丹參水溶性提取物、其製劑及用途的製作方法

2023-04-25 05:25:56 1

專利名稱：：丹參水溶性提取物、其製劑及用途的製作方法
技術領域：
：本發明涉及中藥提取物、其製劑及用途領域，特別涉及丹參提取物、其製劑及用途領域。
背景技術：
：近年來，心腦血管疾病逐年增加，已成為危害人類健康的第一殺手。尋找和研製有效的心血管疾病治療藥物已經成為藥物研究領域的熱點問題。傳統中藥因其療效好、副作用小，得到越來越多的關注，其中，研究比較多的是丹參及其製劑。丹參是唇形科植物丹參(SalviamiltiorrhizaB皿ge)的乾燥根及根莖，是傳統的活血化淤中藥之一，有長期的臨床應用基礎。丹參注射液是臨床上治療冠心病、心絞痛、心肌梗塞、缺血性中風等的常用藥物，但現有製劑因有效成分不明確，質量控制指標不嚴格等，導致臨床療效不穩定，不良反應時有發生，不符合中藥現代化和國際化的要求。
發明內容本發明提供了一種組分清楚、藥效明顯且剌激作用的丹參水溶性提取物。本發明述的提取物，其中總酚酸的重量百分含量為80_100%，其特徵在於它含有丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸E，其含量百分含量分別為40X-90%%、3.0-15%、2-10%、0.2-2.2%。本發明的提取物，其優選為其中總酚酸的重量百分含量為80-100%，其特徵在於它含有丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸E，其含量百分含量分別為45%-80%%、3.0-12%、2-8%、0.2_2.2%。本發明的提取物，更優選為其中總酚酸的重量百分含量為80-96%，其特徵在於它含有丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸E，其含量百分含量分別為45-70%、3.0-6.0%、2.3-5.0%、0.2-2.2%。本發明的提取物，是按照包括如下步驟的方法製備的(1)丹參用水或含水乙醇提取；(2)提取液在除去乙醇後經聚醯胺層析或非極性或弱極性大孔樹脂層析或聚醯胺與大孔樹脂組合進行純化。優選的方法包括如下步驟(1)丹參用含水乙醇，提取液濃縮至無醇；(2)提取物經過聚醯胺層析，用水或30%以下的乙醇洗去雜質，以30-100%乙醇或O.01-0.5%碳酸氫鈉或0.01-0.5X碳酸鈉洗脫，收集洗脫液，調節pH值不高於5.5，通過大孔樹脂柱，水洗或20%以下乙醇洗去雜質，30-100%乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮、乾燥，即得。最優選的方法包括如下步驟(1)丹參用濃度20%_90%乙醇提取，提取液濃縮至無醇；(2)提取物經過聚醯胺層析，用水或30%以下的乙醇洗去雜質，以30_95%乙醇或0.05-0.3%碳酸氫鈉或0.01-0.3%碳酸鈉洗脫，收集洗脫液，調pHl-5.5，通過弱極性或非3極性大孔樹脂柱，水洗或20%以下乙醇洗去雜質，30-95%乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮、乾燥，即得。還提供用本發明的中藥有效組分作為藥物活性成分製備成的藥物組合物，本發明的藥物組合物，包括有效組分，根據需要該組合物還可以加入藥物可接受的載體。本發明的組合物，是單位劑量的藥物製劑形式，所述單位劑量形式是指製劑的單位，如片劑的每片，膠囊的每粒膠囊，口服液的每瓶，顆粒劑每袋等。本發明的組合物其中的有效組分，其在製劑中所佔重量百分比可以是0.1-99.9%，其餘為藥物可接受的載體。本發明的組合物，通過將上述有效組分和藥物可接受的載體混合製備得到。本發明的組合物，其藥物製劑形式可以是任何可藥用的劑型，這些劑型包括片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、衝劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、軟膏劑、硬膏劑、霜劑、噴霧劑、滴劑、貼劑。本發明的製劑，優選的是口服劑型，如膠囊劑、片劑、口服液、顆粒劑、丸劑、散劑、丹劑、膏劑等。本發明的組合物，其口服給藥的製劑可含有常用的賦形劑，諸如粘合劑、填充劑、稀釋劑、壓片劑、潤滑劑、崩解劑、著色劑、調味劑和溼潤劑，必要時可對片劑進行包衣。適用的填充劑包括纖維素、甘露糖醇、乳糖和其它類似的填充劑。適宜的崩解劑包括澱粉、聚乙烯吡咯烷酮和澱粉衍生物，例如羥基乙酸澱粉鈉。適宜的潤滑劑包括，例如硬脂酸鎂。適宜的藥物可接受的溼潤劑包括十二烷基硫酸鈉。可通過混合，填充，壓片等常用的方法製備固體口服組合物。進行反覆混合可使活性物質分布在整個使用大量填充劑的那些組合物中。口服液體製劑的形式例如可以是水性或油性懸浮液、溶液、乳劑、糖漿劑或酏劑，或者可以是一種在使用前可用水或其它適宜的載體復配的乾燥產品。這種液體製劑可含有常規的添加劑，諸如懸浮劑，例如山梨醇、糖漿、甲基纖維素、明膠、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、硬脂酸鋁凝膠或氫化食用脂肪，乳化劑，例如卵磷脂、脫水山梨醇一油酸酯或阿拉伯膠；非水性載體(它們可以包括食用油)，例如杏仁油、分餾椰子油、諸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐劑，例如對羥基苯甲酯或對羥基苯甲酸丙酯或山梨酸，並且如果需要，可含有常規的香味劑或著色劑。對於注射劑，製備的液體單位劑型含有本發明的活性物質和無菌載體。根據載體和濃度，可以將此化合物懸浮或者溶解。溶液的製備通常是通過將活性物質溶解在一種載體中，在將其裝入一種適宜的小瓶或安瓿前過濾消毒，然後密封。輔料例如一種局部麻醉齊U、防腐劑和緩衝劑也可以溶解在這種載體中。為了提高其穩定性，可在裝入小瓶以後將這種組合物冰凍，並在真空下將水除去。本發明的組合物，在製備成藥劑時可選擇性的加入適合的藥物可接受的載體，所述藥物可接受的載體選自甘露醇、山梨醇、焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、鹽酸半胱氨酸、巰基乙酸、蛋氨酸、維生素C、EDTA二鈉、EDTA鈣鈉，一價鹼金屬的碳酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽或其水溶液、鹽酸、醋酸、硫酸、磷酸、胺基酸、氯化鈉、氯化鉀、乳酸鈉、木糖醇、麥芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、澱粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、矽衍生物、纖維素及其衍生物、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土溫80、瓊脂、碳酸鈣、碳酸氫鈣、表面活性劑、聚乙二醇、環糊精、13_環糊精、磷脂類材料、高嶺土、滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂等。本發明的組合物在使用時根據病人的情況確定用法用量，可每日服三次，每次1-20劑，如:1-20袋或粒或片。本發明還提供了上述丹參水溶性提取物在製備治療心腦血管疾病中的應用。其中所述的心腦血管疾病可以是腦缺血性疾病，特別是腦梗塞，它能縮小腦梗塞面積，減輕腦梗塞後的腦功能障礙，改善學習記憶功能障礙，因此可用於腦梗塞後遺症，特還可以減輕腦水腫。所述的心腦血管疾病還可以是高凝血狀態。藥效試驗表明，上述丹參水溶性提取物對腦缺血有很好的治療作用，能減少腦梗塞面積、減輕腦水腫、減輕腦功能障礙、改善學習記憶功能障礙；另外，丹參水溶性提取物還有明顯的抗血栓和抗血小板聚集作用。藥效試驗本發明的試驗所用的丹參水溶性提取物都是採用實施例3的方法製備。藥效試驗1:對腦缺血的治療作用1.l試驗目的觀察權利要求所述丹參提取物對阻斷大腦中動脈造成的大鼠局灶性腦缺血的神經功能症狀、腦梗塞面積及腦含水量的影響。1.2試驗材料1.2.1動物Wistar雄性大鼠，體重280-330克。合格證號醫動字第01-3008號。1.2.2儀器KW65-3A型高頻電刀由北京醫用電子儀器廠生產；SXP-1B型手術顯微鏡為上海醫用光學儀器廠產品；恆溫水浴箱為產品；P/G2003-培養/乾燥箱由重慶試驗設備廠生產。1.2.3藥品與試劑丹參水溶性提取物批號20021008丹參水溶性提取物粉針劑批號20021201，(每135mg含丹參水溶性提取物100mg)複方丹參注射液為黃山天目藥業股份有限公司產品，批號990506。四氮唑蘭(TTC)由中國人民解放軍軍事醫學科學院生產，化學純，批號870401。1.2.4被測藥物配製方法丹參水溶性提取物粉針劑，丹參水溶性提取物用滅菌生理鹽水配成所需濃度。1.2.5被測藥物劑量及給藥途徑丹參水溶性提取物粉針劑27、13.5、6.75mg/Kg，丹參水溶性提取物20、10、5mg/Kg複方丹參注射液2、lg/Kg，均由舌下靜脈注射。1.2.6試驗組的設置採用雄性Wistar大鼠，隨機分為9組假手術組，對照組(iv生理鹽水)，丹參水溶性提取物粉針劑27、13.5、6.75mg/Kg3組，丹參水溶性提取物(981008)20、10、5mg/Kg3組，及複方丹參注射液2、lg/Kg2組。1.2.7被測藥物的保存方法臨用時稀釋，4t:冰箱保存，連續使用3天。1.3試驗方法1.3.1大鼠局灶性腦缺血試驗大鼠經水合氯醛350mg/Kgip麻醉後，左側臥位固定於鼠板上，於手術顯微鏡下沿外耳道與眼眥連線中點切開皮膚，暴露出顴弓，用小牽張器將鱗狀骨和下頜骨間距撐開，與顱骨底開一lcmXlcm的骨窗，撕開硬腦膜，暴露出大腦中動脈，用高頻電刀電凝阻斷一側大腦中動脈造成局部腦缺血，逐層縫合切口。術中、術後室溫嚴格控制在2425°C。除假手術組外，其他各組均阻斷一側大腦中動脈。在阻斷一側大腦中動脈30min後，由舌下靜脈給藥，24h後，參照文獻方法判斷神經症狀，然後斷頭取腦，測定腦含水量。另取Wistar雄性大鼠，分組及給藥同前，在阻斷一側大腦中動脈後24h，斷頭取腦，參照文獻方法測定腦梗塞面積。1.3.2腦梗塞面積的測定將剝離完整的大腦放入4t:冰箱內盛有生理鹽水的小杯中，10min後，去除嗅球、小腦及低位腦幹，沿冠狀面切為5片，立即放入TTC染色液中，避光在37t:水浴中溫孵30min。取出腦片放入10%福馬林液中固定。正常組織為玫瑰紅色，缺血組織呈白色。用重量求積法測定梗塞面積，計算梗塞區域佔全腦面積的百分比。1.3.3神經症狀評分判斷標準a.提起大鼠尾部，觀察兩前肢情況，正常動物兩前肢向前伸直並且對稱。手術後，腦缺血半球的對側前肢內收，肩內旋。觀察其程度不同評為0-4分。b.牽拉兩肢，正常大鼠肌力對稱，手術後腦缺血半球的對側前肢肌無力，觀察其程度不同評為0-3分。c.推兩肩，正常大鼠為雙側肩阻力對稱，手術後腦缺血半球的對側肩阻力下降，觀察其程度不同評為0-3分。根據以上標準，滿分為10分，分數越高，說明腦功能障礙越嚴重。以此作為腦功能障礙的指標。1.3.4腦含水量的測定用乾濕法測定腦含水量。動物處死後，取出全腦，去除嗅腦，低位腦幹及小腦，立即稱取腦溼重，置12(TC烘箱中烘烤18h至衡重後稱腦幹重。腦含水量公式為腦含水量(％)=(腦溼重_腦幹重)/腦溼重*100%1.4實驗結果1.4.1丹參水溶性提取物針劑及丹參水溶性提取物對MCAO大鼠腦梗塞面積的影響如表1所示，丹參水溶性提取物20、10mg/Kg，丹參水溶性提取物粉針劑27、13.5mg/Kgiv，可顯著縮小大鼠MCAO24h後的腦梗塞面積，與對照組比較，有顯著差異。且二者作用相當，無顯著性差別。丹參水溶性提取物10mg/Kg、丹參水溶性提取物粉針劑13.5mg/Kg與複方丹參注射液2g/Kg作用相當。表1.丹參水溶性提取物及丹參水溶性提取物粉針劑iv對MCAO大鼠腦梗塞面積的影響tableseeoriginaldocumentpage7*p<0.05，**p<0.01與對照組比較n=101.4.2丹參水溶性提取物及丹參水溶性提取物粉針劑對MCA0大鼠神經功能症狀的影響對照組大鼠麻醉清醒後即有偏癱樣症狀出現，主要表現為手術對側前肢內收、肩內旋、前肢肌張力下降，向手術對側推動時抵抗阻力下降。丹參水溶性提取物20、10mg/Kg，丹參水溶性提取物粉針劑27、13.5mg/Kg，可顯著改善神經功能症狀，與對照組比較，有顯著差異，且二者作用相當，無顯著性差別。丹參水溶性提取物10mg/Kg、丹參水溶性提取物粉針劑13.5mg/Kg與複方丹參注射液2g/Kg作用相當。表2.丹參水溶性提取物針劑及丹參水溶性提取物對MCAO大鼠神經功能症狀的影響tableseeoriginaldocumentpage7tableseeoriginaldocumentpage8*p<0.05，**p<0.01與對照組比較n=101.4.3丹參水溶性提取物及丹參水溶性提取物粉針劑對MCA0大鼠腦含水量的影響如表3所示，阻斷大鼠一側中動脈24h後，對照組的腦含水量為82.82±1.29，而假手術組的腦含水量為80.91±0.79，二者相比有顯著差別，提示阻斷一側中動脈24h後，阻斷側腦半球形成了嚴重水腫。丹參水溶性提取物20、10mg/Kg，丹參水溶性提取物粉針劑27、13.5mg/Kg，可顯著減輕缺血性腦水腫，且二者作用相當，無顯著性差別。丹參水溶性提取物10mg/Kg、丹參水溶性提取物粉針劑13.5mg/Kg與複方丹參注射液注射2g/Kg作用相當。表3.丹參水溶性提取物針劑及丹參水溶性提取物iv對MCAO大鼠腦含水量的影響組別劑量(fflg/kg)腦含水量[(%)假手術組80.91土0.79林對照組82.82土1.29丹參水溶性提取物粉針2780.99土0.90林劑13.581.52土1.07*6.7582.Ol土O.85丹參水溶性提取物2081.OO土O.86**1081.50土0.87*582.07土1.02複方丹參注射液200081.55土0.61*100082.42+0.92*p<0.05，**p<0.01與對照組比較n=101.5實驗結論1.5.1用電燒灼法阻斷大鼠一側大腦中動脈(MCA0)造成大鼠局部腦缺血，且在阻斷側腦半球形成了嚴重水腫。1.5.2丹參水溶性提取物20、10mg/Kg，丹參水溶性提取物粉針劑27、13.5mg/Kgiv，可顯著改善神功能症狀，與對照組比較，有顯著差異，丹參水溶性提取物與丹參水溶性提取物針劑二者作用相當，無顯著差別。丹參水溶性提取物10mg/Kg，丹參水溶性提取物粉針劑13.5mg/Kg與複方丹參注射液2g/Kg作用相當。1.5.3丹參水溶性提取物20、10mg/Kg，丹參水溶性提取物粉針劑27、13.5mg/Kgiv，可顯著縮小大鼠MCAO24h後的腦梗塞面積，與對照組比較，有顯著差異，且二者作用相當，無顯著性差別。丹參水溶性提取物10mg/Kg、丹參水溶性提取物粉針劑13.5mg/Kg與複方丹參注射液2g/Kg作用相當。1.5.4丹參水溶性提取物20、10mg/Kg，丹參水溶性提取物粉針劑27、13.5mg/Kgiv，可顯著減輕缺血性腦水腫，而其小劑量作用不明顯；丹參水溶性提取物與丹參水溶性提取物粉針劑二者作用相當；丹參水溶性提取物20、10mg/Kg，丹參水溶性提取物粉針劑13.5mg/Kg、與複方丹參注射液2g/Kg作用相當。藥效試驗2丹參水溶性提取物對凝血系統功能的影響2.1動物昆明種雄性小鼠，24-28克，購自中國醫學科學院動物中心2.2藥物丹參水溶性提取物分別配成3mg/10ml，6mg/10ml，10mg/10ml複方丹參注射液配成200mg/10ml，2000mg/10ml以上藥液均按0.lml/10g尾靜脈注射2.3方法將小鼠隨機分為六組，分別尾靜脈注射生理鹽水、複方丹參注射液200mg/kg、2000mg/kg，丹參水溶性提取物3mg/kg、6mg/kg、1Omg/kg;半小時後將小鼠用摘眼球法取血，滴血在載玻片上測定凝血時間，其餘血用3.8%檸檬酸鈉抗凝送檢測定血小板、凝血酶原及纖維蛋白原。2.4結果靜脈注射複方丹參注射液200mg/kg、2000mg/kg，丹參水溶性提取物3mg/kg、6mg/kg、10mg/kg對凝血時間、血小板、凝血酶原及纖維蛋白原均無影響。靜脈注射丹參水溶性提取物對小鼠凝血時間的影響(n=10)tableseeoriginaldocumentpage10靜脈注射丹參水溶性提取物對小鼠凝血酶原的影響(n=5)劑量(mg/kg)凝血酶原(s士SD)tableseeoriginaldocumentpage112.5小結丹參水溶性提取物有明顯的抗血栓和抗血小板聚集作用，但對凝血系統沒有影響；複方丹參注射液即無抗血栓作用也不影響凝血系統功能。藥效試驗3丹參水溶性提取物對腦缺血再灌注小鼠學習記憶功能障礙的改善作用3.1試驗目的研究丹參水溶性提取物對缺血再灌注小鼠的學習記憶功能障礙的改善作用和耐缺氧能力的影響。3.2試驗材料3.2.1受試藥物丹參水溶性提取物，用生理鹽水配成濃度為3mg/kg、6mg/kg和10mg/kg的溶液。複方丹參注射液，北京第四製藥廠生產，批號990101.3.2.2動物昆明種小鼠，$，體重23士4g，共84隻，中國醫學科學院試驗動物中心提供。合格證醫動字第01-30083.2.3實驗儀器小鼠跳臺實驗自動記錄儀，中國醫學科學院儀電室製造.3.3試驗方法小鼠隨機分為七組假手術組，對照組(iv等容量生理鹽水)，複方丹參注射液組(分別iv丹參注射液50mg/kg，200mg/kg，2g/kg)，丹參水溶性提取物組(分別iv總丹參水溶性提取物3mg/kg，6mg/kg，10mg/kg)，每組12隻，以戊巴比妥鈉(60mg/kg，ig)麻醉後，仰臥位固定。頸正中切口，分離雙側頸總動脈，並穿以零號絲線。雙側頸總動脈阻斷血流10min，然後恢復血流lOmin，如此重複三次，縫合皮膚，術後小鼠正常飼養[1]。假手術組只分離雙側頸總動脈。缺血再灌注後lOmin，尾靜脈注射藥物，每天一次，連續三天。第二天給藥半小時後進行跳臺實驗[2]。將待測小鼠放入跳臺儀中，適應環境3min，然後向底部柵板通電，觀察小鼠跳上高臺時間(反應時間)和5min內小鼠由高臺跳下受到電擊的次數(訓練期錯誤次數)。24小時後，將小鼠放於實驗儀高臺上，底部柵板同時通電，記錄小鼠跳下高臺的時間(潛伏期)，和5min內受到電擊次數(重測期錯誤次數)。缺血再灌注小鼠分組與給藥方法同上，採用斷頭法完全中斷全腦血液供應，觀察小鼠全腦停止供血後張口呼吸持續時間。3.4試驗結果上述結果用X士S表示，組間比較用t檢驗。3.4.1丹參水溶性提取物iv對小鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用跳臺試驗主要是觀察訓練後24小時記憶獲得障礙的影響，訓練期的反應時間和錯誤次數僅供參考.如表1示，與對照組相比，丹參水溶性提取物3mg/kg可減少反應時間(P<0.05)，延長潛伏期(P<0.05)，減少重測期錯誤次數(P<0.01);丹參水溶性提取物6mg/kg可延長潛伏期(P<0.01)，減少重測期錯誤次數(P<0.01);丹參水溶性提取物10mg/kg可減少反應時間(P<0.001)，延長潛伏期(P<0.01)，減少測試期和重測期錯誤次數(分別為P〈0.05，P<0.01)。複方丹參注射液50mg/kg可減少反應時間(P<0.05)，減少訓練期錯誤次數(P<0.05)，複方丹參注射液200mg/kg可延長潛伏期(P<0.01)，減少訓練期和重測期錯誤次數(P<0.05，p<0.01)，複方丹參注射液2g/kg可減少反應時間(P<0.001)，可延長潛伏期(P<0.001)，減少訓練期和重測期錯誤次數(分別為p<0.001，p<0.01)，表1丹參水溶性提取物和複方丹參注射液iv對小鼠腦缺血再灌注損傷引起的記憶障礙的保護作用tableseeoriginaldocumentpage12假手術組對照組複方丹參注射液複方丹參注射液複方丹參注射液丹參水溶性提取物丹參水溶性提取物丹參水溶性提取物NS502002000101010111110127.2±5.5林24.1±15.38.8±7.3*20.1±16.46.5±4.3**11.4±8.7*17.6±15.14.9±2.8氺傘承2.9±1.5氺6.2±3.52.7±1.42.8±2.21.4±1.3氺本氺3.7±2.53.5±3.33.4±2.6249.8±99.7林91.4±114.70.4±1.0**2.5±1.7175.4±97.21.3±1.0249.8±67,3*求252.8±66.7氺氺氺195.5±78.3*243.9±86.2**245.3±81.l林0.5±0.7**0.5±0.7**0,9±0.5**0.5±0.7林0.7±1.0***P<0.05**P<0.01***P<0.001VS.對照組3.4.2丹參水溶性提取物iv對腦缺血再灌注小鼠的耐缺氧能力的影響如表2示，與對照組相比，丹參水溶性提取物3mg/kg，6mg/kg，10mg/kg和複方丹參注射液50mg/kg，200mg/kg，2g/kg皆可顯著提高腦缺血再灌注小鼠的耐缺氧能力(p<0.001).表2丹參水溶性提取物和複方丹參注射液iv對腦缺血再灌注小鼠耐缺氧能力的影響13tableseeoriginaldocumentpage14丹參水溶性提取物101221.1±2.6****P<0.05***P<0.001VS.對照組3.5試驗結論丹參水溶性提取物3mg/kg，6mg/kg，lOmg/kg可改善腦缺血再灌注小鼠的學習記憶，顯著提高其耐缺氧能力，丹參水溶性提取物10mg/kg的作用與複方丹參注射液2g/kg的作用相當。藥效試驗4丹參水溶性提取物對大鼠中腦動脈血栓的實驗研究4.1試驗目的觀察丹參水溶性提取物對大鼠大腦中動脈血栓所致局部腦缺血性損傷的保護作用4.2試驗材料4.2.1受試藥物丹參水溶性提取物，，批號981008，用生理鹽水配成所需濃度；複方丹參注射液，北京第四製藥廠生產，批號990101，以生理鹽水稀釋至所需濃度。4.2.2動物雄性Wistar大鼠，二級，體重240-260g，共64隻，由中國醫學科學院實驗動物中心提供，合格證醫動字第01-30084.2.3實驗儀器SXP型手術顯微鏡為上海醫用光學儀器廠產品；恆溫水浴振蕩器為江蘇省太倉縣醫療器械廠生產，SHZ-22型；石蠟切片機為美國AO公司。4.3試驗方法4.3.1大鼠大腦中動脈血栓模型大鼠以12X水合氯醛350mg/kgip.麻醉後，置於鼠板上，於手術顯微鏡下延右側外耳道與眼眥連線中點切開皮膚，暴露出顴弓，用小牽張器將磷狀骨和下頜骨間距撐開，於顱底開一lcmXlcm的骨窗，撕開硬腦膜，暴露出右側位於嗅束和大腦下靜脈之間的一段大腦中動脈，置一小片塑料薄膜保護血管周圍腦組織，將吸有50%三氯化鐵溶液(lmol/L鹽酸)10iiL的小片定量濾紙(2X2mm)敷在此段大腦中動脈上，30min後取下濾紙，用生理鹽水衝洗局部組織，逐層縫合，回籠飼養。術中術後室溫均嚴格控制在24-25°C。4.3.2動物分組取Wistar雄性大鼠，隨機分為8組，每組動物8隻，假手術組(生理鹽水)，模型組(生理鹽水)，丹參水溶性提取物組(丹參水溶性提取物3、6、及10mg/kg)及複方丹參注射液組(丹參50、200mg/kg和2000mg/kg)假手術組除在大腦中動脈敷生理鹽水外，其餘手術操作同模型組。各組在術後30分鐘由舌下靜脈給藥一次，24小時後參照文獻方法判斷神經症狀，然後斷頭取腦，測定腦梗塞面積。4.3.3神經症狀的評分手術後24小時對每隻動物進行評分，根據其症狀嚴重程度分3級共10分。具體方法如下(表1):表1.神經症狀評分tableseeoriginaldocumentpage15根據以上標準，滿分為10分，分數越高，說明腦功能障礙越嚴重。4.3.4腦梗塞面積的測定動物經神經症狀評分後，斷頭取腦。剔除嗅腦、低位腦幹及小腦，剩餘部分在冰上沿冠狀面切成厚度基本相同的5片，於37°CTTC染料中溫浴30分鐘，正常腦組織呈玫瑰紅色，梗塞區呈白色。然後將腦片置於10%的甲醛中固定，將白色組織仔細取下稱重，以梗塞組織重量佔總腦重量的百分比作為梗塞面積。4.3.5腦組織形態學觀察動物於術後24小時，斷頭取材，取大腦中動脈血栓形成部位用4%多聚甲醛中固定，乙醇脫水，石蠟包埋，切片7ym，HE染色，光學顯微鏡下觀察。4.4試驗結果上述結果用X士S表示，組間比較用t檢驗。4.4.1丹參水溶性提取物對行為缺陷程度的影響丹參水溶性提取物6、10mg/kg可明顯減輕大鼠腦血栓24h後的神經症狀，與模型組比較有明顯差異(P<0.Ol，P0.05)。(表2)表2.丹參水溶性提取物對大鼠中動脈血栓模型的大鼠神經症狀的影響(n=8，x±s)tableseeoriginaldocumentpage16與模型組比較**P<0.01，***P0.05)。複方丹參注射液50、200和2000mg/kg均無明顯作用(P>0.05)。(表3)表3.丹參水溶性提取物對大腦中動脈血栓模型的大鼠腦梗塞面積的影響(n=8，x±s)tableseeoriginaldocumentpage17與模型組比較**P<0.01，***P<0.0014.4.3丹參水溶性提取物對腦組織形態學變化的影響模型組大鼠在手術24小時後，肉眼觀察病灶大腦中動脈皮層供血區蒼白，腦表面血管較對側充血，受損段大腦中動脈呈暗紫色，丹參水溶性提取物組6、10mg/kg大鼠經大腦中動脈血栓形成24小時後，病灶側腦表面未呈現明顯的蒼白、無光，受損段大腦中動脈較模型組紅潤。光鏡下觀察，模型組大腦中動脈內充滿血栓(圖l)，丹參水溶性提取物組6、10mg/kg脈血管內血栓減少，大劑量組作用更為明顯(圖5)。複方丹參注射液各組與模型組比較未見明顯差別(圖6，7，S)。4.5試驗結論本實驗用三氯化鐵局部塗抹損傷血管，從腦梗塞範圍和行為障礙為觀察指標判斷，形成了大鼠大腦中動脈血栓模型。丹參水溶性提取物6、10mg/kg於術後30分鐘靜脈注射，可明顯縮小腦血栓形成24小時後的腦梗塞範圍，改善行為障礙。腦組織病理形態觀察中，丹參水溶性提取物6，10mg/kg組動物大腦中動脈內血栓減少，大劑量組作用更為明顯。複方丹參注射液50、200和2000mg/kg均無明顯作用。說明丹參水溶性提取物可減輕腦血栓形成所致的腦缺血性損傷，為臨床治療腦血栓提供了實驗依據。藥效試驗5丹參水溶性提取物對大腦中動脈合併同側頸總動脈結紮大鼠皮層血流量的影響5.l實驗目的觀察丹參水溶性提取物對腦缺血大鼠皮層血流量的影響。5.2實驗材料5.2.1儀器lS-3型組織血流儀，北京立科技術公司生產；大鼠腦立體定位儀，西北光學儀器廠生產。5.2.2藥品複方丹參注射液，中國黃山天目藥業有限公司生產，批號990506;丹參水溶性提取物，批號9810085.2.3動物Wistar大鼠，雌雄各半，體重180-200克，由中國醫學科學院動物所實驗動物繁育廠提供，合格證編號醫動字第01-3008號。5.3實驗方法5.3.1大鼠腦缺血模型大鼠用25%烏拉坦(1250mg/kg)腹腔注射麻醉，切開頸正中皮膚，分離右側頸總動脈，在動脈下埋線並打活結，以備結紮。在右側眼眶後皮膚作一個1.5cm長的切口，剝離並切除顳肌，暴露顳鱗骨，在顳鱗骨接縫處用牙科鑽作直徑2.5mm的骨窗，暴露大腦中動脈主幹，以備凝閉。切開顱頂皮膚，在右側顱頂前囟中心後lmm，旁開2mm處用牙科鑽作直徑2.5mm骨窗，以備插測量電極；分離頸後皮膚，以備插參比電極。5.3.2分組及給藥實驗共分7組，分別是假手術組，模型組，複方丹參注射液0.2g/kg及2g/kg，丹參水溶性提取物3mg/kg，6mg/kg及10mg/kg組。所有藥物均用生理鹽水溶解，給藥途徑為舌下靜脈注射，給藥體積為2ml/kg體重。藥物於大腦中動脈凝閉及頸總動脈結紮後30分鐘時給入，其中模型及假手術組給予相同體積的生理鹽水。5.3.3測定過程將大鼠固定於腦立體定位儀，參比電極置於頸背部皮下，測量電極通過顱頂骨窗置於皮層下O.8mm，測定正常血流，然後將大鼠頸總動脈結紮，並將大腦中動脈凝閉，30分鐘後舌下靜脈給藥，分別於給藥後15分鐘及30分鐘測定血流。5.3.4結果處理為排除個體差異計算相對血流，結果用組間比較，t檢驗。相對血流=(結紮後血流/結紮前血流)X100%。5.4實驗結果結果見表l表1丹參水溶性提取物靜脈注射對大腦中動脈凝閉合併同側頸總動脈結紮大鼠皮層血流量的影響tableseeoriginaldocumentpage18注與模型組相比，*p<0.05，**p<0.01結果顯示，單側大腦中動脈凝閉合併同側頸總動脈結紮後缺血區皮層血流明顯減少(p<0.01)，丹參水溶性提取物6mg/kg及10mg/kg組皮層血流明顯恢復(p0.05)，結果提示丹參水溶性提取物有改善缺血區皮層血流作用。5.5試驗結論本實驗採用單側大腦中動脈凝閉合併同側頸總動脈結紮造成大鼠局灶腦缺血，採用氫氣清除法測定缺血前後中動脈供血區血流變化，並觀察丹參水溶性提取物的作用，結果發現，血管被凝閉及結紮後皮層血流明顯減少，約為正常值的50%左右，並且隨時間有進一步下降趨勢，舌下靜脈給予丹參水溶性提取物6mg/kg及10mg/kg能明顯提高缺血區皮層血流，使其下降的幅度明顯降低。表明丹參水溶性提取物能改善腦缺血區血流供應。藥效試驗6丹參水溶性提取物對血小板聚集功能的影響6.1試驗目的研究丹參水溶性提取物對血小板聚集功能的影響。6.2試驗材料6.2.1受試藥物丹參水溶性提取物，用生理鹽水配成濃度為3mg/kg、6mg/kg和10mg/kg的溶液。複方丹參注射液，北京第四製藥廠生產，批號990101。膠原，取剃毛後的一塊大鼠皮膚，剝離乾淨，剪碎，按溼重每0.lg加入lml生理鹽水，磨成勻漿，以3000轉/min離心10min，吸取上清液，放置冰箱(4°C)備用.ADP，Sigma，用0.1MPBS配成0.5mM的溶液。花生四烯酸(AA)，Fluka，瑞士，批號287300，先用少量無水乙醇溶解，再加入等當量Na2C03，用0.1MPBS配成32.8mM的溶液。6.2.2動物Wistar大鼠，$，體重180320g，中國醫學科學院實驗動物中心提供，合格證醫動字第01-3008。6.2.3實驗儀器血小板聚集儀，NKKHEMATRACER1，日本。6.3試驗方法6.3.l體外給藥實驗用1%矽油矽化攪拌棒、試管、離心管等。大鼠用12%水合氯醛麻醉(360mg/kg)，頸動脈取血，每ml血加10%抗凝劑(3.8%枸櫞酸鈉)，1100轉/min，離心5min，連續離心兩次，吸出上層合併即PRP。餘下的再以3000轉/min離心10min，上層艮PPPP。用PPP稀釋PRP，PRP:PPP=3:l，用PRP調100X，PPP調零。每管加入160ii1PRP，加入20iU生理鹽水或藥物，溫育5min，再加入誘導劑(ADP為5iU，膠原和花生四烯酸為20ii1)，按比濁法測定血小板聚集性。6.3.2體內給藥實驗將大鼠隨機分為6組對照組，舌下靜脈注射等容量生理鹽水；丹參水溶性提取物組，分別舌下靜脈注射丹參水溶性提取物3mg/kg、6mg/kg和10mg/kg;複方丹參注射液組，分別舌下靜脈注射複方丹參注射液200mg/kg和2g/kg。大鼠麻醉後，給予不同劑量的藥物，半小時後分離PRP和PPP，方法同上。用PPP稀釋PRP，使計數達3X10"個血小板/L。每管加入160ii1PRP，加入20iU生理鹽水，溫育5min，再加入誘導劑(ADP為5ii1，膠原為20iU)，測定血小板聚集性。6.4試驗結果上述結果用X±S表示，組間比較用t檢驗。6.4.1丹參水溶性提取物體外給藥對血小板聚集的影響19丹參水溶性提取物可抑制膠原誘導的血小板聚集，擬合方程為Y=-235.96X+82.341，IC50=0.22mg/ml，丹參水溶性提取物可抑制ADP誘導的血小板聚集，擬合方程為Y=-17.904X+74.138，IC50=2.30mg/ml，丹參水溶性提取物可抑制AA誘導的血小板聚集，擬合方程為Y=-15.355X+94.521，IC50=3.65mg/kg(見附圖1、2和3)。表1丹參水溶性提取物體外給藥對血小板聚集的影響(X±S，n=3-4)tableseeoriginaldocumentpage20*P<0.05**P<0.01***P<0.001VS.對照組^n方丹參複方丹參注射液。6.4.2丹參水溶性提取物體內給藥對血小板聚集的影響如表所示，丹參水溶性提取物6mg/kg、10mg/kg可完全抑制膠原誘導的血小板聚集(P<0.001)，丹參水溶性提取物10mg/kg可顯著地抑制ADP誘導的血小板聚集(P0.05)。表丹參水溶性提取物對膠原和ADP誘導的血小板聚集的影響(X±S，n=8)tableseeoriginaldocumentpage21***P<0.001VS.對照組6.5試驗結論丹參水溶性提取物體外給藥可抑制膠原、ADP和花生四烯酸(AA)誘導的血小板聚集，體內給藥，丹參水溶性提取物6mg/kg可完全抑制膠原誘導的血小板聚集，10mg/kg可顯著抑制ADP誘導的血小板聚集；複方丹參注射液200mg/kg和2g/kg體內給藥對膠原和ADP誘導的血小板聚集功能無抑制作用。6丹參水溶性提取物粉針劑的過敏試驗6.l試驗目的為檢查丹參水溶性提取物粉針劑是否會產生過敏作用，按《注射劑研製指導原則及有關規定彙編》的附件1要求，進行了如下豚鼠過敏試驗6.2試驗材料6.2.1藥物丹參水溶性提取物粉針劑，lOOmg/支，，各以生理鹽水配成應用液，濃度均為2mg/ml。6.2.2動物豚鼠，購自軍事醫學科學院，雌雄均有健康6.3試驗方法各批號取體重250-300克的健康豚鼠雌雄各三隻，連續3次，間日腹腔注射一次丹參水溶性提取物粉針劑應用液0.5ml/只。第14天和第21天時給予靜脈注射相同批號的丹參水溶性提取物粉針劑應用液1ml/只在注射後15分鐘內均不得出現過敏反應。如有豎毛、呼吸困難、噴嚏、乾嘔或咳嗽三聲等現象中的兩種或兩種以上者，或有羅音、抽搐、虛脫或死亡現象之一者，應判為陽性。6.4試驗結果本實驗三種批號981201-1,981201symbol151\f〃TimesNewRoman"2，981202-1連續3次，間日腹腔注射一次丹參水溶性提取物粉針劑應用液0.5ml/只，在第14天時給予豚鼠股靜脈注射濃度為2mg/ml丹參水溶性提取物粉針劑1ml/只，同時觀察動物有無過敏反應，觀察30分鐘，未見豚鼠發生豎毛，呼吸困難，噴嚏，乾嘔或咳嗽三聲；羅音，抽搐，虛脫或死亡現象，以上三種批號無過敏反應。本實驗三種批號981201-1，981201-2，981202-1連續3次，間日腹腔注射一次丹參水溶性提取物粉針劑應用液O.5ml/只，在第21天時給予豚鼠股靜脈注射濃度為2mg/ml丹參水溶性提取物粉針劑1ml/只，同時觀察動物有無過敏反應，觀察30分鐘，未見豚鼠發生豎毛，呼吸困難，噴嚏，乾嘔或咳嗽三聲；羅音，抽搐，虛脫或死亡現象，以上三種批號無過敏反應。6.5試驗結論以上三批藥物均未發現過敏反應。7丹參水溶性提取物剌激性試驗7.l試驗材料7.1.1.l試驗樣品丹參水溶性提取物批號20060601、20060801、20061101-2天津天士力之驕藥業有限公司生產氯化鈉注射液天津天安藥業股份有限公司批號2006052417.1.1.2試驗動物家兔北京科宇動物養殖中心許可證號SCXK(京)2007-00037.2肉眼觀察法7.2.l肌肉剌激性7.2.1.1試驗方法取體重2公斤以上健康家兔2隻，雌者無孕，分別在其左右兩腿股四頭肌內以無菌操作方法注射供試品溶液(l支注射用丹參總酚酸(凍幹)溶解到250ml0.9%氯化鈉注射液中)lml，48小時後，處死家兔，解剖取出股四頭肌，縱向切開，觀察注射給藥部位局部肌肉反應情況，如充血、紅腫、變性、壞死等。根據注射部位肌肉的剌激反應，按下表換算成相應的反應分值。反應級刺激反應0無明顯變化1輕度充血，直徑在O.5cmX1.0cm以下2中度充血，直徑在O.5cmX1.0cm以上3嚴重充血，紅腫，並伴有肌肉變性4出現壞死，有褐色變性5出現廣泛壞死7.2.1.2試驗結果見下表tableseeoriginaldocumentpage237.2.2血管剌激性7.1.2.2.l試驗方法取體重2.53.0kg健康、兩耳無損的家兔2隻，雌兔無孕，每隻家兔每日一側耳緣靜脈滴注供試品溶液(l支注射用丹參總酚酸(凍幹)溶解到250ml0.9%氯化鈉注射液中)40ml(滴速不超過40滴/min)，另一側為陰性對照，給予同等體積生理鹽水，連續給藥七次。肉眼觀察每天給藥前以及最後一次給藥後72小時對動物和注射部位進行肉眼觀察血管及周圍組織應無異常變化，應無充血、節結、水腫現象，並與生理鹽水側對照。最後一次給藥後72小時後將2隻動物處死，做組織學檢查。應無明顯病理變化。7.2.2.1試驗結果肉眼觀察結果見下表tableseeoriginaldocumentpage247.2.2.1試驗結論肉眼觀察無明顯剌激反應。7.3組織切片檢查7.3.1檢驗方法組織經修塊，梯度酒精脫水，石蠟包埋，切片厚度5M，HE染色，光鏡下檢查。7.3.2實驗方法7.3.2.1肌肉剌激性試驗(病理結果見附圖4-15)生理鹽水組給藥1次後48小時，第二組和第三組各有1隻動物局部少量肌纖維肌漿溶解壞死。其餘各只動物肌纖維排列整齊，橫紋清晰，未見變性、壞死及炎細胞浸潤等病理改變。受試藥物組給藥1次後48小時，第一組和第三組各有1隻動物局部少量肌纖維溶解壞死。其餘各只動物肌纖維排列整齊，橫紋清晰，未見變性、壞死及炎細胞浸潤等病理改變。7.3.2.2血管剌激性試驗(病理結果見附圖16-27)生理鹽水組連續給藥7天，末次給藥後72小時，第一組和第二組各有1隻動物注射血管部分內皮細胞輕度腫脹，少量內皮細胞脫落，其中第二組1隻動物血管周圍輕度水腫；第二組另1隻動物注射血管較明顯擴張，血管內皮細胞、血管壁及血管周圍未見明顯異常。其餘各只動物注射血管內皮光滑、完整，內皮細胞未見水腫、變性、脫落及增生，血管腔內未見血栓形成，血管壁及血管周圍未見炎細胞浸潤等病理改變。受試藥物組連續給藥7天，末次給藥後72小時，第二組有1隻動物注射血管部分內皮細胞輕度腫脹，少量內皮細胞脫落，血管壁及血管周圍未見明顯異常；第三組1隻動物注射血管明顯擴張，血管內皮細胞、血管壁及血管周圍未見明顯異常。其餘各只動物注射血24管內皮光滑、完整，內皮細胞未見水腫、變性、脫落及增生，血管腔內未見血栓形成，血管壁及血管周圍未見炎細胞浸潤等病理改變。7.3.3試驗結果7.3.3.1肌肉剌激性試驗鏡下檢查結果可見給藥後48小時，受試藥物第一組和第三組各有1隻動物局部少量肌纖維肌槳溶解壞死，生理鹽水組亦有2隻動物局部少量肌纖維肌槳溶解壞死。由於上述病變範圍較小，且受試藥物組與生理鹽水組比較沒有明顯組織學差異，分析此變化非受試藥物的剌激性，可能為機械剌激所致。7.3.3.2血管剌激性試驗鏡下檢查結果可見末次給藥後72小時，受試藥物第二組有1隻動物注射血管部分內皮細胞輕度腫脹，少量內皮細胞脫落；第三組1隻動物注射血管明顯擴張。生理鹽水組2隻動物注射血管部分內皮細胞輕度腫脹，少量內皮細胞脫落，其中1隻動物血管周圍輕度水腫；另見1隻動物注射血管較明顯擴張。上述病變受試藥物組與生理鹽水組比較沒有明顯組織學差異，分析為由於多次給藥機械損傷引起的病理改變，而非藥物的直接作用。7.3.2試驗結論7.3.3.1肌肉剌激性試驗受試藥物丹參水溶性提取物分為三組，每組2隻，分別給家兔臀部肌肉注射，給藥1次後48小時取材。結果表明三個組別的丹參水溶性提取物與生理鹽水組比較，對家兔的臀部肌肉未見明顯剌激性。7.3.3.2血管剌激性試驗受試藥物丹參水溶性提取物分為三組，每組2隻，分別給家兔耳部血管注射，連續給藥7天，於末次給藥後72小時取材。結果表明三個組別的丹參水溶性提取物與生理鹽水組比較，對家兔的耳部血管無明顯剌激性。圖1丹酚酸對膠原誘導的血小板聚集的影響丹參水溶性提取物可抑制膠原誘導的血小板聚集，擬合方程為Y=-235.96X+82.341，IC50=0.22mg/ml圖2丹酚酸對ADP誘導的血小板聚集的影響丹參水溶性提取物可抑制ADP誘導的血小板聚集，擬合方程為Y=-17.904X+74.138，IC50=2.30mg/ml圖3丹酚酸對花生四烯酸誘導的血小板聚集的影響丹參水溶性提取物可抑制AA誘導的血小板聚集，擬合方程為Y=-15.355X+94.521，IC50=3.65mg/kg圖4給藥1次後48小時，丹參水溶性提取物組1號動物臀部肌肉肌纖維排列整齊，橫紋清晰，未見明顯病理改變HEX200圖5給藥1次後48小時，生理鹽水組1號動物臀部肌肉肌纖維排列整齊，橫紋清晰，未見明顯病理改變HEX200圖6給藥1次後48小時，丹參水溶性提取物組2號動物臀部肌肉局部少量肌纖維肌漿溶解壞死HEX200圖7給藥1次後48小時，生理鹽水組3號肌纖維排列整齊，橫紋清晰，未見明顯病理改變HEX200圖8給藥1次後48小時，丹參水溶性提取物組3號動物臀部肌肉肌纖維排列整齊，橫紋清晰，未見明顯病理改變HEX200圖9給藥1次後48小時，生理鹽水組3號動物臀部肌肉局部少部分肌纖維壞死，少量肌漿溶解HEX200圖10給藥1次後48小時，丹參水溶性提取物組4號動物臀部肌肉肌纖維排列整齊，橫紋清晰，未見明顯病理改變HEX200圖11給藥1次後48小時，生理鹽水組4號動物臀部肌肉肌纖維排列整齊，橫紋清晰，未見明顯病理改變HEX200圖12給藥1次後48小時，丹參水溶性提取物組5號動物臀部肌肉肌纖維排列整齊，橫紋清晰，未見明顯病理改變HEX200圖13給藥1次後48小時，生理鹽水組5號動物臀部肌肉肌纖維排列整齊，橫紋清晰，未見明顯病理改變HEX200圖14給藥1次後48小時，丹參水溶性提取物組6號動物臀部肌肉局部少量肌纖維肌槳溶解壞死HEX200圖15給藥1次後48小時，生理鹽水組6號動物臀部肌肉局部少量肌纖維肌漿溶解壞死HEX200圖16末次給藥後72小時，生理鹽水組1號動物注射血管血管內皮光滑完整，管腔、管壁、管周未見明顯異常HEX100圖17末次給藥後72小時，丹參水溶性提取物組1號動物注射血管血管內皮光滑完整，管腔、管壁、管周未見明顯異常HEX100圖18末次給藥後72小時，生理鹽水組2號動物注射血管部分血管內皮細胞輕度腫脹，少量脫落，管壁、管周未見明顯異常HEX200圖19末次給藥後72小時，丹參水溶性提取物組2號動物注射血管血管內皮光滑完整，管腔、管壁、管周未見明顯病理改變HEX100圖20末次給藥後72小時，生理鹽水組3號動物注射血管血管較明顯擴張，內皮細胞、管壁、管周未見明顯異常HEX100圖21末次給藥後72小時，丹參水溶性提取物組3號動物注射血管血管內皮光滑完整，管腔、管壁、管周未見明顯異常HEX100圖22末次給藥後72小時，生理鹽水組4號動物注射血管部分血管內皮細胞輕度腫脹，少量脫落，血管周圍輕度水腫HEX200圖23末次給藥後72小時，丹參水溶性提取物組4號動物注射血管部分血管內皮細胞輕度腫脹，少量脫落，管壁、管周未見明顯異常HEX200圖24末次給藥後72小時，生理鹽水組5號動物注射血管血管內皮光滑完整，管腔、管壁、管周未見明顯異常HEX100圖25末次給藥後72小時，丹參水溶性提取物組5號動物注射血管血管明顯擴張，內皮細胞、管壁、管周未見明顯異常HEX100圖26末次給藥後72小時，生理鹽水組6號動物注射血管血管內皮光滑完整，管腔、管壁、管周未見明顯異常HEX10026圖27末次給藥後72小時，丹參水溶性提取物組6號動物注射血管血管內皮光滑完整，管腔、管壁、管周未見明顯異常HEX100具體實施例方式下面將結合本發明的實施例進一步詳細說明本發明的實質內容，該實施例僅用於說明本發明而對本發明並沒有限制。實施例1丹參飲片1000克，6000ml水回流提取四次，每次0.5小時。合併提取液，離心，上清液通過500克聚醯胺，12000ml水衝洗，無水乙醇12000ml洗脫，洗脫液濃縮到無醇並加水到約1克藥材/ml，調pH值4.5，通過1000克大孔樹脂，4000ml水衝洗，8000ml50%乙醇洗脫，濃縮乙醇洗脫液，減壓乾燥。得提取物30克，丹參水溶性提取物B含量58.3%、迷迭香酸3.5%、紫草酸4.2X、丹參水溶性提取物E0.5%，四種成分總含量66.5%。總酚酸85%。實施例2丹參飲片1000克，5000ml75%乙醇回流提取三次，每次1小時。合併提取液，濃縮至無醇，過濾，濾液調pH值3.5後通過300克聚醯胺，12000ml水衝洗，50%乙醇12000ml洗脫，洗脫液濃縮到無醇並加水到約1克藥材/ml，濃縮液調pH5.O，通過1000克大孔樹脂，4000ml水衝洗，1000ml50X乙醇洗脫，濃縮乙醇洗脫液，減壓乾燥。得提取物45克，丹參水溶性提取物B含量71%、迷迭香酸3.1%、紫草酸2.7%、丹參水溶性提取物EO.2%，四種成分總含量77%。總酚酸92%。實施例3丹參飲片1000克，5500ml水回流提取三次，第一次1小時，第二、三次0.5小時。合併提取液，調ra值2.5，離心，上清液通過500克聚醯胺，12000ml水衝洗，0.1%碳酸氫鈉12000ml洗脫，洗脫液調pH2.O，濃縮液通過1000克大孔樹脂，4000ml水衝洗，8000ml50%乙醇洗脫，濃縮乙醇洗脫液，減壓乾燥。得提取物30克，丹參水溶性提取物B含量55.48%、迷迭香酸3.55X、紫草酸4.42、丹參水溶性提取物E0.32%，四種成分總含量63.77%。總酚酸87%。實施例4丹參飲片1000克，5500ml90%乙醇回流提取三次，第一次1小時，第二、三次0.5小時。合併提取液，調ra值l，離心，上清液通過500克聚醯胺，12000ml水衝洗，O.3%碳酸氫鈉12000ml洗脫，洗脫液調pH1.O，濃縮液通過1000克大孔樹脂，4000mll5%乙醇衝洗，8000ml95%乙醇洗脫，濃縮乙醇洗脫液，減壓乾燥。得提取物30克，丹參水溶性提取物B含量54.00%、迷迭香酸3.55%、紫草酸5.02、丹參水溶性提取物E0.40%，四種成分總含量62.97%。總酚酸87%。權利要求一種丹參水溶性提取物，其中總酚酸的重量百分含量為80-100％，其特徵在於它含有丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸E，其含量百分含量分別為40％-90％％、3.0-15％、2-10％、0.2-2.2％。2.如權利要求1所述的提取物，其中總酚酸的重量百分含量為80-100%，其特徵在於它含有丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸E，其含量百分含量分別為45X80%%、3.0-12%、2-8%、0.2-2.2%。3.—種丹參水溶性提取物，其中總酚酸的重量百分含量為80-96%，其特徵在於它含有丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸E，其含量百分含量分別為45-70X、3.0_6.0%、2.3-5.0%、0.2-2.2%。4.如權利要求13的任一權利要求的提取物，是按照包括如下步驟的方法製備的(1)丹參用水或含水乙醇提取；(2)提取液在除去乙醇後經聚醯胺層析或非極性或弱極性大孔樹脂層析或聚醯胺與大孔樹脂組合進行純化。5.如權利要求4的提取物，是按照包括如下步驟的方法製備的(1)丹參用含水乙醇，提取液濃縮至無醇；(2)提取物經過聚醯胺層析，用水或30%以下的乙醇洗去雜質，以30-100%乙醇或0.01-0.5%碳酸氫鈉或0.01-0.5X碳酸鈉洗脫，收集洗脫液，調節pH值不高於5.5，通過大孔樹脂柱，水洗或20%以下乙醇洗去雜質，30-100%乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮、乾燥，即得。6.如權利要求5的提取物，是按照包括如下步驟的方法製備的(1)丹參用濃度20%_90%乙醇提取，提取液濃縮至無醇；(2)提取物經過聚醯胺層析，用水或30%以下的乙醇洗去雜質，以30-95%乙醇或0.05-0.3%碳酸氫鈉或0.01-0.3%碳酸鈉洗脫，收集洗脫液，調pH1_5.5，通過弱極性或非極性大孔樹脂柱，水洗或20%以下乙醇洗去雜質，30-95%乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮、乾燥，即得。7.—種藥物組合物，由權利要求16的任一權利要求的提取物和藥學上可接受的載體製成。8.根據權利要求7的製劑，該製劑為注射液、注射用無菌粉末、注射用凍乾粉針、片劑、膠囊、口服液、滴丸或顆粒劑。9.根據權利要求15的任一提取物在製備治療心腦血管疾病中的藥物中的應用。10.根據權利要求9的應用，其中所述的心腦血管疾病是腦缺血性疾病。11.根據權利要求10的應用，其中所述的腦缺血性疾病是腦梗塞。12.根據權利要求ll的應用，其中所述的腦缺血性疾病是腦梗塞後遺症。13.根據權利要求10的應用，其中所述的腦缺血性疾病是腦水腫。14.根據權利要求9的應用，其中所述的心腦血管疾病是高凝血狀態。全文摘要本發明提供一種丹參水溶性提取物，其中總酚酸的重量百分含量為80-100％，其特徵在於它含有丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸E，其含量百分含量分別為40％-90％、3.0-15％、2-10％、0.2-2.2％。本發明還提供了含有該提取物的製劑，以及該提取物。文檔編號A61P9/10GK101744878SQ20081015376公開日2010年6月23日申請日期2008年12月5日優先權日2008年12月5日發明者嶽洪水申請人:天津天士力之驕藥業有限公司