食道癌確定用組合物及方法

2023-04-24 17:32:36 2

專利名稱：食道癌確定用組合物及方法
技術領域：
本發明涉及對確定或檢測食管癌有用的診斷(確定或檢測)用組合物、利用該組 合物的食管癌檢測或確定方法、及利用該組合物的食管癌診斷或檢測試劑盒。
背景技術：
食管是連接咽和胃的管腔狀器官，大部分存在於胸腔，一部分存在於頸部和腹腔。 在胸腔上部，食管位於氣管和脊椎之間，在胸腔下部，食管被心臟、大動脈和肺包圍。食管具 有將從口攝入的食物輸送到胃的作用。2001年日本人的癌死亡率為10萬人中有238. 8人。死亡原因中食管癌所佔的比 例逐年增加，2001年男性的食管癌死亡例佔到所有癌症死亡例的5. 0%、女性佔到1. 4%0 食管癌的發病年齡的高峰在60 70歲，男性發病較多。另外，吸菸、飲酒、嗜好熱食品等環 境因素與發病密切相關。並且，一般認為由於在食管壁內部或周圍，血管和淋巴管豐富，所 以發生的癌症多出現轉移。食管癌的治療根據進展程度(日本食管疾病研究會編臨床 病理食管癌治療規範 1999年)或轉移、及全身狀況而決定。食管癌的標準治療方法記載於日本食管疾病研究會 編「食管癌治療方針」(2002年)。目前最普通的治療方法是手術療法，即切除含有癌細胞 的食管和包括淋巴結的周圍組織(淋巴結清掃(lymph node dissection))，並利用胃等其 他器官重建食管。但是，手術療法、特別是大範圍的淋巴結清掃給患者帶來很大的負擔，還 必須考慮手術後的生活質量評分OiOL)降低的問題。對於黏膜內的早期癌症，有時可以在 內窺鏡下實施黏膜剝除術。另外，從根治療法、對症療法兩方面考慮，有時可以進行放射線 照射。進而，與手術療法或放射線療法組合，進行化學療法。目前，一般認為在化學療法中， 並用5-氟尿嘧啶和順鉬的治療方法是最有效的。食管癌通常是在患者感覺吞咽時有不適感、吞咽困難、胸骨後部疼痛及胸部不適 感等自覺症狀進行就診時被發現。但是，上述症狀的出現是由癌在食管內生長導致的，患者 因自我檢測而就診時發現的癌已經擴散或轉移到食管壁外，通常預後不良。食管癌可以通過食管造影檢查、內窺鏡檢查及活組織檢查進行確定。在進行內窺 鏡檢查時或手術時採集活組織檢查標本，製作病理標本，並且通過病理組織學分類加以診 斷。此時，需要開發一種快速簡便的診斷方法，該方法能根據內窺鏡檢查得到的細胞的性質 預測是否有食管癌。至今為止，已有人提出使用食管癌組織中特異性含有的標記物的分子生物學診斷 方法。該方法能快速地得到客觀的結果，有助於快速診斷。目前，作為食管癌臨床檢查用標記物，除使用作為血清中的蛋白質標記物的SCC、 CYFRA21-1、CEA等之外，還報導了專利文獻1、2中記載的蛋白質等。但是，上述標記物缺 少靈敏度、特異性，即使是靈敏度最高的CYFRA21-1，其靈敏度也只是33. 9% (非專利文獻 1) 43. 9% (非專利文獻幻左右。因此，尚不能達到通過對上述血清中的標記物及其組 合進行檢測來確定食管癌細胞是否存在的階段。
另外，作為使用了用於特異性判斷從受試者採集的活檢試樣中是否含有食管癌 細胞的基因的標記物，公開了染色體異常(例如參見專利文獻3，4)或基因的後生序列 (epigenetic sequences)(例如專利文獻5)，除此之外，還報導了多個利用DNA晶片全 面解析基因表達的結果(例如，參見專利文獻6、非專利文獻3 8)。特別是，專利文獻 6中，提供了 20種基因，所述基因通過組合檢測來確定是否存在食管癌細胞，但由於分別 使用不同的判斷機器判斷含有食管癌細胞和不含食管癌細胞，所以不僅診斷複雜，而且在 一方判斷機器預測含有食管癌細胞，另一方預測不含食管癌細胞時，還存在無法進行診斷 的情況。另外，作為以單獨的基因表達作為指標的標記物，報導了專利文獻7、非專利文 獻9、10中記載的SPRR3基因(Small proline-rich protein 3)、非專利文獻11中記載 的fgf3基因、專利文獻7、非專利文獻12中記載的CSTB基因(cystatin B、liver thiol proteinase inhibitor)、專利文獻 8 中記載的 UCP2 基因(mitochondrial uncoupling protein 2)及 C0L3A1 (3，region for pro-alpha (III) collagen)、專利文獻 7 中記載的 UPK IA 基因(uroplakin 1A)、非專利文獻 13 中記載的 HSPA IB 基因(Heat Shock 70kDa Protein 1)等。另外，作為上皮系惡性腫瘤的標記物，已知專利文獻9中記載的RRMl基因 (ribonucleotide reductase Ml polypeptide)等。但是，即使利用上述基因，也不能充分 地診斷是否存在食管癌。 專利文獻1 日本特開2003-259872號公報 專利文獻2 日本特表2000-511536號公報 專利文獻3 日本特開2001-17200號公報 專利文獻4 日本特開2002-27M97號公報 專利文獻5 日本特表2004-505612號公報 專利文獻6 國際公開第2006/118308號說明書 專利文獻7 國際公開第2003/042661號說明書 專利文獻8 國際公開第2003/076594號說明書專利文獻9 國際公開第2006/119464號說明書非專利文獻 1 Nakamura, T.等，1998, Diseases of the Esophagus,第 11 卷，P. 35-39 非專利文獻2 =Kawaguchi, H.等，2000，Cancer，第 89 卷，p. 1413-1417 非專利文獻3 :Luo, Α.等，2004 年，Oncogene，第 23 卷，ρ· 1291-1299 非專利文獻4 Zhi,H.等，2003年，International Journal of Cancer，第 106卷， p. 327-333非專利文獻5 :Lu, J.等，2001 年，International Journal of Cancer，第 91 卷， p. 288-294非專禾Ij文獻 6 :Kazemi-Noureini，S.等，2004 年，World Journal of Gastroenterology,第 10 卷，p.1716-1721非專利文獻7 :Xu, S. H.等，2003 年，World Journal of Gastroenterology，第 9 卷，p. 417-422非專利文獻8 :Su, H.等，2003 年，Cancer Research，第 63 卷，p. 3872-3876非專利文獻9 :Chen, B. S.等，2000 年，Carcinogenesis，第 21 卷，p. 2147-2150
非專利文獻10 =Abraham, J. M.等，1996 年，Cell Growth & Differentiation，第 7 卷，p. 855-860非專利文獻11 :Kitagawa,Y.等，1991 年，Cancer Research，第51 卷，p. 1504-1508非專利文獻 12 =Shiraishi, T.等，1998 年，International Journal of Cancer, 第 79 卷，p. 175-178非專利文獻13 Kawanishi, K.等，1999 年，Cancer，第 85 卷，p. 1649-1657

發明內容
但是，由於上述現有的指標缺少特異性及/或靈敏性，或尚未確立從生物試樣中 有效地檢出的方法，所以通常不應用於臨床，迫切希望開發出特異性及靈敏性高的食管癌 標記物。本發明的目的在於提供在食管癌的診斷及治療中有用的疾病確定用組合物、使用 該組合物的食管癌的確定(或檢測)方法、及利用該組合物的食管癌的確定(或檢測或診 斷)用試劑盒。作為尋找標記物的方法，可以舉出下述方法通過某種方法對食管癌細胞中的、手 術時來自患者的食管癌細胞、和來自患者的非癌細胞中的基因表達或蛋白質表達、或細胞 代謝產物等的量進行比較的方法；和對食管癌患者和非食管癌患者體液中含有的基因、蛋 白質、代謝產物等的量進行測定的方法等。近年來，使用DNA陣列進行的基因表達量解析，被特別廣泛地用作尋找上述標記 物的方法。DNA陣列中固定有使用了對應於數百至數萬種基因的鹼基序列的探針。通過將 受試試樣添加到DNA陣列中，試樣中的基因與探針結合，利用某種方法測定結合量，由此可 以知道受試試樣中的基因量。對應於固定在DNA陣列上的探針的基因可以自由選擇，另外， 使用來自手術時或內窺鏡檢查時食管癌患者的食管癌細胞和非食管癌細胞，比較試樣中的 基因表達量，由此能判定可以作為食管癌標記物的基因組。為了解決上述課題，本發明人等發現利用DNA晶片解析來自手術時食管癌患者 的食管癌細胞和非食管癌細胞的基因表達，發現了可用於食管癌的檢測標記物的基因，並 且發現它們的基因表達量與非食管癌細胞相比，在食管癌細胞中減少、降低、或增加、增大， 從而完成了本發明。1.發明概要本發明具有以下特徵。在本發明的第一方案中，本發明提供一種食管癌診斷用組合物，其中含有選自下 述(a) (e)所示的多核苷酸、其變異體、或其片段中的3個以上多核苷酸。(a)由序列號1 38表示的鹼基序列組成的多核苷酸、其變異體、或其含有15個 以上連續鹼基的片段，(b)含有序列號1 38表示的鹼基序列的多核苷酸，(c)由與序列號1 38表示的鹼基序列互補的鹼基序列組成的多核苷酸、其變異 體、或其含有15個以上連續鹼基的片段，(d)含有與序列號1 38表示的鹼基序列互補的鹼基序列的多核苷酸，(e)在嚴格條件下與上述(a) (d)中任一多核苷酸雜交的多核苷酸、或其含有15個以上連續鹼基的片段。另外，在其他實施方式中，在上述組合物中，上述片段為含有60個以上連續鹼基 的多核苷酸。另外，在其他實施方式中，在上述組合物中，上述片段是序列號1 38中任一個表 示的鹼基序列中分別含有序列號63 100中的任一個表示的鹼基序列、且含有60個以上 連續鹼基的多核苷酸，或含有與該多核苷酸的序列互補的鹼基序列的多核苷酸。另外，在其他實施方式中，在上述組合物中，上述片段是含有序列號63 100中任 一個表示的鹼基序列、或與其互補的鹼基序列的多核苷酸。另外，在本發明的其他實施方式中，如上述任一項所述的組合物，其中還含有選自 下述(f) (j)所示的多核苷酸、其變異體、或其片段中的2個以上多核苷酸。(f)由序列號39 62表示的鹼基序列組成的多核苷酸、其變異體、或其含有15個 以上連續鹼基的片段，(g)含有序列號39 62表示的鹼基序列的多核苷酸，(h)由與序列號39 62表示的鹼基序列互補的鹼基序列組成的多核苷酸、其變異 體、或其含有15個以上連續鹼基的片段，(i)含有與序列號39 62表示的鹼基序列互補的鹼基序列的多核苷酸，(j)在嚴格條件下與上述(f) ⑴中任一多核苷酸雜交的多核苷酸、或其含有 15個以上連續鹼基的片段。另外，在其他實施方式中，上述組合物中，上述片段為含有60個以上連續鹼基的 多核苷酸。另外，在其他實施方式中，上述組合物中，上述片段是序列號39 62中任一個表 示的鹼基序列中分別含有序列號101 IM中任一個表示的鹼基序列、且含有60個以上連 續鹼基的多核苷酸，或含有與該多核苷酸的序列互補的鹼基序列的多核苷酸。另外，在其他實施方式中，上述組合物中，上述片段是含有序列號101 124中任 一個表示的鹼基序列、或與其互補的鹼基序列的多核苷酸。作為本發明的第二方案，本發明提供一種食管癌診斷用試劑盒，其中含有上述任 一項中所述的(a) (e)所示的多核苷酸、其變異體、或其片段中的3個以上多核苷酸。另外，在其他實施方式中，上述試劑盒中還含有上述任一項中所述的(f) (j)所 示的多核苷酸、其變異體、或其片段中的2個以上多核苷酸。另外，在其他實施方式中，上述試劑盒中，上述多核苷酸是由序列號1 62中任一 個表示的鹼基序列組成的多核苷酸、由其互補序列組成的多核苷酸、在嚴格條件下與上述 多核苷酸雜交的多核苷酸、或上述多核苷酸的含有15個以上連續鹼基的片段。另外，在其他實施方式中，上述試劑盒中，上述片段為含有60個以上連續鹼基的 多核苷酸。另外，在其他實施方式中，上述的試劑盒中，上述片段是序列號1 62中任一個表 示的鹼基序列中分別含有序列號63 124中的任一個表示的鹼基序列、且含有60個以上 連續鹼基的多核苷酸，或含有與該多核苷酸的序列互補的鹼基序列的多核苷酸。另外，在其他實施方式中，上述試劑盒中，上述片段是含有序列號63 IM中的任 一個表示的鹼基序列、或與其互補的鹼基序列的多核苷酸。
另外，在其他實施方式中，上述試劑盒中，上述片段是由序列號63 124中任一個 表示的鹼基序列組成的多核苷酸。另外，在其他實施方式中，上述試劑盒含有5種以上至全部的含有序列號63 IM 中任一個表示的鹼基序列或其互補序列的多核苷酸。另外，在其他實施方式中，如上述任一項所述的試劑盒中，上述多核苷酸分別或以 任意組合包裝在不同的容器中。另外，在其他實施方式中，本發明提供一種食管癌診斷用DNA晶片，其中含有上述 任一項所述的(a) (e)所示的多核苷酸、其變異體、或其片段中的3個以上多核苷酸。作為本發明的第三方案，本發明提供一種食管癌診斷用DNA晶片，其中含有上述 任一項所述的(f) (j)所示的多核苷酸、其變異體、或其片段中的2個以上多核苷酸。另外，在其他實施方式中，上述DNA晶片含有5種以上 全部的含有序列號63 124中任一個表示的鹼基序列或其互補序列的多核苷酸。作為第4方案，本發明提供一種在體外確定來自受試者的受試樣品中是否含有食 管癌細胞的方法，該方法使用上述任一項所述的組合物、上述任一項所述的試劑盒、上述任 一項所述的DNA晶片或它們的組合，測定來自受試者的生物試樣中的靶核酸的表達量，由 此在體外確定來自受試者的受試樣品中是否含有食管癌細胞。另外，在其他實施方式中，上述方法使用DNA晶片。另外，在其他實施方式中，提供一種確定食管癌的方法，該方法包括以下步驟第1步驟，使用上述任一項所述的組合物、上述任一項所述的試劑盒、上述任一項 所述的DNA晶片或它們的組合，體外測定多個生物試樣中的靶核酸的表達量，所述生物試 樣是已知含有食管癌細胞的組織；第2步驟，以該第1步驟中得到的該靶核酸的表達量的測定值作為訓練樣本製作 辨別式(支持向量機(Support Vector Machine))；第3步驟，與第1步驟相同地體外測定來自受試者食管的生物試樣中的該靶核酸 的表達量；第4步驟，將第3步驟中得到的該靶核酸的表達量的測定值代入上述第2步驟中 得到的辨別式，基於由該辨別式得到的結果，判斷生物試樣中含有食管癌細胞。另外，在其他實施方式中，本發明提供上述任一項所述的組合物、上述任一項所述 的試劑盒、或上述任一項所述的DNA晶片在體外預測是否有食管癌中的應用。另外，在其他實施方式中，本發明提供一種體外預測受試者是否有食管癌的方法， 所述方法包括使用針對由序列號1 38表示的鹼基序列編碼的多肽的、3個以上抗體或 其片段，體外測定來自受試者的食管癌細胞或血液中的該多肽的量。另外，在其他實施方式中，上述方法還包括使用針對由序列號39 62表示的鹼 基序列編碼的多肽的、2個以上抗體或其片段，測定該多肽的量。另外，在其他實施方式中，上述方法的上述多肽具有序列號125 186表示的氨基 酸序列。另外，在其他實施方式中，上述任一項所述的方法中，與健康的受試者相比，上述 多肽的表達水平在患有食管癌的受試者中發生變化時，確定為食管癌。2.定義
本說明書中使用的術語具有以下定義。核酸、多核苷酸、胺基酸、肽、多肽、蛋白質等簡寫符號所表達的含義根據「包括鹼 基序列或胺基酸序列的說明書等的撰寫用手冊」(日本國特許廳編)及本領域中的慣用含 義。在本說明書中，「多核苷酸」是指包括RNA及DNA在內的核酸。需要說明的是，上 述DNA包括cDNA、基因組DNA及合成DNA。另外，上述RNA包括總RNA、mRNA、rRNA、及合成 RNA。另外，本說明書中多核苷酸可以與核酸互換使用。在本說明書中，「cDNA」包括與基因表達生成的RNA互補的序列的全長DNA鏈、及由 其部分序列組成的DNA片段。cDNA可以通過以RNA為模板，利用使用聚T引物的RT-PCR(逆 轉錄酶-聚合酶鏈反應)進行合成。在本說明書中，「基因」不僅包括雙鏈DNA，還包括構成雙鏈DNA的正鏈(或有意義 鏈)或互補鏈(或反義鏈)等各單鏈DNA。另外，對其長度無特別限定。所以，在本說明書中，在沒有特別說明的情況下，「基因」是指包括人類基因組 DNA在內的雙鏈DNA、包括cDNA在內的單鏈DNA (正鏈)、具有與該正鏈互補的序列的單鏈 DNA(互補鏈)、及上述DNA的片段中的任一個。另外，該「基因」不僅包括以特定的鹼基序 列(或序列號)表示的「基因」，還包括編碼與由上述基因編碼的蛋白質的生物學功能相同 的蛋白質的「基因」，所述蛋白質例如可以舉出同源物(即homolog)、剪接變體等變異體、及 衍生物。作為編碼上述同源物、變異體或衍生物的「基因」，具體可以舉出具有在下述的嚴格 條件下與上述序列號1 62表示的任一特定鹼基序列的互補序列雜交的鹼基序列的「基 因」。例如，作為來自人的蛋白質的同源物(即homolog)或編碼該同源物的基因，可 以舉出與該蛋白質或編碼該蛋白質的人基因對應的其它生物種的蛋白質或基因，上述蛋 白質或基因同源物可以通過 homoloGene (http //www. ncbi. nlm. nih. gov/homoloGene/) 鑑定。具體而言，可以將特定的人類胺基酸或鹼基序列代入BLAST程序(BLAST program) (Karlin, S.等，Proceedings of the National Academic Sciences U. S. A. , 1993 年， 第 90 卷，p. 5873-5877，http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)，得到一致(得分最 高、E值為0且同一性顯示為100%)序列的登錄號(accession number)。作為BLAST 程序，已知有BLASTN(基因)、BLASTX(蛋白質)等。例如，進行基因檢索時，將從上述 BLAST 檢索得到的登錄號輸入 UniGene (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/UniGene/)，得到 UniGeneClusterID (以 Hs.表示的編號)，將得到的 UniGeneClusterID 輸入 homoloGene。 從作為結果得到的表示其它生物種基因與人類基因的基因同源物的相關性的列表中選擇 其它生物種的基因作為與由特定鹼基序列表示的人類基因對應的基因同源物。另外，在該 方法中，也可以使用 FASTA 程序(http://www. ddbj. nig. ac. jp/search/fasta-e. html)代 替BLAST程序。需要說明的是，對「基因」的功能區域沒有限定，例如可以包括表達控制區域、編碼 區域、外顯子或內含子。在本說明書中，「轉錄產物」是指以基因的DNA序列為模板合成的信使RNA(mRNA)。 RNA聚合酶與位於基因上遊的被稱為啟動子的部位結合，使核糖核苷酸與3』末端結合，使 其與DNA的鹼基序列互補，合成信使RNA。該信使RNA中不僅含有基因自身，還含有包括表達控制區域、編碼區域、外顯子或內含子在內的從轉錄起點至聚A序列末端的全長序列。在本說明書中，「翻譯產物」表示無論轉錄合成的信使RNA接受/不接受剪接等修 飾，都基於其信息而合成的蛋白質。在信使RNA的翻譯過程中，首先，核糖體與信使RNA結 合，然後，根據信使RNA的鹼基序列結合胺基酸，從而合成蛋白質。在本說明書中，「探針」包括能用於特異性地檢測基因表達產生的RNA或來自該 RNA的多核苷酸所使用的多核苷酸及/或與其互補的多核苷酸。在本說明書中，「引物」包括能特異性識別、擴增基因表達產生的RNA或來自該RNA 的多核苷酸的連續的多核苷酸及/或與其互補的多核苷酸。此處，互補的多核苷酸(互補鏈、反鏈)是指基於A :T (U)、G :C的鹼基配對，與由 序列號定義的鹼基序列組成的多核苷酸的全長序列、或其部分序列(此處，為了便於說明， 將上述序列稱為正鏈)具有鹼基互補關係的多核苷酸。其中，所述互補鏈不只限於形成與 作為對象的正鏈的鹼基序列完全互補的序列，也可以是具有能與作為對象的正鏈在嚴格條 件下雜交的程度的互補關係的序列。在本說明書中，「嚴格條件」是指相對於探針對其它序列的雜交，探針以可檢測性 更大的程度(例如，比背景至少大2倍)與其靶序列雜交的條件。嚴格條件具有序列依賴 性，因進行雜交的環境的不同而不同。通過控制雜交及/或清洗條件為嚴格條件，可以鑑定 與探針100%互補的靶序列。在本說明書中，「變異體」為核酸時，是指起因於多型性、突變、轉錄時的選擇剪接 等的天然變異體、或以遺傳密碼的簡併為基礎的變異體、或在序列號1 62表示的鹼基序 列或其部分序列中缺失、置換、添加或插入1個以上、優選1個或幾個鹼基的變異體、或與該 鹼基序列或其部分序列具有約80%以上、約85%以上、約90%以上、約95%以上、約97%以 上、約98%以上、約99%以上的同源性百分比的變異體、或在上述定義的嚴格條件下與含 有該鹼基序列或其部分序列的多核苷酸或寡核苷酸雜交的核酸，另一方面，變異體為蛋白 質或肽時，是指包括在序列號125 186表示的胺基酸序列或其部分序列中缺失、置換、添 加或插入1個以上、優選1個或幾個胺基酸的變異體、或與該胺基酸序列或其部分序列具有 約80%以上、約85%以上、約90%以上、約95%以上、約97%以上、約98%以上、約99%以 上的同源性百分比的變異體。在本說明書中，「數個」是指約10、9、8、7、6、5、4、3或2個的整數。在本說明書中，「同源性百分比」可以使用由上述BLAST或FASTA得到的蛋白質或 基因檢索系統，導入或不導入空位(gap)而進行確定(Karlin，S.等，1993年，Proceedings of the National Academic Sciences U. S. A.,第 90 卷，p. 5873-5877 ;Altschul, S. F.等， 1990 年，Journal of Molecular Biology，第 215 卷，p. 403-410 ;Pearson，W. R.等，1988 年，Proceedings of the National Academic Sciences U. S. A.,第 85 卷，p.2444-2448)。在本說明書中，「衍生物」為核酸時，是指通過螢光團等進行標記的衍生物、含有修 飾核苷酸(例如，含有滷素、甲基等烷基、甲氧基等烷氧基、硫代、羧甲基等基團的核苷酸， 及進行了鹼基的再構建、雙鍵的飽和、脫氨基化、硫分子對氧分子的取代等的核苷酸等)的 衍生物等，另一方面，「衍生物」為蛋白質時，是指乙醯化、醯化、烷基化、磷酸化、硫酸化、糖 基化、生物素化等化學修飾衍生物。在本說明書中，「診斷(或檢測或確定)用組合物」，是指為了診斷是否罹患食管癌、發病程度或是否改善或改善程度，或為了篩選對食管癌的預防、改善或治療有用的候補 物質，而直接或間接使用的組合物。其中，包括能特異性識別或結合下述基因的核酸、寡核 苷酸及多核苷酸，所述基因與食管癌的罹患相關、在生物體內特別是在食管組織內的表達 發生變化，還包括能檢測作為該基因翻譯產物的蛋白質的抗體。上述核酸、寡核苷酸及多核 苷酸基於上述性質，可以有效地用作探針或引物，所述探針用於檢測在生物體內、組織或細 胞內等表達的上述基因，所述引物用於擴增在生物體內表達的上述基因。在本說明書中，成為檢測·診斷對象的「生物組織」是指伴隨食管癌的發生，本發 明的基因表達發生變化的組織。具體是指食管組織、其周圍的淋巴結、及懷疑發生轉移的其 它器官等。本說明書中使用的「EYA2基因」或「EYA2」的術語，在沒有被序列號定義的情況 下，包括特定鹼基序列(序列號1)表示的眼缺乏同源物2 (eyes absent homolog 2)基因 (DNA)、編碼HTG、PRKCBP 1、RPS2、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序 列號1中記載的EYA2基因(GenBank登錄號AL049540)或其他生物種同源物等。EYA2基因 可以根據Zimmerman J. Ε.等，1997年，Genome Res.，第7卷，pp. 128-141中記載的方法得 到。本說明書中使用的「SERF1A基因」或「SERF1A」的術語，在沒有被序列號定義的情 況下，包括特定鹼基序列(序列號2)表示的小EDRK豐富因子l(Small EDRK-rich factor 1)基因(DNA)、編碼4F5、H4F5、SMA修飾物1、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。 具體包括序列號2中記載的SERF IA基因(GenBank登錄號AF073519)或其他生物種同源 物等。SERFlA 基因可以根據 Scharf J. M.，等.，1998 年，Nat. Genet.，第 20 卷，pp. 83-86 中記載的方法得到。本說明書中使用的「 IGHGl基因」或「 IGHGl，，的術語，在沒有被序列號定義的情 況下，包括特定鹼基序列(序列號幻表示的免疫球蛋白重鏈恆定區Yl (immunoglobulin heavy constant gamma 1)基因(DNA)、編碼 Glm marker、FLJ39988、FLJ40036、FLJ40253、 FLJ40587、FLJ40789、FLJ40834、MGC45809、DKFZp686H11213、其同源物、變異體及衍生物等 的基因(DNA)。具體包括序列號3中記載的IGHGl基因(GenBank登錄號NC_000014)或其他 生物種同源物等。IGHGl基因可以根據Hood L.，等，1968年，Nature，第220卷，pp. 764-767 中記載的方法得到。本說明書中使用的「 ITSN2基因」或「 ITSN2 」的術語，在沒有被序列號定義 的情況下，包括特定鹼基序列(序列號4)表示的INTERSECTIN2基因(DNA)、編碼 SH3domain_containing protein IB、SH3P18、SH3P18_like WASP associated protein、其 同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號4中記載的ITSN2基因(GenBank 登錄號匪_0195卯)或其他生物種同源物等。ITSN2基因可以根據Pucharcos C.，等，2000 年，FEBS Lett.，第478卷，pp. 43-51中記載的方法得到。本說明書中使用的「RAB11FIP5基因」或「RAB11FIP5」的術語，在沒有被序列號定 義的情況下，包括特定鹼基序列(序列號幻表示的人類RABll家族結合蛋白5(類I)基因 (DNA)、編碼KIAA0853、RIPll、pp75、GAFl、DKFZP434H018、其同源物、變異體及衍生物等的基 因(DNA)。具體包括序列號5中記載的RAB11FIP5基因(GenBank登錄號BC035013)或其 他生物種同源物等。RAB11FIP5基因可以根據Ito T.，等，1999年，J. Clin. Invest.，第104卷，pp. 1265-1275中記載的方法得到。本說明書中使用的「HSPA1A基因」或「HSPA1A」的術語，在沒有被序列號定義的 情況下，包括特定鹼基序列(序列號6)表示的熱休克70kD蛋白IAOfeat shock 70kDa protein 1A)基因(DNA)、編碼 HAPAl (DNA)、HSP70. 1 (DNA)、HSP70-1/HSP70-2 (DNA)、 HSPAlB (DNA)、HSP72 (DNA)、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號6 中記載的HSPAlA基因(GenBank登錄號ΝΜ_005345)或其他生物種同源物等。HSPAlA基因 可以根據Ito Τ.，等，1998年，J. Biochem. (Tokyo)，第IM卷，pp. ；347_353中記載的方法得 到。本說明書中使用的「NMU基因」或「NMU」的術語，在沒有被序列號定義的情況下， 包括特定鹼基序列(序列號7)表示的神經介素U前體(neuromedin U precursor)基因 (DNA)、編碼神經介素-U-25、NmU-25、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括 序列號7中記載的NMU基因(GenBank登錄號NM_006688)或其他生物種同源物等。NMU基 因可以根據 Austin U.，等，1995 年，J. Mol. Endocrinol.，第 14 卷，pp. 157-169 中記載的方 法得到。本說明書中使用的「E2F3基因」或「E2F3」的術語，在沒有被序列號定義的情況下， 包括特定鹼基序列(序列號8)表示的E2F轉錄因子3(E2F transcription factor 3)基 因(DNA)、編碼E2F-3、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號8中記 載的E2F3基因(GenBank登錄號ΝΜ_001949)或其他生物種同源物等。E2F3基因可以根據 Lees J.A.，等，1993，Mol. Cell. Biol.，第 13 卷，pp. 7813-7825 中記載的方法得到。本說明書中使用的「ESR2基因」或「ESR2」的術語，在沒有被序列號定義的情況 下，包括特定鹼基序列(序列號9)表示的雌激素受體β (estrogen receptor beta)基因 (DNA)、編碼ER-BETA、Erb, NR3A2、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序 列號9中記載的ESR2基因(GenBank登錄號NM_001437)或其他生物種同源物等。ESR2基 因可以根據 Dotzlaw H.，等，1997 年，J. Clin. Endocrinol. Metab.，第 82 卷，pp. 2371-2374 中記載的方法得到。本說明書中使用的「CFDP1基因」或「CFDP1」的術語，在沒有被序列號定義的情況 下，包括特定鹼基序列(序列號10)表示的顱面發育蛋白1 (craniofacial development protein 1)基因(DNA)、編碼 Bucentaur、BCNT、CP27、p97、SWC5、Yeti、其同源物、變異 體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號10中記載的CFDPl基因(GenBank登錄號 NM_006324)或其他生物種同源物等。CFDPl基因可以根據Diekwisch T. G.，等，1999年， Gene，第235卷，pp. 19-30中記載的方法得到。本說明書中使用的「HSPC190基因」或「HSPC190」的術語，在沒有被序列號定 義的情況下，包括特定鹼基序列(序列號11)表示的前細胞凋亡胱天蛋白酶連接蛋白 (proapoptotic caspase adaptor protein)(DNA) > ^5 ^^ S g|-2S > MGC29506、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號11中記載的 HSPC190基因(GenBank登錄號ΝΜ_016459)或其他生物種同源物等。HSPC190基因可以根 據 Katoh M.，等，2003 年，Int. J. Oncol.，第 23 卷，pp. 235-241 中記載的方法得到。本說明書中使用的「C0L1A2基因」或「C0L1A2」的術語，在沒有被序列號定義的情 況下，包括特定鹼基序列(序列號12)表示的膠原α-2 (I)鏈前體(collagen alpha-2(I)chain precursor)基因(DNA)、編碼 α-2 型 I 膠原(Alpha-2 type I collagen)、其同源 物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號12中記載的C0L1A2基因(GenBank 登錄號Z7461)或其他生物種同源物等。C0L1A2基因可以根據Mottes M.，等，1998年，Hum. Mutat.，第12卷，pp. 71-72中記載的方法得到。本說明書中使用的「GCS1基因」或「GCS1」的術語，在沒有被序列號 定義的情況下，包括特定鹼基序列(序列號1 表示的甘露糖基寡糖葡糖苷酶 (Manno sy 1 -o 1 i go sac char i de glucosidase)基因(DNA)、編碼加工 A-葡糖苷酶 !(Processing A-glucosidase I)、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括 序列號13中記載的GCSl基因(GenBank登錄號NM_006302)或其他生物種同源物等。GCSl 基因可以根據 Kalz-Fuller B.，等，1995 年，Eur. J. Biochem.，第 231 卷，pp. 344-351 中記 載的方法得到。本說明書中使用的「PARL基因」或「PARL」的術語，在沒有被序列號定義的情況下， 包括特定鹼基序列(序列號14)表示的早老素相關菱形樣蛋白(presenillins associated rhomboid-like protein)基因(DNA)、編碼其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具 體包括序列號14中記載的PARL基因(GenBank登錄號NM_0186 或其他生物種同源物等。 PARL 基因可以根據 Pellegrini L.，等，2001 年，J. Alzheimers Dis.，第 3 卷，pp. 181-190 中記載的方法得到。本說明書中使用的「CELSR2基因」或「CELSR2」的術語，在沒有被序列號定義的 情況下，包括特定鹼基序列(序列號1 表示的鈣粘著蛋白EGF LAG七經G型受體2前 體(Cadherin EGF LAG seven-pass G-type receptor 2 precursor)基因(DNA)、編石馬 類表皮生長因子2(印idermal growth factor-like 2)、類表皮生長因子域3 (multiple epidermal growth factor-like domains 3)、Flamingo 1、其同源物、變異體及 行生物等的 基因(DNA)。具體包括序列號15中記載的CELSR2基因(GenBank登錄號ΝΜ_001408)或其 他生物種同源物等。CELSR2基因可以根據Nakayama Μ.，等，1998年，Genomics，第51卷， PP- 27-34中記載的方法得到。本說明書中使用的「NDRG1基因」或「NDRG1」的術語，在沒有被序列號定義的情 況下，包括特定鹼基序列(序列號16)表示的N-myc下遊調節基因1 (N-myc downstream regulated gene 1)基因(DNA)、編碼 GC4、RTP, NDRl、匪SL、TDD5、CAP43、CMT4D、HMSNL, RIT42、TARG1、PR0XY1、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號16中記 載的NDRGl基因(GenBank登錄號NM_006096)或其他生物種同源物等。NDRGl基因可以根 據 Kokame K.，等，1996 年，J. Biol. Chem.，第 271 卷，pp. 29659-29665 中記載的方法得到。本說明書中使用的「SLC25A44基因」或「SLC25A44」的術語，在沒有被序列號定義 的情況下，包括特定鹼基序列(序列號17)表示的溶質載體家族25成員44(Solute carrier family 25,member 44)基因(DNA)、編碼 FLJ90431、KIAA0446、RP11_54H19. 3、其同源物、變 異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號17中記載的SLC25A44基因(GenBank登錄 號NM_014655)或其他生物種同源物等。SLC25A44基因可以根據Haitina T.，等，2006年， Genomics，第88卷，pp. 779-790中記載的方法得到。本說明書中使用的「TUSC2基因」或「TUSC2」的術語，在沒有被序列號定義的情況 下，包括特定鹼基序列(序列號18)表示的腫瘤抑制因子候選基因2 (tumor suppressorcandidate 2)基因(DNA)、編碼PAP、FUSU PDAP2、C3orf 11、其同源物、變異體及衍生物等 的基因(DNA)。具體包括序列號18中記載的TUSC2基因(GenBank登錄號NM_007275)或 其他生物種同源物等。TUSC2基因可以根據Lerman Μ. I.，等，2000，Cancer Res.，第60卷， PP. 6116-6133中記載的方法得到。本說明書中使用的「SLC4A1基因」或「SLC4A1」的術語，在沒有被序列號定義的情 況下，包括特定鹼基序列(序列號19)表示的溶質載體家族4陰離子交換體成員KSolute carrier family 4, anion exchanger, member 1)(DNA)、||§石馬 DI、FR、SW、WD、WR、AE1、 WD1、BND3、EPB3、CD233、EMPB3、RTA1A、MGC116753、MGC126619、MGC126623、其同源物、變異 體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號19中記載的SLC4A1基因(GenBank登錄號 NM_000342)或其他生物種同源物等。SLC4A1基因可以根據Lux S. E.，等，1189年，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α.，第 86 卷，pp. 9089-9093 中記載的方法得到。本說明書中使用的「MS4A7基因」或「MS4A7 」的術語，在沒有被序列號定 義的情況下，包括特定鹼基序列(序列號20)表示的跨膜結構域4亞家族A成員 7(Membrane-spanning 4-domains, sunfamily A, member 7)基因(DNA)、編石馬 CFFM4、 MS4A8、4SPAN2、CD20L4、MGC22368、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序 列號20中記載的MS4A7基因(GenBank登錄號NM_206938)或其他生物種同源物等。MS4A7 基因可以根據Ishibashi K.，等，2001年，Gene，第264卷，pp. 87-93中記載的方法得到。本說明書中使用的「胸腺素β -4基因」或「TMSB4X」的術語，在沒有被序列號定 義的情況下，包括特定鹼基序列(序列號21)表示的胸腺素i3-4(thymOSin beta-4)基因 (DNA)、編碼FX、TB4X、PTMB4、TMSB4、胸腺素β -4、X-Iinked 8、其同源物、變異體及衍生物 等的基因(DNA)。具體包括序列號21中記載的TMSB4X基因(GenBank登錄號ΝΜ_021109) 或其他生物種同源物等。TMSB4X基因可以根據Gondo H.等，1987年，J. Immunol.，第139 卷，pp. 3840-3848中記載的方法得到。本說明書中使用的「PRC1基因」或「PRC1」的術語，在沒有被序列號定義的情況 下，包括特定鹼基序列(序列號2 表示的胞質分裂調控蛋白Kprotein regulator of cytokinesis 1)基因(DNA)、編碼胞質分裂調控蛋白 1 (protein regulationg cytokinesis 1)、ASE1、MGC1671、MGC3669、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號 22中記載的PRCl基因(GenBank登錄號NM_003981)或其他生物種同源物等。PRCl基因可 以根據Jiang W.，等，1998年，Mol. Cell.，第2卷，pp. 877-885中記載的方法得到。本說明書中使用的「VCP基因」或「VCP」的術語，在沒有被序列號定義的情況下， 包括特定鹼基序列(序列號23)表示的纈酪肽蛋白(Valosin-containing protein)基因 (DNA)、編碼p97、TERA、IBMPFD、MGC8560、MGC131997、MGC148092、其同源物、變異體及衍生物 等的基因(DNA)。具體包括序列號23中記載的VCP基因(GenBank登錄號NM_007126)或其 他生物種同源物等。VCP基因可以根據Druck T.，等，1995年，Genomics，第30卷，pp. 94-97 中記載的方法得到。本說明書中使用的「RBM9基因」或「RBM9」的術語，在沒有被序列號定義的情況下， 包括特定鹼基序列(序列號24)表示的RNA結合修飾蛋白9 (RNA binding motif protein 9)基因(DNA)、編碼 RTA、fxh、Fox-2、HNRBP2、HRNBP2、djl06I20. 3、其同源物、變異體及衍生 物等的基因(DNA)。具體包括序列號對中記載的RBM9基因(GenBank登錄號ΝΜ_014309)或其他生物種同源物等。RBM9基因可以根據Norris J. D.，等，2002年，Mol. Endocrinol.， 第16卷，pp. 459-468中記載的方法得到。本說明書中使用的「GPRU6基因」或「GPRU6」的術語，在沒有被序列號定義的 情況下，包括特定鹼基序列(序列號2 表示的G蛋白偶聯受體126(G protein-coupled receptor 126)基因(DNA)、編碼 FLJ14937、DKFZp564D0462、VIGR、DREG、PSlTP2、其同源物、 變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號25中記載的GPRU6基因(GenBank登錄 號BC075798)或其他生物種同源物等。GPRU6基因可以根據Mehlik C.，等，2004年，FEBS Lett.，第569卷，pp. 149-155中記載的方法得到。本說明書中使用的「H0XA10基因」或「H0XA10」的術語，在沒有被序列號定義的 情況下，包括特定鹼基序列(序列號26)表示的同源異型框基因AlOOtomeobox A10)基因 (DNA)、編碼H0X1. 8、MGCU859、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列 號沈中記載的H0XA10基因(GenBank登錄號BC013971)或其他生物種同源物等。H0XA10 基因可以根據 Lowney P.，等，1991 年，Nucleic Acid Res.，第 19 卷，pp. 3443-3449 中記載 的方法得到。本說明書中使用的「PPP1R1A基因」或「PPP1R1A」的術語，在沒有被序列號定義的 情況下，包括特定鹼基序列(序列號27)表示的蛋白磷酸酶1調控因子(抑制因子)亞基 IA (protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit ΙΑ) (DNA)、|S石馬
物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號27中記載的PPP1R1A基因(GenBank 登錄號NM_006741)或蛋白磷酸酶抑制因子 l(protein phosphatase inhibitor 1)、IPP_1、 1-1、其他生物種同源物等。PPP1R1A基因可以根據Endo S.，等，1996年，Biochemistry，第 35卷，pp. 5220-5228中記載的方法得到。本說明書中使用的「MY09B基因」或「MY09B」的術語，在沒有被序列號定義的情況 下，包括特定鹼基序列(序列號28)表示的myosine IXB基因(DNA)、編碼MYR5、CELIAC4、 其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號觀中記載的MY09B基因 (GenBank登錄號NM_004145)、其他生物種同源物等。MY09B基因可以根據Wirth J.A.，等， 1996年，J. Cell. Sci.，第109卷，pp. 653-661中記載的方法得到。本說明書中使用的「SLC04C1基因」或「SLC04C1」的術語，在沒有被序列號定義 的情況下，包括特定鹼基序列(序列號29)表示的溶質載體有機陰離子轉運蛋白家族成員 4C1 (solute carrier organic anion transporter family, member 4C1)基因(DNA)、編 碼其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號四中記載的SLC04C1基因 (GenBank登錄號NM_180991)或其他生物種同源物等。SLC04C1基因可以根據Mikkaichi T.，等，2004 年，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α.，第 101 卷，pp. ；3569_3574 中記載的方法得到。
本說明書中使用的「SERPINB13基因」或「SERPINB13」的術語，在沒有被序列號 定義的情況下，包括特定鹼基序列(序列號30)表示的HURPIN基因(DNA)、編碼HACAT UV-REPRESSIBLE SERPIN、PROTEASE INHIBITOR 13、HEADPIN、SERPIN B13、其同源物、變異 體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號30中記載的SERPINB13基因(GenBank登錄 號NM_012397)或其他生物種同源物等。SERPINB13基因可以根據Spring P.，等，1999年， Biochem. Biophys. Res. Commun.，第洸4 卷，pp. 299-304 中記載的方法得到。 本說明書中使用的「SDC2基因」或「SDC2」的術語，在沒有被序列號定義的情況下，包括特定鹼基序列(序列號31)表示的Syndecan 2基因(DNA)、編碼硫酸乙醯肝 S S S IK H ι (heparan sulfate proteoglycan 1) > cell-associated> ^f & MW (fibroglycan)、人硫酸乙醯肝素蛋白聚糖核心蛋白3』末端(Human heparan sulfate proteoglycan (HSPG) core protein 3，end)、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。 具體包括序列號31中記載的SDC2基因(GenBank登錄號J04621)或其他生物種同源物等。 SDC2 基因可以根據 de Boeck H.，等，1987 年，Biochem. J.，第 247 卷，pp. 765-771 中記載的 方法得到。本說明書中使用的「T0R1A基因」或「T0R1A」的術語，在沒有被序列號定義的情 況下，包括特定鹼基序列(序列號32)表示的torsin家族成員A(torsin family, member Α)基因(DNA)、編碼Dystonial、DYTl、DQ2、torsin Α、其同源物、變異體及衍生物等的基因 (DNA)。具體包括序列號32中記載的TORlA基因(GenBank登錄號NM_000113)或其他生物種 同源物等。TORlA 基因可以根據 Ozelius L. J.，等，1997 年，Nat. Genet.，第 17 卷，pp. 40-48 中記載的方法得到。本說明書中使用的「RPL18A基因」或「RPL18A」的術語，在沒有被序列號定義的情 況下，包括特定鹼基序列(序列號33)表示的核糖體蛋白L18a(ribOSOmal protein L18a) 基因(DNA)、編碼其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號33中記載的 RPL18A基因(GenBank登錄號NM_000980)或其他生物種同源物等。RPL18A基因可以根據 Adams M. D.，等，1992 年，Nature，第 355 卷，pp. 632-634 中記載的方法得到。本說明書中使用的「GAS7基因」或「GAS7」的術語，在沒有被序列號定義的情況下， 包括特定鹼基序列(序列號34)表示的生長終止特異性蛋白7 (Growth-arrest-specific protein 7)基因(DNA)、編碼GAS-7、MGC1348、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。 具體包括序列號；34中記載的GAS7基因(GenBank登錄號匪_20143幻或其他生物種同源 物等。GAS7 基因可以根據 Ju Y. T.，等，1998 年，Proc. Natl. Acad. ki. U.S. A.，第 95 卷， pp. 11423-11428中記載的方法得到。本說明書中使用的「WISP1基因」或「WISP1」的術語，在沒有被序列號定義的情 況下，包括特定鹼基序列(序列號35)表示的WNTl誘導信號通道蛋白1 (WNT1 inducible signaling pathway protein 1)基因(DNA)、編碼 CCN4、WISPlc、WISPli、WISPltc、其同源 物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號35中記載的WISPl基因(GenBank登 錄號NM_003882)或其他生物種同源物等。WISPl基因可以根據Pennica D.，等，1998年， Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α.，第 95 卷，pp. 14717-14722 中記載的方法得到。本說明書中使用的「 CACNG4基因」或「 CACNG4 」的術語，在沒有被序列號定義 的情況下，包括特定鹼基序列(序列號36)表示的依賴電壓的鈣離子通道Y-4亞單元 (voltage-dependent calcium channel gamma-4 subunit)基因(DNA)、編碼神經元電壓門 控性 丐通道 Y-4 亞單位(Neuronal voltage-gated calcium channel gamma_4subunit)、 MGC11138、MGC24983、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號36中記 載的CACNG4基因(GenBank登錄號ΝΜ_014405)或其他生物種同源物等。CACNG4基因可以 根據 Burgess D. L.，等，1999 年，Genome Res.，第 9 卷，pp. 1204-1213 中記載的方法得到。本說明書中使用的「S100P基因」或「S100P」的術語，在沒有被序列號定義的情況 下，包括特定鹼基序列(序列號37)表示的S-100P蛋白(S-100P protein)基因(DNA)、編碼SlOO鈣結合蛋白P(SlOOcalcium binding protein P)、MIG9、其同源物、變異體及衍生 物等的基因(DNA)。具體包括序列號37中記載的S100P基因(GenBank登錄號NM_005980) 或其他生物種同源物等。S100P基因可以根據Becker Τ.，等，1992年，Eur. J. Biochem.，第 207卷，pp. 541-547中記載的方法得到。本說明書中使用的「UCHL5基因」或「UCHL5」的術語，在沒有被序列號定義的 情況下，包括特定鹼基序列(序列號38)表示的泛素羧基末端水解酶L5(UbiqUitin carboxyl-terminal hydrolase L5)基因(DNA)、編碼UCH37、CGI_70、其同源物、變異體及衍 生物等的基因(DNA)。具體包括序列號38中記載的UCHL5基因(GenBank登錄號ΝΜ_015984) 或其他生物種同源物等。UCHL5基因可以根據Wicks S. J.，等，2005年，Oncogene，第M卷， PP- 8080-8084中記載的方法得到。本說明書中使用的「APQ3基因」或「APQ3」的術語，在沒有被序列號定義的情況下， 包括特定鹼基序列(序列號39)表示的水通道蛋白3 (Aquaporin 3)基因(DNA)、編碼其同 源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號39中記載的APQ3基因(GenBank 登錄號NM_004925)或其他生物種同源物等。APQ3基因可以根據Kuriyama H.，等，1997年， Biochem. Biophys. Res. Commun.，第 241 卷，pp. 53—58 中記載的方法得到。本說明書中使用的「NSUN5基因」或「NSUN5」的術語，在沒有被序列號定義的情況 下，包括特定鹼基序列(序列號40)表示的N0L1/N0P2/太陽域家族成員5 (N0Ll/N0P2/Sun domain family, member 5)基因(DNA)、編碼 pl20、N0LlR、N0Ll、MGC986、NSUN5A、WBSCR20、 FLJ10267.WBSCR20A.pl20 (NOLI)、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序 列號40中記載的NSUN5基因(GenBank登錄號ΝΜ_018044)或其他生物種同源物等。NSUN5 基因可以根據 Doll A.，等，2001 年，Cytogenet. Cell Genet.，第 95 卷，pp. 20-27 中記載的 方法得到。本說明書中使用的「B4GALT2基因」或「B4GALT2」的術語，在沒有被序列號定義的 情況下，包括特定鹼基序列(序列號41)表示的UDP-Gal β GlcNAc β 1,4-半乳糖基轉移 酶多肽 2 (UDP-Gal :betaGlcNAc beta 1,4-galactosyltransferase, polypeptide 2)基 因(DNA)、編碼其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號41中記載的 B4GALT2基因(GenBank登錄號BC096821)或其他生物種同源物等。B4GALT2基因可以根據 Lo N. W.，等，1998 年，Glycobiology，第 8 卷，pp. 517-52 中記載的方法得到。本說明書中使用的「CD48基因」或「CD48」的術語，在沒有被序列號定義的情況下， 包括特定鹼基序列(序列號42)表示的CD48分子(CD48 molecule)基因(DNA)、編碼BCM1、 BLAST、hCD48、mCD48、BLAST 1、SLAMF2、MEM-102、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。 具體包括序列號42中記載的⑶48基因(GenBank登錄號NM_001778)或其他生物種同源物 等。CD48 基因可以根據 Wong Y. W.，等，1990 年，J. Exp. Med.，第 171 卷，pp. 2115-2130 中記 載的方法得到。本說明書中使用的「DAB2基因」或「DAB2」的術語，在沒有被序列號定義的情況 下，包括特定鹼基序列(序列號4 表示的失效同源物2，促分裂原應答磷蛋白(Disabled homo log 2，mitogen-responsive phosphoprotein)基因(DNA)、編碼 D0C2、D0C-2、 FLJ266^、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號43中記載的DAB2 基因(GenBank登錄號NM_00134 或其他生物種同源物等。DAB2基因可以根據AlbertsenH. M.，等，1996年，Genomics，第33卷，pp. 207-213中記載的方法得到。本說明書中使用的『 ΒΙ3基因」或『 ΒΙ3」的術語，在沒有被序列號定義的情況 下，包括特定鹼基序列(序列號44)表示的Epstein-barr病毒誘導(Epstein-barr virus induced)基因(DNA)、編碼其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號44 中記載的EBI3基因(GenBank登錄號匪_00575幻或其他生物種同源物等。EBI3基因可以 根據Devergne 0.，等，1996年，J. Virol.，第70卷，pp. 1143-1153中記載的方法得到。本說明書中使用的「MAP;3K12基因」或「MAP;3K12」的術語，在沒有被序 列號定義的情況下，包括特定鹼基序列(序列號45)表示的絲裂原活化蛋白激酶 12(mitogen-activated protein kinase 12)基因(DNA)、編碼DLK、MUK、ZPK、ZPKP1、其同源 物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號45中記載的MAP;3K12基因(GenBank 登錄號NM_006301)或其他生物種同源物等。MAP;3K12基因可以根據Ready U. R.和Pleasure D.，1994 年，Biochem. Biophys. Res. Commun.，第 202 卷，pp. 613-620 中記載的方法得到。本說明書中使用的「SPEN基因」或「SPEN」的術語，在沒有被序列號定義的情況 下，包括特定鹼基序列(序列號46)表示的spen同源物轉錄調控因子(spen homolog, transcriptional regulator)基因(DNA)、編碼 MINT、SHARP、KIAA0929、RP1-134019. 1、其 同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號46中記載的SPEN基因(GenBank 登錄號NM_015001)或其他生物種同源物等。SPEN基因可以根據Sii T.，等，2001年，Genes Dev.，第15卷，pp. 1140-1151中記載的方法得到。本說明書中使用的「ARHGEF3基因」或「ARHGEF3」的術語，在沒有被序列號定義的 情況下，包括特定鹼基序列(序列號47)表示的Mio鳥苷酸轉換因子(GEF) 3 0 ho guanine nucleotide exchange factor (GEF) 3)基因(DNA)、編碼 GEF、STA3、XPLN、MGCl 18905、 DKFZP434FM^、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號47中記載的 ARHGEF3基因(GenBank登錄號ΝΜ_019555)或其他生物種同源物等。ARHGEF3基因可以根 據 Thiesen S.，等，2000 年，Biochem. Biophys. Res. Commun.，第 273 卷，pp. 364-369 中記載 的方法得到。本說明書中使用的「C0L3A1基因」或「C0L3A1」的術語，在沒有被序列號定義的情 況下，包括特定鹼基序列(序列號48)表示的α (III)型前膠原3』區域(3 『region for pro-alpha (III) collagen)基因(DNA)、編碼其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。 具體包括序列號48中記載的C0L3A1基因(GenBank登錄號X06700)或其他生物種同源 物等。C0L3A1 基因可以根據 Loidl H. R.，等，1984 年，Nucleic Acids Res.，第 16 卷， pp. 9383-9394中記載的方法得到。本說明書中使用的「CSTB基因」或「CSTB」的術語，在沒有被序列號定義的情況 下，包括特定鹼基序列(序列號49)表示的半胱氨酸蛋白酶抑制劑-B(Cystatin-B)基 因(DNA)、編碼 Mef in-B、肝巰基蛋白酶抑制劑(Liver thiol proteinase inhibitor)、 CPI-B、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號49中記載的CSTB基 因(GenBank登錄號ΝΜ_000100)或其他生物種同源物等。CSTB基因可以根據Jerala，R.， 等·，1988年，FEBS Lett.，第239卷，pp. 41-44中記載的方法得到。本說明書中使用的「SPRR3基因」或「SPRR3」的術語，在沒有被序列號定義的情 況下，包括特定鹼基序列(序列號50)表示的小脯氨酸豐富蛋白3(Small proline-richprotein 3)基因(DNA)、編碼Cornifine、hophagin、其同源物、變異體及衍生物等的基因 (DNA)。具體包括序列號50中記載的SPRR3基因(GenBank登錄號NM_005416)或其他生物 種同源物等。SraR3基因可以根據AbrahamJ. M.，等，1996年，Cell Growth Differ.，第7 卷，pp. 855-860中記載的方法得到。本說明書中使用的「SLIT2基因」或「SLIT2」的術語，在沒有被序列號定義的情況 下，包括特定鹼基序列(序列號51)表示的Slit同源物2蛋白(Slit homolog 2 protein) 基因(DNA)、編碼Slit-2、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號51 中記載的SLIT2基因(GenBank登錄號NM_004787)或其他生物種同源物等。SLIT2基因可 以根據Holmes G. P.，等，1998年，Mech. Dev.，第79卷，pp. 57-72中記載的方法得到。本說明書中使用的「 CAMK2B基因」或「 CAMK2B 」的術語，在沒有被序列號定義 的情況下，包括特定鹼基序列(序列號5 表示的鈣/鈣調素依賴蛋白激酶II型β鏈 (Calcium/calmodulin-dependent protein kinase type II beta chain)基因(DNA)、編 碼 CaM-激酶 II β 鏈(CaM-kinase II beta chain)、CaM 激酶 II β 亞單位(CaM kinase II subunit beta)、CaMK-II 激酶 β 亞單位(CaMK-II subunit beta)、其同源物、變異 體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號52中記載的CAMK2B基因(GenBank登錄 號NM_001220)或其他生物種同源物等。CAMK2B基因可以根據Tombes R. M.，等，1997年， Biochem. Biophys. Acta.，第 1355 卷，pp. 281-292 中記載的方法得到。本說明書中使用的「SLC2A14基因」或「SLC2A14」的術語，在沒有被序列號定義的 情況下，包括特定鹼基序列(序列號53)表示的溶質載體家族2 (Solute carrier family 2)基因(DNA)、編碼易化葡萄糖轉運成員 14(facilitated glucose transporter member 14)、葡萄糖轉運蛋白14(Glucose transporter type 14)、GLUT14、其同源物、變異體及 衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號53中記載的SLC2A14基因(GenBank登錄號 NM_153449)或其他生物種同源物等。SLC2A14基因可以根據而X.等，2002年，Genomics， 第80卷，pp. 553-557中記載的方法得到。本說明書中使用的「SATB2基因」或「SATB2」的術語，在沒有被序列號定義的情 況下，包括特定鹼基序列(序列號54)表示的DNA結合蛋白SATB2(DNA-binding protein SATB2)基因(DNA)、編碼特異富含 AT 序列結合蛋白 2 (Special AT-rich sequence-binding protein 2)、FLJ21474、KIAA1034、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序 列號討中記載的SATB2基因(GenBank登錄號NM_015 或其他生物種同源物等。SATB2 基因可以根據 FitzPatrick D. R.，等，2003 年，Hum. Mol. Genet.，第 12 卷，pp. 2491-2501 中 記載的方法得到。本說明書中使用的「SEPT6基因」或「SEPT6」的術語，在沒有被序列號定義的情況 下，包括特定鹼基序列(序列號55)表示的kptin-6基因(DNA)、編碼KIAA0U8、MGC16619、 MGC20339、SEP2、SEPT2、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號55中 記載的SEPT6基因(GenBank登錄號ΝΜ_015129)或其他生物種同源物等。SEPT6基因可以 根據 Sui L.，等，2003 年，Biochem. Biophys. Res. Commun.，第 304 卷，pp. 393-398 中記載的 方法得到。本說明書中使用的「GALNS基因」或「GALNS」的術語，在沒有被序列號定義的情況 下，包括特定鹼基序列(序列號56)表示的半乳糖胺(N-乙醯基)-6-硫酸鹽硫酸酯酶(( lactosamine (N-acetyl)-6-sulfate sulfatase)基因(DNA)、編石馬 Morquio syndrome、粘 多糖貯積症IVA型(mucopolysaccharidosis type IVA)、其同源物、變異體及衍生物等的 基因(DNA)。具體包括序列號56中記載的GALNS基因(GenBank登錄號NM_000512)或其 他生物種同源物等。GALNS基因可以根據Nakashima Y.，等，1994年，Genomics，第20卷， pp. 99-104中記載的方法得到。本說明書中使用的「TR0AP基因」或「TR0AP」的術語，在沒有被序列號定義的情 況下，包括特定鹼基序列(序列號57)表示的滋養蛋白關聯蛋白(Trophinin associated protein)基因(DNA)、編碼滋養蛋白輔助蛋白(tastin)、其同源物、變異體及衍生物等的 基因(DNA)。具體包括序列號57中記載的TROAP基因(GenBank登錄號NM_005480)或其 他生物種同源物等。TROAP基因可以根據Fukuda M. N.，等，1995年，Genes Dev.，第9卷， pp. 1199-1210中記載的方法得到。本說明書中使用的「XRCC3基因」或「XRCC3」的術語，在沒有被序列號定義的情況 下，包括特定鹼基序列(序列號58)表示的中國倉鼠細胞X射線修復補缺陷修復3 (X-ray repair complementing defective repairin Chinese hamster cells 3)基因(DNA)、編 碼其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號58中記載的XRCC3基因 (GenBank登錄號匪_00543幻或其他生物種同源物等。XRCC3基因可以根據Tebbs R. S.， 等，1995 年，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α.，第 92 卷，pp. 6354-6358 中記載的方法得到。本說明書中使用的「FGF3基因」或「FGF3」的術語，在沒有被序列號定義的情況 下，包括特定鹼基序列(序列號59)表示的成纖維生長因子3 (fibroblast growth factor 3)基因(DNA)、編碼鼠乳腺腫瘤病毒整合位點(v-int-2)癌基因同源物(murine mammary tumor virus integration site (v-int-2) oncogene homolog)、INT-2、HBGF-3、其同源 物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號59中記載的FGF3基因(GenBank登 錄號NM_005M7)或其他生物種同源物等。FGF3基因可以根據Brookes S.，等，1989年， Oncogene，第4卷，pp. 429-436中記載的方法得到。本說明書中使用的「EIF4EBP2基因」或「EIF4EBP2」的術語，在沒有被序列號定 義的情況下，包括特定鹼基序列(序列號60)表示的真核細胞翻譯起始因子4E結合蛋白 (eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein)基因(DNA)、編石馬 4EBP2、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號60中記載的EIF4EBP2 基因(GenBank登錄號NM_004096)或其他生物種同源物等。EIF4EBP2基因可以根據Pause Α.，等，1994，Nature.，第 371 卷，pp. 762-767 中記載的方法得到。Kawamata, H.等，2003 年， Cancer kience，第94卷，pp. 699-706中公開了 EIF4EBP2基因在食管癌株化細胞的轉移 性亞株中表達增加。本說明書中使用的「RRM1基因」或「RRM1」的術語，在沒有被序列號定義的情況下， 包括特定鹼基序列(序列號61)表示的核苷酸還原酶Ml多肽(ribonucleotide reductase Ml polyp印tide)基因(DNA)、編碼Rl、RR1、MR1、其同源物、變異體及衍生物等的基因 (DNA)。具體包括序列號61中記載的RRMl基因(GenBank登錄號ΝΜ_001033)或其他生物 種同源物等。RRMl基因可以根據Parker N. J.，等，1994年，Genomics，第19卷，pp. 91-96 中記載的方法得到。 本說明書中使用的「Mere基因」或「Mere」的術語，在沒有被序列號定義的情況下，包括特定鹼基序列(序列號6 表示的甘露糖-6-磷酸受體(陽離子依賴) (mannose-6-phosphate receptor (cation dependent))基因 (DNA)、編碼其同源物、變異 體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號62中記載的M6ra基因(GenBank登錄號 NM_002355)或其他生物種同源物等。M6PR基因可以根據Pohlmann R.，等，1987年，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α.，第 84 卷，pp. 5575-5579 中記載的方法得到。本發明提供對診斷及治療食管癌有用的疾病確定用組合物及使用了該組合物的 食管癌確定(或檢測)方法，由此具有以下獨特的作用效果，即，提供具有特異性且預測率 高、及迅速、簡單的確定食管癌的方法。本說明書包括作為本申請優先權基礎的日本國專利申請2008-133491號說明書 及/或附圖中記載的內容。


[圖1]表示組合使用與表1中記載的基因對應的序列號63 124的多核苷酸時， 存在食管癌細胞的檢出率。縱軸表示能夠檢測到樣品中存在食管癌組織的準確率，橫軸表 示檢測食管癌所需要的基因總數，該基因數按照表1中記載的序列號依次增加。[圖2]表示組合使用與表1中記載的基因對應的序列號63 124的多核苷酸時， 存在食管癌細胞的檢出率。縱軸表示樣品中存在食管癌組織的準確率，橫軸從左依次表示 以由食管癌組織得到的總RNA與由不含食管癌的組織得到的總RNA的比率為9 1、8 2、 7 3、6 4、5 5、4 6、3 7、2 8、1 9混合得到的RNA混合物的數據。[圖3]表示組合使用與表1中記載的基因對應的序列號63 124的多核苷酸時， 存在來自活檢組織的食管癌細胞的檢出率。縱軸表示活檢樣品中存在食管癌組織的準確 率，橫軸的左邊的框表示由利用內窺鏡採集的食管癌患者的不含食管癌的活檢組織得到的 數據，橫軸的右邊的框表示由利用內窺鏡採集的食管癌患者的含有食管癌的活檢組織得到 的數據。[圖4]表示組合使用與國際公開第2006/118308號中記載的食管癌診斷用組合物 對應的多核苷酸時，存在食管癌細胞的檢出率。辨別機按照專利文獻6所述的方法，製作癌 辨別用辨別機，辨別活檢樣品中存在食管癌組織的準確率。縱軸表示活檢樣品中存在食管 癌組織的準確率，橫軸的左邊的框表示由利用內窺鏡採集的食管癌患者的不含食管癌的活 檢組織得到的數據，橫軸的右邊的框表示由利用內窺鏡採集的食管癌患者的含有食管癌的 活檢組織得到的數據。[圖5]表示組合使用與國際公開第2006/118308號中記載的食管癌診斷用組合物 對應的多核苷酸時，存在食管癌細胞的檢出率。辨別機按照專利文獻6所述的方法，製作非 癌辨別用辨別機，辨別活檢樣品中存在食管癌組織的準確率。縱軸表示活檢樣品中存在食 管癌組織的準確率，橫軸的左邊的框表示由利用內窺鏡採集的食管癌患者的不含食管癌的 活檢組織得到的數據，橫軸的右邊的框表示由利用內窺鏡採集的食管癌患者的含有食管癌 的活檢組織得到的數據。[圖6]表示組合使用與國際公開第2006/118308號中記載的食管癌診斷用組合物 對應的多核苷酸時，存在食管癌細胞的檢出率。利用本說明書所述的方法製作辨別機，辨別 活檢樣品中存在食管癌組織的準確率。縱軸表示活檢樣品中存在食管癌組織的準確率，橫軸的左邊的框表示由利用內窺鏡採集的食管癌患者的不含食管癌的活檢組織得到的數據， 橫軸的右邊的框表示由利用內窺鏡採集的食管癌患者的含有食管癌的活檢組織得到的數 據。
具體實施例方式以下進一步具體地說明本發明。1.食管癌靶核酸作為在使用本發明上述定義的食管癌診斷用組合物及試劑盒用於確定存在及/ 或不存在食管癌或食管癌細胞的食管癌標記物的靶核酸，例如包括含有序列號1 62表示 的鹼基序列的人類基因(即，EYA2、SERF1A、IGHGl、ITSN2、RAB11FIP5、HSPA1A、NMU, E2F3、 ESR2、CFDP1、HSPC190、COL1A2、GCS1、PARL、CELSR2、NDRG1、SLC25A44、TUSC2、SLC4A1、MS4A7、 TMSB4X、PRCU VCP, RBM9、GPR126、H0XA10, PPP1R1A、MY09B、SLC04C1、SERPINB13、SDC2、 T0R1A、RPL18A、GAS7、WISPU CACNG4、S100P, UCHL5、AQP3、NSUN5、B4GALT2、CD48、DAB2、 EB13、MAP3K12、SPEN、ARHGEF3、C0L3A1、CSTB、SPRR3、SLIT2、CAMK2B、SLC2A14、SATB2、SEPT6、 GALNS、TR0AP、XRCC3、FGF3、EIF4EBP2、RRM1 及 M6PR)、其同源物、其轉錄產物或 cDNA、或其變 異體或衍生物。此處，基因、同源物、轉錄產物、cDNA、變異體及衍生物的含義與上述定義相 同。優選的靶核酸為含有序列號1 62表示的鹼基序列的人類基因、其轉錄產物或cDNA， 較優選該轉錄產物或cDNA。在本發明中，成為食管癌靶的上述基因在患有食管癌的受試者中的表達水平，與 健康受試者相比均增加/降低(參見下述實施例的表1)。第1靶核酸是EYA2基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生物。迄 今為止還沒有關於EYA2基因或其轉錄產物的表達增加可以作為食管癌的標誌(marker)的 報導。第2靶核酸是SERFlA基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生物。 迄今為止還沒有關於SERFlA基因或其轉錄產物的表達增加可以作為食管癌的標誌的報導。第3靶核酸是IGHGl基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生物。 迄今為止還沒有關於IGHGl基因或其轉錄產物的表達增加可以作為食管癌的標誌的報導。第4靶核酸是ITSN2基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生物。 迄今為止還沒有關於ITSN2基因或其轉錄產物的表達增加可以作為食管癌的標誌的報導。第5靶核酸是RAB11FIP5基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生 物。迄今為止還沒有關於RAB11FIP5基因及其轉錄產物的表達增加可以作為食管癌的標誌 的報導。第6靶核酸是HSPAlA基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生物。 迄今為止還沒有關於HSPAlA基因及其轉錄產物的表達增加可以作為食管癌的標誌的報導。第7靶核酸是NMU基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生物。迄 今為止還沒有關於NMU基因及其轉錄產物的表達增加可以作為食管癌的標誌的報導。第8靶核酸是E2F3基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生物。迄今為止還沒有關於E2F3基因及其轉錄產物的表達增加可以作為食管癌的標誌的報導。第9靶核酸是ESR2基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生物。迄 今為止還沒有關於ESR2基因及其轉錄產物的表達增加可以作為食管癌的標誌的報導。第10靶核酸是CFDPl基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生物。 迄今為止還沒有關於CFDPl基因及其轉錄產物的表達增加可以作為食管癌的標誌的報導。第11靶核酸是HSPC190基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生 物。迄今為止還沒有關於HSPC190基因及其轉錄產物的表達增加可以作為食管癌的標誌的 報導。第12靶核酸是C0L1A2基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生 物。迄今為止還沒有關於C0L1A2基因及其轉錄產物的表達增加可以作為食管癌的標誌的 報導。第13靶核酸是GCSl基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生物。 迄今為止還沒有關於GCSl基因及其轉錄產物的表達增加可以作為食管癌的標誌的報導。第14靶核酸是PARL基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生物。 迄今為止還沒有關於PARL基因及其轉錄產物的表達減少可以作為食管癌的標誌的報導。第15靶核酸是CELSR2基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生 物。迄今為止還沒有關於CELSR2基因及其轉錄產物的表達增加可以作為食管癌的標誌的 報導。第16靶核酸是NDRGl基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生物。 迄今為止還沒有關於NDRGl基因及其轉錄產物的表達增加可以作為食管癌的標誌的報導。第17靶核酸是SLC25A4基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生 物。迄今為止還沒有關於SLC25A4基因及其轉錄產物的表達增加可以作為食管癌的標誌的 報導。第18靶核酸是TUSC2基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生物。 迄今為止還沒有關於TUSC2基因及其轉錄產物的表達增加可以作為食管癌的標誌的報導。第19靶核酸是SLC4A1基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生 物。迄今為止還沒有關於SLC4A1基因及其轉錄產物的表達增加可以作為食管癌的標誌的 報導。第20靶核酸是MS4A7基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生物。 迄今為止還沒有關於MS4A7基因及其轉錄產物的表達減少可以作為食管癌的標誌的報導。第21靶核酸是TMSB4X基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生 物。迄今為止還沒有關於TMSB4X基因及其轉錄產物的表達增加可以作為食管癌的標誌的 報導。第22靶核酸是PRCl基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生物。 迄今為止還沒有關於PRCl基因及其轉錄產物的表達減少可以作為食管癌的標誌的報導。第23靶核酸是VCP基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生物。迄 今為止還沒有關於VCP基因及其轉錄產物的表達增加可以作為食管癌的標誌的報導。第M靶核酸是RBM9基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生物。 迄今為止還沒有關於RBM9基因及其轉錄產物的表達增加可以作為食管癌的標誌的報導。
第25靶核酸是GPRU6基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生 物。迄今為止還沒有關於GPRU6基因及其轉錄產物的表達增加可以作為食管癌的標誌的 報導。第沈靶核酸是H0XA10基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生 物。迄今為止還沒有關於H0XA10基因及其轉錄產物的表達增加可以作為食管癌的標誌的 報導。第27靶核酸是PPP1R1A基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生 物。迄今為止還沒有關於PPP1R1A基因及其轉錄產物的表達增加可以作為食管癌的標誌的 報導。第28靶核酸是MY09B基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生物。 迄今為止還沒有關於MY09B基因及其轉錄產物的表達增加可以作為食管癌的標誌的報導。第四靶核酸是SLC04C1基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生 物。迄今為止還沒有關於SLC04C1基因及其轉錄產物的表達增加可以作為食管癌的標誌的 報導。第30靶核酸是SERPINB13基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生 物。迄今為止還沒有關於SERPINB13基因及其轉錄產物的表達增加可以作為食管癌的標誌 的報導。第31靶核酸是SDC2基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生物。 迄今為止還沒有關於SDC2基因及其轉錄產物的表達減少可以作為食管癌的標誌的報導。第32靶核酸是TORlA基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生物。 迄今為止還沒有關於TORlA基因及其轉錄產物的表達增加可以作為食管癌的標誌的報導。第33靶核酸是RPL18A基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生 物。迄今為止還沒有關於RPL18A基因及其轉錄產物的表達增加可以作為食管癌的標誌的 報導。第34靶核酸是GAS7基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生物。 迄今為止還沒有關於GAS7基因及其轉錄產物的表達增加可以作為食管癌的標誌的報導。第35靶核酸是WISPl基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生物。 迄今為止還沒有關於WISPl基因及其轉錄產物的表達減少可以作為食管癌的標誌的報導。第36靶核酸是CACNG4基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生 物。迄今為止還沒有關於CACNG4基因及其轉錄產物的表達增加可以作為食管癌的標誌的 報導。第37靶核酸是S100P基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生物。 迄今為止還沒有關於S100P基因及其轉錄產物的表達減少可以作為食管癌的標誌的報導。第38靶核酸是UCHL5基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生物。 迄今為止還沒有關於UCHL5基因及其轉錄產物的表達減少可以作為食管癌的標誌的報導。第39靶核酸是AQP3基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生物。 已知AQP3基因及其轉錄產物的表達可以作為食管癌的標誌(W0 06118308)。第40靶核酸是NSUN5基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生物。 已知NSUN5基因及其轉錄產物的表達可以作為食管癌的標誌(W0 06118308)。
第41靶核酸是B4GALT2基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生 物。已知B4GALT2基因及其轉錄產物的表達可以作為食管癌的標誌(W0 06118308)。第42靶核酸是CD48基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生物。 已知⑶48基因及其轉錄產物的表達可以作為食管癌的標誌(W0 06118308)。第43靶核酸是DAB2基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生物。 已知DAB2基因及其轉錄產物的表達可以作為食管癌的標誌(W0 06118308)。第44靶核酸是EBI3基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生物。 已知EBI3基因及其轉錄產物的表達可以作為食管癌的標誌(W0 06118308)。第45靶核酸是MAP;3K12基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生 物。已知MAP;3K12基因及其轉錄產物的表達可以作為食管癌的標誌(W0 06118308)。第46靶核酸是SPEN基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生物。 已知SPEN基因及其轉錄產物的表達可以作為食管癌的標誌(W0 06118308)。第47靶核酸是ARHGEF3基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生 物。已知ARHGEF3基因及其轉錄產物的表達可以作為食管癌的標誌(W0 06118308)。第48靶核酸是C0L3A1基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生物。 已知C0L3A1基因及其轉錄產物的表達可以作為食管癌的標誌(Su，H.，等，2003年，Cancer Research，第 63 卷，pp. 3872-3876)。第49靶核酸是CSTB基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生物。 已知CSTB基因或其轉錄產物的表達可以作為食管癌的標誌(WO 0304266UShiraishi,T., 等，1998 年，International Journal of Cancer, % 79 卷，pp. 175-178)。第50靶核酸是SPRR3基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生物。 已知SraR3基因為食管癌的標誌(W0 06118308、國際公開WO 2003/0似661說明書、Chem， B. S.，等，2000 年，Carcinogenesis，第 21 卷，p2147_2150、Abraham，J. Μ.，等，1996 年，Cell Growth & Differentiation,第 7 卷，ρ855_860)ο第51靶核酸是SLIT2基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生物。 已知SLIT2基因為食管癌的標誌(W0 06118308)。第52靶核酸是CAMK2B基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生物。 已知CAMK2B基因為食管癌的標誌(W0 06118308)。第53靶核酸是SLC2A14基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生 物。已知SLC2A14基因為食管癌的標誌(W0 06118308)。第M靶核酸是SATB2基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生物。 已知SATB2基因為食管癌的標誌(W0 06118308)。第55靶核酸是SEPT6基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生物。 迄今為止還沒有關於SEPT6基因及其轉錄產物的表達減少可以作為食管癌的標誌的報導。第56靶核酸是GALNS基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生物。 已知GALNS基因為食管癌的標誌(W0 06118308)。第57靶核酸是TROAP基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生物。 已知TROAP基因為食管癌的標誌(W0 06118308)。第58靶核酸是XRCC3基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生物。已知XRCC3基因為食管癌的標誌(W0 06118308)。第59靶核酸是FGF3基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生物。 已知FGF3基因為食管癌的標誌(W0 06118308)。第60靶核酸是EIF4EBP2基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生 物。已知EIF4EBP2基因為食管癌的標誌(W0 06118308)。第61靶核酸是RRMl基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生物。 已知RRMl基因為上皮系惡性腫瘤的標誌(WO 06119464A1)。第62靶核酸是基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生物。 已知M6PR基因為食管癌的標誌(W0 06118308)。2.食管癌相關靶多肽作為使用本發明上述定義的食管癌診斷用組合物及試劑盒用於確定食管癌或食 管癌細胞存在及/或不存在的食管癌標記物的靶核酸，包括例如由含有序列號1 62表示 的鹼基序列的人類基因(即，分別為 EYA2、SERF1A、IGHG1、ITSN2、RAB11FIP5、HSPA1A、NMU、 E2F3、ESR2、CFDP1、HSPC190、COL1A2、GCS1、PARL、CELSR2、NDRG1、SLC25A44、TUSC2、SLC4A1、 MS4A7、TMSB4X、PRCl、VCP, RBM9、GPR126、H0XA10, PPP1R1A、MY09B、SLC04C1、SERPINB13、 SDC2、T0R1A、RPL18A、GAS7、WISPl、CACNG4、S100P, UCHL5、AQP3、NSUN5、B4GALT2、CD48、 DAB2、EBI3、MAP3K12、SPEN、ARHGEF3、C0L3A1、CSTB、SPRR3、SLIT2、CAMK2B、SLC2A14、SATB2、 SEPT6、GALNS, TROAP, XRCC3、FGF3、EIF4EBP2、RRMl、及 M6PR)編碼的多肽，例如含有序列號 125 186表示的胺基酸序列的人多肽、其同源物、或其變異體或衍生物。此處，多肽、同源 物、變異體及衍生物的含義與上述定義相同。優選的靶多肽是含有序列號125 186表示 的胺基酸序列的人多肽。本發明中，成為食管癌的靶的上述多肽與對應的基因及其轉錄產物的表達量相同 地都具有以下特徵食管組織中的表達量低於其在非癌組織中的表達量，或血液中的該多 肽的水平在患有食管癌的受試者中與健康受試者相比增加或下降。 3.食管癌診斷用組合物3. 1 核酸本發明中，能用於確定或診斷食管癌的核酸組合物能夠定性及/或定量地測定食 管癌的靶核酸的存在、表達水平或存在量，作為食管癌的靶核酸，為來自人的EYA2、SERF1A、 IGHGU ITSN2、RAB11FIP5、HSPA1A、NMU, E2F3、ESR2、CFDPl、HSPC190、C0L1A2、GCSU PARL, CELSR2、NDRG1、SLC2 5A44、TUSC2、SLC4A1、MS4A7、TMSB4X、PRC1、VCP、RBM9、GPR126、HOXA10、 PPP1R1A、MY09B、SLC04C1、SERPINB13、SDC2、T0R1A、RPL18A、GAS7、WISPl、CACNG4、S100P, UCHL5、AQP3、NSUN5、B4GALT2、CD48、DAB2、EBI3、MAP3K12、SPEN、ARHGEF3、C0L3A1、CSTB, SPRR3、SLIT2、CAMK2B、SLC2A14、SATB2、SEPT6、GALNS, TROAP, XRCC3、FGF3、EIF4EBP2、RRMl 及M6ra基因、其同源物、其轉錄產物或cDNA、或其變異體或衍生物。上述靶核酸在患有食管癌的受試者中的表達水平與在健康受試者中的表達水平 相比增加或降低。因此，本發明的組合物能夠有效地用於測定食管癌組織和正常食管組織 中的靶核酸的表達水平，並對其進行比較。本發明中能使用的組合物包括選自下述多核苷酸組的1種或多種(優選3個以 上、較優選5個以上)多核苷酸的組合，所述多核苷酸組為患有食管癌的患者的生物組織中含有序列號1 62表示的鹼基序列的多核苷酸組及其互補多核苷酸組；在嚴格條件下與下 述DNA分別雜交的多核苷酸組及其互補多核苷酸組，所述DNA由與上述鹼基序列互補的鹼 基序列組成；及上述多核苷酸組的鹼基序列中含有15個以上、優選20個以上、較優選25個 以上連續鹼基的多核苷酸組。具體而言，本發明的組合物可以含有以下1種或多種(優選3個以上、較優選5個 以上)多核苷酸或其片段。(1)由序列號1 62表示的鹼基序列組成的多核苷酸組、其變異體、或其含有15 個以上連續鹼基的片段。(2)含有序列號1 62表示的鹼基序列的多核苷酸組。(3)由序列號1 62表示的鹼基序列組成的多核苷酸組、其變異體、或其含有15 個以上連續鹼基的片段。(4)含有序列號1 38表示的鹼基序列的多核苷酸組。(5)由與序列號1 38表示的鹼基序列互補的鹼基序列組成的多核苷酸組、其變 異體、或其含有15個以上連續鹼基的片段。(6)含有與序列號1 38表示的鹼基序列互補的鹼基序列的多核苷酸組。(7)在嚴格條件下，與下述DNA雜交的多核苷酸組、或其含有15個以上連續鹼基的 片段，上述DNA由與序列號1 38表示的各鹼基序列互補的鹼基序列組成。(8)在嚴格條件下與由序列號1 38表示的各鹼基序列組成的DNA雜交的多核苷 酸組、或其含有15個以上連續鹼基的片段。(9)由序列號39 62表示的鹼基序列組成的多核苷酸組、其變異體、或其含有15 個以上連續鹼基的片段。(10)含有序列號39 62表示的鹼基序列的多核苷酸組。(11)由與序列號39 62表示的鹼基序列互補的鹼基序列組成的多核苷酸組、其 變異體、或含有15個以上連續鹼基的片段。(12)含有與序列號39 62表示的鹼基序列互補的鹼基序列的多核苷酸組。(13)在嚴格條件下，與下述DNA雜交的多核苷酸組、或其含有15個以上連續鹼基 的片段，上述DNA由與序列號39 62表示的各鹼基序列互補的鹼基序列組成。(14)在嚴格條件下，與由序列號39 62表示的各鹼基序列組成的DNA雜交的多 核苷酸組、或其含有15個以上連續鹼基的片段。上述(1) (14)的多核苷酸的片段可以含有各多核苷酸的鹼基序列中的例如下 述範圍的連續鹼基數，但並不限定於此，所述範圍包括15 序列的全部鹼基數、15 5000 個鹼基、15 4500個鹼基、15 4000個鹼基、15 3500個鹼基、15 3000個鹼基、15 2500個鹼基、15 2000個鹼基、15 1500個鹼基、15 1000個鹼基、15 900個鹼基、 15 800個鹼基、15 700個鹼基、15 600個鹼基、15 500個鹼基、15 400個鹼基、 15 300個鹼基、15 250個鹼基、15 200個鹼基、15 150個鹼基、15 140個鹼基、 15 130個鹼基、15 120個鹼基、15 110個鹼基、15 100個鹼基、15 90個鹼基、 15 80個喊基、15 70個喊基、15 60個喊基、15 50個喊基、15 40個喊基、15 30個鹼基或15 25個鹼基；25 序列的全部鹼基數、25 1000個鹼基、25 900個鹼 基、25 800個鹼基、25 700個鹼基、25 600個鹼基、25 500個鹼基、25 400個鹼基、25 300個鹼基、25 250個鹼基、25 200個鹼基、25 150個鹼基、25 140個鹼 基、25 130個鹼基、25 120個鹼基、25 110個鹼基、25 100個鹼基、25 90個鹼 基、25 80個鹼基、25 70個鹼基、25 60個鹼基、25 50個鹼基或25 40個鹼基； 50 序列的全部鹼基數、50 1000個鹼基、50 900個鹼基、50 800個鹼基、50 700 個鹼基、50 600個鹼基、50 500個鹼基、50 400個鹼基、50 300個鹼基、50 250 個鹼基、50 200個鹼基、50 150個鹼基、50 140個鹼基、50 130個鹼基、50 120 個鹼基、50 110個鹼基、50 100個鹼基、50 90個鹼基、50 80個鹼基、50 70個鹼 基或50 60個鹼基；60 序列的全部鹼基數、60 1000個鹼基、60 900個鹼基、60 800個鹼基、60 700個鹼基、60 600個鹼基、60 500個鹼基、60 400個鹼基、60 300個鹼基、60 250個鹼基、60 200個鹼基、60 150個鹼基、60 140個鹼基、60 130個鹼基、60 120個鹼基、60 110個鹼基、60 100個鹼基、60 90個鹼基、60 80 個鹼基或60 70個鹼基等。根據本發明的實施方案，含有序列號1 62表示的鹼基序列的多核苷酸的片段， 優選分別含有序列號63 124表示的鹼基序列或其互補序列、或其連續15個鹼基以上的 部分序列。本發明的組合物中例如含有以下多核苷酸。(1)序列號1 38表示的鹼基序列或其互補序列的各序列中，含有15個以上連續 鹼基的多核苷酸。(2)序列號1 38表示的鹼基序列或其互補序列的各序列中，含有60個以上連續 鹼基的多核苷酸。(3)序列號39 62表示的鹼基序列或其互補序列中，含有15個以上連續鹼基的 多核苷酸。(4)序列號39 62表示的鹼基序列或其互補序列中，含有60個以上連續鹼基的 多核苷酸。(5)序列號1 38表示的鹼基序列中，分別含有序列號63 100表示的鹼基序 列、且含有60個以上連續鹼基的多核苷酸。(6)與序列號1 38表示的鹼基序列互補的序列中，分別含有與序列號63 100 表示的鹼基序列互補的序列、且含有60個以上連續鹼基的多核苷酸。(7)序列號39 62表示的鹼基序列中，含有序列號101 IM表示的鹼基序列、 且含有60個以上連續鹼基的多核苷酸。(8)與序列號39 62表示的鹼基序列互補的序列中，分別含有與序列號101 124表示的鹼基序列互補的序列、且含有60個以上連續鹼基的多核苷酸。本發明中使用的上述多核苷酸類或其片段類均可以為DNA或RNA。作為本發明的組合物的多核苷酸可以使用DNA重組技術、PCR法、使用DNA/RNA自 動合成儀的方法等常規技術進行製作。DNA重組技術及PCR法可以使用例如Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons, US (1993) ；Sambrook 等，Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,US(1989)等中記載的技術。來自人的EYA2、SERF1A、IGHGl、ITSN2、RAB11FIP5、HSPA1A、NMU, E2F3、ESR2、CFDPl、HSPC190、C0L1A2、GCSl、PARL, CELSR2、NDRGl、SLC25A44、TUSC2、SLC4A1、MS4A7、 TMSB4X、PRCU VCP, RBM9、GPR126、H0XA10, PPP1R1A、MY09B、SLC04C1、SERPINB13、SDC2、 T0R1A、RPL18A、GAS7、WISPU CACNG4、S100P, UCHL5、AQP3、NSUN5、B4GALT2、CD48、DAB2、 EB13、MAP3K12、SPEN、ARHGEF3、C0L3A1、CSTB、SPRR3、SLIT2、CAMK2B、SLC2A14、SATB2、SEPT6、 GALNS, TROAP, XRCC3、FGF3、EIF4EBP2、RRMl及M6PR基因是公知的，如上所述，其獲得方法 也是已知的。所以，可以通過克隆上述基因製作作為本發明的組合物的多核苷酸。構成本發明的組合物的多核苷酸可以使用DNA自動合成裝置化學合成得到。通常 可以使用亞磷醯胺法進行合成，利用該方法可以自動合成至約100個鹼基的單鏈DNA。DNA 自動合成裝置可以從例如Polygen公司、ABI公司、Applied BioSystems公司等購買。或者，本發明的多核苷酸也可以通過cDNA克隆法製作。可以從表達作為本發明中 的靶的上述基因的食管組織等生物組織中提取總RNA，將該總RNA用寡聚dT纖維素柱處理 得到聚A⑴RNA，通過RT-PCR法由該聚A⑴RNA製作cDNA庫，通過雜交篩選、表達篩選、抗 體篩選等進行篩選，從該cDNA庫得到目標cDNA克隆。也可以根據需要，利用PCR法擴增 cDNA克隆。可以基於序列號1 62表示的鹼基序列，從15 100個連續鹼基序列中選擇並 合成探針或引物。例如在 Sambrook，J. & Russel，D.著，Molecular Cloning,A LABORATORY MANUAL、Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001 年 1 月 15 日出版，第 1 卷 7· 42 7. 45，第2卷8. 9 8. 17中記載了 cDNA克隆技術。3. 2食管癌診斷用試劑盒(抗體)本發明還提供一種食管癌診斷用試劑盒，所述食管癌診斷用試劑盒含有針對下述 多肽的1種或多種(優選3個以上)的抗體、其片段、或其化學修飾衍生物，所述多肽具有 序列號125 162表示的胺基酸序列。本發明的試劑盒可以進一步含有針對下述多肽的1種或多種(優選2個以上)的 抗體、其片段、或其化學修飾衍生物，所述多肽具有序列號163 186表示的胺基酸序列。通 過並用上述抗體，可以提高用於預後預測的準確度。S卩，根據本發明，為了檢測作為食管癌標記物的、被上述EYA2、SERF1A、IGHGU ITSN2、RAB11FIP5、HSPA1A、NMU、E2F3、ESR2、CFDPl、HSPC190、COL1A2、GCSl、PARL、CELSR2、 NDRG1、SLC2 5A44、TUSC2、SLC4A1、MS4A7、TMSB4X、PRC1、VCP、RBM9、GPR126、HOXA10、PPP1RIA、 MY09B、SLC04C1、SERPINB13、SDC2、T0R1A、RPL18A、GAS7、WISP1、CACNG4、S100P、UCHL5、AQP3、 NSUN5、B4GALT2、CD48、DAB2、EBI3、MAP3K12、SPEN、ARHGEF3、C0L3A1、CSTB, SPRR3、SLIT2、 CAMK2B、SLC2A14、SATB2、SEPT6、GALNS, TROAP, XRCC3、FGF3、EIF4EBP2、RRMl 及 M6PR 基因 編碼的多肽、其同源物、或其變異體或衍生物，可以組合使用1種或多種針對上述多肽的抗 體。上述多肽可以利用DNA重組技術得到。例如，將如上所述得到的cDNA克隆插入表 達載體中，通過培養由該載體轉化或轉染的原核或真核宿主細胞，可以從該細胞或培養上 清得到上述多肽。載體及表達系統可以從Novagen公司、寶酒造、第一化學藥品、Qiagen公 司、Stratagene 公司 >Promega 公司、Roche Diagnositics 公司、Invitrogen 公司 >Genetics hstitute公司、Amersham Bioscience公司等購買。作為宿主細胞，可以使用細菌等原核 細胞(例如大腸桿菌、枯草菌)、酵母(例如釀酒酵母)、昆蟲細胞(例如Sf細胞)、哺乳動 物細胞(例如C0S、CH0、BHK)等。載體中除含有編碼該多肽的DNA以外，還可以含有調節成分，例如啟動子、增強子、多聚腺苷酸化信號、核糖體結合部位、複製起始點、終止子、選擇標 記等。為了容易進行多肽的精製，可以將多肽製成在多肽的C末端或N末端結合了標記肽 的融合多肽。作為代表性的標記肽，可以舉出6 10個殘基的組氨酸重複序列、FLAG、myc 肽、GFP多肽等，但標記肽並不限定於此。另外，DNA重組技術記載於Sambrook，J. & Russel， D.(參見上述記載)。在不結合標記肽的狀態下製備本發明的多肽時，作為其精製方法，例如可以舉出 利用離子交換色譜法的方法。除此之外，還可以使用組合凝膠過濾或疏水性色譜、等電點色 譜等的方法。另一方面，在該蛋白上結合組氨酸重複序列、FLAG、myc、GFP等標記肽時，可以 舉出適合通常使用的各種標記肽的親和色譜法。可以構建能容易分離·精製的表達載體。 特別是構建能以多肽和標記肽的融合多肽的狀態進行表達的表達載體，利用基因工程技術 製備該多肽時，也可容易地進行分離·精製。識別如上所述得到的多肽的抗體可以通過抗體的抗原結合部位特異性結合該多 肽。具體而言可以將具有序列號125 186的胺基酸序列的多肽或其片段、其變異體多肽 或融合多肽等，分別用作用於產生免疫反應性抗體的免疫原。更具體而言，多肽、片段、變異體、融合多肽等含有促使抗體形成的抗原決定基或 抗原決定部位，上述抗原決定基或抗原決定部位可以是直鏈，也可以是較高級結構(斷 開)。需要說明的是，該抗原決定基或抗原決定部位可以通過本領域已知的所有方法進行確定。利用本發明的多肽能誘導所有種類的抗體。如果分離該多肽的全部或一部分或 抗原決定部位，則使用常規技術即可製備多克隆抗體及單克隆抗體中的任一個。方法例 如包括 Kennet 等(主編)，Monoclonal Antibodies, Hybridomas :A New Dimension in Biological Analyses, Ple num Press, NewYork, 1980 中列舉的方法。作為本發明的抗體，只要是能與本發明的靶多肽或其片段特異性結合的抗體即 可，沒有特別限定，可以使用單克隆抗體，也可以使用多克隆抗體，優選使用單克隆抗體。另 外，本發明抗體的球蛋白類型只要具有上述特徵的抗體即可，沒有特別限定，可以是IgG、 IgM、IgA、IgE、IgD 中的任一個。(1)免疫及抗體產生細胞的採集對哺乳動物例如大鼠、小鼠(例如近交系小鼠Balb/c)、家兔等給與由靶多肽組成 的免疫原。免疫原的1次給藥量可以根據免疫動物種類、給藥途徑等適當確定，每1隻動物 給藥約50 200yg。主要通過在皮下、腹腔內注入免疫原進行免疫。另外，免疫的間隔沒 有特別限定，初次免疫後，間隔數日至數周，優選間隔1 4周，進行2 10次、優選3 4 次追加免疫。初次免疫後，利用ELISA(酶聯免疫吸附測定(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay))法等反覆測定免疫動物血清中的抗體值，抗體值達到平臺時，向靜脈內或腹腔內注 射免疫原，進行最終免疫。從最終免疫日起2 5日後，優選3日後，採集抗體產生細胞。作 為抗體產生細胞，可以舉出脾臟細胞、淋巴結細胞、末梢血細胞等，優選脾臟細胞或局部淋 巴結細胞。(2)細胞融合製作生產對各靶多肽特異的單克隆抗體的雜交瘤細胞株。該雜交瘤可以通過常規技術進行生產並鑑定。用於生產該雜交瘤細胞株的方法之一包括用本發明的蛋白質免疫 動物，從被免疫的動物中採集脾臟細胞，使該脾臟細胞與骨髓瘤細胞株融合，由此生成雜交 瘤細胞，鑑定生產與該酶結合的單克隆抗體的雜交瘤細胞株。作為與抗體產生細胞融合的 骨髓瘤細胞株，可以使用小鼠等動物的通常能購買到的細胞株。作為使用的細胞株，優選具 有下述性質的細胞株，即具有藥劑選擇性，並具有在未融合狀態下在HAT選擇培養基(含有 次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶)中不能存活，只有在與抗體產生細胞融合的狀態下能存活 的性質。另外，細胞株優選來自與免疫動物同種系的動物的細胞。作為骨髓瘤細胞株的具 體例，可以舉出來自BALB/c小鼠的次黃嘌呤·鳥嘌呤·磷酸核糖基·轉換酶(HGPRT)缺損 細胞株即 P3X63-Ag. 8 株(ATCC TIB9)等。接下來使上述骨髓瘤細胞株與抗體產生細胞進行細胞融合。細胞融合如下進行 在不含有血清的DMEM、RPMI-1640培養基等動物細胞培養用培養基中，以約1 1 20 1 的比例混合抗體產生細胞和骨髓瘤細胞株，在細胞融合促進劑的存在下進行融合反應。作 為細胞融合促進劑，可以使用濃度約為10 80%、平均分子量為1500 4000道爾頓的聚 乙二醇等。另外，因情況的不同，為了提高融合效率，可以並用二甲基亞碸等輔助劑。還可 以使用利用電刺激(例如電穿孔)的市售的細胞融合裝置使抗體產生細胞和骨髓瘤細胞株 融合。(3)雜交瘤的篩選及克隆從細胞融合處理後的細胞中篩選目標雜交瘤。作為篩選方法，使用例如含有胎牛 血清的RPMI-1640培養基等適當稀釋細胞懸浮液後，以約200萬個細胞/孔左右接種到微 孔板上，向各孔中加入選擇培養基，並在以後適當更換選擇培養基，進行培養。培養溫度為 20 40°C、優選為約37°C。骨髓瘤細胞是HGPRT缺損株或胸苷激酶缺損株時，通過使用含 有次黃嘌呤·氨基蝶呤·胸腺嘧啶核苷的選擇培養基(HAT培養基)，能夠僅選擇性培養、 增殖具有抗體產生能力的細胞與骨髓瘤細胞株的雜交瘤。結果在用選擇性培養基培養開始 後，生長約14天左右的細胞可以作為雜交瘤被得到。接下來，在進行了增殖的雜交瘤的培養上清中對是否存在目標抗體進行篩選。雜 交瘤的篩選可以按照常規方法進行，沒有特別限定。例如，採集作為雜交瘤培養的包含在 孔中的培養上清的一部分，通過酶免疫測定法(EIA=Enzyme Immuno Assay、及ELISA)、放 射免疫測定法(RIA =Radio Immuno Assay)等進行篩選。融合細胞的克隆通過有限稀釋 法等進行，從而最終確立產生單克隆抗體的細胞即雜交瘤。本發明的雜交瘤如下所述，在 RPMI-1640、DMEM等基本培養基中的培養穩定，並能生產、分泌與靶多肽特異性反應的單克 隆抗體。(4)抗體的回收單克隆抗體可以利用常規技術進行回收。即，作為從確立的雜交瘤中採集單克隆 抗體的方法，可以採用通常的細胞培養法或腹水形成法等。採用細胞培養法時，在通常的培 養條件(例如，37°C、5% CO2濃度)下，在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養基、MEM培養 基或無血清培養基等動物細胞培養基中培養雜交瘤2 10日，從該培養上清中獲得抗體。 採用腹水形成法的情況下，向與來自骨髓瘤細胞的哺乳動物同種系的動物的腹腔內給與約 1000萬個雜交瘤，使雜交瘤大量增殖。並在1 2周後採集腹水或血清。對於上述抗體的採集方法，在需要精製抗體的情況下，可以通過適當選擇硫酸銨鹽析法、離子交換色譜法、親和色譜法、凝膠色譜法等公知的方法，或組合使用上述方法，得 到精製的單克隆抗體。製作多克隆抗體時，與上述相同，免疫家兔等動物，從最終免疫日起6 60天後， 利用酶免疫測定法(EIA及ELISA)、放射免疫測定法(RIA)等測定抗體值，在顯示最大抗體 值的當天採血，得到抗血清。然後，利用ELISA法等測定抗血清中的多克隆抗體的反應性。根據本發明，提供一種在體外確定受試者的樣品試樣中不含食管癌細胞/或含有 食管癌細胞的方法，所述方法包括使用本發明的上述抗體，在體外測定來自受試者的食管 癌細胞、血液等生物試樣中的該多肽水平。作為免疫學測定方法，例如可以舉出酶免疫測定法(ELISA、EIA)、螢光免疫測定 法、放射免疫測定法(RIA)、發光免疫測定法、免疫比濁法、乳膠凝集反應、乳膠比濁法、紅細 胞凝集反應、粒子凝集反應或蛋白質印跡法。上述方法通過使用了標記的免疫測定法進行時，可以在將本發明的抗體、或試樣 中的成分固相化後，進行其免疫學反應。作為固相載體，可以使用由聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯基甲苯、聚丙烯、聚乙烯、 聚氯乙烯、尼龍、聚甲基丙烯酸酯、乳膠、明膠、瓊脂糖、纖維素、瓊脂糖凝膠、玻璃、金屬、陶 瓷或磁性體等材料組成的微珠、微量培養板、試管、棒(stick)或試驗片等形狀的不溶性載 體。可以通過物理吸附法、化學結合法或並用兩種方法等公知的方法，使固相載體和 本發明的抗體或試樣成分結合，進行固相化。進而，在本發明中，為了容易地檢測本發明的抗體與試樣中的靶多肽的反應，通過 標記本發明的抗體直接檢測該反應，或通過使用標記二抗間接檢測該反應。本發明的檢測 方法，從靈敏度方面考慮，優選使用後者的間接檢測(例如，夾心法等)。作為標記物質，使用酶免疫測定法時，可以使用過氧化物酶(POD)、鹼性磷酸酶、 β -半乳糖苷酶、脲酶、過氧化氫酶、葡萄糖氧化酶、乳酸脫氫酶、澱粉酶或生物素-抗生物 素蛋白複合體等酶；使用螢光免疫測定法時，可以使用異硫氰酸螢光素、四甲基羅丹明異硫 氰酸鹽、取代異硫氰酸羅丹明、二氯三嗪異硫氰酸鹽、Alexa或AlexaFluoro等；使用放射免 疫測定法時，可以使用氚、碘125或131等。另外，使用發光免疫測定法時，可以使用NADH-、 FMNH2-、螢光素酶類、魯米諾-過氧化氫-POD類、吖啶酯類或二氧雜環丁烷化合物類等。作為標記物質和抗體的結合方法，在使用酶免疫測定法時，可以使用戊二醛法、馬 來醯亞胺法、吡啶基二硫化物法或高碘酸法等公知方法；在使用放射免疫測定法時，可以使 用氯胺T法、Bolton-Hunter法等公知方法。測定操作方法可以通過公知的方法(Current protocols in Protein Sciences、1995 年，John Wiley & Sons Inc.、Current protocols in Immunology、2001年，John Wiley & Sonslnc.)進行。例如，直接標記本發明的抗體時， 將試樣中的成分固相化，使其與標記的本發明的抗體接觸，形成標記多肽和本發明的抗體 的複合體。然後將未結合的標記抗體洗滌分離，可以由結合標記抗體量或未結合標記抗體 量測定試樣中的靶多肽的量。另外，使用例如標記二抗時，使本發明的抗體與試樣反應(一次反應)，再與標記二抗反應(二次反應)。一次反應和二次反應可以以相反的順序進行，也可以同時進行，還 可以錯開時間進行。通過一次反應及二次反應，形成固相化的靶多肽-本發明的抗體-標 記二抗的複合體、或固相化的本發明的抗體-靶多肽-標記二抗的複合體。然後洗滌分離 未結合的標記二抗，可以通過結合標記二抗量或未結合標記二抗量測定試樣中的靶多肽的量。具體而言，使用酶免疫測定法時，在標記酶的最適條件下使其與基質反應，通過光 學方法等測定反應生成物的量。使用螢光免疫測定法時，測定由螢光物質標記產生的螢光 強度，使用放射免疫測定法時，測定由放射性物質標記產生的放射能量。使用發光免疫測定 法時，測定由發光反應體系產生的發光量。本發明的方法中，通過採用光學方法測定或者肉眼觀測其透射光或散射光的測定 方法來測定免疫比濁法、乳膠凝聚反應、乳膠比濁法、紅細胞凝集反應或粒子凝集反應等中 免疫複合體凝集物的生成，此時，作為溶劑可以使用磷酸緩衝液、甘氨酸緩衝液、Tris緩衝 液或Good』 s緩衝液等，還可以在反應體系中含有聚乙二醇等反應促進劑或非特異性反應 抑制劑。本發明的試劑盒中含有的抗體可以單獨存在，也可以以混合物的狀態存在，或與 固相載體結合存在，也可以以游離狀態存在。另外，本發明的試劑盒可以含有標記二抗、載 體、清洗緩衝液、試樣稀釋液、酶基質、反應停止液、精製的作為標準物質的標記物(靶)多 肽、使用說明書等。4.食管癌診斷用試劑盒(核酸)另外，本發明提供一種食管癌診斷(檢測)用試劑盒，所述試劑盒含有與本發明的 組合中含有的多核苷酸相同的多核苷酸、其變異體及/或其片段中的1種或多種(優選3 個以上、較優選5個以上)。本發明的試劑盒優選含有選自上述3. 1中記載的多核苷酸中的1種或多種多核苷 酸或其片段。本發明的試劑盒可以含有下述多核苷酸中的3個以上，所述多核苷酸為含有序列 號1 38表示的鹼基序列的多核苷酸、含有其互補序列的多核苷酸、在嚴格條件下與上述 多核苷酸雜交的多核苷酸、或上述多核苷酸的片段。本發明的試劑盒可以進一步含有下述多核苷酸中的2個以上，所述多核苷酸為含 有序列號39 62表示的鹼基序列的多核苷酸、含有其互補序列的多核苷酸、在嚴格條件下 與上述多核苷酸雜交的多核苷酸、或上述多核苷酸的片段。本發明的試劑盒中可以含有的多核苷酸片段例如是選自下述(1) (5)中的5個 以上DNA (1)序列號1 62表示的鹼基序列或其互補序列中，含有15個以上連續鹼基的 DNA。(2)序列號1 62表示的鹼基序列或其互補序列中，含有60個以上連續鹼基的 DNA。(3)序列號1 62表示的鹼基序列或其互補序列中，分別含有序列號63 124表 示的鹼基序列或其互補序列、且含有60個以上連續鹼基的DNA。(4)包含序列號63 IM表示的鹼基序列的DNA。
(5)含有與序列號63 IM表示的鹼基序列互補的鹼基序列的DNA。在優選的實施方案中，上述多核苷酸是含有由序列號1 38中任一個表示的鹼基 序列組成的多核苷酸、由其互補序列組成的多核苷酸、在嚴格條件下與上述多核苷酸雜交 的多核苷酸、或其含有15個以上、優選20個以上、較優選25個以上連續鹼基的片段。在其他優選的實施方案中，本發明的試劑盒除含有上述多核苷酸以外，還可以含 有由序列號47表示的鹼基序列組成的多核苷酸、由其互補序列組成的多核苷酸、在嚴格條 件下與上述多核苷酸雜交的多核苷酸、或其含有15個以上連續鹼基的片段。在優選的實施方案中，上述片段可以是含有15個以上、優選20個以上、較優選25 個以上、更優選60個以上連續鹼基的多核苷酸。在其他優選的實施方案中，上述片段是序列號1 62中任一個表示的鹼基序列中 分別含有序列號63 124中任一個表示的鹼基序列、且含有60個以上連續鹼基的多核苷 酸、或含有與該多核苷酸的序列互補的鹼基序列的多核苷酸。在其他優選的實施方案中，上述片段是含有序列號63 124中任一個表示的鹼基 序列的多核苷酸。在其他優選的實施方案中，上述片段是含有與序列號63 IM中任一個表示的鹼 基序列互補的鹼基序列的多核苷酸。在其他優選的實施方案中，上述片段是由序列號63 124中任一個表示的鹼基序 列組成的多核苷酸。上述組合的例子包括對於含有序列號1 62表示的鹼基序列或其互補序列 的多核苷酸、在嚴格條件下與上述多核苷酸雜交的多核苷酸、及/或其片段(例如序列號 63 124)，從下述表1所示的基因的優先順序(第1號至第62號)較高的一方開始依次 組合基因。採用上述方案依次組合62種基因時，相對於檢測食管癌所需的基因數將存在 食管癌的檢測準確率(％ )進行繪圖，準確率如下例如僅為SPRR3(序列號50)時準確率 為42. 1%，SPRR3(序列號50)及CSTB(序列號49)的組合時準確率為52.6%，SPRR3 (序 列號50)、CSTB(序列號49)及EYA2 (序列號1)的組合時準確率為59.6%, SPRR3 (序列號 50)、0318(序列號49)3￥々2(序列號1)及SERFlA(序列號2)的組合時準確率為59.7%, SPRR3 (序列號50) ,CSTB (序列號49)、EYA2 (序列號1)、SERFlA (序列號2)及IGHGl (序列 號3)的組合時準確率為86. 0%，同樣地組合全部62種基因時，準確率為96. 5% (圖1)。因此，本發明的實施方式中，優選最少的組合為SPRR3(序列號50)、CSTB(序列號 49)、EYA2 (序列號1) ,SERFlA (序列號2)及IGHGl (序列號3)的組合，構成其的各多核苷酸 或片段選自含有序列號50、49、1、2或3所示的鹼基序列或其互補的序列的多核苷酸、在嚴 格條件下與上述多核苷酸雜交的多核苷酸、及/或其片段。進而，可以在上述5種基因中， 追加表1所示的其他基因，由此，可以提高其準確率至例如89%以上、91%以上、92%以上、 96%以上。根據其他較優選的實施方式，本發明的試劑盒可以包括3個以上(優選5個以 上) 全部的含有序列號63 IM表示的鹼基序列或其互補序列的多核苷酸。在本發明中，多核苷酸片段的大小是各多核苷酸鹼基序列中下述範圍的連續鹼基 數，例如15 序列的全部鹼基數、15 5000個鹼基、15 4500個鹼基、15 4000個鹼基、 15 3500個喊基、15 3000個喊基、15 2500個喊基、15 2000個喊基、15 1500個鹼基、15 1000個鹼基、15 900個鹼基、15 800個鹼基、15 700個鹼基、15 600個 鹼基、15 500個鹼基、15 400個鹼基、15 300個鹼基、15 250個鹼基、15 200個 鹼基、15 150個鹼基、15 140個鹼基、15 130個鹼基、15 120個鹼基、15 110個 喊基、15 100個喊基、15 90個喊基、15 80個喊基、15 70個喊基、15 60個喊基、 15 50個鹼基、15 40個鹼基、15 30個鹼基或15 25個鹼基；25 序列的全部鹼基 數、25 1000個鹼基、25 900個鹼基、25 800個鹼基、25 700個鹼基、25 600個鹼 基、25 500個鹼基、25 400個鹼基、25 300個鹼基、25 250個鹼基、25 200個鹼 基、25 150個鹼基、25 140個鹼基、25 130個鹼基、25 120個鹼基、25 110個鹼 基、25 100個喊基、25 90個喊基、25 80個喊基、25 70個喊基、25 60個喊基、 25 50個鹼基或25 40個鹼基；50 序列的全部鹼基數、50 1000個鹼基、50 900 個鹼基、50 800個鹼基、50 700個鹼基、50 600個鹼基、50 500個鹼基、50 400 個鹼基、50 300個鹼基、50 250個鹼基、50 200個鹼基、50 150個鹼基、50 140 個喊基、50 130個喊基、50 120個喊基、50 110個喊基、50 100個喊基、50 90個 鹼基、50 80個鹼基、50 70個鹼基或50 60個鹼基；60 序列的全部鹼基數、60 1000個鹼基、60 900個鹼基、60 800個鹼基、60 700個鹼基、60 600個鹼基、60 500個鹼基、60 400個鹼基、60 300個鹼基、60 250個鹼基、60 200個鹼基、60 150個鹼基、60 140個鹼基、60 130個鹼基、60 120個鹼基、60 110個鹼基、60 100個鹼基、60 90個鹼基、60 80個鹼基或60 70個鹼基等。構成本發明的試劑盒的上述組合只是列舉，其他各種可能的組合都包括在本發明 中。本發明的試劑盒除了上述說明的本發明的多核苷酸、其變異體或其片段之外，還 可以含有已知能夠檢測食管癌的或將來發現的多核苷酸。本發明的試劑盒中含有的多核苷酸、其變異體或其片段可以被單獨或任意組合包 裝在不同容器中。5. DNA 晶片本發明還提供一種食管癌診斷用DNA晶片，所述食管癌診斷用DNA晶片含有與本 發明的組合物及/或試劑盒中含有的物質相同的多核苷酸(或上述3. 1節的組合物及/或 4節的試劑盒中記載的多核苷酸)、變異體、片段或它們的組合。作為DNA晶片的基板，只要是能夠將DNA固相化的基板即可，沒有特別限定，可以 舉出載玻片、矽制晶片、聚合物制晶片及尼龍膜等。另外，可以對上述基板進行聚L賴氨酸 塗布或導入氨基、羧基等官能團等的表面處理。另外，固相化法只要是通常使用的方法即可，沒有特別限定，可以舉出以下方法 使用被稱為點樣器(spotter)或陣列點樣儀(arrayer)的高密度分液器點樣DNA的方法、 或使用通過壓電元件等從噴嘴噴射微量的液滴的裝置(噴墨)將DNA噴射到基板上的方 法、或在基板上依次進行核苷酸合成的方法。使用高密度分液器時，例如如下進行固相化 在具有多個孔的平板的各孔中裝入不同的基因溶液，用針取出該溶液，然後依次點到基板 上。使用噴墨法時，如下進行固相化從噴嘴噴射基因，將基因高速地排列在基板上。在基 板上合成DNA時，如下進行固相化用能在光或熱的作用下離去的官能團保護與基板結合 的鹼基，通過使用掩模只將特定部位的鹼基接觸光或熱，使官能團離去。然後，反覆進行向反應液中加入鹼基、使其與基板上的鹼基偶聯的步驟。被固相化的多核苷酸是上述說明的本發明的全部多核苷酸。例如，上述多核苷酸可以含有以下1種或幾種(優選5個以上)多核苷酸或其片 段。(1)由序列號1 62表示的鹼基序列組成的多核苷酸組、其變異體、或其含有15 個以上連續鹼基的片段。(2)含有序列號1 62表示的鹼基序列的多核苷酸組。(3)由序列號1 38表示的鹼基序列組成的多核苷酸組、其變異體、或其含有15 個以上連續鹼基的片段。(4)含有序列號1 38表示的鹼基序列的多核苷酸組、其變異體、或其含有15個 以上連續鹼基的片段。(5)由與序列號1 38表示的鹼基序列互補的鹼基序列組成的多核苷酸組、其變 異體、或其含有15個以上連續鹼基的片段。(6)含有與序列號1 38表示的鹼基序列互補的鹼基序列的多核苷酸組。(7)在嚴格條件下與DNA雜交的多核苷酸組、或其含有15個以上連續鹼基的片段， 所述DNA由與序列號1 38表示的各鹼基序列互補的鹼基序列組成。(8)在嚴格條件下與由序列號1 38表示的各鹼基序列組成的DNA雜交的多核苷 酸組、或其含有15個以上連續鹼基的片段。(9)由序列號39 62表示的鹼基序列組成的多核苷酸組、其變異體、或其含有15 個以上連續鹼基的片段。(10)含有序列號39 62表示的鹼基序列的多核苷酸組、其變異體、或其含有15 以上連續鹼基的片段。(11)由與序列號39 62表示的鹼基序列互補的鹼基序列組成的多核苷酸組、其 變異體、或其含有15個以上連續鹼基的片段。(12)含有與序列號39 62表示的鹼基序列互補的鹼基序列的多核苷酸組。(13)在嚴格條件下與DNA雜交的多核苷酸組、或其含有15個以上連續鹼基的片 段，上述DNA由與序列號39 62表示的各鹼基序列互補的鹼基序列組成。(14)在嚴格條件下與由序列號39 62表示的各鹼基序列組成的DNA雜交的多核 苷酸組、或其含有15個以上連續鹼基的片段。(15)序列號1 38表示的鹼基序列或其互補序列的各序列中含有15個以上連續 鹼基的多核苷酸。(16)序列號1 38表示的鹼基序列或其互補序列的各序列中含有60個以上連續 鹼基的多核苷酸。(17)序列號39 62表示的各鹼基序列或其互補序列中，含有15個以上連續鹼基 的多核苷酸。(18)序列號39 62表示的各鹼基序列或其互補序列中，含有60個以上連續鹼基 的多核苷酸。(19)序列號1 38表示的鹼基序列中，分別含有序列號63 100表示的鹼基序 列、且含有60個以上連續鹼基的多核苷酸。
(20)與序列號1 38表示的鹼基序列互補的序列中，分別含有與序列號63 100 表示的鹼基序列互補的序列、且含有60個以上連續鹼基的多核苷酸。(21)序列號39 62表示的鹼基序列中，分別含有序列號39 62表示的鹼基序 列、且含有60個以上連續鹼基的多核苷酸。(22)與序列號39 62表示的鹼基序列互補的序列中，分別含有與序列號39 62表示的鹼基序列互補的序列、且含有60個以上連續鹼基的多核苷酸。根據優選的實施方案，本發明的DNA晶片可以含有5個以上 全部的含有序列號 63 IM表示的鹼基序列或其互補序列的多核苷酸。本發明中，被固相化的多核苷酸可以是基因組DNA、cDNA、RNA、合成DNA、合成RNA 中的任一個，可以為單鏈或雙鏈。作為能夠檢測、測定靶基因、RNA或cDNA的表達水平的DNA晶片的例子，可以舉出 Hfttilt土的 3D—Gene、Affymetrix &司的 the Gene Chip Human Genome U133 Plus 2. 0 Array、Agilent 公司的 Whole human genome oligo microarray、Takara Bio 公司的 htelIiGene (註冊商標)HS Human Expression CHIP 等。DNA晶片的製作例如可以使用在固相表面固定預先製備的探針的方法。在固相 表面固定預先製備的多核苷酸探針的方法如下合成導入了官能團的多核苷酸，在經過表 面處理的固相載體表面上點樣寡核苷酸或多核苷酸，使其共價鍵合(例如、J. B. Lamture 等、Nucleic. Acids. Research、1994 年，第 22 卷，p. 2121-2125、Ζ. Guo 等、Nucleic. Acids. Research、1994年，第22卷，p. 5456-5465) 多核苷酸通常通過間隔臂(spacer)或交聯 劑(crosslinker)與經過表面處理的固相載體共價鍵合。還已知使聚丙烯醯胺凝膠的微小 片排列在玻璃表面上，使合成多核苷酸與其共價鍵合的方法(G. Yershov等、Proceedings of the National Academic Sciences U. S. A.、1996 年，第 94 卷，p. 4913)。還已知下述方 法在二氧化矽微陣列上製作微小電極的陣列，在電極上設置含有鏈黴抗生物素蛋白的瓊 脂糖的滲透層，形成反應部位，通過使該部位帶正電，固定生物素化多核苷酸，通過控制部 位的電荷，能高速且嚴格地進行雜交(R.G. Sosnowski等、！Proceedings of the National Academic Sciences U. S. A.、1997 年，第 94 卷，p. 1119-1123)。6.食管癌的檢測法本發明提供下述方法，所述方法是使用本發明的組合物、試劑盒、DNA晶片、或它們 的組合，在體外確定樣品試樣中是否含有食管癌細胞的方法，所述方法包括手術時或內窺 鏡檢查時使用來自食管癌患者的食管癌細胞和非癌細胞，比較試樣中表達基因的量，該樣 品試樣中的細胞的靶核酸表達量增加/降低時，確定該樣品試樣中存在食管癌細胞，此處， 該靶核酸可以通過該組合物、試劑盒或DNA晶片所含的多核苷酸、其變異體或其片段來檢 測。另外，本發明提供本發明的組合物、試劑盒、DNA晶片在體內檢測來自受試者的樣 品試樣中的食管癌中的應用。本發明的上述方法中，組合物、試劑盒、DNA晶片以單獨的方式或以所有可能的組 合的方式含有如上所述的本發明的多核苷酸、其變異體或其片段進行使用。在本發明的食管癌的檢測、確定或(基因)診斷中，本發明的組合物、試劑盒或DNA 晶片中含有的多核苷酸、其變異體或其片段可以作為引物或探針使用。用作引物時，可以舉出鹼基長度通常為15 50個鹼基、優選為15 30個鹼基、較優選為18 25個鹼基的引 物。另外，用作檢測探針時，例如可以舉出鹼基長度為15個鹼基 全部序列的鹼基數、優選 為25 1000個鹼基、較優選為25 100個鹼基的探針，但並不限定於上述範圍。本發明的組合物或試劑盒中含有的多核苷酸、其變異體或其片段在RNA印跡法 (Northern Blot)、DNA印跡法(Southern blot)、RT_PCR法、原位雜交法、DNA雜交法等特異 性地檢測特定基因的公知方法中，可以根據標準方法用作引物或探針。作為測定對象試樣， 根據所用的檢測方法的種類，可以通過活組織檢測等採集受試者的食管組織或被懷疑存在 食管癌細胞的生物組織的一部分或全部，或者從手術取出的生物組織中回收。還可以使用 按照常規方法由其製備的總RNA，還可以使用基於該RNA製備的含有cDNA、聚A(+)RNA的各 種多核苷酸。或者，可以使用DNA晶片(包括DNA宏陣列(macroarray))檢測或定量生物組織 中的本發明的基因、RNA、cDNA等核酸的表達量。此種情況下，本發明的組合物或試劑盒可 以用作DNA陣列的探針(例如，在Affymetrix公司的Human Genome U133 Plus 2.0 Array 中，使用長度為25個鹼基的多核苷酸探針)。使上述DNA晶片與以從生物組織採集的RNA 為基礎製備的標記DNA或RNA雜交，以該標記DNA或RNA的標記為指標，檢測通過該雜交形 成的上述探針和標記DNA或RNA的複合體，由此能評價生物組織中的食管癌相關基因或食 管癌是否表達或表達水平(表達量)。本發明方法中優選使用DNA晶片，該DNA晶片能對一 個生物試樣同時評價多個基因是否表達或表達水平。本發明的組合物、試劑盒或DNA晶片對於食管癌的診斷、確定或檢測(是否患病或 患病程度的診斷)是有用的。使用該組合物、試劑盒或DNA晶片診斷食管癌具體可以如下 進行使用手術時或內窺鏡檢查時來自食管癌患者的食管癌細胞和非癌細胞，比較試樣中 的基因表達量，或者將手術時或內窺鏡檢查時來自食管癌患者的食管癌細胞和非癌細胞與 等同的生物組織進行比較，判斷用該診斷用組合物檢測的基因的表達水平的不同。此時，基 因表達水平的不同不僅僅表示有無表達，還包括以下情形來自食管癌患者的食管癌細胞 和非癌細胞兩者都表達時，比較兩者間的表達量時的差值。例如，由於EYA2基因在食管癌 中表達誘導/減少，所以，在受試者的食管癌組織中表達/減少，如果將該表達量與正常組 織的表達量相比較存在差異，則確定試樣中不含食管癌細胞/或含有食管癌細胞。利用本發明的組合物、試劑盒或DNA晶片檢測樣品試樣中不含食管癌細胞/或含 有食管癌細胞的方法如下通過活組織檢測等採集或從手術取出的生物組織中回收受試者 的生物組織的一部分或全部，使用選自本發明的多核苷酸組中的1種或幾種多核苷酸、其 變異體或其片段檢測上述生物組織中含有的基因，測定該基因的表達量，由此診斷是否患 有食管癌或患病程度。另外，本發明的食管癌的檢測方法還可以在例如對食管癌患者給與 用於改善該疾病的治療藥時，檢測、確定或診斷該疾病是否改善或改善程度。本發明的方法例如可以包括以下(a)、(b)及(C)步驟(a)使來自受試者的生物試樣與本發明的組合物、試劑盒或DNA晶片的多核苷酸 接觸的步驟，(b)使用上述多核苷酸作為探針測定生物試樣中的靶核酸的表達水平的步驟、(c)基於(b)的結果，判斷該生物試樣中是否存在食管癌(細胞)的步驟。作為本發明方法中使用的生物試樣，可以舉出由受試者的生物組織例如食管組織及其周圍組織、懷疑發生食管癌的組織等製備的試樣。具體而言，含有由該組織製備的RNA 的試樣、或含有由該組織製備的多核苷酸的試樣可以如下製備，即，通過活組織檢測等採集 或從通過手術取出的生物組織中回收受試者的生物組織的一部分或全部，然後按照常規方 法進行製備。此處的受試者是指哺乳動物，例如人、猴子、小鼠、大鼠等，並無限定，優選為人。本發明的方法，可以根據用作測定對象的生物試樣的種類變更步驟。例如，使用RNA作為測定對象物時，食管癌(細胞)的檢測可以包括例如下述步驟 (a)、(b)及(c)(a)使由受試者的生物試樣製備的RNA或由該RNA轉錄的互補多核苷酸(cDNA)與 本發明的組合物、試劑盒或DNA晶片的多核苷酸結合的步驟，(b)使用上述多核苷酸作為探針，測定與該多核苷酸結合的來自生物試樣的RNA 或由該RNA轉錄的互補多核苷酸的步驟，(c)基於上述(b)的測定結果，判斷是否存在食管癌(細胞)的步驟。為了利用本發明檢測、確定或診斷食管癌(細胞)，例如可以使用各種雜交法。所 述雜交法，例如可以使用RNA印跡法、DNA印跡法、RT-PCR法、DNA晶片解析法、原位雜交法、 DNA雜交法等。使用RNA印跡法時，通過使用本發明的診斷用組合物作為探針，可以檢測、測定 RNA中的各基因是否表達或其表達水平。具體可以舉出以下方法用放射性同位素(32P、 呷、％等)或螢光物質等標記本發明的診斷用組合物(互補鏈)，使其與利用常規方法 轉移到尼龍膜等上的來自受試者的生物組織的RNA雜交，然後用放射線檢測器(可以舉 出BAS-1800II Fuji Photo Film株式會社等)或螢光檢測器(例如ST0RM860，Amersham Bioscience公司等)檢測、測定形成的診斷用組合物(DNA)和RNA的雙鏈中的來自診斷用 組合物的標記物(放射性同位素或螢光物質)的信號。使用定量RT-PCR法時，通過使用本發明的上述診斷用組合物作為引物，可以檢 測、測定RNA中的基因是否表達或其表達水平。具體可以舉出以下方法按照常規方法由來 自受試者的生物組織的RNA製備cDNA，為了能以該cDNA為模板擴增各靶基因區域，使由本 發明的組合物製備的1對引物(由與上述cDNA結合的正鏈和反鏈組成)與cDNA雜交，按 照常規方法進行PCR法，檢測得到的雙鏈DNA。需要說明的是，作為雙鏈DNA的檢測方法，可 以採用以下方法使用預先用放射性同位素或螢光物質標記的引物進行上述PCR的方法； 用瓊脂糖凝膠電泳PCR產物，用溴乙錠等染色雙鏈DNA進行檢測的方法；將產生的雙鏈DNA 按照常規方法轉移到尼龍膜等上，作為探針與標記的診斷用組合物雜交，進行檢測的方法。使用DNA晶片解析時，使用將本發明的上述診斷用組合物作為DNA探針(單鏈或 雙鏈)貼合到基板上製成的DNA晶片。將基因組在基板上固相化得到的物質通常稱為DNA 晶片及DNA陣列，DNA陣列包括DNA宏陣列和DNA微陣列，本說明書中稱為DNA晶片時，即 為含有該DNA陣列的物質。雜交條件沒有限定，例如，包括在30°C 50°C下，在3 4XSSC、0. 1 0. 5% SDS 中雜交1 M小時，較優選在40°C 45°C下，在3XSSC、0. 3% SDS中雜交1 M小時，然 後進行清洗。作為清洗條件，例如可以舉出利用含有30°C的3XSSC和0. SDS的溶液、及 42°C&0.3XSS(^n0. 1% SDS溶液、及30°C的0. 1 X SSC溶液在室溫下連續清洗等的條件。此處，IX SSC是含有150mM氯化鈉及15mM檸檬酸鈉的水溶液(pH7. 2)。互補鏈優選為即使 在上述條件下進行清洗仍能保持與作為對象的正鏈雜交的狀態的鏈。作為上述互補鏈，具 體可以舉出由與作為對象的正鏈的鹼基序列具有完全互補關係的鹼基序列組成的鏈、以及 由與該鏈具有至少80%同源性的鹼基序列組成的鏈。作為以來自本發明的組合物或試劑盒的多核苷酸片段為引物進行PCR時的嚴格 的雜交條件的例子，例如可以舉出使用組成為IOmM Tris-HCL(pH8. 3)、50mM KCLU 2mM MgCl2等的PCR緩衝液，在由該引物序列計算的Tm+5 10°C下處理15秒 1分鐘左右等。 作為上述Tm的計算方法，可以舉出Tm = 2X (腺嘌呤殘基數+胸腺嘧啶殘基數)+4X (鳥 嘌呤殘基數+胞嘧啶殘基數)等。上述雜交的「嚴格條件」的其它例子，記載於例如Sambrook，J. & Russel，D.著， Molecular Cloning,A LABORATORY MANUALXold Spring Harbor Laboratory Press、2001 年1月15日出版，第1卷7. 42 7. 45，第2卷8. 9 8. 17等中，可以在本發明中使用。本發明還提供判斷生物試樣不含及/或含有食管癌細胞的方法，該方法使用本發 明的組合物、試劑盒、DNA晶片或它們的組合，測定來自受試者的生物試樣中的靶核酸或基 因的表達量，以支持向量機(SVM，support vector machine)作為辨別式進行判斷，所述支 持向量機(SVM)以食管癌組織和正常組織的基因表達量作為訓練樣本。S卩，本發明還提供上述方法，該方法包括以下步驟第1步驟，使用本發明的組合 物、試劑盒、DNA晶片或它們的組合，體外測定多個生物試樣中的靶核酸的表達量，所述生物 試樣是已知確定樣品試樣中不含食管癌細胞/或含有食管癌細胞的生物試樣；第2步驟，以 該第1步驟得到的該靶核酸的表達量的測定值作為訓練樣本，製作辨別式(支持向量機)； 第3步驟，與第1步驟相同地體外測定來自受試者的食管的生物試樣中的該靶核酸的表達 量；第4步驟，將第3步驟中得到的該靶乙酸的表達量的測定值代入該第2步驟中得到的辨 別式，基於由該辨別式得到的結果，判斷生物試樣中不含食管癌細胞/或含有食管癌細胞， 此處，該靶核酸可以通過該組合物、試劑盒或DNA晶片中含有的多核苷酸、其變異體或其片 段檢測到。或者，本發明的方法可以包含例如下述步驟(a)、(b)及(C)(a)步驟使用本發明的診斷(檢測)用組合物、試劑盒或DNA晶片測定生物試樣 中的靶基因的表達量，所述生物試樣是已知含有來自食管癌患者的食管癌細胞的組織及/ 或不含來自食管癌患者的食管癌細胞的組織；(b)步驟將(a)中測定的表達量的測定值代入下述數1 數5的式中，製作稱為 SVM的辨別式；(c)步驟使用本發明的診斷(檢測)用組合物、試劑盒或DNA晶片測定來自受試 者的生物試樣中的該靶基因的表達量，並將其代入(b)中製作的辨別式，基於得到的結果， 判斷該生物試樣中是否含有食管癌細胞。SVM是為了解決二級分類問題而製作的，是1995年由AT&T的V. Vapnik (The Nature of Statistical Leaning Theory、Springer、1995 年出版)基於統計學習理論的 框架提出的學習機。SVM是一種線性辨識器，但通過組合後述的核函數(Kernel)，能夠解決 非線性問題。針對不同級別的訓練樣本，在辨識上述訓練樣本的多個超平面中，將該超平面 與訓練樣本的最小距離變得最大的超平面作為辨識面，由此能最準確地辨識新給與的試樣屬於哪一個級別。SVM只能解決線性問題，但作為用於解決本質上為非線性問題的方法，已知將特徵 向量非線性地轉換成高維，在該高維空間內進行線性辨識的方法。使用該方法，與在原空間 使用非線性模型等效。但進行向高維轉換的繪圖需要龐大的計算量，歸納能力也降低。SVM 中，辨識函數僅依賴輸入圖案的內積，如果能計算內積，則能構建最優辨識函數。非線性地 繪製的空間中的二個要素的內積僅由各自原來的空間的輸入表示的式子稱為核函數，一邊 在高維空間中繪製，一邊避免在實際繪製的空間中的特徵的計算，僅由核函數的計算構建 最優辨識函數，即辨別式(例如，麻生英樹等著、統計科學的前沿6「圖案識別與學習的統計 學新概念和方法」、巖波書店、東京、日本(2004年))。本發明的方法中可以使用的辨別式的計算例如下所示。為了確定SVM，可以準備生物試樣中的靶基因的表達量作為訓練樣本，按照以下步 驟確定辨識函數的常數，所述生物試樣是已知含有食管癌細胞的組織或正常組織。訓練樣本Xi屬於被分類為(+1、-1)的含有食管癌細胞的組織組或正常組織組中 的任一組。可以用超平面線性分離上述訓練樣本時，辨識函數例如為下式。[等式1]
權利要求
1.一種食管癌診斷用組合物，其中，含有選自下述(a) (e)所示的多核苷酸、其變異 體或其片段中的3個以上多核苷酸(a)由序列號1 38表示的鹼基序列組成的多核苷酸、其變異體、或其含有15個以上 連續鹼基的片段，(b)含有序列號1 38表示的鹼基序列的多核苷酸，(c)由與序列號1 38表示的鹼基序列互補的鹼基序列組成的多核苷酸、其變異體、或 其含有15個以上連續鹼基的片段，(d)含有與序列號1 38表示的鹼基序列互補的鹼基序列的多核苷酸，(e)在嚴格條件下與所述(a) (d)中的任一多核苷酸雜交的多核苷酸、或其含有15 個以上連續鹼基的片段。
2.如權利要求1所述的組合物，其中，所述片段為含有60個以上連續鹼基的多核苷酸。
3.如權利要求2所述的組合物，其中，所述片段是序列號1 38中的任一個表示的鹼 基序列中分別含有序列號63 100中的任一個表示的鹼基序列的多核苷酸，或含有與該多 核苷酸的序列互補的鹼基序列的多核苷酸。
4.如權利要求2所述的組合物，其中，所述片段是含有序列號63 100中的任一個表 示的鹼基序列、或含有與該鹼基序列互補的鹼基序列的多核苷酸。
5.如權利要求1 4中任一項所述的組合物，其中，還含有選自下述(f) (j)所示的 多核苷酸、其變異體、或其片段中的2個以上多核苷酸(f)由序列號39 62表示的鹼基序列組成的多核苷酸、其變異體、或其含有15個以上 連續鹼基的片段，(g)含有序列號39 62表示的鹼基序列的多核苷酸，(h)由與序列號39 62表示的鹼基序列互補的鹼基序列組成的多核苷酸、其變異體、 或其含有15個以上連續鹼基的片段，(i)含有與序列號39 62表示的鹼基序列互補的鹼基序列的多核苷酸，(j)在嚴格條件下與所述(f) (i)中任一多核苷酸雜交的多核苷酸、或其含有15個 以上連續鹼基的片段。
6.如權利要求5所述的組合物，其中，所述片段為含有60個以上連續鹼基的多核苷酸。
7.如權利要求6所述的組合物，其中，所述片段是序列號39 62表示的鹼基序列中含 有序列號101 IM表示的鹼基序列的多核苷酸、或含有與該多核苷酸的序列互補的鹼基 序列的多核苷酸。
8.如權利要求6所述的組合物，其中，所述片段是含有序列號101 IM表示的鹼基序 列、或含有與該鹼基序列互補的鹼基序列的多核苷酸。
9.一種食管癌診斷用試劑盒，含有權利要求1 4中任一項所述的(a) (e)所示的 多核苷酸、其變異體及/或其片段中的3個以上。
10.如權利要求9所述的試劑盒，其中，還含有權利要求5 8中任一項所述的(f) (j)所示的多核苷酸、其變異體、或其片段中的2個以上。
11.如權利要求9或10所述的試劑盒，其中，所述多核苷酸是由序列號1 62中任一 個表示的鹼基序列組成的多核苷酸、由其互補序列組成的多核苷酸、在嚴格條件下與所述 多核苷酸雜交的多核苷酸、或其含有15個以上連續鹼基的片段。
12.如權利要求11所述的試劑盒，其中，所述片段為含有60個以上連續鹼基的多核苷酸。
13.如權利要求12所述的試劑盒，其中，所述片段是序列號1 62中的任一個表示的 鹼基序列中分別含有序列號63 IM中的任一個表示的鹼基序列的多核苷酸，或含有與所 述多核苷酸的序列互補的鹼基序列的多核苷酸。
14.如權利要求12所述的試劑盒，其中，所述片段是含有序列號63 124中任一個表 示的鹼基序列、或含有與該鹼基序列互補的鹼基序列的多核苷酸。
15.如權利要求14所述的試劑盒，其中，所述片段是由序列號63 124中任一個表示 的鹼基序列組成的多核苷酸。
16.如權利要求9所述的試劑盒，其中，含有5種以上至全部的含有序列號63 124表 示的鹼基序列或其互補序列的多核苷酸。
17.如權利要求9 16中任一項所述的試劑盒，其中，所述多核苷酸分別或任意組合包 裝在不同的容器中。
18.一種食管癌診斷用DNA晶片，其中，含有權利要求1 4中任一項所述的(a) (e) 所示的多核苷酸、其變異體、或其片段中的3個以上。
19.如權利要求18所述的DNA晶片，其中，還含有權利要求5 8中任一項所述的 (f) (j)所示的多核苷酸、其變異體、或其片段中的2個以上。
20.如權利要求18或19所述的DNA晶片，其中，含有5個以上 全部的含有序列號 63 IM表示的鹼基序列或其互補序列的多核苷酸。
21.一種在體外確定來自受試者的受試樣品中不含食管癌細胞、或含有食管癌細胞的 方法，所述方法使用權利要求1 8中任一項所述的組合物、權利要求9 17中任一項所 述的試劑盒、權利要求18 20中任一項所述的DNA晶片或它們的組合，測定來自受試者的 生物試樣中的靶核酸的表達水平，由此在體外確定來自受試者的受試樣品中不含食管癌細 胞、或含有食管癌細胞。
22.如權利要求21所述的方法，其中，使用DNA晶片。
23.一種確定食管癌的方法，所述方法包括以下步驟第1步驟，使用權利要求1 8中任一項所述的組合物、權利要求9 17中任一項所 述的試劑盒、權利要求18 20中任一項所述的DNA晶片或它們的組合，體外測定多個生物 試樣中的靶核酸的表達量，所述生物試樣是已知含有食管癌細胞的組織或正常組織；第2步驟，以所述第1步驟中得到的所述靶核酸的表達量的測定值作為訓練樣本製作 辨別式(支持向量機)；第3步驟，與第1步驟相同地體外測定來自受試者食管的生物試樣中的所述靶核酸的 表達量；第4步驟，將第3步驟中得到的所述靶核酸的表達量的測定值代入所述第2步驟中得 到的辨別式，基於由所述辨別式得到的結果，判斷來自受試者的生物試樣中不含食管癌細 胞、或含有食管癌細胞。
24.權利要求1 8中任一項所述的組合物、權利要求9 17中任一項所述的試劑盒、 或權利要求18 20中任一項所述的DNA晶片在體外確定來自受試者的生物試樣中不含食 管癌細胞、或含有食管癌細胞中的應用。
25.—種體外確定來自受試者的生物試樣中不含食管癌、或含有食管癌細胞的方法，所 述方法包括使用針對由序列號1 38表示的鹼基序列編碼的多肽的、3個以上的抗體或 其片段，體外測定來自受試者的食管癌細胞或血液中的所述多肽的水平。
26.如權利要求25所述的方法，其中，還使用針對由序列號39 62表示的鹼基序列編 碼的多肽的、2個以上的抗體或其片段，測定所述多肽的水平。
27.如權利要求25或沈所述的方法，其中，所述多肽具有序列號125 186表示的氨 基酸序列。
28.如權利要求25 27中任一項所述的方法，其中，與健康受試者相比，所述多肽的表 達水平在患有食管癌的受試者中發生變化時，確定為食管癌。
全文摘要
本發明提供食管癌診斷用組合物、試劑盒或DNA晶片或者使用該組合物、試劑盒或DNA晶片檢測食管癌的方法。所述食管癌診斷用組合物、試劑盒或DNA晶片含有多種多核苷酸，所述多種多核苷酸選自與來自食管癌患者的不含食管癌的組織相比在來自食管癌患者的食管癌組織中表達水平發生變化的多核苷酸、其變異體或其片段。
文檔編號G01N33/53GK102089428SQ20098012693
公開日2011年6月8日 申請日期2009年5月21日 優先權日2008年5月21日
發明者信正均, 妙本陽, 小園聰子, 島田裕, 秋山英雄, 辻本豪三 申請人:東麗株式會社, 國立大學法人京都大學