在肺動脈高血壓的治療中調控microrna的方法
2023-04-24 16:46:36
在肺動脈高血壓的治療中調控microrna的方法
【專利摘要】本發明提供一種在有此需要的受試者中治療或預防肺動脈高血壓的方法，即對該受試者施用miR-145表達或活性的抑制劑。還公開了用於治療肺動脈高血壓的包含miR-145抑制劑的藥物組合物和試劑盒。
【專利說明】在肺動脈高血壓的治療中調控MICRORNA的方法
發明領域
[0001]本發明涉及肺動脈高血壓的治療和預防，即施用調控一種microRNA(miRNA)的活性或表達的藥劑。具體地，本發明提供用於治療或預防肺動脈高血壓的方法，即抑制有此需要的受試者的細胞中miR-145的表達或活性。[0002]發明背景
[0003]肺動脈高血壓(PAH)是肺小動脈(PA)的一種疾病，其特徵在於PA壓和血管重塑的增加，從而導致肺血管阻力的進行性增加(Rich等，1987)。血管閉合(obliteration)的後果是右心衰竭和高死亡率(Jeffery等，2002; Voelkel等，1997)。在約70%的患有可遺傳形式的PAH(hPAH)的患者中已鑑定出編碼骨形態發生蛋白(BMP) 2型受體(BMPR2)(—種針對轉化生長因子(TGF)-13超家族的受體)的基因中的種系突變(Morrell等，2001)。而且，在缺乏此基因中突變的情況下，PAH病例中BMPR2表達也顯著降低(先天性ΡΑΗ，?ΡΑΗ)，表明此受體途徑在PAH形成中的更廣泛的作用。在肺動脈平滑肌細胞(PASMC)中，BMPR2中的突變與對BMP和TGF-β的異常生長應答有關。在內皮細胞中，這些突變增加了細胞對凋亡的易感性(PAEC) (Morrell等，2001)。在一些家族中和大多數iPAH病例中不存在BMPR2突變表明，仍然需要鑑定出另外的、可能與TGF-β超家族有關的病理學機制。
[0004]對於所有PAH形式來說共同的一個主要的組織病理學特徵是表達平滑肌特異性α-肌動蛋白(SMA)的細胞在周圍肺動脈中的積累。這包括SMA陽性細胞在新內膜(neointima)中的出現和SMA陽性細胞到正常沒有平滑肌的前毛細管肺微動脈中的擴張(Mandegar等，2004)。負責PA的該遠端部分的肌肉化(muscularization)的細胞過程尚不清楚，但這些觀察表明PASMC在PAH形成中的重要作用。
[0005]MicroRNA (miRNA)是一類小的內源性非編碼RNA，其能夠通過靶向特定的信使RNA(mRNA)並誘導它們的降解或翻譯抑制來負性調苄基因表達(Ambros, 2004;Bartel, 2009)。最近的研究已將mRNA降解定義為miRNA:mRNA靶物的主要機制性作用(Guo等，2010)。數項最近的研究評估了 miRNA在血管炎症中以及血管病理形成中的直接作用(Kartha和Subramanian, 2010;Urbich等，2008)。在一項最近的研究中，顯示miR-145在血管壁中豐富表達(Cheng等，2009)。MiR-145被轉錄為編碼人5號染色體上(Lio等，2010)和小鼠18號染色體上的miR-143和miR-145兩者的長初始!1^1?應(?1^-1^1?應)，其受到保守SRF結合位點的調節(Xin等，2009)。miR-145到血管壁的定位顯示在平滑肌層中相比於外膜(adventitial)成纖維細胞和內皮細胞的高表達(Cheng等，2009)。因此，miR-145被視為一種平滑肌細胞表型標誌物和調控物，它能夠經由它的靶基因KLF-5及其下遊信號分子心肌蛋白(myocardin)調節平滑肌細胞(SMC)成熟和增殖，以及血管新內膜損傷形成(Cheng等，2009;Elia等，2009)。已顯示TGF-β超家族中的激動劑經由Smad依賴性途徑激活miR-143/145簇(Davis-Dusenbery等，2011; Long等，2011)。而且，對miR-145、miR-143和miR-143/145敲除(ko，-/-)小鼠的分析顯示主動脈和其它周圍動脈的明顯更薄的平滑肌層，這是由於肌動蛋白絲的破壞誘導降低的SMC大小(Elia等，2009)。這導致miR-145-/-小鼠中應答損傷產生中度系統性低血壓和缺乏新內膜形成(Xin等，2009)。而且，從單ko和雙ko動物分離的血管平滑肌細胞(VSMC)顯示高增殖活性和更高的向源自血小板的生長因子(TOGF，VSMC的一種已知的化學引誘劑)遷移的能力(Elia等，2009; Xin等，2009)。此外，對miR-143 (145) ko小鼠血管系統的藥理學分析揭示了對血管加壓(vasopressive)刺激的減弱應答(Elia等，2009;Xin等，2009)。總之，這些發現顯示VSMC在miR-145ko和miR-143/145雙ko小鼠中的去分化表型。
[0006]儘管對基礎遺傳學的理解有所改善，但PAH仍然是一種嚴重且經常致命的疾病。小肺動脈的廣泛重塑，包括肺動脈平滑肌細胞(PASMC)的增殖，表徵其病理學。目前對PAH的治療無法適當處理PAH病理學根本性的平滑肌增殖。如此，本領域中需要開發出對PAH的新療法。據報告在血管重塑中起作用的miCToRNA代表了一種在開發針對PAH的有效治療中的潛在的新治療靶物。
[0007]發明概述
[0008]本發明部分基於以下發現，即miR-145在PAH的小鼠模型中調節異常而在患有PAH的特發性和可遺傳形式的人的肺組織中上調。在發育中敲除動物中消除miR-145表達賦予免於PAH形成的保護。因此，本發明提供一種在有此需要的受試者中治療或預防PAH的方法，即對該受試者施用miR-145表達或功能的抑制劑。
[0009]在一個實施方案中，所述方法包括對受試者施用包含與miR-145序列(例如初始miR-145、前體miR-145或成熟miR-145)至少部分互補的序列的反義寡核苷酸。在某些實施方案中，所述反義寡核苷酸包含與人成熟miR-145序列至少部分互補的序列。反義寡核苷酸可含有一個或多個主鏈或糖修飾，如硫代磷酸酯連接、2』-O-烴基修飾和雙環糖核苷修飾(例如，鎖定核酸(LNA))。在一些實施方案中，靶向miR-145的反義寡核苷酸抑制劑的長度為約8至約18個核苷酸。在具體的實施方案中，靶向miR-145的反義寡核苷酸抑制劑的長度範圍為約12至約16個核苷酸或長度為約10至約14個核苷酸。
[0010]在一個實施方案中，所述反義寡核苷酸是antimiR。AntimiR是祀向並抑制miR-145的反義寡核苷酸。AntimiR可以是LNA antimiR。在一個實施方案中，antimiR革巴向成熟miR-145的鹼基2-17。在另一個實施方案中，antimiR長度為16個核苷酸。在又一個實施方案中，antimiR是全部硫代磷酸化的(thiophosphate)。AntimiR可以是全部硫代磷酸化的並與miR-145的5』區完全互補。AntimiR還可以合成為LNA和DNA的混合物。
[0011]在本發明的另一個實施方案中，將miR-145抑制劑施用給診斷為或有風險形成肺高血壓或肺動脈高血壓(PAH)的受試者。受試者可能診斷為或有風險形成的肺高血壓的形式包括但不限於，特發性PAH、遺傳性或家族性PAH、和繼發性肺高血壓(例如起因於肺栓塞、肺氣腫、肺纖維化和先天心臟病的高血壓)。在一個實施方案中，受試者被診斷為患有特發性PAH或遺傳性PAH。在一些實施方案中，有形成PAH風險的受試者在編碼骨形態發生蛋白2型受體的基因中具有突變。在一個具體的實施方案中，受試者是人。
[0012]可以經由各種路徑將miR-145抑制劑施用給受試者，包括靜脈內、動脈內、鼻、口腔，或經由肺部路徑(例如通過經由鼻或口吸入)。在某些實施方案中，通過吸入路徑經由肺部投遞裝置施用miR-145抑制劑。在這類實施方案中，miR-145抑制劑可配製為乾粉末或液體氣霧劑。
[0013]本發明還包括用於治療或預防肺動脈高血壓的試劑盒。在一個實施方案中，所述試劑盒包含如本文中描述的miR-145的抑制劑和施用裝置。施用裝置可設計為用於肺部投遞，如吸入器、噴霧器(nebulizer)、吹入器(insufflator)、點滴器(dropper)和氣霧器(aerosolizer)。在其它實施方案中，施用裝置可設計為用於靜脈內或動脈內投遞，如導管。任選地，miR-145抑制劑可配製為存放在施用裝置中。試劑盒還可包含用於對受試者(例如人)施用miR-145抑制劑以治療或預防PAH的用法說明書。
[0014]附圖簡述
[0015]圖1.MiR145探針對SMC的共定位。處理正常人肺切片用於miR145和SMA染色，如實施例中詳述的。(A)miR145探針和SM肌動蛋白，(B)對照探針和SM肌動蛋白。10倍放大。(C)在正常人的肺和來自患有iPAH和fPAH的患者的肺中的分析。
[0016]圖2.MiR-145在小鼠肺切片中的定位和在含氧量正常對缺氧小鼠中的表達。(A)顯示miR-145在小鼠肺中定位的原位雜交。將石蠟切片再水合併與抗miR-145或作為陰性對照的混雜探針溫育。對於共定位，在相同樣品中使用免疫組化測定法檢測α肌動蛋白，其中以非免疫同種型IgG抗體作為陰性對照。圖像放大100或400倍=50 μ m。對含氧量正常和14天缺氧的野生型小鼠的q-PCR分析。從含氧量正常(白色條)或缺氧(黑色條)10周齡小鼠的(B)整個肺或(C)右心室提取總RNA。分析6隻小鼠/組。一式三份地測試每份樣品。將結果標準化至U6值並表達為相對倍數變化，其中將任意值I分配給對照組。使用不配對t檢驗分析數據(***p〈0.001相對對照樣品)。
[0017]圖3.含氧量正常相對於缺氧小鼠中的MiR-143。對含氧量正常和14天缺氧的wt小鼠的q-PCR分析。從含氧量正常(白色條)或缺氧(黑色條)10周齡小鼠的(A)整個肺或(B)右心室提取總RNA。分析6隻小鼠/組。一式三份地測試每份樣品。將結果標準化至U6值並表達為相對倍數變化，其中將任意值I分配給對照組。使用不配對t檢驗分析數據(*ρ〈0.05, ***ρ 〈0.001相對含氧量正常樣品)ο
[0018]圖4.在缺氧wt小鼠的腦、腎和脾中的MiR-145表達。(A、B、C分別)為來自含氧量正常(白色條)或缺氧(黑色條)小鼠。從每種器官中一式四份地提取總RNA並通過q-PCR分析。使用t檢驗分析數據但未鑑定出顯著性。
[0019]圖5.體外暴露於5%缺氧的SMC中的MiR-145表達。將原代遠端肺動脈平滑肌細胞暴露於(A) 24h或(B) 72h，體外5%缺氧，並評估在有和無抑制劑SB203580 (p38抑制劑-5μΜ) ；SB431542(TGF-^ 抑制劑 _1 μ M) ；U0126(ERK 抑制劑 _1 μ Μ)存在下 miR145 在24的水平。
[0020]圖6.對在miR-145-/-小鼠相比於wt小鼠中的miR-145表達的分析。ko小鼠中的miR-145消除由(A) q-PCR和⑶原位分析確認。圖像均100倍放大，比例尺=100 μ m。
[0021]圖7.野生型和miR-145-/-小鼠中應答缺氧的MiR-143表達。對含氧量正常和14天缺氧野生型(WT)和敲除(KO)小鼠的q-PCR分析。從含氧量正常(黑色條)或缺氧(條紋條)10周齡小鼠提取總RNA。分析6隻小鼠/組。將結果標準化至U6值並表達為相對倍數變化，其中將任意值I分配給對照組。使用雙因素ANOVA繼之以Bonerroni事後檢驗來分析數據(***ρ〈0.001相對對照樣品)。
[0022]圖8.miR-145消除對小鼠中PAH形成和血管重塑的影響。評估(A)右心室收縮壓(sRVP, n=9-10)和(B)右心室肥大(RVH, n=9_10)。(C)用 Elastic-Van Gieson 染色的代表性肺動脈。圖像均400倍放大，比例尺=50 μ m。(D)來自含氧量正常和缺氧野生型(WT)和miR-145-/-小鼠(n=5)的肺動脈重塑。使小鼠經受缺氧達14天。N,小鼠數。使用雙因素ANOVA繼之以Bonerroni事後檢驗來分析數據(*p〈0.05相對WT含氧量正常小鼠)。
[0023]圖9.在含氧量正常或缺氧條件下的野生型和miR-145-/-小鼠中對(A)全身動脈壓(systemic arterial pressure, SAP, n=6_9)和(B)心率(HR, n=6_10)的評估。使小鼠經受缺氧達14天。N,小鼠數。使用雙因素ANOVA繼之以Bonerroni事後檢驗來分析數據(*ρ〈0.05, #ρ〈0.005, *#ρ〈0.001相對野生型含氧量正常小鼠)。
[0024]圖10.對miR-145選定靶物的分析。通過q_PCR在wt和miR-145-/-小鼠(含氧量正常和缺氧)的整個肺中評估(A)SMAD5，(B) SMAD4, (C)KLF4和(D)KLF5的表達水平。使用單因素ANOVA繼之以Bonerroni事後檢驗來分析數據Ορ〈0.05, ***ρ〈0.001)。
[0025]圖11.對WT和miR-145-/-缺氧雌性小鼠中KLF4和KLF5蛋白表達水平的分析。(A、D)通過western印跡在暴露於長期缺氧達14天的WT和miR-145-/-小鼠的整個肺中評估KLF4和KLF5的表達水平。分析4隻小鼠/組,並使用特定軟體(Scion Image software)測量western印跡條帶的強度。所得定量條示意在(B)、(C)、(E)和(F)的圖中。將結果標準化至GAPDH值並表達為倍數增加，其中將任意值I分配給WT組。使用不配對t檢驗來分析數據(**ρ〈0.005相比於wt小鼠)。
[0026]圖12.微陣列數據的驗證。通過q-PCR在wt和miR-145-/-小鼠(含氧量正常和缺氧)的肺動脈中評估(A)WIFl, (B)TGFB2, (C)FRZB, (D)DAB2, (E)ACE, (F)FSCNl, (G)CTGF, (H)Angptl4, (I)AP2B1和(J) ITGBLlI的表達水平。使用單因素ANOVA繼之以Bonerroni 事後檢驗來分析數據(*ρ〈0.05, ***ρ〈0.001)。
[0027]圖13.在注射miRNA特異性的antimiR之後獲得的對miR-145或miR-143的選擇性敲低。將8周齡雌性小鼠用與成熟miR-143或miR-145序列之一的5』區完全互補的antimiR皮下注射，並接受長 期缺氧達14天。它們在缺氧8天後接受第二次注射。14天後，將小鼠殺死並從肺提取總RNA。含氧量正常的用媒介處理的動物，缺氧的用媒介處理的動物，和用混雜、miR-145或miR_143antimiR注射的缺氧動物中的(A)miR-145和(B)miR-143表達。(C)-(F)通過q-PCR對相同RNA的Northern印跡分析，其顯示(C)-(D)miR-145或(E)-(F)miR-143表達水平。使用單因素ANOVA繼之以Bonerroni事後檢驗來分析數據(*p<0.05, ***ρ〈(λ 001.miR-145和miR-143下調對所有其他組均是統計學顯著的)。
[0028]圖14.MiR-145或miR-143敲低對小鼠中PAH形成和血管重塑的影響。在用特異於miR-145或miR-143的antimiR、混雜的antimiR或媒介處理並暴露於長期缺氧達14天的C57B16小鼠中評估(A)右心室收縮壓(sRVP，n=6 - 10)、(B)右心室肥大(RVH n=7_13)。(C)在相同組(n=4)中測量的肺動脈重塑。η=小鼠數。使用單因素ANOVA繼之以Bonerroni事後檢驗來分析數據(*ρ〈0.05, **ρ〈0.005, ***ρ〈0.001)。(D)用 Elastic-Van Gieson 染色的代表性肺動脈。圖像均40倍放大，比例尺=20 μ m。
[0029]圖15.在用媒介處理的含氧量正常小鼠和用媒介、混雜的、miR-145或miR-143antiMir注射的缺氧小鼠中評估(A)全身動脈壓(SAP, n=6 - 8)和⑶心率(HR, n=7-13)。使用單因素ANOVA繼之以Bonerroni事後檢驗來分析數據。
[0030]圖16.對iPAH和hPAH人肺中miR-145表達水平的評估。(A)對從iPAH(n=6)、hPAH (n=5)和對照患者(n=6)的石蠟包埋的人肺提取的RNA的q-PCR分析，其顯示miR-145的表達水平。將所有樣品均標準化至Rnu-48值並表達為相對倍數變化，其中將任意值I分配給對照組。使用雙因素ANOVA繼之以Boneironi事後檢驗來分析數據(*p〈0.05, **p〈0.005)。(B)對從用於q-PCR分析的相同樣品獲得的石蠟切片中miR-145表達的原位分析。將混雜探針用作陰性對照。對於共定位，在相同樣品中使用在連續切片上的免疫組化檢測α肌動蛋白，其中以非免疫同種型IgG抗體作為陰性對照。圖像顯示在典型複雜損傷和新肌肉化的微動脈中α肌動蛋白和miR-145的增加的表達。圖像均400倍放大，比例尺=50 μ m。(C)在hPAH患者的新內膜損傷中的miR-145下調。對於共定位，通過免疫組化檢測α肌動蛋白表達。
[0031]圖17.對人BMPR2突變的PASMC的分析。(A)對PASMC中miR-145表達的qPCR分析。從具有BMPR2基因中突變的hPAH患者的PASMC提取總RNA。使用原代細胞的第4代傳代。對於前體miR-145和成熟miR-145表達，相比於不受影響的對照分析cDNA。將結果標準化至(A) GAPDH (對於前體miR-145)和(B) Rnu-48 (對於成熟miR-145)，並表達為相對倍數變化，其中將任意值I分配給對照組。使用不配對t檢驗來分析數據(**p〈0.005, ***p〈0.001相對對照樣品)。(C)將從野生型和BMPR2突變的細胞提取的相同總RNA還用於northern印跡分析以確認q-PCR結果。印跡定量用Scion Image軟體實施:建立感興趣的miRNA的條帶強度並標準化至相應的U6信號(D).使用不配對t檢驗來分析數據(***p〈0.001相對對照樣品)。
[0032]圖18.在經由siRNA下調BMPR2表達的人PASMC中的miR-143和miR-145上調。將原代人PASMC用能靶向並特異性抑制BMPR2表達的siRNA或用作為陰性對照的si混雜(siScramble)轉染。在72h後，從這些樣品和用於比較的未經處理細胞提取總RNA。BMPR2下調的效率由(A)TaqMan Real-Time PCR評估。在相同樣品中還評估(B)miR_143和(C)miR-145表達。將結果標準化至GAPDH(對於BMPR2)和Rnu_48(對於miR-143和miR-145)，並表達為相對倍數變化，其中將任意值I分配給對照組。使用單因素ANOVA繼之以Bonerroni事後檢驗來分析數據。**p〈0.005, ***p〈0.001相比於CTR或si混雜組,如指示的。
[0033]圖 19.wt 和 BMPR2BMPR2R899X 小鼠中的 miR-145 表達。從 4 只 wt 或 BMPR2 突變小鼠的整個肺中提取RNA，並評估miR-14`5表達，所述評估通過(A) q_PCR，其中一式三份地分析每份樣品，將結果標準化至U6並表達為相對倍數變化，其中將任意值I分配給對照組(***ρ〈0.001相對對照樣品)；和(B)-(C)通過northern印跡。(D)顯示miR-145在相同小鼠的肺中定位的原位雜交。將石蠟切片再水合併與抗miR-145或作為陰性對照的混雜探針溫育。對於共定位，在相同樣品中使用免疫組化測定法檢測α肌動蛋白，其中以非免疫同種型IgG抗體作為陰性對照。圖像200倍放大，比例尺=50 μ m。
[0034]發明詳述
[0035]本發明部分基於以下令人驚訝的發現，即miR-145表達和功能在肺動脈高血壓(PAH)的形成中起著關鍵作用。發明人顯示，miR-145在應答長期缺氧的小鼠中顯著上調，且對miR-145的遺傳或藥學抑制對小鼠中PAH形成是保護性的。在人組織中，發明人報告了從具有BMPR2基因中突變的PAH患者獲得的肺組織和分離的肺動脈平滑肌細胞(PASMC)中前體和成熟miR-145形式相比於對照升高。如此，本發明提供將miR-145作為對PAH治療幹預的新靶物。
[0036]在一個實施方案中，本發明提供在有此需要的受試者中治療或預防肺高血壓，特別是PAH的方法，包括對受試者施用miR-145表達和/或活性的抑制劑。當肺中的肺動脈變得擁擠、阻塞或受損從而導致動脈壓升高時發生肺高血壓。右心室增強的工作負載導致心肌勞損並且能導致心力衰竭。PAH的症狀包括但不限於，呼吸短促(開始時在運動時出現，最後在休息時也出現)、疲勞、頭暈或暈眩(fainting spell)、胸部壓迫或疼痛、下肢(踝和腿)和腹部中的腫脹、皮膚和唇帶藍色、以及快速脈搏或心悸。優選地，在患有PAH的受試者中施用miR-145抑制劑後，相比於未接受治療的受試者，前述症狀的一種或多種得到改善或消除，或者PAH的形成延遲。在一些實施方案中，受試者中的右心室收縮壓在施用miR-145抑制劑後降低。
[0037]可用本發明的方法治療的肺高血壓的形式包括但不限於，特發性PAH、遺傳性或家族性PAH、和繼發性肺高血壓(例如起因於肺栓塞、肺氣腫、肺纖維化和先天心臟病的高血壓)。PAH的家族性或遺傳性形式與某些基因中的突變相關。例如，70%的具有可遺傳形式PAH的患者在編碼骨形態發生蛋白(BMP) 2型受體(BMPR2)的基因中具有突變(Morrell等，2001)。如此，在一些實施方案中，要用本發明方法治療的受試者有形成PAH的風險。在一個實施方案中，有風險的受試者(例如人)在編碼BMPR2的基因中具有突變。
[0038]如本文中使用的，術語「受試者」或「患者」指任何脊椎動物，包括但不限於人和其它靈長類(例如黑猩猩和其它猿和猴物種)、農場動物(例如牛、綿羊、豬、山羊和馬)、家養哺乳動物(例如犬和貓)、實驗室動物(例如齧齒動物如小鼠、大鼠和豚鼠)、以及鳥類(例如家禽、野生鳥類和獵鳥，如雞、火雞和其它鶉雞類(gallinaceous bird)、鴨、鵝等)。在一些實施方案中，受試者是哺乳動物。在其它實施方案中，受試者是人。
[0039]miR-145與miR-143 —起位於鼠18號染色體和人5號染色體上基因間區內的簇中。MiR-145和miR-143 (彼此不具有同源性)共轉錄為單一轉錄本。miR-145的前體miRNA(pre-miRNA)序列被加工為成熟序列和星號(即次要(minor))序列。星號序列從莖環結構的另一臂加工。下面給出了小鼠和人miR-145的前體miRNA(例如莖環序列)、成熟序列和星號序列:`[0040]人成熟miR-145 (SEQ ID NO:1)
[0041]5， -GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU-3，
[0042]人miR-145*(SEQ ID NO:2)
[0043]5， -GGAUUCCUGGAAAUACUGUUCU-3，
[0044]人前體miR-145 (SEQ ID NO:3)
[0045]5， -CACCUUGUCCUCACGGUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUUAGAUGC UAAGAU
[0046]GGGGAUUCCUGGAAAUACUGUUCUUGAGGUCAUGGUU-3，
[0047]小鼠成熟miR-145 (SEQ ID NO:4)
[0048]5， -GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU-3，
[0049]小鼠miR-145* (SEQ ID NO:5)
[0050]5， -AUUCCUGGAAAUAC腳UCUUG-3，
[0051]小鼠前體miR-145 (SEQ ID NO:6)
[0052]5， -CUCACGGUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUUGGAUGCUAAGAUGG GGAUUCCU
[0053]GGAAAUAC腳UCUUGAG-3，
[0054]上文序列可以是核糖核酸序列或脫氧核糖核酸序列或這兩者的組合(即包含核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸的核酸)。理解包含任一種本文所述序列的核酸對於DNA序列將會把尿苷鹼基替換為胸苷鹼基，而對於RNA序列將會把胸苷鹼基替換為尿苷鹼基。
[0055]適於用在本發明方法中的miR-145表達或活性的抑制劑包括反義寡核苷酸、antagomir、合成性核酶或適體。在某些實施方案中,miR-145的抑制劑是反義寡核苷酸。反義寡核苷酸可包括核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或其組合。優選地，反義寡核苷酸具有至少一個化學修飾(例如糖或主鏈修飾)。例如，合適的反義寡核苷酸可包含一個或多個「構象受限的」或雙環糖核苷修飾(BSN)，其對含有BSN的寡核苷酸與其互補性microRNA靶鏈之間形成的複合物賦予增強的熱穩定性。例如，在一個實施方案中，反義寡核苷酸含有至少一個「鎖定核酸」。鎖定核酸(LNA)含有2』 -O, 4』 -C-亞甲基核糖核苷(結構A)，其中核糖糖模塊處於「鎖定」構象中。在另一個實施方案中，反義寡核苷酸含有至少一個2』，4』 -C-橋聯的2』脫氧核糖核苷(CDNA，結構B)。參見，例如美國專利N0.6，403，566和Wang等(1999)Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, Vol.9:1147-1150,兩者均通過全文提述併入本文。在再一個實施方案中，反義寡核苷酸含有至少一個經修飾的具有結構C中顯示的結構的核苷。靶向miR-145的反義寡核苷酸可含有BSN(LNA、CDNA等)或其它經修飾核苷酸、和核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸的組合。在一些實施方案中，靶向miR-145的反義寡核苷酸包含LNA和DNA核苷酸的組合。
[0056]
【權利要求】
1.一種在有此需要的受試者中治療或預防肺動脈高血壓(PAH)的方法，包括對所述受試者施用miR-145的抑制劑。
2.權利要求1的方法，其中所述miR-145的抑制劑是包含與成熟miR-145序列至少部分互補的序列的反義寡核苷酸。
3.權利要求2的方法，其中所述反義寡核苷酸包含與5』-GUCCAGUUUUCCCAGGMUCCCU-3』或5』 -GGAUUCCUGGMAUACUGUUCU-3』的序列至少部分互補的序列。
4.權利要求2或3的方法，其中所述反義寡核苷酸包含至少一個糖修飾。
5.權利要求4的方法，其中所述至少一個糖修飾是2』-0_烴基修飾或雙環糖核苷修飾。
6.權利要求5的方法，其中所述雙環糖核苷修飾是鎖定核酸。
7.權利要求2至6中任一項的方法,其中所述反義寡核苷酸包含至少一個主鏈修飾。
8.權利要求7的方法，其中所述主鏈修飾是硫代磷酸酯連接。
9.權利要求2至8中任一項的方法，其中所述反義寡核苷酸的長度為約8至約18個核苷酸。
10.權利要求9的方法，其中所述反義寡核苷酸的長度為約12至約16個核苷酸。
11.前述權利要求中任一項的方法，其中通過吸入施用路徑來對所述受試者施用所述抑制劑。
12.權利要求11的方法，其中所述抑制劑配製為乾粉。
13.權利要求11的方法，其中所述抑制劑配製為液體氣霧劑。
14.前述權利要求中任一項的方法，其中所述受試者是人。
15.權利要求14的方法，其中所述人在編碼骨形態發生蛋白2型受體的基因中具有突變。
16.一種用於治療或預防肺動脈高血壓的試劑盒，其包含miR-145的抑制劑和施用裝置。
17.權利要求16的試劑盒，其中所述施用裝置是吸入器。
18.權利要求16或權利要求17的試劑盒，其中所述miR-145的抑制劑是包含與成熟miR-145序列至少部分互補的序列的反義寡核苷酸。
19.權利要求18的試劑盒，其中所述反義寡核苷酸包含與5』-GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU-3?或5』 -GGAUUCCUGGAAAUACUGUUCU-3?的序列至少部分互補的序列。
20.權利要求18或權利要求19的試劑盒，其中所述反義寡核苷酸包含至少一個糖修飾。
21.權利要求20的試劑盒，其中所述至少一個糖修飾是2』-0_烴基修飾或雙環糖核苷修飾。
22.權利要求21的試劑盒，其中所述雙環糖核苷修飾是鎖定核酸。
23.權利要求18至22中任一項的試劑盒，其中所述反義寡核苷酸包含至少一個主鏈修飾。
24.權利要求23的試劑盒，其中所述主鏈修飾是硫代磷酸酯連接。
25.權利要求18至24中任一項的試劑盒，其中所述反義寡核苷酸的長度為約8至約18個核苷酸。
26.權利要求25的試劑盒，其中所述反義寡核苷酸的長度為約12至約16個核苷酸。
27.權利要求16至26中任一項的試劑盒，其中所述抑制劑配製為包含在所述施用裝置內的粉末。
28.權利要求16至26中任一項的試劑盒，其中所述抑制劑配製為包含在所述施用裝置內的液體氣霧劑。
29.miR-145的抑制劑，其用於在有此需要的受試者中治療或預防肺動脈高血壓(PAH)的方法，所述方法包括對所述受試者施用miR-145的抑制劑。
30.miR-145的抑制劑，其用於權利要求29的用途，其中所述miR-145的抑制劑是包含與成熟miR-145序列至少部分互補的序列的反義寡核苷酸。
31.miR-145的抑制劑，其用於權利要求30的用途，其中所述反義寡核苷酸包含與5』 -GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU-3』 或 5』 -GGAUUCCUGGAAAUACUGUUCU-3』 的序列至少部分互補的序列。
32.miR-145的抑制劑，其用於權利要求30或31的用途，其中所述反義寡核苷酸包含至少一個糖修飾。
33.miR-145的抑制劑，其用於權利要求32的用途，其中所述至少一個糖修飾是2』 -O-烴基修飾或雙環糖核苷修飾。
34.miR-145的抑制劑，其用於權利要求33的用途，其中所述雙環糖核苷修飾是鎖定核酸。
35.miR-145的抑制劑，其用於權利要求30-34任一項的用途，其中所述反義寡核苷酸包含至少一個主鏈修飾。
36.miR-145的抑制劑，其用於權利要求35的用途，其中所述主鏈修飾是硫代磷酸酯連接。
37.miR-145的抑制劑，其用於權利要求30-36任一項的用途，其中所述反義寡核苷酸的長度為約8至約18個核苷酸。
38.miR-145的抑制劑，其用於權利要求37的用途，其中所述反義寡核苷酸的長度為約12至約16個核苷酸。
39.miR-145的抑制劑，其用於權利要求29-38任一項的用途，其中通過吸入施用路徑來對所述受試者施用所述抑制劑，或其中適於通過吸入施用路徑來對所述受試者施用所述抑制劑。
40.miR-145的抑制劑，其用於權利要求39的用途，其中所述抑制劑配製為乾粉。
41.miR-145的抑制劑，其用於權利要求39的用途，其中所述抑制劑配製為液體氣霧劑。
42.miR-145的抑制劑，其用於權利要求29-41任一項的用途，其中所述受試者是人。
43.miR-145的抑制劑，其用於權利要求42的用途，其中所述人在編碼骨形態發生蛋白2型受體的基因中具有突變。
【文檔編號】A61K31/712GK103814131SQ201280034183
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2012年5月9日 優先權日:2011年5月9日
【發明者】A.貝克, M.麥克利恩, N.莫雷爾 申請人:格拉斯哥大學理事會, 劍橋企業有限公司