蛋白病模型小鼠的腦脊髓液中觀察到高濃度的磷酸化Tau蛋白(圖6b)。7)小鼠行為分析全部的行為實驗在受到京都大學醫學研究科動物實驗委員會(京都，日本)認可的基礎上進行。通過對本實驗中使用的Tau蛋白病模型小鼠(P301STau轉基因小鼠)施用Tau疫苗，用以下的方法評價痴呆症患者中觀察到的行為學的異常(記憶カ下降、社交性的缺乏、焦慮行為、多動性、活動量、空間學習、參照記憶、感覺中樞、聽カ等)的改善效果。(I)對tau蛋白病模型小鼠的SeV-TauP301S接種的新奇環境下的社會行為實驗(bocial interaction test)社會行為實驗是用於評價在新奇場面中的行為的實驗。將接種有Sev-TauP301S (5 X IO6CIU/只)的Tau蛋白病模型小鼠或接種有Sev-GFP(5X IO6CIU/只)的Tau蛋白病模型小鼠在接種後第3個月，與至今沒有進入過同一籠子的小鼠每I只放入I個箱(40 X 40 X 30cm)中，使其自由地探尋10分鐘。社會行為通過CXD照相機(Sony DXC-151A)進行監視，將圖像載入計算機並使用Image SI軟體自動地測定接觸次數、每I次接觸的平均時間、移動距離。進行了分析，與施用有Sev-GFP的Tau蛋白病模型小鼠相比，接種Sev-TauP301S的Tau蛋白病模型小鼠對陌生小鼠接觸的時間長。根據該分析，確認了社會行為、以及對新的小鼠的出現的響應能力的改善效果(圖7A)。(2)對Tau蛋白病模型小鼠的SeV_TauP301S接種產生的社會行為測定實驗(しrawley versionノ社會行為測定實驗(Crawley’s social interaction test, Crawley 社會行為測定實驗)是用於對各類的小鼠的記憶力、社會關係的形成、社交性的評價的實驗。裝置利用嵌板隔成3個空間，在兩端的空間的一角落分別設定小的籠子各I個。將至今沒有進入過同一籠子的小鼠放入籠子中，其後，對Tau蛋白病模型小鼠接種Sev-TauP301S (5 X IO6CIU/只)或Sev-GFP (5 X IO6CIU/只)，將接種後第3個月的小鼠放置於籠子之外，10分鐘期間原封不動放置。10分鐘後，在另外的籠子中放入其它的至今沒有進入過同一籠子的小鼠後，接種Sev-TauP301S或接種Sev-GFP的Tau蛋白病模型小鼠在已經進入了 10分鐘的小鼠(Familiar Side,熟悉側)、新的陌生小鼠(Stranger Side,陌生側)中哪ー個小鼠的附近長時間停留，通過測定停留時間進行社會行為的評價。作為結果，與Sev-GFP接種Tau蛋白病模型小鼠在熟悉側的停留時間長相比，接種Sev-TauP301S的Tau蛋白病模型小鼠在陌生側的停留時間長，確認了社會行為、以及對不同小鼠的記憶カ的改善效果(圖7B)。(3)對tau蛋白病模型小鼠的Sev-TauP301S接種的高架十字迷宮實驗高架十字迷宮是用於評價焦慮行為的裝置，由相同大小的2個開放臂和附有高度15cm的透明的壁的2個閉合臂構成。在閉合臂上安裝有高度15cm的透明的壁。臂以及中心的正方形的部分由白的塑料板形成，位於離地板50cm的高度。將接種SeV-TauP301S(5xl07CIU/只，每I周一次，共3次)的Tau蛋白病模型小鼠或同滴度的Sev-GFP接種給Tau蛋白病模型小鼠，將接種後第3個月的小鼠分別在迷宮中心的正方形的部分(5X5cm)以朝向閉合臂的方向的方式放置，記錄10分鐘行為。使用Image EP軟體自動地測量從迷宮中心向4個方向的每ー個方向的全部出入次數(A)、向沒有柵欄的方向的出入次數的比例(B)、小鼠的總移動距離(C)、向沒有柵欄的場所的停留時間的比例(D)。接種Sev-TauP301S的Tau蛋白病模型小鼠，向沒有柵欄的場所的停留時間顯著地變少，確認了焦慮行為、以及對落下的危險的判斷力的改善(圖8D)。(4)對Tau蛋白病模型小鼠的重組Tau蛋白接種的曠場試驗曠場試驗是用於測定活動量或情緒性的實驗。隨著將重組Tau蛋白(TAUP301S)100ii g/只/次、每2周一次共3次、用Adju-Phos佐劑(Gentaur公司)對Tau蛋白病模型小鼠進行皮下接種，在接種後第一個月進行曠場試驗。對接種小鼠，在附有高度30cm的柵欄的40cm見方的曠場試驗用裝置(AccuscanInstruments)中放入小鼠,將120分鐘的自由行為劃分為5分鐘時段,評價移動距離(A)、伸腰的次數(B)、在視野中央的停留時間(C)、刻板行為(D)。對於接種TAUP301S的Tau蛋 白病模型小鼠，移動距離顯著地變短，確認有多動性(沉著的喪失)的改善效果(圖9A)。
(5)對Tau蛋白病模型小鼠的重組Tau蛋白接種的高架十字迷宮實驗隨著將重組Tau蛋白(TAUP301S) 100 ii g/只/次、每2周一次共3次、用Adju-Phos佐劑(Gentaur公司)對Tau蛋白病模型小鼠進行皮下接種，在接種後第一個月進行高架十字迷宮的分析。將接種小鼠分別在迷宮中心的正方形的部分(5X5cm)以朝向閉合臂的方向放置，記錄10分鐘行為。使用Image EP軟體自動地測量從中央向4個方向的每ー個方向的全部的出入次數(A)、出入於沒有柵欄的方向的的次數的比例(B)、小鼠的總移動距離(C)、向沒有柵欄的場所的停留時間的比例⑶。接種TAUP301S的Tau蛋白病模型小鼠，與對照(佐劑施用)的小鼠的結果相比，在高架十字迷宮分析中沒有確認有大的差異(圖10)。(6)對Tau蛋白病模型小鼠的DNA-Tau P301S接種的曠場試驗 在開始的時刻，在5個月齡的Tau蛋白病模型小鼠左後肢大腿肌肉上進行肌肉內接種cDNA-Tau P301S 100 y g/只/次，每周一次共6次，接著，每2周一次共3次，總計9次，在接種後第一個月進行曠場試驗。對接種小鼠，在附有高度30cm的柵欄的40cm見方的曠場試驗用裝置(Accuscan Instruments)中放入小鼠,將120分鐘的自由行為劃分為5分鐘時段，評價移動距離(A)、伸腰的次數(B)、在視野中央的停留時間(C)、刻板行為(D)。接種cDNA-Tau P301S的Tau蛋白病模型小鼠證實移動距離縮短，確認有多動性(沉著的喪失)的改善效果(圖11A)。(7)對Tau蛋白病模型小鼠的cDNA-Tau P301S接種的新奇環境下的社會行為實驗在開始的時刻，在5個月齡的Tau蛋白病模型小鼠左後肢大腿肌肉上進行肌肉內接種cDNA-Tau P301S 100 u g/只/次，每周一次共6次，接著，每2周一次共3次，總計9次，在接種後第一個月與至今沒有進入過同一籠子的小鼠每I只放入I個箱(40X40X30cm)中，自由地探尋10分鐘。就社會行為而言，通過CXD照相機(Sony DXC-151A)進行監視，將圖像載入計算機，使用Image SI軟體自動地測定接觸次數、每I次接觸的平均時間、移動距離。進行了分析，接種cDNA-Tau P301S的Tau蛋白病模型小鼠與作為對照的接種有pcDNA3. l(ATG-)(以下為cDNA-空白)的Tau蛋白病模型小鼠相比，對陌生小鼠接觸的時間顯著縮短& = 0.0164，學生セ檢驗)(圖12A)。另外，接種cDNA-Tau P301S的Tau蛋白病模型小鼠與接種cDNA-空白的Tau蛋白病模型小鼠相比，移動距離也縮短。(圖12B)。其結果，與曠場試驗同樣地，通過cDNA-Tau P301S接種，確認有對多動性的改善。(8)對Tau蛋白病模型小鼠的Sev-TauP301S接種的巴恩斯迷宮試驗巴恩斯迷宮試驗是用於研究空間學習或參照記憶的實驗。在I張圓狀的板上打12個孔，僅在其中的I個孔的下面放置有暗箱。對Tau蛋白病模型小鼠及野生型小鼠接種Sev-TauP301S(5X IO6CIU/ 只)或 Sev-GFP (5 X IO6CIU/ 只)，在接種後第 4 個月進行本實驗。首先，在一定期間內以使小鼠記憶暗箱的空間的位置的方式進行訓練(訓練期間)，訓練結束後經過24小時後，根據停留於(放置有暗箱)靶點的孔的周圍的時間，評價空間學習或參照記憶(探測試驗)。通過Sev_TauP301S接種,在Tau蛋白病模型小鼠中，至到達革巴點的時間減少(圖15B)，而且，停留於靶點的孔的周圍的時間變長(圖15C)，因此，確認有改善效果。(9)對Tau蛋白病小鼠的Sev_TauP301S接種的恐怖條件反射試驗恐怖條件反射試驗是用於測定情景記憶或注意能力的實驗。對Tau蛋白病小鼠及野生型小鼠接種Sev-TauP301S(5X IO6CIU/只)或Sev-GFP (5 X IO6CIU/只)，在接種後第4個月進行實驗。對放入箱中的小鼠施加電休克，在該體驗有電休克的同一箱中給予其它的刺激(例如聲音)，經過一定的時間後，在同一箱中放入小鼠或者放入其它箱中並進行同一聲音引起的刺激的，由此在小鼠中產生凍結(畏縮行為)現象。根據該凍結的出現率評價情景記憶或注意能力。通過Sev-TauP301S接種，在Tau蛋白病模型小鼠中，凍結的出現率減少，確認有改善效果(圖16C)。(10)對Tau蛋白病模型小鼠的Sev-TauP301S接種的身體測定圖17表示對Tau蛋白病模型小鼠及野生型小鼠接種SeV_TauP301S(5X IO6CIU/只)或Sev-GFP(5X IO6CIU/只)、在接種後第一個月進行與體重、體溫、握力、抓住金屬絲的時間有關的測定的結果。沒有確認有各組中的優勢差。
(11)對Tau蛋白病模型小鼠的Sev-TauP301S接種產生的社會行為測定試驗社會行為測定試驗是將被試小鼠2隻放入箱中、對10分鐘的接觸次數或接觸持續時間、小鼠的移動距離等進行測定的用於社會行為測定的實驗。對Tau蛋白病模型小鼠及野生型小鼠接種Sev-TauP301S (5 X IO6CIU/只)或Sev-GFP (5 X IO6CIU/只)，在接種後第2個月進行本實驗。作為結果，在接種Sev-TauP301S的Tau蛋白病模型小鼠中，確認在接觸次數的増加(圖18B)、活躍接觸的持續時間的延長(圖18C)及總移動距離的増加(圖18E)方面有改善效果。(12)通過對Tau蛋白病模型小鼠的Sev-TauP301S接種的前脈衝抑制實驗前脈衝抑制實驗是進行感覺中樞或聽力、(對於刺激)跳起的反應等的評價的實驗。對於接種Sev-TauP301S(5X IO6CIU/只)的Tau蛋白病模型小鼠及野生型小鼠或接種Sev-GFP (5X IO6CIU/只)的Tau蛋白病模型小鼠及野生型小鼠，在接種後第3個月進行了前脈衝抑制實驗。作為結果，也沒有確認有通過Sev-TauP301S接種的凍結抑制效果，在各組間沒有確認有優勢的差異(圖19)。(13)對Tau蛋白病模型小鼠的SeV_TauP301S接種的曠場試驗對Tau蛋白病模型小鼠及野生型小鼠接種Sev-TauP301S (5X106CIU/只)或Sev-GFP(5X106CIU/只)，在接種後第一個月進行了曠場試驗。(A)表示總移動距離，(B)表示垂直方向的活動量，(C)表示在中心部的停留時間，(D)表示刻板行為次數。在各組間沒有確認有優勢的差異(圖20)。(14)對Tau蛋白病模型小鼠及野生型小鼠的曠場試驗對野生型小鼠及Tau蛋白病模型小鼠進行了曠場實驗。(A)表示總移動距離，(B)表示垂直方向的活動量，(C)表示中心部中的停留時間，(D)表示刻板行為次數。與野生型小鼠相比，Tau蛋白病模型小鼠總移動距離長(A)，垂直方向的運動量多
(B)，停留在中心部的時間(C)長。對於刻板行為次數(D)，沒有確認有優勢的差異(圖21)。(15)對Tau蛋白病模型小鼠及野生型小鼠的高架十字迷宮實驗對Tau蛋白病小鼠或野生型小鼠進行了高架十字迷宮實驗。作為結果，對於Tau蛋白病小鼠，侵入沒有柵欄的開放臂的比例⑶和停留在沒有柵欄的開放臂的時間(D)與野生型小鼠相比顯示優勢高的值(圖22)。(16)對Tau蛋白病模型小鼠及野生型小鼠的前脈衝抑制實驗
對Tau蛋白病模型小鼠及野生型小鼠進行了前脈衝抑制實驗。Tau蛋白病模型小鼠與野生型小鼠相比，對聲音的驚愕反應低(圖23A)，但通過預先發出小的聲音後發出大的聲音的驚愕反應的抑制的比例顯示高的值(圖23B)。(17)對Tau蛋白病模型小鼠及野生型小鼠的腦組織的Tau蛋白的表達 對於Tau蛋白病模型小鼠和野生型小鼠的腦組織中的Tau蛋白的表達水平的比較在病理組織學上進行了探討。
雖然沒有觀察到Tau的聚集圖像或包含體，但是，與野生型小鼠相比，在Tau蛋白病小鼠的腦組織中顯著地確認有磷酸化Tau蛋白(圖24)。可以認為，較多地看到磷酸化Tau的帯狀回皮質、大腦皮質扁桃核、海馬等與不安障礙有關，海馬與記憶障礙有夫，因此暗示這些組織中磷酸化Tau的積累可能導致呈現行為異常。(18)對Tau蛋白病模型小鼠及野生型小鼠的身體測定對13周齡的Tau蛋白病模型小鼠及野生型小鼠進行了一般的身體測定。(A)表示體重，⑶表示直腸溫度，(C)表示握力，⑶表示鋼絲繩懸掛實驗的結果。在Tau蛋白病模型小鼠和野生型小鼠之間沒有確認有優勢的差異(圖25)。(19)對Tau蛋白病模型小鼠及野生型小鼠的社會行為測定實驗(新奇場面)對Tau蛋白病小鼠或野生型小鼠進行了社會行為測定實驗。社會行為測定實驗的結果，是在Tau蛋白病模型小鼠和野生型小鼠之間沒有確認有優勢的差異(圖26)。(20)對Tau蛋白病模型小鼠及野生型小鼠的恐怖條件反射試驗對野生型小鼠及Tau蛋白病模型小鼠進行了恐怖條件反射試驗。在Tau蛋白病模型小鼠中，凍結的出現率與野生型小鼠相比顯示低的值，但總體上沒有大的優勢差異(圖27)。(21)對Tau蛋白病模型小鼠及野生型小鼠的巴恩斯迷宮試驗對野生型小鼠及Tau蛋白病模型小鼠進行了巴恩斯迷宮試驗。圖28的(A) (C)表示訓練期間的結果。圖28的(D)表示訓練後經過24小時後的探測實驗。訓練期間，在Tau蛋白病模型小鼠和野生型小鼠之間沒有確認有優勢的差異(圖28A-C)。在探測實驗中，在Tau蛋白病模型小鼠和野生型小鼠之間，Tau蛋白病模型小鼠在靶點的鄰近孔周圍及靶點的孔周圍的停留時間短(圖28D)。(22)對Tau蛋白病模型小鼠及野生型小鼠的腦組織的Tau蛋白的表達對於Tau蛋白病模型小鼠和野生型小鼠的腦組織中的Tau蛋白的表達水平的比較在病理組織學上進行了探討。雖然沒有確認有Tau蛋白的聚集圖像或包含體，但是，與野生型小鼠相比，在Tau蛋白病小鼠的腦組織中顯著地確認有磷酸化Tau蛋白(圖24)。可以認為，較多地看到酸化Tau的帯狀回皮質、大腦皮質扁桃核、海馬等與不安障礙有關，海馬與記憶障礙有夫，因此暗示這些組織中磷酸化Tau蛋白的積累可能導致呈現行為異常。エ業上的可應用性本發明的疫苗在Tau蛋白異常地積累於中樞神經系而引起的疾病(Tau蛋白病)的症狀中，尤其是對Tau蛋白病型痴呆症的改善是有效的，因此，醫療上是有用的。序列表自由文本
序列號4 11引物序列號12、13合成DNA 將本說明書中引用的全部的出版物、專利及專利申請通過引用併入本說明書中。
權利要求
1.一種Tau蛋白病的預防或治療用疫苗，該疫苗包含含有編碼連接於分泌信號序列的突變體Tau蛋白的核酸的載體作為有效成分，其中，所述突變體Tau蛋白包含在Tau蛋白的胺基酸序列中對應於選自由序列號I的257位、260位、266位、272位、279位、280位、284位、296 位、301 位、303 位、305 位、315 位、317 位、320 位、335 位、336 位、337 位、342 位、352位、369位、389位及406位構成的組中的至少I個位置的位置的胺基酸殘基的突變，並且與突變體Tau蛋白的直接施用相比，該載體在受試者中可以更持續地誘導對Tau蛋白的抗體。
2.如權利要求I所述的疫苗，其中，所述突變為選自由K257T、I260V、L266V、G272V、N279K、K280 Δ、L284L、N296 Δ、N296H、P301L、P301S、G303V、S305N、L315R、K317M、S320F、G335S、G335V、Q336R、V337M、E342V、S352L、K369I、G389R 及 R406W 構成的組中的至少 I 種突變，其中△為缺失。
3.如權利要求I或2所述的疫苗，其中，所述突變至少包含P301L、P301S或P301T的突變。
4.如權利要求I 3中任一項所述的疫苗，其中，所述分泌信號序列為澱粉樣前體蛋白信號序列或CD59信號序列。
5.如權利要求I 4中任一項所述的疫苗，其中，所述載體為仙臺病毒載體。
6.如權利要求I 4中任一項所述的疫苗，其中，所述載體為質粒載體。
7.如權利要求I 6中任一項所述的疫苗,該疫苗被配製為用於鼻內施用。
8.如權利要求I 7中任一項所述的疫苗，該疫苗具有改善Tau蛋白病型痴呆症的作用。
9.如權利要求I 8中任一項所述的疫苗，該疫苗在受試者中具有改善社會行為異常、焦慮行為異常及記憶障礙的至少I種症狀的作用。
10.如權利要求I 9中任一項所述的疫苗，其中，該疫苗具有將受試者腦內的小神經膠質細胞活化、由此抑制突變體Tau蛋白的積累的作用。
11.如權利要求I 10中任一項所述的疫苗，其中，Tau蛋白是磷酸化的。
全文摘要
本發明涉及一種Tau蛋白病的預防或治療用疫苗，該疫苗包含含有編碼連接於分泌信號序列的突變體Tau蛋白的核酸的載體作為有效成分，其中，與突變體Tau蛋白的直接施用相比，該疫苗在受試者中可以更持續地誘導對Tau蛋白(任選地磷酸化的)的抗體。
文檔編號A61P25/14GK102711812SQ201180005511
公開日2012年10月3日 申請日期2011年1月11日 優先權日2010年1月8日
發明者井上治久, 季斌, 樋口真人, 竹內啟喜, 須原哲也, 高橋良輔 申請人:國立大學法人京都大學, 獨立行政法人放射線醫學綜合研究所