對引起嚴重急性呼吸道綜合症(sars)的人病毒的高通量診斷性試驗的製作方法

2023-04-28 19:58:36

專利名稱：對引起嚴重急性呼吸道綜合症(sars)的人病毒的高通量診斷性試驗的製作方法
對引起嚴重急性呼吸道綜合症(SARS)的人病毒的高通量診斷性試驗
本申請為分案申請，原申請的申請號為200480007680.4 (PCT/CN2004/000246)，申請日為2004年3月24日，發明名稱為"對 引起嚴重急性呼吸道綜合症(SARS)的人病毒的高通量診斷性試驗，，。
本申請要求以下申請的優先權2003年3月24日提交的美國臨 時申請60/457，031、2003年3月26日提交的美國臨時申請60/457,730、 2003年4月2日提交的美國臨時申請60/459,931、 2003年4月3曰 提交的美國臨時申請60/460,357、. 2003年4月8日提交的美國臨時 申請60/461,265、 2003年4月14日提交的美國臨時申請60/462,805、 2003年4月23日提交的美國臨時申請60/464,886、 2003年4月25 曰提交的美國臨時申請60/465,738和2003年5月14曰提交的美國 臨時申請60/470,935,它們各自通過引用整體結合到本文中。
本申請包含一份長序列表，該序列表通過一式三份的CD-R代 替印刷的紙質文本一併提交，其通過引用整體結合到本文中。所述 CD-R於2004年3月22日刻錄，分別標記為"CRF， 、 "Copy 1" 和"Copy2"，每個只含有一個相同的1.6MB文件(V9661077.APP)。
1.介紹
本發明涉及對導致人類嚴重急性呼吸道綜合症(SARS)的病毒 ("hSARS病毒")的高通量診斷性試驗。具體的說，本發明涉及高通 量逆轉錄-PCR "^斷性測定SARS相關冠狀病毒(SARS-CoV)。本發明 試驗方法是快速可靠的檢測方法，可用於診斷和監測SARS的傳播。 本發明方法消除了假陰性結果，並且為試驗提供了高靈敏度。本發 明進一步涉及用於診斷SARS的核苷酸序列及其部分。本發明還涉 及用於評價SARS遺傳多態性的核苷酸序列及其部分。本發明的核 苷酸序列包括hSARS病毒的(核殼)N-基因和S-基因序列。本發明涉 及用於檢測hSARS病毒N-基因或S-基因的包含核酸分子的診斷試劑 盒。本發明還涉及推斷的hSARS病毒N-基因和S-基因產物的M酸
序列。本發明還涉及N-基因和S-基因產物在診斷方法中的用途。本 發明還包括包含產生的抗N-基因或S-基因產物抗體的診斷性試驗方 法和試劑盒。
2.
背景技術：
最近，中國大陸的廣東省爆發了非典型肺炎。在2002年11月 到2003年3月之間，報導了 792例病例，其中31例死亡(WHO. Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS) ,e/:/少一(afew/。/ i ec. 2,; 78: 86)。患SARS的患者表現出各種臨床症狀，包括發熱(38攝氏度或以 上超過24小時)、不適、寒戰、頭痛和體痛。胸部X-射線表現出可 與肺炎相容的改變。其它症狀包括咳嗽、呼吸短促或呼吸困難。到2003 年5月3號，在香港已累計共發生1621件病例，179人死亡，分別 佔全球報導病例(6234)和死亡(435)的26%和41%。由於該疾病具有 高度傳染性，並在日常活動中傳播，非常需要開發一種快速和可靠 的診斷檢測方法以監測和控制該疾病。為應對此次危機，香港醫院 管理局加強了對嚴重非典型肺炎患者的監視。在此次調查過程中， 確認了多個衛生保健工作者群體患有此病。另外，與此病感染者密 忉接觸的人中出現多個肺炎病例群體。儘管採用了針對已知通常與 非典型肺炎有關的細菌病原體的典型抗生素治療方法，此病的嚴重 程度和發展仍非同尋常。本發明的發明人(簡稱本發明人)是參與調查 這些患者的小組之一。在這些患者中，對常見病毒和細菌的所有鑑 定試驗結杲均為陰性。此外，檢測hSARS病毒中其它基因如lb-基 因的診斷檢測方法不能用於準確診斷SARS。該疾病按嚴重急性呼吸 道綜合症(Severe Acute Respiratory Syndrome)的首字母命名 ("SARS")。該病毒突變和變化得很快，因此診斷SARS非常困難， 直到由本發明人如本文所公開從SARS患者中分離出該病毒的特有 區域，hSARS病毒的N-基因和S-基因。即本發明公開了使用該病毒 基西組中的特殊區域快速、準確、可靠和特異性鑑定hSARS病毒的
診斷性試驗方法。本發明可用於臨床和科學研究用途。此外，本發
明提供了高通量試驗方法，可用作診斷和監測SARS傳播的靈敏方 法。
3.發明概述
本發明基於本發明人對hSARS病毒特有區域的筌定，具體的說， 是hSARS病毒基因組的3'區域，尤其是可用於診斷性試驗以檢測 hSARS的hSARS病毒(核殼)N-基因。具體的說，N-基因用於診斷 SARS是因為與hSARS病毒中的其它基因相比，N-基因在病毒感染 時具有最多的拷貝數，尤其是當細胞裂解時。因此，hSARS病毒N-基因的核苷酸序列尤其可用於對hSARS病毒的快速和可靠的診斷性 試驗。此外，本發明方法消除了假陰性結果，並提高了試驗的靈敏 度。
所述病毒是從在最近爆發於中國的嚴重非典型肺炎中患上SARS 的患者中分離出來的。該分離病毒是正極性有包膜單鏈RNA病毒， 屬巢病毒(A^jfov/raky)目冠狀病毒科(Cora"ov/ndae) 。 hSARS病毒是 非常巨大的RNA病毒，由約29,742個核苷酸組成。hSARS病毒的 完整基因組序列保藏在Genbank， NCBI，其檢索號為AY278491 (SEQ ID NO: 15),其通過引用結合到本文中。分離的hSARS病毒於2003 年4月2日保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC),被給予檢索號 CCTCC-V200303,如下面第7節中所述，其通過引用結合到本文中。 同樣，hSARS病毒CCTCC-V200303的完整基因組序列及其特徵公 開於與本文同時在2004年3月24日提交的代理檔案號為V9661.0069
的美國專利申請中，其通過引用整體結合到本文中。該病毒突變和 變化得很快，因而使得診斷SARS非常困難。本發明人設計了檢測 N-基因核苷酸序列或蛋白存在的診斷性試驗方法，以快速、準確和 特異性鑑定hSARS病毒。此外，本發明人設計了診斷性檢測S-基因 核苷酸序列或蛋白存在的試驗方法，以測定hSARS病毒的遺傳多態
性。因此，本發明涉及檢測hSARS病毒N-基因和S-基因核苷^列 的方法。
本發明提供快速可靠的檢測hSARS病毒的試驗方法。在優選實 施方案中，hSARS病毒的檢測包括在聚合酶鏈反應、逆轉錄-聚合酶 鏈反應(RT-PCR)、 DNA分析、RNA分析或其它核酸雜交中使用本發 明核酸分子以檢測hSARS核酸。在一個實施方案中，本發明提供在 生物材料如細胞、鼻咽抽吸物、痰、血、唾液、尿、糞等中檢測本 發明hSARS病毒存在、活性或表達的方法。在優選實施方案中，生 物材料為鼻咽抽吸物或糞。樣品中hSARS病毒活性或表達相對對照 樣品的升高或降低可通過使生物材料接觸可直接或間接檢測hSARS 病毒存在、活性或表達的檢測試劑而測定。在一個具體實施方案中， 衝全測試劑為本發明的核酸分子。
本發明還涉及鑑定hSARS病毒感染對象的方法，所述方法包括 從該對象的生物樣品獲得總RNA;逆轉錄總RNA以獲得cDNA;和 用一套來源於hSARS核苷酸序列的引物使cDNA進行PCR測定。 在優選實施方案中，引物來源於(核殼)N-基因。在最優選實施方案 中，引物包含SEQIDNO: 2475和/或2476或SEQ ID NO: 2480和/ 或2481核苷酸序列。在另一個優選實施方案中，引物來源於(刺突)S-基因。在更優選的實施方案中，引物包含SEQIDNO: 2477和/或2478 核苷酸序列。
本發明還涉及分離的病毒的序列信息在診斷和治療方法中的用 途。在一個具體實施方案中，本發明提供了適合作為引物的核酸分 子，所述核酸分子包含或由SEQIDNO: 1、 11、 13、 15、 2471或2473
優選實施方案中，引物包含SEQIDNO: 2475和/或2476或SEQ ID NO: 2480和/或2481核苷酸序列以檢測N-基因。在另一個最優選實 施方案中，引物包含SEQ ID NO: 2477和/或2478核苷酸序列以檢 測S-基因。在另一個具體實施方案中，本發明提供適合與hSARS核
酸雜交的核酸分子，包4舌但不限於PCR引物、逆轉錄酶引物、DNA 分析的探針或其它核酸雜交分析以檢測hSARS核酸，例如包含或由 SEQIDNO: 1、 11、 13、 15、 2471、 2473、 2475、 2476、 2477、 2478、 2480或2481核苷酸序列或其互補序列或其部分組成。在優選實施方 案中，擴增包含(SEQ ID NO: 15的18057-18222位核苷酸或其部分)lb 基因、(SEQ ID NO: 15的21920-22107位核苷酸或其部分)M-基因 和(SEQIDNO: 15的28658-28883位核苷酸或其部分)N-基因的片段 的引物，可用於合成檢測hSARS核酸的探針。在一個具體實施方案 中，本發明提供包含核酸分子的診斷試劑盒，其適合用於檢測hSARS 的N-基因。在一個具體實施方案中，N-基因包含SEQ ID NO: 2471 核苷酸序列。在一個具體實施方案中，核酸分子包含SEQ ID NO: 2475 和/或2476或SEQ ID NO: 2480和/或2481核苷酸序列。在優選實施 方案中，診斷試劑盒還包含用於擴增lb基因的對照。在一個具體實 施方案中，用於擴增lb基因的引物為SEQ ID NO: 3和/或4。在另 一個具體實施方案中，診斷試劑盒還包含使用豬p-肌動蛋白基因的內
部對照。在一個具體實施方案中，用於擴增P-肌動蛋白基因的引物為 SEQ H) NO: 2482和/或2483。
在一個具體實施方案中，本發明提供包含核酸分子的診斷試劑 盒，該核酸分子適合用於檢測hSARS的S-基因。在一個具體實施方 案中，S-基因包含SEQ ID NO: 2473核苷酸序列。在一個具體實施 方案中，核酸分子包含SEQ ID NO: 2477和/或2478核苷酸序列。 本發明還包括整體或部分由所述核苷酸序列編碼的嵌合或重組病 毒。
在另一個具體實施方案中，本發明提供包含SEQIDNO: 1、 11、 13、 2471和/或2473核苷酸序列的核酸分子。在一個具體實施方案 中，本發明提供分離的核酸分子，該核酸分子包含或由SEQ ID NO: 1核苷酸序列或其互補序列或其部分組成，優選SEQ ID NO: 1核苷 酸序列或其互補序列的至少5、 10、 15、 20、 25、 30、 35、 40、 45、
100、 150、 200、 300、 350、 400、 450、 500、 550、 600或更多連續 核苷酸。在另一個具體實施方案中，本發明提供分離的核酸分子， 該核酸分子包含或由SEQ ID NO: 11核苷酸序列或其互補序列或其 部分組成，優選SEQIDNO: 11核苷酸序列或其互補序列的至少5、 10、 15、 20、 25、 30、 35、 40、 45、 100、 150、 200、 300、 350、 400、 450、 500、 550、 600、 700、 750、 800、 850、 900、 950、 1000、 1050、 1100、 1150、 1200或更多連續核苷酸。在又一個具體實施方案中， 本發明提供分離的核酸分子，該核酸分子包含或由SEQ ED NO: 13 核苷酸序列或其互補序列或其部分組成，優選SEQ ID NO: 13核苷 酸序列或其互補序列的至少5、 10、 15、 20、 25、 30、 35、 40、 45、 100、 150、 200、 300、 350、 400、 450、 500、 550、 600、 650、 700
或更多連續核苷酸。在另一個實施方案中，本發明提供分離的核酸 分子，該核酸分子包含或由SEQ ID NO: 15核苷酸序列或其互補序 列或其部分組成，優選SEQ ID NO: 15核苷酸序列或其互補序列的 至少5、 10、 15、 20、 25、 30、 35、 40、 45、 100、 150、 200、 300、 350、 400、 450、 500、 550、 600、 650、 7Q0、 750、 800、 850、 900、 950、 1000、 1050、 1100、 1150、 1200、 2000、 3000、 4000、 5000、 6000、 7000、 8000、 9000、 10000、 11000、 12000、 13000、 14000、 15000、 16000、 17000、 18000、 19000、 20000、 21000、 22000、 23000、 24000、 25000、 26000、 27000、 28000、 29000或更多連續核苷酸。 在另一個具體實施方案中，本發明提供分離的核酸分子，該核酸分 子包含或由SEQ ID NO: 2471核苷酸序列或其互補序列或其部分組 成，優選SEQ ID NO: 2471核苷酸序列或其互補序列的至少5、 10、 15、 20、 25、 30、 35、 40、 45、 100、 150、 200、 300、 350、 400、 450、 500、 550、 600、 650、 700、 750、 800、 850、 900、 950、 1000、 1050、 1100、 1150、 1200或更多連續核苷酸。在另一個具體實施方案中， 本發明提供分離的核酸分子，該核酸分子包含或由SEQIDNO: 2473 核苷酸序列或其互補序列或其部分組成，優選SEQ ID NO: 2473核
苷酸序列或其互補序列的至少5、 10、 15、 20、 25、 30、 35、 40、 45、 100、 150、 200、 300、 350、 400、 450、 500、 550、 600、 650、 700、 750、 800、 850、 900、 950、 1000、 1050、 1100、 1150、 1200、 2000、 3000或更多連續核苷酸。此外，在另一個具體實施方案中，本發明 提供分離的核酸分子，該核酸分子在本文定義的嚴格條件下與具有 SEQ ID NO: 1、 11、 13、 15、 2471或2473序列或其互補序列的核 酸分子雜交。在一個實施方案中，本發明提供與本發明核酸的編碼 鏈反義的分離核酸分子。在另一個具體實施方案中，本發明提供由 核酸分子編碼的分離的多肽或蛋白，該核酸分子包含或由SEQ ID NO: 1核苷酸序列或其互補序列的至少5、 10、 15、 20、 25、 30、 35、 40、 45、 100、 150、 200、 300、 350、 400、 450、 500、 550、 600或 更多連續核苷酸的核苷酸序列組成。在又一個具體實施方案中，本 發明提供由核酸分子編碼的分離的多肽或蛋白，該核酸分子包含或 由SEQ ID NO: 11核苷酸序列或其互補序列的至少5、 10、 15、 20、 25、 30、 35、 40、 45、 100、 150、 200、 300、 350、 400、 450、 500、 550、 600、 650、 700、 750、 800、 850、 900、 950、 1000、 1050、 1100、 1150、 1200或更多連續核苷酸的核苷酸序列組成。在又一個具體實 施方案中，本發明提供由核酸分子編碼的分離的多肽或蛋白，該核 酸分子包含或由SEQ ID NO: 13核苷酸序列或其互補序列的至少5、 10、 15、 20、 25、 30、 35、 40、 45、 100、 150、 200、 300、 350、 400、 450、 500、 550、 600、 650、 700或更多連續核苷酸的核苷酸序列組 成。在又一個具體實施方案中，本發明提供由核酸分子編碼的分離 的多肽或蛋白，該核酸分子包含或由SEQ ID NO: 15核普酸序列或 其互補序列的至少5、 10、 15、 20、 25、 30、 35、 40、 45、 100、 150、 200、 300、 350、 400、 450、 500、 550、 600、 650、 700、 750、 800、 850、 900、 950、 1000、 1050、 1100、 1150、 1200、 2000、 3000、 4000、 5000、 6000、 7000、 8000、 9000、 10000、 11000、 12000、 13000、 14000、 15000、 16000、 17000、 18000、 19000、 20000、 21000、 22000、 23000、
24000、 25000、 26000、 27000、 28000、 29000或更多連續核普酸的 核苷酸序列組成。在又一個具體實施方案中，本發明提供由核酸分 子編碼的分離的多肽或蛋白，該核酸分子包含或由SEQIDNO: 2471 核苷酸序列或其互補序列的至少5、 10、 15、 20、 25、 30、 35、 40、 45、 100、 150、 200、 300、 350、 400、 450、 500、 550、 600、 650、 700、 750、 800、 850、 900、 950、 1000、 1050、 1100、 1150、 1200 或更多連續核苷酸的核苷酸序列組成。在又一個具體實施方案中， 本發明提供由核酸分子編碼的分離的多肽或蛋白，該核酸分子包含 或由SEQ ID NO: 2473核苷酸序列或其互補序列的至少5、 10、 15、 20、 25、 30、 35、 40、 45、 100、 150、 200、 300、 350、 400、 450、 500、 550、 600、 650、 700、 750、 800、 850、 900、 950、 1000、 1050、 1100、 1150、 1200、 2000、 3000或更多連續核普酸的核苷酸序列組 成。本發明還提供從hSARS病毒分離的蛋白或多肽，包括從病毒感
染的細胞分離但不存在於相應未感染細胞的病毒蛋白。本發明還提 供

圖11 (SEQ ID NO: 17-239、 241-736和738-1107)和12 (SEQ ID NO: 1109-1589, 1591-1964和1966-2470)所示的蛋白或多肽。本發明還提 供具有SEQIDNO: 2472或2474胺基酸序列的蛋白或多肽。本發明 的多肽或蛋白優選具有SEQ ID NO: 1、 11、 13、 2471或2473序列 編碼的蛋白的生物活性(包括抗原性和/或免疫原性)。在其它實施方案 中，本發明多肽或蛋白具有核苷酸序列編碼的蛋白的生物活性(包括 抗原性和/或免疫原性)，該核苷酸序列為SEQ ID NO: 15核苷酸序 列或其互補序列的至少5、 10、 15、 20、 25、 30、 35、 40、 45、 100、 150、 200、 300、 350、 400、 450、 500、 550、 600、 650、 700、 750、 800、 850、 900、 950、 1000、 1050、 1100、 1150、 1200、 2000、 3000、 4000、 5000、 6000、 7000、 8000、 9000、 10000、 11000、 12000、 13000、 14000、 15000、 16000、 17000、 18000、 19000、 20000、 21000、 22000、 23000、 24000、 25000、 26000、 27000、 28000、 29000或更多連續核 苷酸。在其它實施方案中，本發明多肽或蛋白具有圖11 (SEQ ID NO:
17-239,241-736和738-1107)和12 (SEQ ID NO: 1109-1589, 1591-1964 和1966-2470)的蛋白的生物活性(包括抗原性和/或免疫原性)。本發明 還提供蛋白或多肽，所迷蛋白或多肽具有SEQ ID NO: 2472或2474 胺基酸序列的蛋白的生物活性。
在一個方面，本發明提供在宿主細胞中增殖hSARS病毒的方法， 該方法包括用分離的hSARS病毒感染宿主細胞、培養宿主細胞使病 毒複製以及收穫所得病毒體。本發明也提供被hSARS病毒感染的宿 主細胞。
在一個方面，本發明涉及分離的hSARS病毒在診斷和治療方法 中的用途。在一個具體實施方案中，本發明提供使用分離的hSARS 病毒或其任何蛋白或多肽在生物樣品中檢測hSARS病毒免疫特異性 抗體的方法。在另一個具體實施方案中，本發明提供篩選免疫特異 性結合和中和hSARS的抗體的方法。這種抗體用於hSARS感染對 象的被動免疫或免疫療法。
本發明還提供抗體，所述抗體特異性結合SEQ ID NO: 1、 11、 13、 2471或2473核苷酸序列或其片段編碼的本發明多肽、或包含在 嚴g件下與SEQ ED NO: 1、 11、 13、 2471或2473核苷酸序列雜 交的核苷酸序列的核酸編碼的本發明多肽、和/或具有一種或多種本 發明多肽生物活性的任何hSARS表位。本發明還提供特異性結合SEQ ID NO: 15核苷酸序列或其片段編碼的本發明多肽的抗體。這些多 肽包括圖U (SEQ ID NO: 17-239、 241-736和738-1107)和12 (SEQ ID NO: 1109-1589、 1591-1964和1966-2470)中所示的多肽。在另一個 實施方案中，該多肽包含SEQIDNO: 2472或2474胺基酸序列。本 發明還提供抗體，所述抗體特異性結合由包含在嚴格條件下與SEQ ID NO: 15核苷酸序列雜交的核苷酸序列的核酸編碼的本發明多肽，和 /或具有一種或多種本發明多肽生物活性的任何hSARS表位。這種抗 體包括但不限於多克隆抗體、單克隆抗體、雙特異性抗體、多特異 性抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段、F(ab')2
片段、二疏鍵連接的Fvs、胞內抗體以及含有特異性結合本發明多肽 的VL或VH域或甚至互補決定區(CDR)的片段。
在另一個實施方案中，本發明提供包含hSARS病毒(包括所述 病毒的重組和嵌合形式)或所述病毒的蛋白亞單位的疫苗製品。在一 個具體實施方案中，本發明疫苗製品包含活的但減毒的有或沒有佐 劑的hSARS病毒。在另一個具體實施方案中，本發明疫苗製品包含 滅活的或死的hSARS病毒。可通過病毒在宿主細胞中的一系列傳代 或通過製備重組或嵌合形式的病毒而製備這種減毒或滅活病毒。因 此，本發明還提供製備重組或嵌合形式hSARS的方法。在另一個具 體實施方案中，本發明疫苗製品包含hSARS ^毒(例如檢索號為 CCTCC-V200303的病毒)的核酸或片段，或其序列為SEQ ID NO: 1、 11、 13、 15、 2471或2473或其片段的核酸分子。在另一個實施方案 中，本發明提供包含一種或多種從hSARS病毒分離的或從hSARS 病毒核酸產生的多肽的疫苗製品，所述病毒例如保藏檢索號為 CCTCC-V200303的病毒。在一個具體實施方案中，疫苗製品包含SEQ ED NO: 1、 11、 13、 2471或2473核苷酸序列或其片段編碼的本發 明多肽。在一個具體實施方案中，疫苗製品包含圖11 (SEQIDNO: 17-239、 241-736和738-1107)和12(SEQIDNO: 1109-1589、 1591-1964 和1966-2470)中所述的本發明多肽或SEQ ID NO: 15核苷酸序列或 其片段編碼的本發明多肽。在一個具體實施方案中，疫苗製品包含 含有SEQ ID NO: 2472或2474胺基酸序列的多肽。此外，本發明提 供通過單獨給予或與佐劑或其它藥物可接受賦形劑聯合使用的本發 明疫苗製品或抗體來治療、改善、控制或預防SARS的方法。
在另一個方面，本發明提供包含本發明抗病毒劑和藥物可接受 栽體的藥物組合物。在一個具體實施方案中，本發明抗病毒劑為免 疫特異性結合hSARS病毒或任何hSARS表位的抗體。在優選實施 方案中，這種抗體中和hSARS病毒。在一個具體實施方案中，本發 明抗病毒劑結合hSARS病毒N-基因或S-基因的片段、變體、同源物。在一個具體實施方案中，本發明抗病毒劑結合包含SEQE)NO: 2472 或2474 M酸序列的多肽的片段、變體、同源物。在另一個具體實 施方案中，抗病毒劑為本發明多肽或蛋白或本發明核酸分子。本發 明也提供包含本發明藥物組合物的藥盒。
3.1定義
本文所用術語"免疫特異性結合本發明多肽的抗體或抗體片段" 指免疫特異性結合SEQ ID NO: 1、 11、 13、 15、 2471或2473核苷 酸序列編碼的多肽或圖11或12中所示多肽或其片段，並且不非特 異性地結合其它多肽的抗體或其片段。免疫特異性結合本發明多肽 的抗體或其片段可與其它抗原發生交叉反應。優選免疫特異性結合 本發明多肽的抗體或其片段不與其它抗原發生交叉反應。免疫特異 性結合本發明多肽的抗體或其片段可通過例如免疫測定或本領域技 術人員熟知的其它技術進行鑑定。
"分離的"或"純化的"肽或蛋白質基本不含來自所述蛋白質的 細胞源或組織源的細胞材料或其它汙染蛋白質，或當它們通過化學 法合成時，基本不含化學前體或其它化學物質。措詞"基本不含細 胞材料，，包括多肽/蛋白質製品，其中多肽/蛋白質從其分離或重組生 產的細胞的細胞組分中分離出來。因此，基本不含細胞材料的多肽/ 蛋白質包括含少於約30%、 20%、 10%、 5%、 2.5%或1% (乾重)汙染 蛋白質的多^/蛋白質製品。當多AU蛋白質為重組生產時，還優選基 本不含培養基，即培養基佔蛋白質製品的體積少於約20%、 10%或 5%。當多肽/蛋白質通過化學合成生產時，優選基本不含化學前體或 其它化學物質，即與參與蛋白質合成的化學前體或其它化學物質分 離。因此，這種多^/蛋白質製品含少於約30%、 20%、 10%、 5%(幹
重)不是目的多肽/蛋白質片段的化學前體或化合物。在本發明優選的 實施方案中，多W蛋白質是分離的或純化的。
"分離的"核酸分子是與其天然來源中存在的其它核酸分子分
離的核酸分子。此外，"分離的"核酸分子如cDNA分子，當通過 重組技術生產時可基本不含其它細胞材料或培養基，當通過化學法 合成時可基本不含化學前體或其它化學物質。在本發明優逸的實施 方案中，編碼本發明多肽/蛋白質的核酸分子是分離的或純化的。術 語"分離的"核酸分子不包括未與含有其它核酸分子的其它文庫克 隆分離的文庫成員核酸。
本文所用術語"部分"或"片段"指含有相關核酸分子的長度 為至少約25、 30、 35、 40、 45、 100、 150、 200、 300、 350、 400、 450、 500、 550、 600、 650、 700、 750、 800、 850、 900、 950、 1,000、 1,050、 1,100、 1，150、 1，200、 2,000、 3,000、 4,000、 5,000、 6,000、 7,000、 8,000、 9，000、 10,000、 11,000、 12,000、 13,000、 14,000、 15，000、 16，000、 17,000、 18，000、 19,000、 20,000、 21,000、 22,000、 23,000、 24,000、 25,000、 26,000、 27,000、 28,000、 29,000或更多個連續核酸，且具 有至少一種相關核酸分子的功能特徵(或其編碼的蛋白質具有相關核
酸分子所編碼的蛋白質的一種功能特徵)的核酸分子片段；或指含有
相關蛋白質或多肽的至少5、 10、 15、 20、 25、 30、 35、 40、 45、 50、 55、 60、 65、 70、 75、 80、 90、 100、 120、 140、 160、 180、 200、 220、 240、 260、 280、 300、 320、 340、 360、 400、 500、 600、 700、 800、 900、 1,000、 1，500、 2,000、 2,500、 3,000、 3,500、 4,000、 4,100、 4,200、 4,300、 4,350、 4,360、 4,370、 4，380個胺基酸殘基長度，且具有至少
一種相關蛋白質或多肽的功能特徵的蛋白質或多肽片段。
術語"hSAR病毒基因組的3'區，，指SEQ ID NO: 15的約 18000-29742位核苷酸。
術語"具有本發明蛋白質的生物活性，，或"具有本發明多肽的 生物活性，，指具有共同生物活性的多肽或蛋白質的特性，其與SEQID NO: 1、 11、 13、 15、 16、 240、 737、 1108、 1590、 1965、 2471或2473 核苷酸序列編碼的多肽相比，具有類似或相同結構域和/或具有足夠 的胺基酸一致性。本發明多肽的這種共同生物活性包括抗原性和免
疫原性。
術語"在嚴*件下"指相互之間具有至少70%、至少75%、 至少80%、至少85%、至少90%或至少95%—致性的核苷酸序列 保持互相雜交的雜交和洗滌條件。這種雜交條件例如但不限於在 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989),6.3.1-6.3.6.; Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Co.， Inc., N.Y. (1986)，第75-78頁和第84-87頁； 及Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1982), 第387-389頁中描述，對本領域技術人員來說是熟知的。優選的嚴格 雜交條件的非限制性實例是，在約68°C下6X氯化鈉/檸檬酸鈉 (SSC)、 0.5% SDS中雜交，然後在室溫下2X SSC、 0.5% SDS中洗滌 一次或多次。另一個優選的嚴格雜交條件的非限制性實例是，在約 45。C下6X SSC中雜交，然後在約50-65。C下0.2X SSC、 0.1% SDS 中洗滌一次或多次。
本文所用術語"變體"指天然產生的hSARS基因突變株或重組 製備的hSARS突變體，與CCTCC-V200303的hSARS相比，它們各 自在其基因組中含有一個或多個突變。術語"變體"也可指特定肽 的天然產生的突變體或特定肽或蛋白質的重組製備的突變體，其中 一個或多個胺基酸殘基通過胺基酸置換、插入或缺失被修飾。
4.附圖簡述
圖1顯示從SARS病毒獲得的部分DNA序列(SEQ ID NO: l)及 其推斷的氣基酸序列(SEQ ID NO: 2)，所述SARS病毒與已知冠狀 病毒的RNA依賴性RNA聚合酶蛋白具有57 %的同源性。
圖2顯示具有類似冠狀病毒的形態學特徵的新型hSARS病毒的 電子顯孩麼照片。
圖3顯示與感染新型冠狀病毒科(Cora"avz'n'ofae)人呼吸道病毒的 FrHK-4細胞特異性結合的IgG抗體的免疫螢光染色。
圖4顯示生長於細胞培養物中、在pH 7.0用3%磷鵠酸鉀負染 色的hSARS病毒的超離心沉積物的電子顯微照片。
圖5A顯示SARS患者的肺活組織切片檢查的薄層切片電於顯孩t 照片；圖5B顯示hSARS感染細胞的薄層切片電子顯孩麼照片。
圖6顯示hSARS病毒(GenBank檢索號AY268070)的部分蛋白 序列(215氬基酸；SEQ ID NO: 2)的系統發生學分析結果。系統樹是 通過鄰接法構建的。水平線距離表示兩個相比較的序列不同的位點 的數目。自引導值是從500個重複中推斷得出的。
圖7A顯示在能定量檢測樣品中hSARS病毒的實時定量PCR試 驗中螢光強度對PCR循環的擴增圖。指出了反應中輸入質粒DNA 的拷貝數。X軸表示定量PCR試驗的循環數，Y軸表示超過背景的 螢光強度(FI)。圖7B顯示臨床樣品的PCR產物的解鏈曲線分析結果。 指出了得自陽性(+ve)樣品、陰性(-ve)樣品和水對照(水)的信號。X軸 表示溫度(。C), Y軸表示超過背景的螢光強度(FI)。
圖8顯示另一種從SARS病毒獲得的部分DNA序列(SEQ ID NO: U)及其推斷的胺基酸序列(SEQIDNO: 12)。
圖9顯示又一種從SARS病毒獲得的部分DNA序列(SEQ ID NO: 13)及其推斷的胺基酸序列(SEQEDNO: 14)。
圖10顯示SARS病毒的整個基因組DNA序列(SEQIDNO: l5)。 圖11顯示以三種讀框(參見SEQ ID NO: 16、 240和737)從SEQ ID NO: 15獲得的推斷胺基酸序列。星號(*)表示標誌肽的末端的終 止密碼子。第一讀框胺基酸序列SEQ ID NO: 17-239;第二讀框氨 基酸序列SEQ ID NO: 241-736;第三讀框胺基酸序列SEQ ID NO: 738-1107。
圖12顯示以三種讀框(參見SEQIDNO: 1108、 1W0和19M)從 SEQ ED NO: 15的互補序列獲得的推斷胺基酸序列。星號(*)表示標 志肽的末端的終止密碼子。第一讀框胺基酸序列SEQ ID NO: 1109-1589;第二讀框胺基酸序列SEQ ID NO: 1591-1964;笫三讀框胺基酸序列SEQIDNO: 1966-2470。
圖13顯示N-基因引物序列(其在SEQ ID NO: 2471的29247-29410位擴增核苷酸)；150弁(SEQIDNO: 2475); 200# (SEQ ID NO: 2476);以及S-基因引物序列(其在SEQIDNO: 2473的24751-25049 位擴增核苷酸)；131#(SEQIDNO: 2477); 132# (SEQ ID NO: 2478)。
圖14A顯示N-基因的核苷酸序列(SEQ ID NO: 2471)。圖14B 顯示N-基因的胺基酸序列(SEQIDNO: 2472)。
圖15A顯示S-基因的核苷酸序列(SEQ ID NO: 2473)。圖15B 顯示S-基因的胺基酸序列(SEQIDNO: 2474)。
圖16顯示SARS-CoV HK-39的基因組組構和轉錄策略。基因組 和mRNA轉錄物被加帽(黑圏)，在5'近端攜帶前導序列(垂線)，並被 聚腺苷化(A15)。箭頭指基因間序列5'-CTAAACGAAC-3' (SEQ ID NO: 2479)的位置。在正義基因組RNA釋放到宿主細胞細胞質中後， 合成ORF la和lb編碼的病毒RNA-依賴性RNA聚合酶。它進行全 長互補(反義)RNA的轉錄，從該RNA合成新的基因組RNA、次基 因組mRNA轉錄物的重疊群(overlapping set)和前導RNA。應注意到 所有轉錄物之前都有共同的5'前導序列和共同的3'末端。ORFla和 lb-RNA-依賴性RNA聚合酶；S-主要的包膜突起糖蛋白；M-跨膜糖 蛋白；N-核殼；XI、 X2、 X3-推定的蛋白。
圖17顯示pSARSCoV-ORFlb-N的構建圖。從SARS-CoV的 ORFlb (lb)和N基因擴增的PCR產物共同連接到克隆載體pCR2.1-TOPO (Invitrogen)中。核苷酸(nt)數相當於在HK-39抹SARS-CoV (AY278491)的序列中的位置。陰影區域表示用於診斷測定的引物(即 SEQ ID NO: 2480和2481)擴增的擴增子。
圖18顯示用SV總RNA分離系統從SARS患者提取的總RNA 電泳後的瓊脂糖凝膠照片。提取的RNA然後經逆轉錄聚合酶鏈反應 (RT-PCR)試驗以檢測患者中的冠狀病毒。
圖19顯示逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)中潛在抑制劑的影響。
為除去潛在抑制劑，從SV96結合板洗脫的總RNA用95%乙醇和3 M 乙酸鈉沉澱，重懸在12 nl無核酸酶的水中。用actin-F (SEQ ID NO: 2482)和actin-R (SEQ ID NO: 2483)引物進行RT-PCR。顯示的數字 為作為內部對照加入樣品中的豬腎上皮細胞(PK-15)的數量。用未處 理RNA樣品沒有擴增出DNA片段。
圖20顯示用於擴增各種基因的引物。SRS251 (SEQIDNO: 2480) 和SRS252 (SEQ ID NO: 2481)從N-基因區擴增出225絲對的片段， 該區與其它冠狀病毒沒有表現出同源性。coro3 (SEQ ED NO: 3)和 coro4 (SEQ BD NO: 4)擴增作為對照的RNA-依賴性RNA聚合酶(lb 基因)。Actin-F (SEQ ED NO: 2482)和actin-R (SEQ ID NO: 2483)從 作為PCR試驗內部對照的P-肌動蛋白基因擴增出745 ^Jjft的片段。 圖21A顯示焚光強度對PCR循環數作的擴增圖。黑線表示N-基因特異性PCR的動態範圍，其連續稀釋的質粒構建體為10M(^拷 貝。非SARS患者，包括感染腺病毒(n:5)、呼吸道合胞病毒0=5)、 人間質肺病毒(human metapneumovirus) (n = 5)、 流感A病毒(n = 5)或 流感B病毒(n = 5)的患者的NPA樣品用灰線表示。帶三角的線表示 SARS-CoV陽性NPA樣品；NTC表示無模板對照；X-軸表示進行的 定量PCR的循環數，而Y-軸表示超過背景信號的螢光強度(FAM-400) (ARn)。插入圖表示PCR產物的解鏈曲線分析。顯示了來自陽性(+ve) 樣品、陰性(-ve)樣品和無模板對照的信號。X-軸表示溫度(。C)，而Y-軸表示螢光強度(ARn)。圖21B顯示N-基因和lb-基因的特異性PCR 的動態範圍的比較。N-基因和lb-基因PCR的動態範圍均用相同質 粒構建體獲得，其中相應擴增子以1:1的比例亞克隆。拷貝數為10"-10S拷貝的連續稀釋的質粒用作兩個PCR中的模板。帶三角的線表示 N-基因特異性PCR，而灰線表示lb-基因特異性PCR。插入圖表示使 用不同模板拷貝數時兩個PCR實驗的三個重複中的Ct值士標準偏差。 NTC表示無模板對照；X-軸表示進行的定量PCR的循環數，而Y-軸表示螢光強度。
圖22A和22B分別顯示對SARS CoV的lb (4吏用具有SEQ ID NO: 3和4的引物)和N-基因(使用具有SEQ ID NO: 2480和2481 的引物)特異性的實時定量PCR的擴增曲線和解鏈曲囝22A:焚 光強度對PCR循環數作擴增圖。來自有臨床症狀的患者的NPA、氣 管分散物(tracheal dispersion)和肺活組織檢查的1 plcDNA用作各PCR 的模板。PCR進行50個循環以達到反應的飽和期。X-軸表示進行的 定量PCR的循環數，而Y-軸表示超過背景信號的螢光強度(FAM-490)。水平灰線表示通過最大曲率法計算的閾值，自動計算基線循環 Ct。插入圖表示使用來源於各種組織的cDNA的兩個PCR的半數最 大螢光值(1/2最大)和Ct,這些組織在三個不同時間點分離自關鍵患 者(New Engl. J. Med. 348: 1967-76 (Drosten等，2003)中所提到的患 者A)。 NPA-鼻咽抽吸物；TW-氣管洗滌物；LW-肺洗滌物。圖22B: PCR產物的解鏈曲線。在10分鐘的反應進一步延伸步驟後進行解鏈 曲線的分析。溫度分76次從56。C升高到94。C，每次0.5。C增量， 每個設定點的溫度保持7秒以收集數據和分析。lb-和N-基因特異性 PCR產物的解鏈溫度分別為80.5°C和85.5。C。 X-軸為以攝氏度表示 的溫度，而Y-軸表示超過背景信號的螢光強度(FAM-490)。 l^il水在 反應中用作無模板對照。
圖23顯示48個臨床樣品的診斷結果，其中分別使用具有SEQ ID NO: 2480和2481的引物，以|3-肌動蛋白PCR作為內部對照。各道 上方的條帶表示用actin-F和actin-R擴增的745 bp DNA片段，而下 方的條帶為SARS冠狀病毒(225 bp) N-基因特異性引物的擴增子。表 示了試驗中的-ve對照(水)和+ve對照(來自SARS冠狀病毒感染的Vero 細胞的cDNA)。混合兩個反應的5 ^ PCR產物，加到2%瓊脂糖凝 膠的樣品孔中。M = 1 kb+分子量標記(Invitrogen)。
圖24顯示SARS-CoV總RNA的RNA印跡分析。從SARS-CoV 感染的Vero E6細胞提取SARS-CoV的總RNA。 RNA在含有6.29% 曱醛的1%變性凝膠中分離。然後RNA轉移到正電性尼龍膜上，分
20 別與對lb、 S、 M和N基因特異性的地高辛西;基標記片段雜交。l道 -lb; 2道-S; 3道-M; 4道-N。垂直條表示分子量參照。箭頭表示與 N探針雜交的轉錄物。信號通過化學發光分析。
圖25顯示用於RNA印跡分析的DNA探針。表示了 lb基因(核 苷酸18057-18222; SEQIDNO: 2484)、 S基因(核苷酸21920-22107; SEQEDNO: 2485)、 M基因(核苷酸25867-26996; SEQIDNO: 2486) 和N基因(核苷酸28658-28883; SEQIDNO: 2487)的探針。
5.發明詳述
本發明人開發了用於SARS相關冠狀病毒(SARS-CoV)的快速、 高通量逆轉錄-PCR診斷測試方法。包括核殼基因(N-基因)的hSARS 病毒基因組3'區表現為敏感的分子標記，可在lb基因以外用於增加 測試的敏感性。使用PK-15細胞作為內部對照可用以確保在提取過 程和cDNA合成時RNA的完整性，因此消除了假陰性結果。
在冠狀病毒屬的典型成員小鼠肝炎病毒(MHV)中，基因組RNA 和mRNA轉錄物被加帽，具有共同的3'端和共同的5'端前導序列。 根據該獨特的轉錄策略，病毒在宿主內增殖時不同病毒基因的拷貝 數不同(圖19)。病毒複製時編碼核殼的N基因具有最豐富的拷貝數， 因為所有轉錄物可攜帶來自N基因的核苷酸序列，雖然它們不是都 在翻譯出該基因產物的框內。本發明人已發現了基於病毒基因組3'區 (包括N-基因)的診斷性試驗，提供了比病毒基因組其餘部分更敏感 的試驗。因此，在優選實施方案中，可用於診斷性試驗的核酸分子 包含SEQ ID NO: 15的18000-29742位核苷酸的核香酸序列或其部 分。該部分可包含具有來自SEQ ID NO: 15的18000-29742位核苷 酸的核酸序列的15、 20、 25、 30、 35、 40、 45、 100、 150、 200、 300、 350、 400、 450、 500、 550、 600、 650、 700、 750、 750、 800、 850、 900、 950、 1000、 1050、 1100、 1150、 1200個核苦酸。在其它優選 實施方案中，用於診斷性試驗的核酸分子包含SEQ ID NO: 15的
28658-28883或29247-29410位核苷酸的核酸序列。
從具有主要臨床症狀和明顯密切接觸感染患者史的SARS疑似 患者獲得鼻咽抽吸物(NPA)和糞樣品。從患者樣品提取總RNA，同 時以PK-15細胞作為內部對照。通過逆轉錄PCR試驗分析樣品。進 行RNA印跡分析以顯示病毒不同的次基因組轉錄物。使用實時定量 PCR以比較用於該診斷性試驗的兩種部位的敏感性。在一個具體實 施方案中，在RNA提取過程後用乙醇沉澱除去PCR抑制劑。
在優選實施方案中，本發明提供在生物樣品中檢測N-基因核酸 存在與否的方法。該方法包括從各種來源獲得生物樣品，使樣品與 可檢測hSARS病毒N-基因核酸(例如mRNA、基因組RNA)的化合 物或試劑接觸，從而檢測樣品中N-基因的存在。在優選實施方案中， N-基因可用包含SEQ ID NO: 2471核苷酸序列或其互補序列或其部 分的標記核酸探針檢測。該部分長度可為10、 20、 30、 40、 50、 100、 200、 400、 500、 600、 800、 1000、 1200個核苷酸。在優選實施方案 中，包含SEQ ID NO: 2475和/或2476或SEQ ED NO: 2480和/或2481 核苷酸序列的引物可用於擴增N-基因的部分以進行檢測。
優選用於檢測本發明hSARS mRNA或基因組RNA的試劑為能 與編碼本發明多肽的mRNA或基因組RNA雜交的標記核酸探針。 該核酸探針例如可為包含或由核苷酸序列組成的核酸分子，所述核 苷酸序列為SEQ ID NO: 1、 11、 13、 15、 2471或2473或其互補序 列或其部分，例如長度為至少15、 20、 25、 30、 50、 100、 250、 500、 750、 IOOO或更多連續核普酸，並足以在嚴*件下與hSARSmRNA 或基因組RNA特異性雜交的寡核苷酸。
在另一個優選具體實施方案中，使用基於N-基因部分核苷酸序 列或SEQ ID NO: 15的基因組核苷酸序列或基於SEQ IDNO: 1、 11、 13、 15、 2471或2473核苷酸序列構建的引物，通過逆轉錄聚合酶鏈 反應(RT-PCR)檢測樣品中N-基因的存在。在一個非限制性具體實施 方案中，RT-PCR方法中優選使用的引物為5'-TACACACCTCAG-
22
CGTTG-3' (SEQ ID NO: 3)和/或5'-CACGAACGTGACGAAT-3' (SEQ ID NO: 4),在2.5mMMgCl2存在下，熱循環例如為但不限於94。C 8 分鐘，然後94。C l分鐘、50°C l分鐘、72°C l分鐘的循環40次(也 參見以下6.7和6.8節)。在優選實施方案中，引物包含SEQIDNO: 2475和2476核酸序列。在另一個優選實施方案中，引物包含SEQID NO: 2480和2481核酸序列。在優選實施方案中，熱循環為94°C 10 分鐘，然後94°C 30秒、56°C 30秒、72°C 30秒的循環40次，72°C 10 分鐘。在另一個優選實施方案中，熱循環為94°C3分鐘，然後94°C30 秒、56°C 30秒、72°C 30秒的循環40次，72。C 10分鐘。在更多優 選具體實施方案中，本發明提供實時定量PCR試驗以檢測生物樣品 中hSARS病毒的存在，通過使來自樣品的提取總RNA逆轉錄，將 獲得的cDNA用特異性引物(例如具有SEQ ID NO: 3和4核苷酸序 列的引物)和螢光染料(例如SYBR Green I,其在非特異性結合雙鏈 DNA時發螢光)進行PCR反應。由於經過一定數量的熱循環產生了 PCR產物，在延長步驟的結束時捕獲這些反應的焚光信號，因此可 基於擴增圖定量測定樣品中病毒量(參見下述6.7)。
在優選實施方案中，本發明提供在生物樣品中檢測S-基因核酸 存在與否的方法。該方法包括從各種來源獲得生物樣品，^吏樣品與 可檢測hSARS病毒S-基因核酸(例如mRNA、基因組RNA)的化合物 或試劑接觸，從而檢測樣品中S-基因的存在。優選用於檢測本發明 hSARS mRNA或基因組RNA的試劑為能與編碼本發明多肽的mRNA 或基因組RNA雜交的標記核酸探針。該核酸探針例如可為包含或由 SEQ ID NO: 1、 11、 13、 15、 2471或2473核苷酸序列或其互補序 列或其部分組成的核酸分子，例如長度為至少15、 20、 25、 30、 50、 100、 250、 500、 750、 1000或更多連續核苷酸，並足以在嚴格條件 下與hSARS mRNA或基因組RNA特異性雜交的寡核苷酸。
在另一個優選具體實施方案中，使用基於S-基因部分核苷酸序 列(SEQ ID NO: 2473)構建的引物，通過逆轉錄聚合S^反應(RT-PCR)
檢測樣品中s-基因的存在。
體外用於檢測mRNA的技術包括Northern雜交、原位雜交、 RT-PCR和RNA酶保護。體外用於檢測基因組RNA'的技術包括 Nothern雜交、RT-PCT和RNA酶保護。
編碼N-基因的多核苷酸可在其被檢測前擴增。術語"擴增，，指 從單個多核苷酸分子製備該核酸多個拷貝的過程。多核苷酸的擴增 可在體外通過本領域技術人員已知的生物化學方法進行。擴增試劑 可為任何可完成引物延長產物合成功能的化合物或體系，包括酶。 用於該目的的合適酶包括例如大腸桿菌DNA聚合酶I、 Taq聚合酶、 大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段、T4DNA聚合酶、其它可獲 得的DNA聚合酶、聚合酶突變蛋白、逆轉錄酶、連接酶和包括熱-穩定酶(即在升高到足以導致變性的溫度後進行引物延長的酶)的其它 酶。合適的酶促進核苷酸以合適的方式結合，以形成與各突變體核 苷酸鏈互補的引物延長產物。通常，該合成從各引物的3'-端開始， 沿模板鏈向5'-方向進行，直到合成結束，產生不同長度的分子。但 是，某些擴增試劑使用與上述相同的過程，在5'-端開始合成，向另 一方向進行。在任何情況下，本發明的方法不限於本文所述擴增的 具體實施方案。
本發明可使用的一種體外擴增方法是美國專利4,683,202和 4,683,195中所述的聚合酶鏈反應(PCR)。術語"聚合酶鏈反應"指使 用熱穩定DNA聚合酶和兩種寡核苷酸引物擴增DNA威基序列的方 法，所述引物一種在待擴增序列的一端與(+)-鏈互補，另一種在另一 端與(-)-鏈互補。因為新合成的DNA鏈可隨後作為相同引物序列的 額外模板，引物退火、鏈延長和解離的連續循環使所需序列產生快 速和高特異性擴增。聚合酶鏈反應用於在樣品中檢測編碼細胞因子 的多核苷酸的存在。許多聚合酶鏈方法是本領域技術人員已知的， 可用於本發明的方法。例如，DNA可在熱循環儀中經歷30-35個下 述擴增循環95°C 30秒、52-60°C 1分鐘和72°C 1分鐘，最終延長
步驟為72°C 5分鐘。又例如，DNA可在熱循環儀中經歷35個聚合 酶鏈反應循環，變性溫度為95。C30秒，然後可變退火溫度54-58。Cl 分鐘，延長步驟為？0。C1分鐘，最終延長步驟在70。C。
用於擴增本發明N-基因或S-基因的引物可使用任何合適的方法 製備，例如傳統的磷酸三酯和磷酸二酯方法或其自動化實施方案， 只要引物能與目標多核苷酸雜交。 一種在修飾的固體栽體上合成寡 核苷酸的方法如美國專利4,458,066中所述。引物的準確長度取決於 許多因素，包括溫度、緩衝液和核苷酸組成。引物必須在擴增誘導 試劑存在下啟動延長產物的合成。
本發明方法使用的引物與待擴增核苷酸序列的各鏈互補。術語 "互補"指引物必須在允許試劑進行聚合的條件下與它們各自的鏈 雜交。換句話說，與側面序列互補的引物與側面序列雜交，允許擴 增核苷酸序列。優選延續的引物3'端具有與側面鏈互補的完全威基配 對互補性。可使用已知方法結合本公開來開發用於本發明N-基因或 S-基因編碼多核苷酸的引物和探針。
本領域普通技術人員了解各種可用於增加目標核酸拷貝數的擴 增方法。本發明方法中檢測的多核普酸可在溶液中或結合到固體載 體後進一步被評價、檢測、克隆、測序等，這可通過任何通常用於 檢測具體核苷酸序列的方法，如另一聚合酶鏈反應、寡聚物限制性 酶切(Saiki等，S/o/Tec/2"o/ogv 3: 1008-1012 (1985))、等位基因特異 性寡核苷酸(ASO)探針分析(Conner等，iVoc. A^/. Jcac/Sc/. [/&4 80: 278 (1983)、寡核苷酸連接試驗(OLAs) (Landegren等，Science 241: 1077 (1988))、 RNA酶保護試驗等。已有DNA分析的分子技術的綜 述(Landegren等，Science 242: 229-237 (1988》。DNA擴增後，反應 產物通過DNA雜交分析檢測，而不使用放射性探針。在這種方法中， 例如，含少量從組織或患者獲得的多核芬酸的DNA樣品被擴增，通 過DNA印跡技術分析。高度放大的信號促進了非放射性探針或標記 的使用。本發明一個實施方案中， 一種三砩酸核苷被放射性標記，
從而允許通過放射自顯影法直接顯示擴增產物。在另 一個實施方案 中，擴增引物被螢光標記，電泳通過電泳體系。通過雷射檢測後計 算機輔助圖形顯示而不是放射性信號，顯示擴增產物。
本發明方法可包括實時定量PCR試驗，例如Taqmai^試驗 (Holland等,Proc Natl Acad Sci USA, 88 (16): 7276 (1991);也參見 2004年3月24日提交的美國專利申請，代理人檔案號V9661.0078, 其通過引用整體結合到本文中)。本發明試驗可在設計用於進行這種 試驗的儀器上進行，例如可荻自Applied Biosystems (Foster City, CA) 的儀器。用於這種試驗的引物和探針可根據本領域技術人員已知的 方法設計。
用於擴增N-基因或S-基因部分的引物的長度為至少10、 15、 20、 25、 30個核苷酸。具體的說，最優選擴增N-基因或S-基因的引物。 優選GC比應高於30%、 35%、 40%、 45%、 50%、 55%或60%,以 防止引物上的髮夾結構。此外，擴增子應有足夠的長度以通過標準 分子生物學方法^r測。優選擴增子長度為至少40、 60、 100、 200、 300、 400、 500、 600、 800、 1000^Jj t。
在一個具體實施方案中，本發明方法進一步涉及從對照對象獲 得對照樣品，將對照樣品與能檢測N-基因或S-基因的化合物或試劑 接觸，從而檢測樣品中編碼N-基因或S-基因的mRNA或基因組RNA 的存在，並將對照樣品中N-基因或S-基因或編碼多肽的mRNA或基 因組RNA是否存在與待測樣品中N-基因或S-基因或編碼多肽的 mRNA或基因組RNA存在相比較。
本發明還包括在待測樣品中檢測N-基因核酸存在的試劑盒。該 試劑盒，例如，可包含能在待測樣品中檢測多肽編碼核酸分子的標 記化合物或試劑，以及某些實施方案中檢測樣品中mRNA量的方法 (結合編碼多肽的DNA或mRNA的寡核苷酸探針)。
對於基於寡核苷酸的試劑盒，該試劑盒可例如包含(l)寡核苷 酸，例如可檢測的標記寡核苷酸，其與編碼本發明多肽的核苷酸序
列或N-基因內的序列雜交；(2)用於擴增含N-基因序列的核酸分子的 引物對。該試劑盒還可包含，例如，緩衝試劑、防腐劑或蛋白穩定 試劑。該試劑盒還可包含檢測可檢測物必需的成分(例如酶或底物)。 該試劑盒還可包含對照樣品或一系列對照樣品，其可被檢測並與待 測樣品比較。該試劑盒的各種成分通常被裝入單獨的容器，所有各 種容器和使用說明 一起封在單個包裝物內。
本發明涉及hSARS病毒分離的N-基因和S-基因。在一個具體 實施方案中，所述病毒包含SEQ ID NO: 1、 11、 13、 15、 2471和/ 或2473核苷酸序列。在一個具體實施方案中，本發明提供hSARS 病毒的分離核酸分子，該核酸分子包括或由SEQIDNO: 1、 11、 13、 15、 24刀和/或24"核苷酸序列或其互補序列或其部分組成。在另 一個具體實施方案中，本發明提供在本文定義的嚴格條件下與具有 SEQ ID NO: 1、 11、 13、 15、 2471和/或2473序列的核酸分子、或 冠狀病毒科已知成員的特定基因、或其互補序列雜交的分離核酸分 子。在另一個具體實施方案中，本發明提供核酸分子編碼的分離多 肽或蛋白質，所述核酸分子包含SEQEDNO: 1核苷酸序列或其互補 序列的至少約5、 10、 15、 20、 25、 30、 35、 40、 45、 100、 150、 200、 300、 350、 400、 450、 500、 550、 600或更多個連續核苦酸的核苷酸 序列。在另一個具體實施方案中，本發明提供核酸分子編碼的分離 多肽或蛋白質，所述核酸分子包含SEQ ED NO: 11核苷酸序列或其 互補序列的至少約5、 10、 15、 20、 25、 30、 35、 40、 45、 100、 150、 200、 300、 350、 400、 450、 500、 550、 600、 700、 750、 800、 850、 900、 950、 1,000、 1,050、 1,100、 1,150、 1，200或更多個連續核苷酸 的核苷酸序列。在又一個具體的實施方案中，本發明提供核酸分子 編碼的分離多肽或蛋白質，所述核酸分子包含SEQ ED NO: 13核芬 酸序列或其互補序列的至少約5、 10、 15、 20、 25、 30、 35、 40、 45、 畫、150、 200、 300、 350、 400、 450、 500、 550、 600、 650、 700 或更多個連續核苷酸的核苷酸序列。在又一個具體實施方案中，本
發明提供核酸分子編碼的分離多肽或蛋白質，所述核酸分子包含SEQ ID NO: 2471核苷酸序列或其互補序列的至少5、 10、 15、 20、 25、 30、 35、 40、 45、 100、 150、 200、 300、 350、 400、 450、 500、 550、 600、 650、 700、 750、 800、 850、 900、 950、 1000、 1050、 1100、 1150、 1200或更多連續核苷酸的核苷酸序列。在又一個具體實施方案中， 本發明提供核酸分子編碼的分離多肽或蛋白質，所述核酸分子包含 SEQID NO: 2473核苷酸序列或其互補序列的至少5、 10、 15、 20、 25、 30、 35、 40、 45、 100、 150、 200、 300、 350、 400、 450、 500、 550、 600、 650、 700、 750、 800、 850、 900、 950、 1000、 1050、 1、 100、 1150、 1200、 2000、 3000或更多個連續核苷酸的核苷酸序列。 在又一個具體的實施方案中，本發明提供由核酸分子編碼的分離多 肽或蛋白質，所述核酸分子包含SEQ ID NO: 15核苷酸序列或其互 補序列的至少5、 10、 15、 20、 25、 30、 35、 40、 45、 100、 150、 200、 300、 350、 400、 450、 500、 550、 600、 650、 700、 750、 800、 850、 900、 950、 1,000、 1,050、 1,100、 1,150、 1,200、 2,000、 3,000、 4,000、 5,000、 6,000、 7,000、 8,000、 9,000、 10,000、 11,000、 12,000、 13,000、 14,000、 15,000、 16，000、 17,000、 18,000、 19,000、 20,000、 21,000、 22,000、 23,000、 24,000、 25,000、 26,000、 27,000、 28,000、 29,000 或更多連續核苷酸的核苷酸序列。這些多肽包括圖11 (SEQID NO: 17-239、 241-736和738-1107)及圖12 (SEQ ID NO: 1109-1589、 1591-1964和1966-2470)所示的多肽或具有SEQ ID NO: 2472或2474 胺基酸序列的多肽。本發明多肽或蛋白質優選具有以下蛋白質的一 種或多種生物活性由SEQ ID NO: 1、 11、 13、 15、 2471或2473 序列編碼的蛋白質；或圖11及圖12中所示的多肽；或含有由SEQID NO: 1、 11、 13、 15、 2471或2473序列編碼的胺基酸序列的天然病 毒蛋白質。
本發明還涉及在宿主細胞中增殖hSARS病毒的方法。 本發明進一步涉及分離病毒的序列信息在診斷方法和治療方法
中的應用。在一個具體實施方案中，本發明提供hSARS病毒CCTCC-V200303的整個核苷酸序列SEQ ID NO: 15或其片段或互補序列。 此外，本發明涉及能在嚴格條件下與hSARS病毒CCTCC-V200303 的基因組SEQE)NO: 15的任何部分雜交的核酸分子。在一個具體 實施方案中，本發明提供適合用作引物的核酸分子，該核酸分子包 含或由SEQEDNO: 1、 11、 13、 15、 2471或2473核香酸序列或其 互補序列或其部分組成。在一個具體實施方案中，所述引物包含SEQ ID NO: 2475、 2476、 2477、 2478、 2480或2481核苷酸序列。在另
一個具體實施方案中，本發明提供適合用作雜交探針的核酸分子， 用於檢測包含或由SEQ ID NO: 1、 11、 13、 15、 2471或2473核香 酸序列或其互補序列或其部分組成的、編碼本發明多肽的核酸。本 發明還涉及包含引物的試劑盒，所述引物具有SEQ ID NO: 2475和 2476以及SEQ ID NO: 2480和2481核苷酸序列，以探測N-基因。 在另一個實施方案中，本發明涉及包含引物的試劑盒，所述引物具 有SEQ ID NO: 2477和/或2478核芬酸序列，以探測S-基因。在一 個優選實施方案中，所述試劑盒還包含試劑，用於檢測作為陰性對 照的hSARS病毒中不存在的基因。本發明進一步包括嵌合病毒或重 組病毒或由所述核苷酸序列編碼的病毒蛋白質。
本發明進一步提供能特異性結合由SEQIDNO: 1、 U、 13、 2471 或2473核苷酸序列或其片段編碼的本發明多肽或任何hSARS表位 的抗體。本發明還提供特異性結合其胺基酸序列為SEQIDNO: 2472 或2^4的多肽的抗體。本發明進一步提供特異性結合由SEQIDNO: l5核苷酸序列或其片段編碼的本發明多肽、或圖11和12中所示多 肽或其片段、或任何hSARS表位的抗體。這種抗體包括但不限於多 克隆抗體、單克隆抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體、人抗體、 人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段、F(ab')2片段、二硫鍵 連接的Fvs、胞內抗體和含有能與本發明多肽特異性結合的VL或VH 結構域或甚至互補決定區(CDR)的片段。
在一個實施方案中，本發明提供在生物材料如細胞、血液、唾
液、尿、痰、鼻咽抽吸物等中檢測本發明hSARS病毒的存在、活性 或表達的方法。可通過將生物材料與能直接或間接檢測hSARS病毒 存在的試劑相接觸來確定樣品中hSARS病毒的存在。在一個具體實 施方案中，檢測試劑是本發明抗體。在另一個實施方案中，檢測試 劑是本發明核酸分子。
在另一個實施方案中，本發明提供包含hSARS病毒(包括所述 病毒的重組形式和嵌合形式)或病毒亞單位的疫苗製品，在一個具體 實施方案中，本發明疫苗製品包含活的但減毒的hSARS病毒，有或 沒有藥物可接受賦形劑，包括佐劑。在另一個具體實施方案中，本 發明疫苗製品包含滅活或死的hSARS病毒，有或沒有藥物可接受載 體，包括佐劑。本發明疫苗製品還可包含包含佐劑或。因此，本發 明進一步提供製備hSARS的重組形式或嵌合形式的方法。在另一個 具體實施方案中，本發明疫苗製品包含一種或多種包含或由SEQ ID NO: 1、 11、 13、 15、 2471和/或2473序列或其片段組成的核酸分 子。在另一個實施方案中，本發明提供包含一種或多種本發明多肽 的疫苗製品，所述多肽由包含或由SEQIDNO: 1、 11、 13、 2471和 /或2473核苷酸序列或其片段組成的核苷酸序列編碼，或為圖11和 12中所示多肽或其片段。在另一個實施方案中，本發明提供包含一 種或多種本發明多肽的疫苗製品，所述多肽由包含或由SEQ ID NO: 15核苷酸序列或其片段組成的核苷酸序列編碼。此外，本發明提供 通過單獨或與以下藥物聯合給予本發明疫苗製品或抗體來治療、改 善、控制或預防SARS的方法抗病毒劑[例如金剛烷胺、金剛乙胺、 更昔洛韋、阿昔洛韋、利巴韋林、噴昔洛韋、奧塞米韋、膦曱酸、 齊多夫定(AZT)、去羥肌苷(ddl)、拉米夫定(3TC)、扎西他濱(ddC)、 司他夫定(d4T)、奈韋拉平、地位韋啶、茚地那韋、利託那韋、阿糖 腺苷、奈非那韋、沙奎那韋、扎那米韋、磷酸奧塞米韋、普來可那 立、幹擾素等]、類固醇和皮質類固醇(如潑尼松、可的松、氟替卡松)
和糖皮質激素、抗生素、止痛劑、支氣管擴張藥或其它用於呼吸道 和/或病毒感染的療法。
此外，本發明提供包含本發明抗病毒劑和藥物可接受載體的藥 物組合物。本發明還提供包含本發明藥物組合物的藥盒。
在另一方面，本發明提供篩選能抑制hSARS病毒或其變體的傳 染性或複製的抗病毒劑的方法。
5.1重組和嵌合hSARS病喜
本發明包括由來源於hSARS病毒或其天然變體的基因組的病毒 栽體編碼的重組或嵌合病毒。在一個具體實施方案中，重組病毒來 源於保藏號為CCTCC-V200303的hSARS病毒。在一個具體實施方 案中，病毒具有SEQIDNO: 15核苷酸序列。在另一個具體實施方 案中，重組病毒來源於hSARS病毒的天然變體。hSARS的天然變體 具有與hSARS病毒CCTCC-V200303的基因組序列(SEQ ID NO: 15) 不同的序列，這是由於基因組序列的一種或多種自發突變，包括但 不限於點突變、重排、插入、缺失等，所述突變會或不會導致發生 表型改變。根據本發明，來源於hSARS病毒CCTCC-V200303基因 組的病毒栽體含有編碼至少hSARS病毒一個ORF的一部分的核酸序 列。在一個具體實施方案中，所述OFR包含或由SEQIDNO: 1、 11、 13、 2471、 24 3核苷酸序列或其片段組成。在一個具體實施方案中， 在SEQ ID NO: l5核苷酸序列或其片段中存在多於一個的OFR,如 圖11 (SEQ ID NO: 16、 240和737)及圖12 (SEQ ID NO: 1108、 1590 和1965)中所示。在另一實施方案中，ORF編碼的多肽包含或由SEQID NO: 2、 12、 14、 2472或2474的胺基酸序列或其片段、或如圖11 (SEQ ID NO: 17-239、 241-736和738-1107)及圖12 (SEQ ID NO: 1109 -1589、 1591-1964和1966-2470)中所示或其片段組成。根據本發明， 這些病毒栽體可包含或不包含不是天然病毒基因組的核酸。
在另一個具體實施方案中，本發明嵌合病毒是進一步包含異源
核苷酸序列的重組hSARS病毒。根據本發明，嵌合病毒可由核苷酸 序列編碼，其中已向基因組添加了異源核苷酸序列或其中內源或天 然核苷酸序列已被異源核苷酸序列置換。
根據本發明，嵌合病毒由進一步包含異源核普酸序列的本發明 病毒載體編碼。根據本發明，嵌合病毒由可包含或不包含不是天然 病毒基因組的核酸的病毒栽體編碼。根據本發明，嵌合病毒由病毒 栽體編碼，其中已添加、插入異源核香酸序列或已置換天然或非天 然序列。根據本發明，嵌合病毒可由來源於hSARS病毒的不同毒抹 或變體的核苷酸序列編碼。具體的說，嵌合病毒由核苷酸序列編碼， 所述核苷酸序列編碼來源於SARS病毒的不同毒抹或變體的抗原多 肽。
嵌合病毒對於生產抗兩種或多種病毒的重組疫苗是特別有用的 (Tao等，丄Virol.72,2955-2961; Durbin等,2000,J.Viro1.74, 6821-6831; Skiadopoulos等,1998， J. Virol. 72， 1762-1768 (1998); Teng等,2000, 丄Virol. 74， 9317-9321)。例如，可以設想，來源於hSARS病毒、表 達hSARS病毒變體的一種或多種蛋白質(反之亦然)的病毒栽體將保 護接種了這種載體的對象免受天然hSARS病毒及其變體的感染。對 於用活疫苗接種的目的，可如其它病毒一樣使用減毒和複製缺陷型 病毒。(參見PCT WO 02/057302第6頁和第23頁，其通過引用結合 到本文中)。
根據本發明，待摻入編碼本發明重組或嵌合病毒的病毒栽體的 異源序列包括從hSARS的不同毒株或變體獲得或衍生的序列。
在某些實施方案中，本發明嵌合或重組病毒由來源於病毒基因 組的病毒栽體編碼，其中一個或多個序列、基因間區、末端序列或 ORF的整體或部分已被異源或非天然序列取代。在本發明的某些實 施方案中，本發明嵌合病毒由來源於病毒基因組的病毒栽體編碼， 其中 一種或多種異源序列已被插入或添加到栽體中。
病毒栽體的選擇可取決於待治療病毒感染或保護免受病毒感染的對象的種類。如果對象是人類，則可用減毒hSARS病毒來提供抗 原序列。
根據本發明，可對病毒栽體進行人工改造，以提供對hSARS及 其天然變體的感染帶來保護作用的抗原序列。可對病毒栽體進行人 工改造，以提供一種、兩種、三種或更多種抗原序列。根據本發明， 抗原序列可來源於同一病毒、同一種類病毒的不同毒抹或變體、或 不同病毒。
根據本發明獲得的表達產物和/或重組或嵌合病毒體可有利地應 用在疫苗製品中。可對本發明表達產物和嵌合病毒體進行人工改造， 以產生抗多種病原體的疫苗，所述病原體包括病毒和細菌抗原、腫 瘤抗原、變應原抗原和與自身免疫病有關的自身抗原。具體的說， 可對本發明嵌合病毒體進行人工改造，以製造能保護對象免受hSARS 病毒或其變體感染的疫苗。
在某些實施方案中，可對本發明表達產物和重組或嵌合病毒體 進行人工改造，以產生抗多種病原體的疫苗，所述病原體包括病毒 抗原、腫瘤抗原和與自身免疫病有關的自身抗原。實現此目標的一 個方法包括對現有的hSARS基因進行修飾，使得在所述基因各自的 外結構域中包含外源序列。在異源序列為病原體的表位或抗原的情 況下，這些嵌合病毒可用來誘導針對衍生這些決定簇的疾病因子的 保護性免疫應答。
因此，本發明涉及使用病毒栽體和重組或嵌合病毒來製備抗多 種病毒和/或抗原的疫苗。本發明還包括包含病毒栽體的重組病毒， 所述病毒栽體來源於hSARS病毒或其變體，含有能使病毒具有更適 合用於疫苗製品的表型(例如減毒表型或增強的抗原性)的序列。突變 和修飾可出現在病毒的編碼區、基因間區和前導序列和尾隨序列。
本發明提供包含本發明核酸或載體的宿主細胞。含有hSARS病 毒聚合酶成分的質粒栽體或病毒栽體在原核細胞中產生，以在相關 的細胞類型(細菌、昆蟲細胞、真核細胞)中表達所述成分。含有hSARS
基因組全長拷貝或部分拷貝的質粒或病毒載體在原核細胞中產生， 以在體外或體內表達病毒核酸。後者栽體可含有其它病毒序列以產 生嵌合病毒或嵌合病毒蛋白，可缺少病毒基因組的某些部分以產生 複製缺陷型病毒，並可含有突變、缺失或插入以產生減毒病毒。此
外，本發明提供感染hSARS病毒(例如保藏號為CCTCC-V200303的 hSARS病毒)的宿主細胞。
hSARS(野生型、減毒型、複製缺陷型或嵌合型)的傳染性拷貝可 根據上述現有技術在共表達聚合酶成分時產生。
此外，可使用短暫或穩定表達一種或多種全長或部分hSARS蛋 白質的真核細胞。這種細胞可通過轉染(蛋白質載體或核酸載體)、感 染(病毒栽體)或轉導(病毒載體)來製成，可用於與所述野生型、減毒 型、複製缺陷型或嵌合型病毒互補。
本發明病毒栽體和嵌合病毒可用於通過刺激體液免疫應答、細 胞免疫應答或通過刺激對抗原的耐受性而調節對象的免疫系統。本 文所用的對象指人、靈長目動物、馬、牛、綿羊、豬、山羊、狗、 貓、鳥類和齧齒動物。
5.2疫苗和抗病毒劑的配製
在一個優選實施方案中，本發明提供由本發明核酸編碼的蛋白 質分子或hSARS病毒特異性病毒蛋白及其功能片段。有用的蛋白質 分子例如來源於可從本發明病毒衍生的任何基因或基因組片段，包 括包膜蛋白(E蛋白)、膜內在蛋白質(M蛋白)、刺突蛋白(S蛋白)、核 殼蛋白(N蛋白)、血凝素酯酶(HE蛋白)和RNA依賴性RNA聚合酶。 本文所提供的這種分子或其抗原片段例如可用於診斷方法或試劑盒 中，以及用於藥物組合物如亞單位疫苗中。特別有用的是由SEQ ID NO: 1、 11、 13、 15、 2471、 2473核苷酸序列編碼的多肽、圖11 (SEQ ID NO: 17-239、 241-736和738-1107)及圖12 (SEQ ED NO: 1109-1589、 1591-1964和1966-2470)中所示的多肽、具有SEQ ID NO: 2472
或2474胺基酸序列的多肽或其抗原片段，供混入作為抗原或亞單位 免疫原，但也可使用滅活的全病毒。還尤其有用的是由hSARS基因 組的重組核酸片段編碼的蛋白物質，當然優選的是在ORF的優逸界 限內、尤其是在體內(例如出於保護目的或治療目的，或用於提供診 斷性抗體)或體外(例如通過噬菌體展示技術或其它用於產生合成抗體 的技術)都引發hSARS特異性抗體或T細胞應答的蛋白物質。
本發明提供用於預防或治療hSARS病毒感染的疫苗製品。在某 些實施方案中，本發明疫苗包含hSARS病毒的重組和嵌合病毒。在 某些實施方案中，病毒是減毒的。
在本發明此方面的另一實施方案中，滅活疫苗製品可通過使用 常規技術"殺死"嵌合病毒來製備。在其傳染性已被破壞的意義上， 滅活疫苗是"死的"。理想的是，病毒的傳染性被破壞，但不影響 其免疫原性。為製備滅活疫苗，可使嵌合病毒在細胞培養物中或在 雞胚的尿嚢中生長，通過區帶超離心純化，用曱醛或p-丙醇酸內酯滅 活，收集。所得疫苗通常通過肌肉內接種。
滅活病毒可用合適的佐劑配製，以增強免疫應答。這種佐劑可 包括但不限於無機凝膠，例如氫氧化鋁；表面活性物質如溶血卵磷 脂、聚醚多元醇(pluronic polyol)、聚陰離子；肽；油乳液；及具有潛 在用途的人佐劑^t口 BCG和小才奉斥幹菌(Co/7"e6。"en.w/w/ arvww)。
在另一方面，本發明還提供DNA疫苗製品，其中包含hSARS 病毒(例如保藏號為CCTCC -V200303的病毒)的核酸或其片段，或具 有SEQIDNO: 1、 11、 13、 15、 2471、 2473序列的核酸分子或其片 段。在另一個具體實施方案中，本發明DNA疫苗製品包含編碼免疫 特異性結合hSARS病毒的抗體的核酸或其片段。在DNA疫苗製品 中，DNA疫苗包含帶有插入片段的病毒載體(例如來源於hSARS病 毒)、細菌質粒或其它表達載體，所述插入片段包含有效地與一種或 多種控制元件相連的本發明核酸分子，從而使得由所述核酸分子編 碼的接種蛋白質可以在接種的對象中表達。這種載體可用重組DNA
技術製備成攜帶本發明核酸分子的重組或嵌合病毒栽體(參見上文5.1節)。
已描迷了備種供DNA接種以抗病毒感染的異源載體。例如，以 下參考文獻描述的栽體可用來表達hSARS序列而不是所描述的病毒 或其它病原體的序列；尤其描述用於以下的栽體B肝病毒(Michel， ML.等，1995，DAN-mediated immunization to the hepatitis B surface antigen in mice: Aspects of the humoral response mimic hepatitis B viral infection in humans, Proc. Natl. Aca Sci. USA 92: 5307-5311; Davis, H丄.等，1993, DNA-based immunization induces continuous seretion of hepatitis B surface antigen and high levels of circulating antibody, Human Molec. Genetics 2: 1847-1851)、 HIV病毒(Wang， B.等，1993, Gene
inoculation generates immune responses against human imunodeficiency virus type 1 ， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 4156-4160; Lu， S.等，1996，
Simian immunodeficiency virus DNA vaccine trial in macques, J. Virol. 70: 3978-3991; Letvin,N.L.等，1997,Potent,protective anti-HIV immune responses generated by bimodal HIV envelope DNA plus protein vaccination, Proc Natl Acad Sci USA. 94(17): 9378-83)和流感病毒 (Robinson, HL等，1993, Protection against a lethal influenza virus challenge by immunization with a haemagglutinin-expressing plasmid DNA, Vaccine 11: 957-960; Ulmer,丄B.等，Heterologous protection against influenza by injection of DNA encoding a viral protein, Science 259: 1745-1749),以及細菌感染如結核病(Tascon， R E.等，1996, Vaccination against tuberculosis by DNA injection, Nature Med. 2: 888-892; Huy gen ， K.等，1996, Immunogenicity and protective efficacy of a tuberculosis DNA vaccine, Nature Med.,2: 893-898)和寄生蟲感染 i口疰疾(Sedegah,M.， 1994， Protection against malaria by immunization with plasmid DNA encoding circumsporozoite protein, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9866-9870; Doolan， D.L.等,1996， Circumventing genetic restriction of protection against malaria with multigene DNA
immunization: CD8+ T cell-interferon 5， and nitric oxide-dependent immunity, J. Exper. Med.， 1183: 1739-1746)。
可使用多種方法來輸入上迷疫苗製品。這些方法包括但不限於 口、皮內、肌內、腹膜內、靜脈內、皮下和鼻內途徑。另外，優選
製品。本發明DNA疫苗可以鹽水溶液形式，通過用注射器和針頭注 射入肌肉或皮膚內來給予(Wolff J,A.等，19gO,Direct gene transfer into mouse muscle in vivo, Science 247: 1465-1468; Raz， E., 1994, Intradermal gene immunization: The possible role of DNA uptake in the induction of cellular immunity to viruses, Proc. Natl. Acd. Sci. USA 91: 9519-9523)。另一種給予DNA疫苗的方式稱為"基因槍"方法，通 過該法，塗有目的DNA分子的微小金珠被射入細胞中(Tang， D.等， 1992， Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response, Nature 356: 152-154)。有關DNA疫苗的方法的全面綜述 參見Robinson, H丄.,1999, DNA vaccines: basic mechanism and immune responses (綜述)，Int. J. Mol. Med 4(5): 549-555; Barber, B., 1997, Introduction: Emerging vaccine strategies, Seminars in Immunology 9(5): 269-270;和Robinson, H丄.等,1997， DNA vaccines, Seminars in Immunology 9(5): 271 -283 。
5.3 hSARS病毒或其變體的減毒
可對本發明hSARS病毒或其變體進行基因工程改造，以顯示出 減毒表型。具體的說，本發明病毒在所述病毒作為疫苗給予的對象 中顯示出減毒表型。減毒可通過普通技術人員熟知的任何方法來實 現。非為理論所囿，可例如通過使用本質上在預定宿主物種中不能 很好地複製的病毒來產生本發明病毒的減毒表型，例如相對於病毒 的野生型毒林，通過減少病毒基因組的複製，通過降低病毒感染宿 主細胞的能力，或通過降低病毒蛋白質裝配成傳染性病毒體的能力。
hSARS病毒及其變體的減毒表型可通過普通技術人員熟知的任 何方法來檢測。候選病毒可例如檢測其感染宿主的能力或其在細胞 培養系統中的複製速率。在茱些實施方案中，用不同溫度下的生長 曲線來檢測病毒的減毒表型。例如，減毒病毒能在35°C下生長，但 不能在39°C或40°C下生長。在某些實施方案中，可用不同的細胞 系評價病毒的減毒表型。例如，減毒病毒可只能在猴細胞系中生長， 但卻不能在人細胞系中生長，或者減毒病毒在不同細胞系中可達到 的病毒滴度不同。在某些實施方案中，病毒在小型動物模型(包括但 不限於倉鼠、棉鼠、小鼠、豚鼠)的呼吸道中的複製被用來評價病毒 的減毒表型。在其它實施方案中，病毒誘導的免疫應答，包括但不 限於抗體滴度(例如通過蝕斑減少中和試驗或ELISA來試驗)被用來 評價病毒的減毒表型。在一個具體實施方案中，蝕斑減少中和試驗 或ELISA在低劑量下進行。在某些實施方案中，可檢測出hSARS病 毒在動物模型中引起病理症狀的能力。病毒在動物模型中引起病理 症狀的能力降低是其減毒表型的指徵。在一個具體實施方案中，檢 測候選病毒在猴;f莫型中對鼻的感染，以翻液的產生為指標。
可對本發明病毒進行減毒，以使病毒的一種或多種功能特徵受 損。在某些實施方案中，減毒是通過與減毒病毒來源的病毒野生型 毒林作比較來測定的。在其它實施方案中，減毒是通過比較減毒病 毒在不同宿主系統中的生長來確定的。因此，作為非限制性實例， 當在人宿主中生長時，如果hSARS病毒或其變體與非減毒hSARS 或其變體相比在人宿主中的生長降低，則hSARS病毒或其變體被稱 為減毒的。
在某些實施方案中，本發明減毒病毒能夠感染宿主，能夠在宿 主中複製，從而產生傳染性病毒體。但是，與野生型毒林相比，減 毒林生長得到的滴度低，或生長得更緩慢。可用普通技術人員熟知 的任何方法確定減毒病毒的生長曲線並將其與野生型病毒的生長曲 線相比較。在某些實施方案中，本發明減毒病毒(例如重組或嵌合hSARS) 在人細胞中複製得不如野生型病毒(例如野生型hSARS)好。但是，減 毒病毒在缺乏幹擾素功能的細胞系如Vero細胞中可複製良好。
在其它實施方案中，本發明減毒病毒能夠感染宿主，能夠在宿 主中複製，以及能夠使本發明病毒的蛋白質嵌入到胞質膜中，但是 減毒病毒不會引起宿主產生新的傳染性病毒體。在某些實施方案中， 減毒病毒感染宿主、在宿主中複製、並且導致病毒蛋白質嵌入到宿 主的胞質膜中的效率與野生型hSARS —樣。在其它實施方案中，減 毒病毒相對於野生型病毒其導致病毒蛋白質嵌入到宿主細胞的胞質 膜中的能力降低。在某些實施方案中，減毒hSARS病毒相對於野生 型病毒其在宿主中複製的能力降低。可使用普通技術人員熟知的任 何技術來確定病毒是否能夠感染哺乳動物細胞，是否能夠在宿主中 複製以及是否能夠導致病毒蛋白質嵌入到宿主的胞質膜中。
在某些實施方案中，本發明減毒病毒能夠感染宿主。但與野生 型hSARS相反的是，減毒hSARS不能在宿主中複製。在一個具體 實施方案中，減毒hSARS病毒能感染宿主，能導致宿主將病毒蛋白 質嵌入到其胞質膜中，但減毒病毒不能夠在宿主中複製。可使用普 通技術人員熟知的任何方法來檢測減毒hSARS病毒是否已感染宿主 以及是否已導致宿主將病毒蛋白質嵌入到其胞質膜中。
在某些實施方案中，減毒病毒感染宿主的能力與野生型病毒感 染相同宿主的能力相比降低了 。可使用普通技術人員熟知的任何技 術來確定病毒是否能夠感染宿主。
在某些實施方案中，突變(例如錯義突變)被引入到病毒的基因組 中，例如被引入到SEQ ID NO: 1、 11、 13、 15、 2471或2473序列 中，以產生具有減毒表型的病毒。突變(例如錯義突變)可被引入到 hSARS的結構基因和/或調節基因中。突變可以是增添、置換、缺失 或它們的組合。可篩選這種hSARS變體的預期功能性，如在細胞培 養物中的傳染性、複製能力、蛋白質合成能力、裝配能力以及致細
胞病變效應。在一個具體實施方案中，錯義突變是冷敏突變。在另 一實施方案中，錯義突變是熱敏突變。在另一實施方案中，錯義突 變防止病毒蛋白質的正常加工或剪切。
在其它實施方案中，缺失被引入到hSARS病毒的基因組中，導 致病毒的減毒。
在某些實施方案中，病毒的減毒是通過用不同種、不同亞群或 不同變體的病毒基因置換野生型病毒的基因來實現的。在另一方面， 病毒的減毒是通過用來源於不同種病毒的相應蛋白質的結構域置換 野生型病毒的蛋白質的一個或多個特定結構域來實現的。在某些其 它實施方案中，病毒的減毒是通過缺失野生型病毒蛋白質的一個或 多個特定結構域來實現的。
當使用活減毒疫苗時，必須考慮其安全性。所述疫苗必須不會 導致疾病。本領域熟知的能使疫苗安全的任何技術均可在本發明中 使用。除減毒技術外，也可使用其它技術。 一個非限制性實例是使 用不能被摻入到病毒體膜中的可溶性異源基因。例如，可使用單拷 貝的缺乏跨膜結構域和胞質結構域的病毒跨膜蛋白質可溶性形式。
可使用多種試驗檢測疫苗的安全性。例如，可使用蔗糖梯度試 驗和中和試驗來檢測安全性。蔗糖梯度試驗可用來確定異源蛋白質 是否被插入到病毒體中。如果異源蛋白質被插入到病毒體中，則應 檢測病毒體在適當的動物模型中導致症狀的能力，因為病毒可能已 經獲得新的、可能致病的性質。
5.4佐劑和栽體分子
hSARS相關抗原與一種或多種佐劑一起給藥。在一個實施方案 中，hSARS相關抗原與無機鹽佐劑或無機鹽凝膠佐劑一起給藥。這 種無機鹽佐劑和無機鹽凝膠佐劑包括但不限於氬氧化鋁 (ALHYDROGEL、 REHYDRAGEL)、磷酸鋁凝膠、羥基磷酸鋁 (ADJU-PHOS)和磷酸鉤。
在另一實施方案中，hSARS相關抗原與免疫刺激佐劑一起給藥。 這類佐劑包括但不限於細胞因子(例如白介素-2、白介素-7、白介素畫 12、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、幹擾素卞白介素-1(3(IL-lp)和IL-1(3肽或Sclavo肽)、含細胞因子的脂質體、三綜類糖 苷或皂苷(例如QuilA和QS-21，亦在商標STEMULON、 ISCOPREP 下出售)、胞壁醯二肽(MDP)衍生物如N-乙醯-胞壁醯-L-蘇氨醯-D-異 穀氨醯胺(蘇氨醯-MDP,在商標TERMURTIDE下出售)、GMDP、 N-乙醯-去曱胞壁醯-L-丙氨醯-D-異穀氨醯胺、N-乙醯胞壁醯-L-丙氨醯-D-異穀氨醯胺醯-L-丙氨酸-2-(l'-2'-二棕櫚醯-sn-甘油基-3-羥基磷醯氧 基)乙胺、胞壁醯三肽磷脂醯乙醇胺(MTP-PE)、未甲基化的CpG二核 苷酸和寡核苷酸如細菌DNA及其片段、LPS、 一碼醯脂質A (3D-MLA，在商標MPL下出售)和聚磷腈。
在另一實施方案中，所用的佐劑是特殊的佐劑，包括但不限於 乳液，例如弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、例如與嵌段共聚物如 L-121 (聚氧丙烯/聚氧乙烯，在商標PLURONICL-121下出售)製備的 角鯊烯或角鯊烷水包油佐劑製劑如SAF和MF59、脂質體、病毒體、 脂質體巻(cochleates)和在商標ISCOM下出售的免疫刺激複合物。
在另一實施方案中，使用微粒佐劑。微粒佐劑包括但不限於生 物可降解和生物相容性聚酯、乳酸的均聚物(PLA)及乙醇酸的均聚物 (PGA)和它們的共聚物、丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)^t粒、能自締 合成孩i粒的聚合物(泊洛沙姆顆粒)、可溶性聚合物(聚磷腈)和病毒樣 顆粒(VLP)如重組蛋白質孩i粒，例如B肝表面抗原(HbsAg)。
可以使用的又一類佐劑包括黏膜佐劑，包括但不限於來自大腸 桿菌(Esc/2mc/^ co/Z)的不耐熱腸毒素(LT)、來自霍亂弧菌(F/^'o c/w/erae)的霍亂全毒素(CT)和霍亂毒素B亞單位(CTB)、突變抹毒素 (例如LTK63和LTR72)、微粒和聚合脂質體。
在其它實施方案中，上述任何類型的佐劑可相互組合或與其它 佐劑組合使用。例如，可用來給予本發明hSARS相關抗原的組合佐
劑製劑的非限制性實例包括包含免疫刺激蛋白質、細胞因子、T細胞 和/或B細胞肽的脂質體；或帶有或不帶包埋IL-2的^L生物或含有腸 毒素的微粒。本領域熟知的其它佐劑也包括在本發明的範圍內(參見 Facc/"e D^/g j,' r/je Sw6ww" 爿咖v爐^p/ oac/2,第7章，Michael F.Powell和Mark J.Newman (編輯)，Plenum Press, New York, 1995, 其通過引用整體結合到本文中)。
佐劑的效力可通過測量誘導針對免疫原性多肽(含有hSARS多 肽表位)的抗體來確定，所述抗體由在也包含各種佐劑的疫苗中給予 這種多肽而產生。
所迷多肽可配製成中性形式或鹽形式的疫苗。藥物可接受的鹽 包括酸加成鹽(通過肽的游離氨基形成)和與無機酸(例如鹽酸或磷酸) 或有機酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、馬來酸等)形成的鹽。通過游離 羧基形成的鹽也可來源於無機鹼，例如氬氧化鈉、氬氧化鉀、氬氧 化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵，及有機鹼，例如異丙胺、三曱胺、2-乙 氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等。
本發明疫苗可以是多價疫苗或單價疫苗。多價疫苗由能指導多 於一種抗原表達的重組病毒製成。
可使用多種方法來引入本發明疫苗製品；這些方法包括但不限 於口服、皮內、肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內途徑和通過劃 痕法(例如使用分叉針刮^f皮皮膚的上層)。
被給予疫苗的患者優選是哺乳動物，最優選是人類，但也可以 是非人類動物，包括但不限於牛、馬、綿羊、豬、禽(例如雞)、山羊、 貓、狗、倉鼠、小鼠和大鼠。
5.5抗體的製備
特異性識別本發明多肽，例如但不限於包含SEQIDNO: 2、 12、 14、 2472、 2474序列的多肽及圖11 (SEQ ID NO: 17-239、 241-736 和738-U07)和圖12(SEQIDNO: 1109-1589、 1591-1964、 1966-2470)
所示的多肽，或hSARS表位的抗體或其抗原結合片段，可用來檢測、 篩選和分離本發明多肽或其片段或可能編碼其它生物類似酶的類似 序列。例如，在一個具體實施方案中，免疫特異性結合hSARS表位 的抗體或其片段可用於各種體外檢測試驗中，包括酶聯免疫吸附測 定(ELISA)、放射免疫測定、蛋白質印跡等，以在樣品例如生物材料 中檢測本發明多肽或優選hSARS，所述生物材料包括細胞、細胞培 養基(例如細菌細胞培養基、哺乳動物細胞培養基、昆蟲細胞培養基、 酵母細胞培養基等)、血液、血漿、血清、組織、痰、鼻咽抽吸物等。 對本發明多肽或hSARS的任何表位具有特異性的抗體可通過本 領域熟知的任何適合方法產生。抗目的抗原(例如保藏號為CCTCC-V200303或包含SEQ ID NO: 15核苷酸序列的hSARS病毒)的多克 隆抗體可通過本領域熟知的各種方法生產。例如，可將抗原給予各 種宿主動物，包括但不限於兔、小鼠、大鼠等，以誘導產生含有抗 原特異性多克隆抗體的抗血清。可使用多種佐劑來增強免疫應答， 取決於宿主物種，佐劑包括但不限於弗氏(完全和不完全)佐劑、無機 凝膠如氫氧化鋁、表面活性物質如溶血卵磷脂、聚醚多元醇、聚陰 離子、肽、油乳液、匙孔蜮血藍蛋白、二硝基酚和對人類具有潛在 用途的佐劑如BCG(卡介苗)和小棒桿菌。這種佐劑在本領域也是熟 知的。
單克隆抗體可使用多種本領域熟知的技術製備，包括使用雜交 瘤技術、重組體技術和噬菌體展示技術或它們的組合。例如單克隆 抗體可使用雜交瘤技術生產，包括本領域公知的雜交瘤技術和例如 在Harlow等，Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版,1988); Hammerling等，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas,第563-681頁(Elsevier, N.Y.， 1981)中講4臾 的雜交瘤技術(兩者通過引用整體結合到本文中)。本文所用術語"單 克隆抗體"不限於通過雜交瘤技術生產的抗體。術語"單克隆抗體" 指來源於單個克隆的抗體，包括任何真核克隆、原核克隆和噬菌體克隆，而不是指抗體生產的方法。
使用雜交瘤技術生產和篩選具體抗體的方法是常規的和本領域 熟知的。在非限制性實例中，小鼠可用目的抗原或表達這種抗原的 細胞免疫。 一旦檢測出免疫應答，例如在小鼠血清中檢測出對抗原 特異的抗體，則收穫小鼠脾臟，分離脾細胞。然後通過熟知的技術 將脾細胞與任何適合的骨髓瘤細胞融合。通過有限稀釋選擇和克隆 雜交瘤。然後用本領域熟知的方法檢測雜交瘤克隆中分泌能結合抗 原的抗體的細胞。通常含有高水平抗體的腹水可通過用陽性雜交瘤 克隆腹膜內接種小鼠來產生。
識別特定表位的抗體片段可通過公知技術產生。例如，Fab和 F(ab')2片段可通過使用酶例如木瓜蛋白酶(用於產生Fab片段)或胃蛋 白酶(用於產生F(ab 片段)，對免疫球蛋白分子進行蛋白酶水解來生 產。F(ab')2片段含有全部輕鏈以及重鏈的可變區、CH1區和鉸鏈區。
本發明抗體或其片段也可通過本領域熟知的任何抗體合成方法 來生產，具體的說通過化學合成法，或優選通過重組表達技術來生 產。
信息獲得(即從Genbank、文獻荻得或通過常規克隆和序列分析獲得)。 如果含有編碼特定抗體或其表位結合片段的核酸的克隆不可獲得， 但抗體分子或其表位結合片段的序列是已知的，則編碼免疫球蛋白 的核酸可通過化學法合成，或獲得自合適的來源(例如抗體cDNA文 庫，或從表達抗體的任何組織或細胞(如選擇用來表達抗體的雜交瘤) 產生的cDNA文庫或從其中分離的核酸，優選poly A+ RNA),通過 使用可與序列的3'和5'末端雜交的合成引物進行PCR擴增，或通過 使用對特定基因序列具有特異性、例如用於從編碼抗體的cDNA文 庫中鑑別cDNA克隆的寡核苷酸探針進行克隆來獲得。通過PCR產 生的擴增核酸隨後可使用本領域熟知的任何方法克隆至可複製克隆 栽體中。
一旦確定了抗體的核普酸序列，抗體的核普酸序列可使用本領
域熟知的操作核苷酸序列的方法，例如重組DNA技術、定點誘變、 PCR等(參見例如上迷Sambrook等和Ausubel等編，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY,它們通過引用整體結 合到本文中)進行操作，以通過例如在抗體的表位結合域中或者在可 增強或降低抗體生物活性的任何部分中引入胺基酸取代、缺失和/或 插入，來產生具有不同胺基酸序列的抗體。
抗體的重組表達需要構建含有編碼抗體的核苷酸序列的表達載 體。 一旦獲得編碼抗體分子或抗體的重鏈或輕鏈或其部分的核苷酸 序列，用於生產抗體分子的栽體可通過重組DNA技術，使用前面各 節討論的本領域熟知的技術來生產。可使用本領域普通技術人員熟 知的方法來構建含有抗體編碼序列和合適轉錄和翻譯控制信號的表 達栽體。這些方法包括例如體外重組DNA技術、合成技術和體內遺 傳重組。可將編碼重鏈可變區、輕鏈可變區、重鏈和輕鏈可變區、 重鏈和/或輕鏈可變區的表位結合片段、或抗體的 一個或多個互補決 定區(CDR)的核苷酸序列克隆到這種載體中進行表達。然後，如此制 備的表達栽體可被引入到合適的宿主細胞中以表達抗體。因此，本 發明包括含有多核苷酸的宿主細胞，所迷多核苷酸編碼對本發明多 肽或其片段具有特異性的抗體。
宿主細胞可用本發明的兩種表達載體共轉染，第一種栽體編碼 重鏈衍生的多肽，第二種栽體編碼輕鏈衍生的多肽。所述兩種載體 可含有相同的可選擇標記(使重鏈和輕鏈多肽的表達相等)或含有不同 的可選擇標記，以確保維持兩種質粒。另外，也可使用編碼和能夠 表達重鏈多肽和輕鏈多肽的單一栽體。在這種情況下，輕鏈應位於 重鏈的前面，以避免出現過量的有毒游離重鏈(Proudfoot， Nature, 322: 52,1986和Kohler， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 2197， 1980)。 重鏈和輕鏈的編碼序列可包含cDNA或基因組DNA。
在另一實施方案中，抗體也可使用本領域熟知的各種噬菌體展
示方法來產生。在噬菌體展示方法中，功能抗體結構域被展示在攜 帶其編碼多核苦酸序列的噬菌體顆粒的表面上。在一個具體實施方 案中，這種噬菌體可被用來展示從所有成分或組合抗體文庫(例如人
的或鼠的)表達的抗原結合域，如Fab和Fv或二硫鍵穩定的Fv。表 達結合目的抗原的抗原結合域的噬菌體可用抗原來選擇或鑑定，例 如使用標記抗原或被結合或捕捉到固體表面或珠粒的抗原。在這些 方法中使用的噬菌體通常是絲狀噬菌體，包括fd和M13。抗原結合 域被表達為與噬菌體基因III或基因VIII蛋白質融合的重組融合蛋白 質。可用來製備本發明免疫球蛋白或其片段的噬菌體展示方法的實 例包括在以下文獻中公開的方法Brinkman等，J. Immunol. Methods, 182: 41-50, 1995; Ames等，J. Immunol. Methods, 184: 177 -186, 1995; Kettleborough等,Eur. J. Immunol., 24: 952-958， 1994; Persic 等,Gene, 187: 9-18, 1997; Burton等,Advances in Immunology, 57: 191-280， 1994; PCT申請號PCT/GB91/01134; PCT
發明者F·C·梁, J·M·黎國思, J·S·M·裴偉士, 潘烈文, 軼 管, 袁國勇, 陳國雄 申請人:香港大學