低溫貯藏所選精細胞的方法

2023-05-22 13:24:26 2

專利名稱：低溫貯藏所選精細胞的方法
技術領域：
本發明涉及冷凍由於某一特殊特徵而被選出的精子的方法，也涉及冷凍的選定精子樣品和使用該樣品的方法。本發明對保存按性別選擇的精子尤其有用。
背景技術：
半個多世紀以前，人工授精作為對各種哺乳動物物種的商業飼養工具傳入美國。雖然人工授精最初被限制在相對靠近精子收集點的區域，但是低溫貯藏和精子存儲上的進步已經推動了計劃用於人工授精或體外受精的精子的廣泛分布及其商業化。
在哺乳動物精子收集、選擇、低溫貯藏、存儲和操作技術上的進一步進步已經增強了飼養者生產具有所需特徵的動物的能力。例如，基於身體特徵細微差異的哺乳動物精子選擇上的進步使得按性別類型將精子分開，也就是說選擇含X或Y的細胞，成為可能。這一技術使得飼養者可以在一個樣品中對X或Y型精子的相對百分比進行控制並因此決定後代的性別。基於性別類型或任何其它令人滿意的特徵來選擇精子的能力，為促進遺傳學的進步、提高生產效率以及在牲畜管理上獲得更大的彈性，提供了一個重要的工具。然而，這一工具的完全開發依賴於冷凍和存儲所選定精子的能力。
選擇細胞有各種方法；然而，由於精子無法進行DNA修復且由於精子的形態學，精子的選擇和接下來的處理面臨著唯一的挑戰。每個精子都有一個覆蓋其頭的頂體和一個尾，其對生育力是十分重要的並且其相對來說易受物理損傷。另外，精子的生育力隨收集與使用之間時間的增加而下降。由於大部分可用的選擇方法既有物理壓力又費時，所以選定的精子與未被選中的細胞相比通常多少都有點損傷。如果選擇技術涉及明顯的稀釋作用的話，生育力可能會被進一步降低。這暗示，該「稀釋效應」可能是由於精清中保護性成分的損失造成的。
流動細胞計量術是一種十分有效的選擇方法，其已被用於按性別類型對精子進行分類。然而，所挑選的精子易受通常在標準人工受精中或在體外受精操作中遇到的那些壓力以外的壓力的影響。尤其是流動細胞計量術非常耗時，並且，由於流動細胞計的物理限制，精子必須要被稀釋到並不最適合存儲的水平來進行分類。(通常為105-106/ml)。而且，必須對所挑選的、打算用於人工受精的精子進行濃縮，從而可以使用常規的包裝和遞送裝置。因此，增加一個濃縮步驟就已經或多或少地將受損傷的精子置於額外的物理壓力之下了。
精子的冷凍也總是會降低其生育力、運動性和/或生存能力，而且，雖然冷凍未經選擇的精子的技術已廣為所知，但是低溫貯藏選定的精子的技術還未見有述。
發明摘要本發明提供了一種低溫貯藏精子的方法，該精子由於具有某種特殊特徵而被選。因為該方法提供了從選定的精子樣品中將精子分離出來，然後向所分離的精子中加入終增容劑以產生具有所要求精子濃度的懸浮液，所以該方法尤其適用於低溫貯藏通過導致精子稀釋的方法選擇的精子。在一優選實施方案中，該方法被用於冷凍性別選擇的精子。雖然本發明的低溫貯藏方法可被用於冷凍經任意多個選擇方法選擇出的精子，但優選使用流動細胞計量術進行選擇。
本發明也提供了一種冷凍的精子樣品，該樣品因其某種特殊特徵而被選，例如性別類型。在優選實施方案中，冷凍的精子樣品包括哺乳動物的精子，例如人、牛、馬、豬、綿羊、麇鹿或野牛的精子。含有本發明冷凍精子樣品的容器也在本發明的範圍之內。
該冷凍的選定精子樣品可在各種應用中使用。具體來說，可將該樣品解凍並用於受精。因此，本發明也包括使用該冷凍的選定精子樣品進行人工受精或體外受精的方法。
本發明詳述本發明使低溫貯藏那些由於某種特殊特徵而被選出的精子成為可能，並使得選定精子樣品的存儲和/或向遠離收集點的地方的運輸更加便利。解凍後可產生可在例如人工受精(「AI」)和體外受精(「IVF」)的方法中使用的活精子。這一結果令人感到驚訝，因為精子一直被認為是脆弱的。以前的研究人員已經證明，與各種選擇方法或與低溫貯藏關聯的壓力會使精子的生育力和/或生存能力明顯下降。本發明首次論證了用選擇並隨後被冷凍的精子可以懷孕。
本發明代表了牲畜管理上的一大進步，為了在這些方法中使用而進行的精子選擇可被用來增加具有所需特性後代的生產。例如，為獲得帶有X或Y染色體的精子而進行的選擇使對後代性別的控制成為可能，其對動物生產者，例如乳牛或肉牛，是十分有利的。性別選擇也可用於飼養有價值的(例如表演或比賽的馬)或瀕危的動物。本發明所提供的、冷凍選定精子的能力將會使那些選擇方法得到廣泛使用，以例如提高牲畜的生產效率和質量。
定義術語「頂體」或「頂體帽(acrosomal cap)」是指覆蓋精子頭部前半部分並含有穿入卵子所需酶的帽。
術語「性別類型」是指精子中性染色體的類型(即X或Y染色體)。
術語「獲能」是指精子經受的、以發展其使卵受精的能力的特異性變化，例如頂體表面導致促進精子進入卵子的頂體酶釋放的酶學變化。
涉及到精子所用的術語「低溫保護劑」是指在凍融周期中保護精子、提高存活及維持受精能力的分子。
術語「稀釋效應」是指在高度稀釋時，精子運動性和/或存活力的迅速下降。
此處所用術語「選擇」是指基於有或無某種特殊性質而將樣品細分的方法(如果沒有其它上下文提示的話)。因此，「選定的精子樣品」就是以某種特殊性質而對源樣品進行選擇所獲得的樣品。因此，相對源樣品來說，選定的精子樣品是對具有該特殊特徵的精子的富集。
此處所用術語「分類」描述了一種使用螢光激活細胞分類器(FACS)進行選擇的方法。
術語「增容劑(extender)」是指趨向於保護精子存活力的任何介質。術語「增容」是指用增容劑稀釋精子。
術語「初增容劑」是指在本發明方法的分離步驟之前，用於增容精子的介質。
術語「終增容劑」是指在本發明方法的冷凍步驟之前，用於增容精子的介質。
此處所述的增容劑中的「有機物質」是指趨向於減弱冷激並保護精子繁殖力的任何有機物質。
此處所述的增容劑中的「能源」是指精子可以利用以進行細胞維護和/或運動性的任何物質或底物。
此處所用術語「重量摩爾滲透壓濃度(osmolality)」是指對水溶液中(例如增容劑)溶解的溶質顆粒的滲透壓的測定。該溶質顆粒既包括離子又包括非離子化的分子。重量摩爾滲透壓濃度以溶於1kg水的滲透活性顆粒的濃度(即滲透壓摩爾)表示。
低溫貯藏方法本發明提供了一種低溫貯藏選定的精子的方法，該方法包括以下步驟(a)獲得選定的精子樣品；(b)冷卻所說的選定精子樣品；(c)從所說的選定精子樣品中分離精子；(d)向所說的分離的精子中添加終增容劑以產生精子懸浮液；及(e)冷凍所說的精子懸浮液。獲得選定的精子樣品本發明低溫貯藏方法的第一步包括獲得先前選定的精子樣品，及將源樣品用於任何適合的選擇方法。任何物種的精子均可按本發明所述的方法進行選擇和冷凍。該方法可以用馴養動物(尤其是牲畜)的精子，也可以用野生動物(例如，瀕危物種)的精子進行。含哺乳動物精子的選定的精子樣品為優選。人精子、牛、馬、豬、綿羊、麇鹿和野牛的精子尤其優選。
通常，選定的精子樣品含有正常的、能存活的精子。為此，獲得的射精物(由此獲得精子)通常會有至少約50％、優選至少約75％形態正常的精子。在這些實施方案中，射精物中通常會有至少約40％、優選至少約60％的精子表現出漸進性運動性。
可以使用各種選擇細胞的方法從混合種群中進行選擇，包括，例如基於細胞或細胞成分與抗體、抗體片斷的結合或其它結合類型及微分染色所進行的選擇。
此處，用基於性別類型的選擇方法對本發明進行了例證，並且用於本發明的性別選擇的精子可以使用任何有利於區分X和Y型精子特徵細微差別的選擇方法得到。典型的性別選擇方法包括磁力技術(參加，例如美國專利4,276,139)、柱技術(參加，例如美國專利5,514,537)、比重技術(參見，例如美國專利3,894,529，再頒專利32350，美國專利4,092,229，4,067,965和4,155,831)。美國專利4,083,957公開了基於電學性質差異的性別選擇方法，在美國專利4,225,405，4,698,142和4,749,458中討論了基於電學和比重性質差異的選擇技術。美國專利4,009,260和4,339,434描述了基於運動性差異的選擇方法。美國專利4,511,661，4,999,283，3,687,803，4,191,749，4,448,767公開了依賴於抗體的生物化學技術，而美國專利5,021,244，5,346,990，5,439,362和5,660,997描述了基於膜蛋白差異的選擇方法。
基於用螢光染料或與螢光標記的分子(例如抗體或核酸)結合的微分染色所進行的流動細胞計量術是從混合種群中將細胞分開的優選方法。在螢光激活細胞分類法(「FACS」)中，基於螢光的放射強度將細胞分成不同的群體。可將FACS用於精子的性別選擇，因為X染色體含有的DNA稍多於Y染色體。當用螢光性DNA結合染料對精子染色時，帶X染色體的精子會比帶Y染色體的精子吸收更多的染料，並因此可通過FACS將這兩個群體分開。在美國專利4,362,246中對該方法進行了討論，並在美國專利5,135,759(頒發給Johnson)中對其進行了重要的擴充。使用高速流動細胞計(例如Cytomation公司(Ft.Collins，CO)生產的MoFlo流動細胞計，其在美國專利5,150,313，5,602,039，5,602,349和5,643,796及PCT公開WO 96/12171中有述)可增強分離效果。
用來獲得選定的精子樣品的選擇方法優選可以保持精子生存力的方法。由於精子相對的脆弱性，所以通常應對正常的流動細胞計量術進行修正以對精子進行分類。更具體地說，該流動細胞計量術包括染色、稀釋和用光進行細胞詢問。所有這些步驟都會產生可減弱精子生存力的壓力。精子對這些壓力的敏感性在不同物種之間、甚至是在物種的不同個體之間會有變化。其敏感性或是已有記載或是可通過經驗研究輕易測得，例如在實施例1-5中所描述的那些。
增強存活力的修飾在上述討論的專利公開中有述。例如，在PCT公開WO 99/33956(申請號PCT/US98/27909)中公開了一些方法，這些方法提供了進行精子分類的改良型鞘和收集器系統。而且，下述實施例1-7描述了精子染色和分類的典型方法。實施例3描述了雷射強度和染料濃度對分過類的冷凍精子解凍後運動性影響的研究。該研究表明，在分類過程中使用較低的雷射強度可提高解凍後運動性。
選定的精子樣品除含有精子外還可含有各種成分，並且經常會含有在選擇過程中加入的、以保護精子的成分。在進行FACS時，選定的精子樣品可以含有用於染色和分類的溶液成分(如鞘液和捕獲緩衝液)。
另外，選定的精子樣品通常含有增容劑或增容劑組份。例如，廣為熟知的「兩步」增容劑，其包括不含甘油的「A組份」和含有甘油的「B組份」。首先將A組份加到精子中，然後加入等體積的B組份。在這步，經常將B組份分成至少兩份並順序加入；例如，在加入第一份15分鐘後再加入第二份。
如果沒有增容劑成分存在的話，通常在從樣品中分離精子之前要向該選定的精子樣品中加入增容劑或增容劑組份。如果僅有一些增容劑成分存在，則可任選地加入另外的增容劑，從而在進行分離之前，使選定的精子樣品中包含有完整的增容劑或增容劑組份。在典型的實施方案中，將牛精子進行流動分類以產生包含有增容劑A組份的選定精子樣品(參見實施例2、3和4)。如果需要的話，可以在進行分離之前向選定的精子樣品中加入B組份(參見實施例5)。分離步驟之前的增容劑(或增容劑組份)被稱為「初增容劑」，以與在冷凍前用來增容分離精子的「終增容劑」相區別。如果選定的精子樣品是用FACS進行選擇的，該初增容劑可與用於分類的鞘液相匹配。在實施例4中對典型的匹配鞘液和增容劑進行了詳細的描述。
適於在選定精子樣品中使用的增容劑包括生理上可接受的載體。該生理上可接受的載體通常為水性的，並且在優選實施方案中包括去離子水。適合的增容劑通常含有一或多個下列附加成分低溫保護劑、保持重量摩爾滲透壓濃度和緩衝液pH的成分、防止冷激並保持精子生育能力的有機物質、與有機物質協同作用以增強精子貯藏的去垢劑、容易被精子利用的能源、保護精子免受冷激的抗氧化劑、促進精子獲能的物質及一或多種抗生素。
雖然在本發明中使用的低溫保護劑不限於那些通過特殊機制起作用的低溫保護劑，但是大部分傳統的低溫保護劑通過、至少部分通過減少胞內失水來起作用。具體說來，冷凍會伴有精子周圍介質中溶質濃度的增加。該溶質濃度的增加會將水汲出細胞，使胞內電解質的濃度增加。典型的低溫保護劑包括甘油、二甲基亞碸、乙二醇、丙二醇等等。適於在所給增容劑中使用的低溫保護劑可根據精子來源的物種而改變。例如，甘油適於在人和牛精子的低溫保護劑中使用，但是通常不用於豬或兔精子的低溫貯藏。這些偏好對許多有商業價值的精子是已知的而且其它類型精子的偏好也可容易地按經驗測定出。
本發明中使用的增容劑任選地包括幫助維持重量摩爾滲透壓濃度並提供緩衝容量的一種或多種成分。在本發明優選實施方案中，增容劑的重量摩爾滲透壓濃度與生理液體的接近。重量摩爾滲透壓濃度在約280mOsm到約320mOsm範圍內的增容劑更優選。pH也優選在生理條件所允許的範圍，在約6.5至約7.5的範圍內更優選。
有助於維持重量摩爾滲透壓濃度和pH在這些範圍內的物質是本領域所熟知的，並且可以以固體或溶液方式添加到增容劑中。可以使用含有鹽、碳水化合物或其組合物的緩衝液來達此目的。具體的例子包括檸檬酸鈉、Tris[羥甲基]氨基甲烷和TES(N-Tris[羥甲基]甲基-2-氨基乙磺酸)及穀氨酸單鈉緩衝液；牛奶；HEPES-緩衝介質；及其任何組合。在某一具體應用中，該用於幫助維持重量摩爾滲透壓濃度並提供緩衝容量的成分依增容劑其它成分的不同而變化，並且在某些情況下會依精子物種來源的不同而改變。無論如何，對在本發明中使用的該成分的選擇在本領域現有技術水平之內。
在增容劑中也可以包括保護精子免受冷激和幫助維持生育能力的一種或多種有機物質。這些物質是廣為人知的，並且有時被稱為「非穿透低溫保護劑」。本領域的技術人員可容易地測定出適於此處所述低溫貯藏方法具體應用的有機物質。例如，在增容劑中可以包括含有據信可減弱冷激影響及稀釋效應的保護性組份的有機物質(如脂蛋白、磷酸磷脂、卵磷脂)。適宜的有機物質包括二糖，三糖及其任何組合。典型的有機物質包括卵黃、卵黃抽提物、牛奶、牛奶抽提物、酪蛋白、清蛋白、卵磷脂、膽固醇及其任何組合。
增容劑也可以包括去汙劑。有報導說烷基離子型去汙劑，例如十二烷基磺酸鈉(SDS)，可與卵黃協同作用從而增強抗冷激的保護作用。用於細胞低溫貯藏的其它去汙劑也可在該增容劑中使用，並且按此處所提供的指導，用於特定應用的具體去汙劑的選擇在本領域技術水平之內。參見，例如實施例5。
該增容劑優選包括容易被精子利用的能源。在無能源時，精子可使胞內磷脂和其它細胞成分氧化。因此，在該增容劑中包含能源可保護胞內儲能和細胞成分。如本領域所熟知的，雖然任何常規能源都可在增容劑中使用，但是糖，尤其是單糖，提供了一種便利的能源。在該增容劑中使用的典型的單糖包括葡萄糖、果糖和/或甘露糖。
在該增容劑中任選地包括一或多種抗氧化劑以提供額外的抗冷激保護。典型的抗氧化劑包括丁基羥基甲苯(BHT)、其衍生物等等。然而，在細胞低溫貯藏中使用的其它抗氧化劑也可在該增容劑中使用，並且按此處所提供的指導，用於特定應用的具體抗氧化劑的選擇在本領域技術水平之內。
增容劑也包含促進精子獲能的物質。許多獲能促進劑是本領域已知的，並且任何一個都可在增容劑中使用。其例子包括酶，例如α澱粉酶、β澱粉酶、β葡萄糖醛酸酶，如果需要的話其可組合使用。
最後，既然一定量的細菌生長會威脅精子的生存力並會增加人工受精或體外受精程序中宿主感染的危險，因此包括抗生素的增容劑為優選。也可在增容劑中使用任何用於細胞低溫貯藏的抗生素。要根據獲得精子(包括獲得並對精子樣品進行操作)的物種的不同選擇合適的抗生素，並且該抗生素要靶標於特定的微生物。典型的抗生素包括太樂菌素、慶大黴素、林古黴素、大觀黴素、林古-大觀黴素(林古黴素和大觀黴素的組合物)、青黴素、鏈黴素和羧噻吩青黴素(ticarcillin)，其可單獨使用也可組合使用。無論如何，本領域技術人員可容易地測定出適合在增容劑中使用的其它抗生素。
下面及在實施例中對典型的增容劑進行了更詳細的討論。
選定精子樣品中的精子濃度通常低於源樣品中的精子濃度，並且如上所示，當使用FACS時，稀釋效應是明顯的。典型的、基於性別類型的分類可以產生含有6×105精子細胞/ml捕獲緩衝液的樣品。既然如此低的濃度對於保存來說並不是最佳的(至少對於大部分所測的物種是這樣)，本發明的低溫貯藏方法通常會將該選定的精子樣品進行濃縮。冷卻選定的精子樣品本低溫貯藏方法的第二步是將選定精子樣品冷卻，通常通過以受控速率減溫來進行。冷卻的太快可能會引起冷激，其可導致膜完整性和細胞功能的喪失。冷激影響的嚴重程度隨物種的不同而不同，並且隨一些因素例如冷卻速率和溫度範圍的不同而不同。在適宜的受控冷卻條件下，精子能夠適應熱的影響。實施例2(其它實施例中也有)，對冷卻牛精子的條件進行了描述，而且測定冷卻其它物種精子適宜條件的方法也在本領域技術範圍之內。
在本發明的優選實施方案中，通常將選定的精子樣品從攝氏22度冷卻到攝氏5度，並且冷卻通常要持續約60分鐘到約24小時，優選約90分鐘到約240分鐘。冷卻可以常規方法進行，包括簡單地將選定的精子樣品放在攝氏5度的環境中。從選定精子樣品中分離精子細胞在對選定精子樣品進行初始增容之後，使用任何有效的、溫和分離方法將精子從該樣品中分離出來，該分離方法應提供至少約50％的精子回收率，更優選精子回收率約75％到約90％，最優選精子回收率約80％到約90％。在進行該分離步驟期間，所冷卻的精子通常應保持其冷卻狀態，即，在約攝氏1度到約攝氏8度之間，且優選接近攝氏4度或5度。
任何適合從懸浮液中回收細胞的方法都可用於分離精子，包括例如過濾、沉澱和離心。在一典型的優選實施方案中，選定的精子樣品被分裝至50ml的管子裡，每管體積不超過27ml，優選約20到約27ml之間。在約4攝氏度、約850xg離心約20分鐘。此離心步驟優選提供至少約50％到約90％的精子回收率，更優選約60％到約90％的精子回收率，最優選約70％到約90％的精子回收率。分離之後，除去上清，於4攝氏度溫度和振蕩或反覆抽吸使沉澱懸浮。然後通常要對該精子的濃度進行測定(例如，使用血細胞計數器)。分離的精子細胞的最終增容在分離之後，如果需要的話，可將精子混在一起並用終增容劑進行增容，使其達到適於冷凍的濃度。在終增容之後、冷凍之前的精子濃度範圍優選從約1×106/ml到約300×106/ml，更優選從約10×106/ml到約50×106/ml，最優選從約10×106/ml到約20×106/ml。
上述對於初增容劑的描述也適用於終增容劑，其可以與初增容劑相同也可以與其不同。在具體的實施方案中，用終增容劑增容的精子樣品的成分本質上與添加初增容劑之後的精子樣品的成分相似(如果不是與其相同的話)。
在本發明一優選實施方案中使用的增容劑是卵黃-Tris。在添加該增容劑之後，該精子懸浮液中含有甘油(低溫保護劑)；檸檬酸和Tris[羥甲基]氨基甲烷(緩衝液)；卵黃(有機物質)；果糖(能源)；太樂菌素、慶大黴素和林古-大觀黴素(抗生素)。在向分離的精子中加入該終增容劑以後，這些成分的典型的近似濃度為卵黃-Tris增容劑的成分甘油4-8％vol/vol檸檬酸55-75mMTris[羥甲基]氨基甲烷190-210mM卵黃5-25％vol/vol果糖45-65mM太樂菌素25-100μg/ml慶大黴素200-300μg/ml林古-大觀黴素100-400μg/ml**100-400μg/mll林古黴素和100-400μg/ml大觀黴素在該實施方案的一個尤其適合冷凍牛精子的變異方案中，在向分離的精子中加入該終增容劑之後的這些成分在無離子水中的濃度為約6％(vol/vol)的甘油、約65mM的檸檬酸、約200mM的Tris[羥甲基]氨基甲烷、約20％(vol/vol)的卵黃、約56mM的果糖、約50μg/ml的太樂菌素、約250μg/ml的慶大黴素和約150/300μg/ml的林古-大觀黴素(即150μg/ml林古黴素和300μg/ml大觀黴素)。
在另一實施方案中使用的是卵黃-檸檬酸鹽增容劑。在添加該增容劑之後，該精子懸浮液含有甘油(低溫保護劑)；檸檬酸鈉(緩衝液)；卵黃(有機物質)；太樂菌素、慶大黴素和林古-大觀黴素(抗生素)。在向分離的精子中加入該終增容劑以後，這些成分的典型的近似濃度為卵黃-檸檬酸鹽增容劑的成分甘油4-8％vol/vol檸檬酸鈉60-80mM卵黃5-25％vol/vol太樂菌素25-100μg/ml慶大黴素200-300μg/ml林古-大觀黴素100-400μg/ml**100-400μg/ml林古黴素和100-400μg/ml大觀黴素用於冷凍牛精子的典型的優選濃度為約7％(vol/vol)甘油、約72mM檸檬酸鈉、約20％(vol/vol)卵黃、約50μg/ml太樂菌素、約250μg/ml慶大黴素和約250/300μg/ml林古-大觀黴素。
在另一實施方案中使用的是卵黃-TES-Tris(「EY TEST」)增容劑。在添加該增容劑之後，該精子懸浮液含有甘油(低溫保護劑)；卵黃和熱乳，例如含1.25％果糖和10％甘油的均質乳(有機物質)；太樂菌素、慶大黴素和林古-大觀黴素(抗生素)。在向分離的精子中加入該終增容劑以後，這些成分的典型的近似濃度為卵黃TES-Tris增容劑的成分甘油3-7％vol/volTris[羥甲基-甲基]-2-氨基乙磺酸140-170mMTris[羥甲基]氨基甲烷60-80mM卵黃5-25％vol/vol果糖5-12mM太樂菌素50-150μg/ml慶大黴素400-600μg/ml林古-大觀黴素200-700μg/ml*
*200-700μg/ml林古黴素和200-700μg/ml大觀黴素用於冷凍牛精子的典型的優選濃度為約5％(vol/vol)甘油、約158mM Tris[羥甲基-甲基]-2-氨基乙磺酸、約72mM Tris[羥甲基]氨基甲烷、約20％(vol/vol)卵黃、約8mM果糖、約100μg/ml太樂菌素、約500μg/ml慶大黴素和約300/600μg/ml林古-大觀黴素。
在本發明再一實施方案中使用的是乳增容劑。在添加該增容劑之後，該精子懸浮液含有甘油(低溫保護劑)；熱的均質乳(有機物質)；果糖(能源)、太樂菌素、慶大黴素和林古-大觀黴素(抗生素)。在向分離的精子中加入該終增容劑以後，這些成分的典型的近似濃度為乳增容劑的成分均質乳90％(vol/vol)甘油3-7％(vol/vol)果糖1.25％(wt/vol)太樂菌素50μg/ml慶大黴素250μg/ml林古-大觀黴素250/300μg/ml**250/300μg/ml林古黴素和250/300μg/ml大觀黴素用於冷凍牛精子的典型的優選濃度為約90％乳、約10％(vol/vol)甘油、約1.25％果糖(wt/vol)、約50μg/ml太樂菌素、約250μg/ml慶大黴素和約250/300μg/ml林古-大觀黴素。
也可使用其它標準用於冷凍精子的增容劑作為冷凍選定精子的終增容劑。對各種最適於在冷凍各種物種精子中使用的增容劑已有敘述並且許多是市售的。用於馬精子的冷凍增容劑通常由乳、卵黃、各種糖、電解液和低溫保護劑組成。典型的冷凍增容劑如E.L.，等，冷卻並冷凍種馬精液，動物繁殖及生物技術實驗室，第69號通報，第8章，「精液增容劑」，49-51頁，(1999年7月)。精子的平衡及冷凍精子樣品的增容產生了精子懸浮液，然後將其轉入容器中進行冷凍。如果打算將該精子用於受精，則將此細胞分成足夠進行受精的單個小份劑量。所需的劑量根據物種的不同可能會有相當大的變化，並且或是熟知的(例如對於牛和馬來說)或是可容易地測得。對於性別選擇的牛精子來說，便利劑量的範圍約為1.0×106精子到約3.0×106精子。
任何合適的容器都可以用於冷凍，包括，例如一次性針劑、小瓶和吸管。打算用於AI的精子通常在與受精槍一起設計使用的吸管中進行冷凍(例如，0.25ml或0.50ml的吸管)。優選地，將增容劑丸劑吸入吸管並按如下順序空氣、精子、空氣和增容劑進行，從而使精子被隔在空氣兩邊，使在吸管兩端的精子與增容劑丸劑分開。
在進行冷凍之前，通常可以將精子在約5℃進行平衡。優選平衡約1小時到約18小時，約3小時到約18小時更優選，最優選為約3小時到約6小時之間(參見實施例2)。
在平衡之後，如果冷凍速率不是特別快的化(即不超過約0.5℃/分鐘)，任何標準的冷凍方法都可以使用。其冷凍速率優選約0.5℃/分鐘。在一典型的優選實施方案中，精子被放在靜態液氮蒸氣中，並在三個不同的階段(每個階段約10分鐘)進行冷凍。在冷凍的第一階段，精子以約40℃/分鐘到約65℃/分鐘的速率從約5℃冷卻到約-15℃。在冷凍的第二階段，精子以約25℃/分鐘到約35℃/分鐘的速率從約-15℃冷卻到約-60℃。在第三階段，將精子放進約-100℃的液氮中。
選定的精子樣品除了冷凍方法以外，本發明還提供了一種冷凍的精子樣品，該樣品含有從源樣品中選出的具有某種特殊特徵的精子。該精子可來自任何物種，包括任何上述作為對冷凍方法的參考所討論的那些物種。本發明包括用任何適合的方法(如上述的那些方法)選擇出的具有任何特徵的冷凍精子。優選的實施方案包括冷凍的性別選擇的人、牛、馬、豬、綿羊、麋鹿或野牛的精子。性別選擇優選使用上述的流動細胞計量術進行。
本發明還包括含有本發明所述的冷凍精子樣品的容器。該容器可由任何不與該冷凍精子樣品發生反應的材料製成，並且可以有任何有利於該樣品在計劃應用中使用的形狀和其它性質。對於打算用於AI的樣品來說，容器可為與受精槍一起設計使用的吸管(例如0.25ml或0.5ml吸管)。該容器在計劃進行保存的溫度(通常為攝氏-80度以下)下用任何適宜進行樣品貯藏的方式密封。例如，0.25ml吸管可以用PVC粉末超聲密封，或用棉線-乙烯聚合物插件和/或不鏽鋼球(BB)來密封。
因為本發明的冷凍精子樣品在使用前通常要先解凍，所用本發明也提供了一種解凍的(先前是冷凍著的)選定精子樣品及含有該解凍樣品的容器。
選定精子樣品的使用方法本發明冷凍的選定精子樣品適於以任何使用精子的方法進行使用。該樣品可以以任何便利的受精方法(例如人工受精或體外受精)進行解凍並使用。解凍以與冷凍的、未經選擇的精子一樣的方式進行。簡單地說，將含有冷凍精子的吸管放在水浴(保持在約35℃到約37℃)中約20到約30秒。解凍之後，按標準步驟進行精液的沉積(例如受精)，小心操作以保護精子免受環境波動的影響。
實施例實施例1
稀釋作用對精子的影響目的測定未冷凍的、未分類的、但高度稀釋的精子的精子濃度對精子運動性的影響。A.稀釋作用對未洗滌精子的影響1.源樣品的收集使用如Schenk J.，Proc 17th NAAB，p.48-58(1998)和Saacke RG，Proc NAAB Tech Conf AI Reprod.4122-27(1972)描述的人造陰道，以常規收集方法從公牛身上收集精子。所有被使用的射精物，其漸進性運動性精子都大於50％並且形態正常的精子都大於75％。如在Shin S.，Proc NAAB Tech Conf AI Reprod.1133-38(1986)中所述，在15分鐘的收集過程中，抗生素被加到原始的射精物中，並使用分光光度計對精子濃度進行了測定。
2.方法使用用20％卵黃(vol/vol)(溶於72mM檸檬酸鈉、50Tg/ml太樂菌素、250Tg/ml慶大黴素和250/300Tg/ml林古-大觀黴素)製備的卵黃-檸檬酸增容劑(EYC)將來自4頭公牛的精子稀釋到1.25、2.5、5、10、15和20×106/ml。每個樣品被製成雙份(2管/稀釋/公牛)，每管總體積8ml。將所有的樣品在22℃溫育60分鐘，然後使用擺轉頭離心法(Eppendorf，Model#581 OR)於600xg離心10分鐘以濃縮精子。離心之後，保留兩套管子中的一套的上清；通過用5-ml血清學移液器輕柔地重複吹吸，將精子重懸於相同的介質中並保持原先的濃度。(第二套管子用於實施例1B。)然後以0.2℃/分鐘的速度將精子樣品冷卻到5℃，歷時90多分鐘。這些精子被稱為「未洗滌的精子」。所有精子都在收集後於5℃保溫24小時或48小時。
3.運動性評估保溫之後，在測定運動性之前，使用乾燥模塊孵育器將樣品加熱10分鐘至37℃。為進行此項實驗，對每個樣品的漸近性運動精子百分比的單盲估算進行測定。由單一觀測者(x200，相差顯微鏡)對漸進性精子運動性的每個亞型進行主觀測定。另一個人以隨機方式製備此顯微鏡切片，從而使觀測者無法知道處理的情況。
4.統計分析使用公牛和初始稀釋濃度這兩個因素，通過離散分析對數據進行分析(SAS研究所，Cary，North Carolina)。分別對每個溫育時間進行分析。使用(對數)線性差異法對稀釋走向進行測試。
5.結果對兩個溫育時間而言，未洗滌精子的數據(表1)都表現出(對數)線性相關性(P＜0.01)。運動精子的百分比隨精子濃度(1.25×106/ml增加到10×106/ml)的增加而增加，但隨後有些輕微的偏差。對24小時的溫育而言，三方期是明顯的(P＜0.05)；對48小時溫育而言，其稍有明顯(P＜0.1)。對這兩個時間而言，公牛的影響都有(P＜0.01)。
表1.冷卻到5℃以後，冷卻對未洗滌精子運動性(％)的影響稀釋 5℃溫育(106/ml)24ha48hb1.25 18c0c2.538c，d6c，d5.056d31d，e10.0 61d42e15.0 55d44e20.0 58d41eS.E.f5.6 6.4a(對數)線性的(P＜0.01)和三次方的影響(P＜0.05)。b(對數)線性的(P＜0.01)和三次方的影響(P＜0.1)。c，d，e無共同上標的欄內的平均值不同(P＜0.05)。 (SAS Institute，Cary，NC，USA)B.稀釋對洗滌精子的影響1.源樣品的收集。在本實驗中使用了在實施例1A中製備的含有樣品的第二套管子。
2.方法。如在實施例1A中所示，該精子被稀釋、溫育並通過離心對其進行濃縮。離心之後，從每個管子裡吸出7.1ml的上清，除去大部分的精清並將精子留在一個900-μl的移液器中。用EYC(參見實施例1A)將該精子稀釋以製成10×106/ml或20×106/ml的精子懸液。然後，如實施例1A中所示，將該樣品冷卻90分鐘以上至5℃。
3.運動性評價。如實施例1A中所示，將該樣品加熱並進行漸進性運動性評估。
4.統計分析。如實施例1A中所示對數據進行分析。此外，實施例1B中的數據是對在5℃溫育濃縮的分析。
5.結果。當在24小時以後對精子進行評估時，洗滌精子的數據(表2)沒有表現出明顯的處理效果。然而，在於5℃保存48小時以後，公牛、初始稀釋、溫育濃度和公牛都受溫育的影響(P＜0.05)。在濃度為20×106/ml比在10×106/ml時有更多的精子保持運動性(31％對20％；P＜0.05)。初始稀釋度為1.25、2.5和5×106精子/ml的漸進性運動性比初始稀釋度為10×106精子/ml的要低(P＜0.05)，主影響平均值分別為19、20、27和37％運動精子。
表2.洗滌、稀釋、濃縮和冷卻對漸進性精子運動性的累積效果(％)37℃預溫育1h期間的 5℃保存一精子濃度與時間精子濃度(106/ml) 24h 48ha20×106/ml 10×106/ml 20×106/ml 10×106/ml1.25 45 4924 152.5 51 4029 115.0 54 5432 2110.0 51 5040 3415.0 60 4120.0 55 40a在保存48h以後，濃縮到20×106精子/ml優於(P＜0.05)濃縮到10×106精子/ml。而且，初始稀釋到10×106優於較低的稀釋度(P＜0.05)。溫育24小時的合併標準差 是4.0，48小時的值是2.8。b明顯的(對數)線性趨勢(P＜0.06)。C.結論無論精清除去與否，高的精子稀釋度和冷卻均會導致運動性精子百分比的大量減少。然而，在貯藏之前，通過將稀釋的精子濃縮到10×106/ml及更濃，到20×106/ml，其稀釋效應會被大大消弱。來自某些牛的精子比來自其它牛的精子對稀釋的耐受性更好；然而，牛的差異是典型的。極端稀釋的精子可能會在分類過程中受到損傷，部分原因是由於去除了精清中的保護成分。
實施例2在對已分過類的精子冷凍之前的平衡時間的影響目標在冷凍之前，評估平衡時間(3、6和18小時，5℃)對流動分類的精子的影響。
下面的實驗使用相同的公牛進行了完全複製；1.源樣品的收集。如實施例1A所述，收集並製備4頭公牛的精子。
2.方法。
a)為分類而進行的染色和準備。
i)染色貯液的製備用去離子水製備8.89mM的Hoechst 33342(bis-Benzimide H-33342；#190305，ICN生物醫藥公司Aurora，OH)貯液。
ii)精子染色過程以修正的TALP緩衝液(表3)將精子稀釋至400×106精子/ml。稀釋之後，將Hoechst 33342染料以224μM的濃度加到該精子懸浮液中。在將染色劑加到精子懸浮液中之後，將樣品於34℃溫育60分鐘。溫育之後，用含2.67％清卵黃和0.002％食用染料(FDC#40)(其可將Hoechst 33342的螢光淬合在細胞膜有損傷的精子上)的TALP將精子稀釋到100×106/ml，從而使它們可以在分類過程出被排除在外。就在進行流動分類之前，將樣品以單位重力通過40-μm尼龍膜進行過濾以除去細胞碎片和結塊的精子。
b)分類。使用兩線的氬雷射於351和364nm及150mW對Hoechst 33342染料進行激發。所使用的流動細胞計/細胞分類器為SXMoFlo(Cytomation，Inc.，Fort Collins，CO，USA)，於50psi進行操作。使用了Tris-鹼鞘液，其含Tris(羥甲基)氨基甲烷(Tris；197.0mM；#T-1503，Sigma化學公司，St.Louis，MO，USA)、檸檬酸一水合物(55.4mM；#C-7129，Sigma化學公司，St.Louis，MO，USA)和果糖(47.5mM；#F-0127，Sigma化學公司St.Louis，MO，USA)。同時也向該Tris-鹼鞘液中加入由0.58g/L青黴素和0.05g/L鏈黴素硫酸鹽組成的基線抗生素。
通過稱作「批量分類」的方法對精子進行分類，其可以對大量精子進行快速的富集從而使得大量的樣品可以在合理的時間內得到處理。精子在標準操作條件下通過流動細胞劑，唯一例外是將所有含有活精子的液滴收集在一個單個的管子裡而不是基於某特定特徵(例如按性別類型分類)將其分成兩個管子。精子是基於其生存力進行分類的；因此，通過批量分類，質膜損傷的精子就被排除在外了。
在分類過程中，將已染色的精子保持在22±1℃。將批量分類的精子收集在含2ml 20％卵黃-Tris增容劑(用溶於去離子水的含200mM Tris、65mM檸檬酸、56mM果糖、50Tg/ml太樂菌素、250Tg/ml慶大黴素和150/300Tg/ml林古-大觀黴素的20％卵黃(vol/vol)製成)的50ml塑料管裡。該卵黃-Tris增容劑被稱作「Tris-A組份」，以表示在該步驟中沒有甘油。收集在管子裡的精子含有12ml大約6×106的精子。隨後，將該精子於22℃溫育1到3小時以模擬基於性別類型的分類條件。
c)冷凍準備。溫育之後，將該分過類的精子冷卻70分鐘以上至5℃。冷卻之後，將兩管合在一起，並放入冰箱內，使用擺轉頭離心法於5℃、850xg離心20分鐘。在去除上清以後，繼續於5℃進行處理，向150μl的精子沉澱中添加約150μl的Tris-A組份增容劑以使精子濃度接近40×106/ml。每頭公牛的精子被合在一起，並立即以等體積的含12％(v/v)甘油的卵黃-Tris增容劑(「Tris-B組份」)進行稀釋。以15分鐘的間隔向該精子懸浮液中加入兩倍體積的此Tris-B組份以調節精子終濃度至20×106/ml。該含精子的完全卵黃-Tris增容劑的最終甘油濃度為6％(v/v)。
d)平衡與冷凍。然後將增容好的精子裝進0.25ml的聚氯乙烯吸管中，以常規方法在靜態液氮蒸氣中按架冷凍。在5℃經過總平衡時間分別為3、6和18小時的平衡以後，將每頭(共4頭)公牛的那兩個吸管進行冷凍。
3.解凍後運動性的評估。吸管於37℃水浴解凍30秒。在將樣品於37℃進行0、1和2小時的解凍後溫育之後，進行了漸進性運動性的盲性評估。兩個觀測者中每個人都對兩管精液的每一管進行了漸進性精子運動性的評估。這四個對每個實驗單位所進行的盲性評估為二次抽樣。
4.統計分析。統計學上，將該二次抽樣樣品作為對主要事件最小平方ANOVA的次要事件來分析，以分析任意觀測者與觀測者X之間處理相互作用的影響。N是指實驗單位的數目，而不是指二次抽樣的樣品；基於這4個二次抽樣樣品的ANOVA和實驗單位數目的誤差均方的平均值算出標準誤差；最小平方均值也同時給出。
通過對每個溫育時間分別進行ANOVA對處理效果進行評估。該模型包括公牛為隨機影響，平衡時間和觀測者為固定影響；該次要事件由觀測者期限和相關的相互作用組成。
5.結果。基於漸進性運動精子的百分比，對0和1小時(P＜0.01)但不包括2小時的解凍後溫育而言，3或6小時的平衡時間優於18小時的(表4)。對溫育時間為1和2小時(但不包括0小時)而言，公牛的影響是明顯的(P＜0.05)。對任意反應而言，公牛不受平衡時間相互作用的影響(P＜0.1)，觀測者也不受其影響。
表3.修正的TALP緩衝液成分 濃度NaCl95.0mMKCl 3.0mMNaHPO40.3mMNaHCO310.0mMMgCl2·6H2O 0.4mM丙酮酸鈉2.0mM葡萄糖 5.0mM乳酸鈉 25.0mMHEPESa40.0mM牛血清清蛋白b3.0mg/ml硫酸慶大黴素30.0μg/mla#H3375，Sigma化學公司，聖路易斯，MO，美國b#US70195，組份V；Amersham/Life Science，Cleveland，OH，USA表4.預冷凍平衡期對解凍後漸進性運動性的影響(％)平衡解凍後溫育(37℃)(5℃) 0h 1h 2h3h41a36a，b166h41a37a1818h 35b31b12S.E.c1.5 0.8 2.0a，b在這些欄內，無共同上標的平均值不同(P＜0.05)，Tukey′sHSD.
c合併的標準誤差 6.結論。此結果表明，在解凍後精子運動性方面，於5℃進行的平衡，對總平衡時間為3小時和6小時之間而言並無差異，但是在冷凍之前、於5℃進行18小時的平衡則在精子的運動性方面有明顯的下降。此3到6小時的時間範圍可以允許將2個連續的、用來冷凍精子的3小時分類批次合在一起進行，而不會使解凍後的運動性下降。
既然公牛受平衡時間相互作用的影響並不明顯，那麼對僅使用了4頭公牛而言，3到6小時的平衡是足夠的。對於少數公牛來說，最優的平衡期為＞6小時。
實施例3染色濃度和雷射功率對已分類的精子的影響目的評估Hoechst 33342染料濃度與雷射強度組合在一起對流動分類精子的影響。
1.源樣品收集。如實施例1A所述，收集6頭公牛的精子。
2.方法。
a)實驗設計。在2對2加對照的設計中使用一個射精物(2頭公牛)和在不同日子的兩個射精物(4頭公牛)。
b)染色和分類。按實施例2中所述，為進行分類和為對精子進行分類而做的染色準備，只是將Hoechst 33342染料以149TM或224TM的終濃度加到精子懸浮液中；並用雷射(以入射功率為100mW或150mW進行)對精子進行批量分類。如實施例2中所述，將批量分類的精子收集在50ml的塑料管裡。對每頭公牛收集4管大約含15×106總精子/管的管子，歷時1小時以上。將該分過類的精子於22℃溫育1小時以模擬較長的分類時間。
c)冷凍準備。如實施例2所述，在溫育之後將精子冷卻。然後將該精子於5℃、850xg離心20分鐘進行濃縮。在除去上清之後，於5℃向每150μl精子沉澱中加入150μl Tris-A組份增容劑。通過溫和的重複吹吸使所有的精子沉澱懸浮起來，並將每頭公牛的精子合在一起。如實施例2中所述，逐步加入Tris B組份增容劑。在含6％甘油的Tris增容劑中，對每頭公牛製備20×106精子/ml的未染色的、未經分離的對照，並在製備批量分類的精子時將其冷卻到5℃。
d)平衡與冷凍。按實施例2中所述，將對照和已分類的精子分裝至0.25ml的聚氯乙烯吸管中，並於5℃平衡3小時，然後按常規進行冷凍。
3.解凍後運動性的評估。按實施例2中所述，將吸管解凍然後進行評估。
4.統計分析。實施例2中已對統計分析進行了一般的描述。具體來說，通過ANOVA對處理效果進行評測。該模型包括染料濃度、雷射強度和公牛為主要事件，觀測者和相關的相互作用為次要事件。公牛被認為是隨機影響，而其它因素被認為是固定影響。
5.結果。公牛對解凍後當時的(P＜0.1)和於37℃溫育1小時和2小時以後(P＜0.05)的漸進性運動精子的影響是明顯的。對任何溫育時間而言，染料濃度或公牛對精子的運動性都不受染料濃度的影響。由於公牛被認為是隨機影響，所以對溫育0小時而言，150mW的雷射功率比100mW的雷射功率所造成的精子解凍後運動性要低(P＜0.1)，但對其它溫育時間則不是這樣(表5)。如果公牛被認為是固定影響，則對所有3個溫育時間而言，150mW的雷射功率比100mW的雷射功率所造成的精子解凍後運動性都要低(P＜0.05)。對溫育1小時而言，公牛對精子的運動性受雷射功率的影響(P＜0.05)，但對溫育0小時或2小時而言則不是這樣。而且，對溫育0和1小時而言，雷射功率越高，導致的精子運動性比對照低的越多(表5)。對溫育1小時而言，觀測者的影響是明顯的，但對溫育0小時或2小時則不是這樣。觀測者不受處理相互作用的影響(P＞0.1)。表5.雷射強度和染料濃度對解凍後運動性的影響(％)。主要影響均值 37℃溫育0h 1h 2h對照 49 44 33染料濃度149μM 41 39 30224μM 42 39 30雷射強度100mW 46 42 33150mW 38a35b27S.E.c2.2 1.2 1.3a顯著的主影響(P＜0.1)及與對照不同(P＜0.05)。
b與對照不同(P＜0.05)。
c合併標準誤差， 6.結論。通過染色和分類，解凍後的漸進性運動精子的百分比減少了。較高的雷射強度比較低的雷射強度造成的損傷要大。染料濃度對解凍後精子的運動性沒有影響。因此，與精子結合的Hoechst33342染料的激發作用在較低的雷射強度下受損較少，並且在較高的染料濃度下對精子染色並不會對解凍後的運動性有太大的影響。所觀測到的損害大概是由於精子運動性儀器造成的。
實施例4分類前染色方法的評估及用於精子低溫貯藏的增容劑的選擇目的(1)評估精子的三種分類前處理；及(2)評估用於低溫貯藏流動分類精子的鞘液和增容劑組合物。
下面的實驗進行了全部複製1.源樣品的收集。按實施例1A中所述，收集並製備4頭公牛的精子。
2.方法。
a)實驗設計。設計了一個3(分類前處理)對3(增容劑)對2(鞘液)對4(公牛)對2(觀測者)的析因試驗以測定分類前最好的保持精子的方法，並且對三種用於低溫貯藏分類的精子的增容劑進行評估。
b)樣品製備與染色。按以下方法對從每頭公牛(共4頭)新收集的精子進行處理(1)在進行批量分類之前，在修正的TALP中將其稀釋到400×106/ml(參見實施例2，表3)並於34℃染色1小時(「稀釋-0h」)；(2)在稀釋、染色和分類之前，於22℃淨(neat)溫育3小時(「淨-3h」)；或(3)在進行批量分類之前，稀釋並染色(「稀釋-0h」)，然後於22℃溫育3小時(「稀釋-3h」)。
c增容劑。對下列冷凍增容劑進行比較含7％甘油的EYC(參見實施例1)、含6％甘油的卵黃-Tris(參見實施例2)和含5％甘油的卵黃-TES-Tris(TEST)。EYC「A組份」是指不含甘油的EYC增容劑，EYC「B組份」是指含有雙倍最終所需甘油濃度(即14％)的EYC增容劑。因此，當EYC的A組份和B組份以等體積混合時，其最終的EYC增容劑將含有7％的甘油。Tris A和B組份以相似的方法命名，並已於實施例2中有述。TEST增容劑以含有5％甘油的完全增容劑製得；因此，對TEST來說，沒有「A」和「B」組份一說。
d)鞘液。鞘液或是98.6mM的檸檬酸鈉二水合物(#S279-3，Fisher Scientific，Fair Lawn，NJ)或是如實施例2中所述的Tris。兩種鞘液的pH都被調到了6.8；重量摩爾滲透壓濃度約為270到280mOsm/kg。使用Tris鞘液收集以後會在卵黃-Tris和TEST冷凍增容劑中進行增容的精子。使用含有98.6mM檸檬酸鈉二水合物的鞘液收集以後會在EYC冷凍增容劑增容的精子。
e)分類。按實施例2中所述，使用150mW的入射雷射功率對每個分類處理、鞘液和增容劑的每一個組合來說，大約58×106精子被批量分類。對每一分類而言，收集精子耗時約1小時以上。分類之後，將該樣品於22℃溫育2小時以模擬3小時的分類過程。
f)冷凍準備。溫育之後，按實施例2中所述，對精子進行冷卻。冷卻之後，於5℃、850xg離心20分鐘。每個樣品的總體積約28ml，並被裝在50ml的塑料管裡。
在除去上清之後，將精子拿回5℃的冷室中進行增容。通過將131μl精子懸浮在69μl EYC的A組份、卵黃-Tris的A組份或TEST增容劑中使樣品增容至40×106/ml。添加匹配的、含增容劑的甘油(即EYC的B組份、Tris的B組份)或TEST將懸浮液立即調至20×106精子/ml。如實施例2中所述，將增容劑的B組份以15分鐘的間隔逐步(2X)加到它們各自的樣品中。TEST按與EYC和Tris增容劑的B組份一樣的方式逐步添加到精子中。
g)平衡與冷凍。將精子分裝至0.25ml的聚氯乙烯吸管中，於5℃平衡3小時，然後在靜態液氮蒸氣中冷凍。
3.解凍後運動性的評估。精子的解凍和解凍後評估按實施例2中描述的方法進行。
4.統計分析。實施例2中已對統計分析進行了一般的描述。具體來說，對每個解凍後溫育時間來說，通過對變量的單獨分析評估處理效果。主要事件包括分類前處理、增容劑和公牛；次要事件由觀測者和關聯的相互作用組成。公牛被認為是隨機影響，而其它因素被認為是固定影響。整個試驗被重複兩次。用Tukey′s HSD檢測將平均值分開。
5.結果。對每個解凍後溫育時間而言，批量分類精子的解凍後漸進性運動性受增容劑和公牛的影響(P＜0.05)，並且對0小時溫育而言受分類前程序的影響(表6)。對鞘液來說沒有差別(P＞0.05)。對解凍後溫育0小時而言，在冷凍和解凍之後，使用淨-3h處理比使用其它兩種分類前染色處理會得到更多的運動性精子(P＜0.05；表6)。然而，在將公牛考慮為隨機影響之時，精子解凍後溫育1或2個小時之後，分類前程序並沒有產生統計學上明顯的影響。重要的是，對這兩個溫育時間而言，分類前處理明顯地受公牛相互作用的影響(P＜0.05)。而且，如果公牛被認為是固定影響的話，那麼對於所有解凍後溫育時間而言，都要明顯地受分類前處理的影響。
對解凍後立即(0小時)進行而言，TEST是最好的增容劑，但對在37℃溫育1或2小時而言，Tris是最好的增容劑。重要的是，對任何反應而言，分類前都不受增容劑相互作用的影響。對所有溫育時間而言，觀測者都有影響(P＜0.01)，但觀測者不受處理相互作用的影響。有一頭公牛在所有的3個溫育時間上都受增容劑相互作用的影響(P＜0.05)。
表6.分類前處理和冷凍增容劑對解凍後漸進性運動性的主要影響(％)分類前程序 37℃溫育增容劑 0h 1h 2h稀釋-0h 均值39 32 22淨-3h 均值43b 36 25稀釋-3h 均值38a 31 19均值TEST44c33 20aS.E.b 0.8 0.8 0.7a，b，c在無共同上標的主要影響的欄內的平均值不同(P＜0.05) 6.結論。該研究表明，在稀釋、染色和分類前淨保持精子3小時比立即稀釋並於0小時或3小時後染色要好。因此，通過3小時然後進入分類，最好用一份新的原始射精物(其被淨保持3小時然後染色)來繼續進行，而不是用原先的精子樣品(被染色並被保持在400×106精子/ml)來繼續。
即使TEST增容劑在0小時提供了更高的解凍後運動性，但當將精子置於37℃溫育時，則Tris為優選的增容劑。兩種鞘液的任何一個對每種增容劑都可以發揮同樣好的作用。基於這些結果，我們已經將Tris鞘液與Tris冷凍增容劑組合在一起使用，使之成為我們的標準方法。
實施例5增容劑添加劑對已分類精子的影響目的評估向冷凍增容劑中添加十二烷基磺酸鈉(「SDS」)對流動分類精子的影響。A.冷凍增容劑中SDS濃縮物影響的評估1.源樣品的收集。按實施例1A中所述，收集並製備6頭公牛的精子。
2.方法。將從每頭公牛(共6頭)得來的精子在含0、0.03、0.06、0.09或0.12％SDS的20％全卵Tris(「WET」)增容劑中增容至20×106/ml，然後裝入吸管並進行冷凍。WET增容劑的製備如下將3.028g Tris[羥甲基]氨基甲烷、1.78g檸檬酸一水合物和1.25g果糖溶於100ml雙蒸水，然後向其中加入20％的全卵(vol/vol)。製得的WET增容劑的pH約為7.0，並含有終濃度約為6％(vol/vol)的甘油。該WET增容劑也含有1000 IU的青黴素「G」鈉和100Tg的鏈黴素硫酸鹽/ml。
3.結果。在解凍大約10分鐘後測得的漸進性運動精子的平均值(n＝從6頭公牛每頭取1個樣)分別是51、51、50、51和48％。基於此結果，在實施例5B中使用了0.06％的SDS。
B.各種冷凍增容劑中0.06％SDS對流動分類精子的解凍後運動性影響的評估。
1.源樣品的收集。按實施例1A中所述，收集並製備8頭公牛的精子。
2.方法。研究了被冷凍在有或無0.06％SDS的卵黃-Tris(參見實施例2)和WET增容劑(參見實施例5A)中的精子的解凍後運動性。對兩種增容劑而言，終甘油濃度都是6％。
a)染色、分類準備、分類。按實施例2中所述，從每頭公牛(共8頭)的射精物中製備染色的精子樣品。使用Tris鞘液對染色的精子進行批量分類，除了使用的入射雷射功率是135mW以外，其它都按實施例2中所述進行。將分過類的精子收集在50ml含2ml每種增容劑A組份冷凍緩衝液的塑料管裡；每個處理收集到15×106的總分類精子(25ml)並於22℃溫育1小時以模擬較長的分類時間。
b)冷凍準備。然後將稀釋過的精子冷卻至5℃，歷時90分鐘以上。以15分鐘的間隔向每個含分類精子的50ml塑料管中分步(2x)加入等體積的適合的B組份增容劑。通過850xg冷凍離心20分鐘，對每份(25ml/增容劑)處理進行濃縮。除去上清，留下600 T1的精子沉澱，然後溫和振蕩15秒使之懸浮。既然含沉澱的該懸浮液中已經有甘油了，所有就沒有再向該精子沉澱中填加額外的增容劑。該精子懸浮液的濃度大約為20×106/ml。對每頭公牛而言，都在含6％甘油的卵黃-Tris增容劑中製備濃度約為20×106精子/ml的未染色的、未分類的對照樣品。在進行批量分類的時候，該對照被放置在5℃的冷室中。
c)平衡與冷凍。所有的對照和批量分類的精子都在同時進行分裝和冷凍。將精子分裝至0.25ml的聚氯乙烯吸管中，於5℃平衡約3到6小時，然後在靜態液氮蒸氣中冷凍。
3.解凍後運動性的評估。除了漸進性運動性在溫育0.5和2.0小時以後進行評估以外，精子的解凍和解凍後評估都按實施例2所述方法進行。
4.統計分析。實施例2中已對統計分析進行了一般的描述。具體來說，通過對每個溫育時間參數的單獨分析對處理效果進行評估。該模型包括公牛和增容劑為主要事件，觀測者和關聯的相互作用為次要事件。通過最小顯著性差異試驗測定平均值之間的差數。
5.結果。解凍後溫育0.5或2小時以後，增容劑對精子的漸進性運動性有影響(P＜0.05，表7)。對0.5小時而言，WET加SDS比Tris加SDS產生的運動性更低。對2小時而言，所有的用批量分類處理的精子都比未分類的對照精子要差。對兩個溫育時間而言，公牛和觀測者都有明顯的影響(P＜0.01)，但觀測者並不受處理相互作用的影響。
表7.增容劑對解凍後漸進性運動性的影響(％)增容劑37℃溫育0.5h2hTris(未分類) 42a41aTris w/o SDS 40a，b35bTris w/SDS 42a37bWET w/o SDS 30a，b35bWET w/SDS38b35bS.E.c1.0 1.2a，b在無共同上標的欄內的平均值不同(P＜0.05) 6.結論。通過解凍後視覺估計測定，我們認為在Tris或WET增容劑中包含SDS對精子質量並無益處。而且使用WET和Tris增容劑所得的結果相似；因此，對於低溫貯藏分過類的牛精子而言，WET看上去與Tris同樣有效。
實施例6田間試驗中，通過流動分類進行性別區分的精子的質量目的基於頂體完整性，評估解凍後分類精子的質量1.源樣品的收集。按實施例1A中所述，收集並製備3頭公牛的精子。
2.方法。將來自相同射精物的分過類的和未分類的對照精子按實施例2中所述方法染色、處理並分類，只是精子以90％純度水平按性別類型進行分類。收集大約20ml的分過類的精子，並冷卻到5℃(0.2℃/min)，歷時90分鐘。冷卻之後，向該分類精子中添加等體積的卵黃-Tris B填充劑(參見實施例2)，分兩次、間隔15分鐘加入。按實施例5中所述進行離心及上清的吹吸。離心和吹吸之後，向精子沉澱中加入含6％甘油(v/v)的卵黃-Tris增容劑，從而使精子濃度達到約20×106/ml。除平衡時間約為3小時以外，流動和解凍按實施例2中所述的進行。
3.解凍後運動性的評估。解凍約10分鐘之後，於37℃進行漸進性運動性精子百分比的視覺估計。在37℃溫育2小時以後使用微分幹差(differential interference-contrast)顯微鏡(x1000)對精子頂體的完整性進行測定。精子用40mM氟化鈉處理，製備溼塗片，每次處理檢測100個精子。頂體被分為(a)完整頂體，(b)腫脹或受損頂體，或(c)沒有頂體(不完整)。
4.統計分析。所分析的數據來自19個不同的冷凍數據(對稱取自田間試驗中使用的3頭公牛)。通過將公牛作為固定影響的變量分析對處理效果(分類對對照)進行評估。
5.結果。儘管在分類中已經將死精子除去了，但未分類精子的解凍後漸進性運動性精子的百分比(50％)還是明顯高於(P＜0.05)分類精子的(46％；表8)。然而，具有完整頂體的精子的百分比則無差別。相對對照精子(P＜0.05)來說，分類增加了失去頂體精子的百分比，但也減少了具有受損精子的百分比。公牛之間在完整頂體百分比(P＜0.05)、不完整頂體百分比(P＜0.01)和解凍後漸進性運動性(P＜0.01)方面有著明顯的差異。在解凍後運動性方面，有一頭公牛受分類的影響(P＜0.01)，但在其它反應方面則不受其影響。來自A公牛和B公牛的，分類的和未分類的精子之間在解凍後運動性方面的差異幾乎為零；對公牛C而言，分類的精子比對照精子在運動性方面低10個百分點(19％)。表8.分類對解凍後運動性(％)和頂體狀態(％)的影響。
頂體狀態完整 損傷不完整 解凍後運動性對照64a20a15a50a分類的 65a14b21b46ba，b具有不同上標從欄平均值不同(P＜0.05)。
6.結論。對分類的、冷凍的精子漸進性運動性平均的視覺估計稍低於(4個百分點；8％)對照精子，有一頭公牛的差異要稍大些。這些評估在解凍後約10分鐘進行。該小均差與溫育2小時後不完整頂體的一致。頂體受損或丟失的精子有可能不能遊動。對分過類的樣品來說，增加了具有不完整頂體的精子的百分比意味著損傷是與分類或真正分類之前或之後的低溫貯藏相關的。想來是因為分類使受損的頂體變成了沒失去頂體。基於標準的、評估精子質量的方法，對大部分公牛來說，沒有理由認為這些流動分類精子的受精潛能受到了嚴重的損傷。
實施例7使用20％的卵黃Tris增容劑對公牛精子進行性別選擇和低溫貯藏目的提供一種低溫貯藏流動分類的公牛精子的方法。
1.收集和射精物評估。按實施例1A中所述，收集並製備射精物。選擇來自那些有＞75％形態正常精子的公牛的射精物。視覺估計漸進性運動精子的百分比(漸進性運動性＞60％的射精物對分類是最好的)。向原精液中添加如下抗生素終濃度為100ug/ml的太樂菌素、終濃度500ug/ml的慶大黴素和終濃度為300/600ug/ml的林古-大觀黴素。
2.染色及分類準備。向原精液樣品中加入抗生素以後，在進行染色前，可以放置12分鐘。對樣品染色按實施例2中所述方法進行。
3.分類。對X和Y兩種類型的精子進行分類，將分類限度設置為90％純度。將精子分裝到含2ml 20％卵黃-Tris增容劑A組份的50ml Falcon管裡(參見實施例2)直至每管的總體積達到最大值20ml(或每次分類最多2小時)，分過類的精子最終濃度為6×105/ml。製得注意的是，在分類之後和冷卻之前必須要再加入20％的卵黃-Tris-A組份捕獲緩衝液，從而使卵黃的最終百分比至少達到3％。
4.冷凍準備。在進行分類之後，將分過類的樣品冷卻至5℃，歷時90多分鐘。冷卻之後，以15分鐘的間隔分步(2X)加入20％的卵黃-Tris增容劑B組份(參見實施例2)。加到精子樣品中的Tris增容劑B組份的終體積應該與Tris增容劑A組份的體積相等。加入Tris增容劑B組份之後，精子樣品的總體積不應該超過27ml。
向該精子樣品中加入Tris增容劑B組份之後，於850xg離心20分鐘以濃縮樣品。吸出上清，留下約150μl的精子沉澱。將精子重懸並將每頭牛的精子合在一起。
5.冷凍。添加完全的卵黃-Tris增容劑(6％甘油)以使終精子濃度達到20×106/ml。按實施例2中所述的方法將增容的精子分裝至0.25ml聚乙烯吸管中進行冷凍。
實施例8野外研究中，流動分類的、冷凍的公牛精子生育力的評估材料和方法精液收集與處理用人工陰道收集來自生育力未知的年輕公牛的精液(參見實施例1A)。在用分光光度計測定精子濃度並對漸進性精子運動性進行主觀評估以後，除了使用發射功率為約135到約150mW的雷射以90％的純度對精液按性別類型這一點以外，按實施例2中所述的方法對精液進行處理和分類。除了平衡時間約為3小時以外，其它按實施例2中所述的方法進行處理和冷凍。在田間試驗中，對液體精液使用的是Cornell通用增容劑(Seidel GE Jr.，Theriogenology 1997；481255-1264)。為在田間試驗2和3中冷凍精液，所使用的增容劑為甘油終濃度為7％的2.9％檸檬酸鈉+20％的卵黃(參見實施例1)。對于田間試驗4到11，精液被冷凍在含200mM Tris、65mM檸檬酸、56mM果糖、20％卵黃和甘油終濃度為6％的Tris-鹼增容劑中(參見實施例2)。對於試驗1、2和3來說，流動細胞計中使用的鞘液為2.9％的檸檬酸鈉(參見實施例4)，而對剩下的試驗使用的是Tris緩衝液。
將精子按筒分裝在0.25ml French吸管的中心，每管50μl。為使稀釋效應最小化，使用小體積從而使其能夠達到至少107精子/ml的濃度。在大部分試驗中，先將一筒沒有精子的增容劑吸入吸管以潤溼其中的棉塞，接著是一小管空氣，然後是按性別選擇的精子。當精子被冷凍的時候，每批次解凍一管(35℃水浴，30秒)以進行質量控制，並且丟棄解凍後漸進性運動性小於25％的批次。通過流動細胞計量術對每批次中按性別選擇的樣品進行聲處理並對其進行分析以測定性別的精確度。母牛管理和人工受精所使用的母牛來自6個廣泛分布的、有不同管理方法的生產單位。季節和品種的差異對實驗異質性有進一步影響(表9)。當母牛進入輸精設備後，儘量在可能的範圍內，在輸精員的公牛內系統地交替進行處理和對照。
發情以4種方法之一同步進行(表9)(1)每天在2.5kg穀物中餵食500mg的醋酸美侖孕酮(melengesterol acetate)(MGA)，進行14天，然後在餵食MGA最後一天立即注射25mg前列腺素F2α(Lutalyse，Upjohn，Kalamazoo，MI，USA)17、18或19天(MGA/PG)；(2)單一注射25mg前列腺素F2α(PG)；(3)立即注射20或25mg前列腺素F2α，間隔12天(PG/PG)或(4)立即注射50或100Tg的GnRH，然後7天後注射25mg前列腺素F2α(GnRH/PG)。
視覺檢查母牛早晚的固定發情，而僅在晚上16:00以後對其進行受精，即大約出現發情1/2或1天以後。
要麼是按常規方法在子宮體內受精，要麼是使用防止損傷的胎盤轉移鞘(IMV，Minneapolis，MN，USA)進入子宮角的一半進行受精。在後一種情況中，精液被放在過了子宮角大彎、可無損進行的(與非手術的胚胎轉移相同)儘量靠前的地方。大部分情況下，精液被放在anterior third和mid-comua之間。
大部分實驗包括冷凍的精子對照，其以來自相同公牛的、用於進行性別類型分類的(「區分性別的」)20或40×106精子/劑量在子宮體內進行受精。該對照為在特定田間試驗條件下，對固有的、正常的母牛生育力及所使用的公牛的生育力和輸精員技術的綜合評估。有些試驗也包括低劑量的、非區分性別的對照組。有時對照受精數量僅被設計為每次處理所用數量的1/2或2/3，以對區分性別的精子獲得更多的信息。將冷凍的區分性別的精子和對照精子在35到37℃水浴中解凍20到30秒。其它細節摘述於表9。
按Curran，S.，Theriogenology 1991；36809-814中所述，受精後28到37天和/或受精後56到92天通過超聲對懷孕進行診斷，此時大部分試驗中的胎兒性別得以測定，而操作者對受精處理或對照並不知情。出生的小牛的性別幾乎與胎兒性別診斷一致。通過對連續性校正的單自由度Chi平方對數據進行分析；如果一尾(1-tail)檢驗未被指定的話，那麼就進行二尾檢驗。由受精處理失誤、生殖道的frank感染、無法穿過子宮頸等等的受精少於5％。從實驗中選取哪一個動物的決定是在受精後很短的時間內作出的，而從不是基於懷孕診斷作出的。
表9.田間實驗程序上的細節試受精日期母牛品種所用的公牛 輸精員同步化注釋驗 發情1 5/20-23，Angus N1，N2，AN4 A，B MGA/PG包括低劑量對照19972 2/18-5/22， Angus雜種 N3，N4，N5，N6 C，D PG/PG 低劑量但無正常劑1998 量的對照；在同步化的時候有些母牛懷孕並流產3 6/2-6/5，Angus AN4，AN5，N7， B，D MGA/PG1998N84 2/10-13，Holstien J2，J4 C，D PG 非常嚴重的汙泥、1999 雪、風和寒冷的大風雨5 2/24-26，Holstien J2，J4，J5 C，B，D PG/PG19996 4/14-16，Holstien J2，J3，J4，J5 C，D PG 有些母牛是生殖精1999選牛7 4/27-5/1， Holstien AN1，AN4 C MGA/PG分類前運輸6h的一1999Angus雜種 頭公牛的精液8 4/21-23，Angus雜種 H1，H2 E MGA/PG飼養場的母牛19999 5/5-8， Red Angus AR1，AR2C，F MGA/PG1999105/31-6/2， Angus AN4，AN7， B，D GnRH/P1999 AN8G117/28-30，Holstien H2，H3 C，D PG/PG 在大得多的試驗中1999 得到的第一份複製物結果與討論所得的數據來自11個連續的、各異的田間實驗，受研究的邏輯方面的限制，例如必須使公牛與畜群的遺傳需要相匹配、無法得到公牛的生育力信息、母牛數量的限制、無法在試驗之間得到相同的輸精員、某些試驗中惡劣的天氣、早期試驗中區分性別的精液量的限制、2個系列的母牛中某些同時發情但直至約55天才被證明懷孕等等。在每個試驗中，至多包括4頭公牛和3位輸精員；這使我們可以對種群取樣以保證結果可以適用於更多的公牛或技師；然而，嚴格評估公牛對公牛生育力方面差異的數據並不充足。
大部分母牛來自位於我們實驗室140到250km範圍內飼養的畜群。在任何試驗中輸精員之間在牲畜的懷孕率方面都沒有明顯的差異，但牲畜/輸精員的數目很低，而且如果進行更大數量的受精實驗則有可能會檢測出差異來。
在試驗之間並沒有對同步發情方法進行比較，因此在這些方法之間不可能對懷孕率進行比較。對所使用的所有4種同步方法來說，懷孕率看上去很另人滿意。
既然受精每天進行一次，那麼晚間發情的母牛就會在檢測到發情大約24小時以後被受精。對這些在所有試驗中都使用區分性別的精子受精的母牛來說，懷孕率為203/414(49.0％)，這與早上發情母牛並於檢測到發情半天后受精的懷孕率(266/586(45.4％))並無明顯的差別(P＞0.1)。較遲受精而有較高生育力的這一趨向與由其它研究得出的結論一致，即當使用的精子數量少或當條件並不是最優的時候，用生育力較低的公牛遲些受精比正常推薦的時間要好。
表10到表20列出了處理後的懷孕率和(如果有的話)胎兒或小牛的性別。除在試驗8中以外，其它試驗的目的是要獲得雌性的後代；在試驗1、3、8、9、10和11中的精確度分別為95％、83％、90％、83％、82％和94％。在其餘的試驗中，由於懷孕診斷的時間選擇、無法找到確定胎兒性別的專業人員和/或因為小牛還沒有生出來的原因，胎兒或出生的性別無法得到。這並非主要的利害關係，因為本研究的主要目的是檢測流動分類精子於低劑量受精時的生育力。
通過調整分類參數可將性別確定的精確度調節到實際所要求的50到95+％之間的任何水平。然而，較高的精確度會導致每單位時間分得的精子數量較低，尤其是對Y染色體精子來說更是如此。對常規工作來說，90％的精確度已經足夠了。
我們將對每個田間試驗中的主要發現依次進行摘述。值得注意的是總精子數量在表頭給出；漸進性運動精子的數量通常是這些值的30到50％。田間試驗1(表10)表明，使用低量的未區分性別的精子在子宮角受精的懷孕率於用正常精子數目的對照相似。用未冷凍的區分性別的精子64到67天的懷孕率(42％)比用同分過類的精子一樣進行稀釋、染色和離心的、未區分性別的液體對照要低12個百分點。性別確定的精確度為95％；來自區分性別精子的小牛的性別與胎兒性別診斷的結果非常匹配；在對照胎兒的性別確定上有一個錯的。在2個月的妊娠期間沒有出現流產，而且所有的19個來自區分性別精子處理的小牛都能生存並很正常。對於區分性別精液的處理而言，對公牛N1、N2和N3來說的這兩個月的懷孕率分別為41、44和40％。39％(13/33)早上發情的母牛和50％(6/12)晚上發情的母牛懷上了小牛。表10.田間試驗1的結果—懷俄明州Angus母牛，1997年處理/部位 精子數 母牛數 懷孕母牛數(31 懷孕母牛數(64 雌性小牛天到33天) 天到67天) 數區分性另 3×10545 20(44％) 19(42％) 18(95％)a的，5℃/子宮角對照，5℃/ 3×10528 15(54％) 15(54％) 5(53％)b子宮角冷凍的對照/40×10629 16(55％) 15(52％) 11(73％)a，b子宮體a，b無共同上標則性別比例有差別(P＜0.02)。
用區分性別的、冷凍精子與用區分性別的、未冷凍的精子所得的結果相似(如果對由於在低溫貯藏過程中被殺死的精子數量作了調整的話)。田間試驗2(表11)對此提供了第一證據。保存在5℃和8℃的區分性別的精子之間也沒有懷孕率的差別。
用來自個別公牛的區分性別的精液受精2+月以後的懷孕率在22到42％之間(P＞0.05)。對區分性別孕牛和對照的孕牛來說，在1和2個月的妊娠期之間的胚胎丟失是非常相似的。
從該試驗中可以得到來自39頭母牛的產仔數據；這些懷孕2個月的母牛(30頭區分性別孕牛，9頭為對照)都在正常長度的妊娠後產仔。表11.田間試驗2的結果—科羅拉多州的雜種肉母牛，1998年處理/部位 精子數 母牛數 懷孕母牛數(30 懷孕母牛數(59天到35天)a天到92天)a對照，5℃/子宮角 5×10558 27(47％) 24(41％)區分性別的，5℃/ 5×10551 17(33％) 16(31％)子宮角區分性別的，18℃/ 5×10546 16(35％) 12(26％)子宮角區分性別的，冷1×10687 29(33％) 28(32％)凍的/子宮角a無顯著差異，χ2田間試驗3(表12)表明，區分性別的、冷凍精子有著滿意的懷孕率。確定精子性別的精確度再次得到確證；然而，與出生的小牛相比，對胎兒的性別確定有4個錯的；列出的是出生小牛的實際性別。而且，在妊娠的2個月間也沒有流產發生。
對公牛N8、N9、AN5和AN4的區分性別的、未冷凍的和區分性別的、冷凍的精子來說，平均的懷孕率分別為24、31、50和60％(P＜0.1)。表12.田間試驗3的結果—懷俄明州的Angus母牛，1998年處理/部位 精子數母牛數 懷孕母牛數(62 雌性小牛數天到65天)a區分性別的，18 1.5×10537 11(30％)a10(91％)c℃/子宮角區分性別的，1×10635 18(51％)a，b14(78％)c冷凍的/子宮角冷凍的，對照/ 40×10637 27(73％)b16(59％)d子宮體a，b無共同上標的平均值不同(P＜0.05)。c，d由區分性別處理的精子受精的雌性小牛的百分比(83％)與對照組有差別，P＜0.05，一尾，χ2。
田間試驗4、5和6(表13、14、15)在同一地點用3個不同的母牛群進行。不幸的是，由于田間試驗的不確定性，例如人員安排、每頭公牛區分性別精液的可利用性等等，我們無法對每個試驗進行相似的複製。試驗5和6之間懷孕率的差異很大，這表明試驗之間的條件是有差異的。試驗6中的有些母牛在自然交配一個月以後無法懷孕，因此這對於我們的試驗是有用的。在這些試驗條件下，精子濃度為1.5到3.0×106精子/劑之間的懷孕率是非常相似的。而且，子宮角受精並沒有什麼優勢可言。除了在試驗5中J2的懷孕率(20/28(71％))比J4的(15/39(38％))要高以外(P＜0.05)，公牛之間在懷孕率方面沒有明顯的差異(P＞0.05)。該差異在試驗與試驗之間也不一致，如J4在數值上有差異但並不明顯高於試驗4和6中J2的懷孕率。表13.田間試驗4的結果—科羅拉多州的Holstein母牛，1999年處理/部位 精子數 母牛數懷孕母牛數(30 懷孕母牛數(64天到35天) 天到67天)*區分性別的，1.5×10555 36(65％)a，b36(65％)a，b冷凍的/子宮體區分性別的，3×10652 27(52％)a26(50％)a冷凍的/子宮體對照，冷凍的/ 20×10655 45(82％)b43(78％)b子宮體a，b無共同上標的平均值不同(P＜0.01)。*在進行第二次懷孕診斷之前，有6頭在30到33天懷孕的母牛被賣掉；這些是對剩下的懷孕母牛的估計。表14.田間試驗5的結果—科羅拉多州的Holstein母牛，1999年處理/部位精子數 母牛數懷孕母牛數(33 懷孕母牛數(60天到35天)a天到62天)a區分性別的，1.5×10623 12(52％) 12(52％)冷凍的/子宮體區分性別的，3.0×10625 15(60％) 14(56％)冷凍的/子宮體區分性別的，1.5×10625 15(60％) 12(48％)冷凍的/子宮角區分性別的，3.0×10625 17(68％) 15(60％)冷凍的/子宮角對照，冷凍的/ 20×10630 20(67％) 19(63％)子宮體a無顯著差異。表15.田間試驗6的結果—科羅拉多州的Holstein母牛，1999年處理/部位 精子數母牛數 懷孕母牛數(31 懷孕母牛數(60天到34天) 天到63天)區分性別的， 1.5×1062711(41％)a9(33％)a冷凍的/子宮體區分性別的， 3.0×1062510(40％)a9(36％)a冷凍的/子宮體區分性別的， 1.5×106248(33％)a7(29％)a冷凍的/子宮角區分性別的， 3.0×1062410(42％)a8(33％)a冷凍的/子宮角對照，冷凍的/ 20×1062418(75％)b17(71％)b子宮體a，b無共同上標的平均值不同(P＜0.05)。
對試驗7(表16)來說，由於時間安排的問題，只能找到一個輸精員。這是唯一的一個表現出子宮角受精要比子宮體受精有著令人信服的優勢的試驗。對在此試驗條件下的該輸精員來說，用區分性別的、冷凍的精液在子宮角內受精比在子宮體內受精、從而懷孕的母牛多55％(22個百分點)。真正的差異可能會更小些，因為這些平均值的置信區間很大。在其它所有的試驗中(對子宮體和子宮角的受精進行了比較的5、6、9和11)，對兩種方法和對該技師及其它技師而言，懷孕率都很相似。
來自一頭試驗7所使用公牛的精液在進行分類前，在-20℃的保溫箱內在沒有進行稀釋的情況下由Montana空運過來；運輸時間為6小時。對於來自這兩頭公牛的區分性別的精子來說，懷孕率實際上是相同的，沒有運輸的為49％，而運過來的是52％。因為有Hoechst33342的精子的染色性質會因增容劑稀釋而改變，所以精液並沒有用增容劑稀釋，也沒有因運輸而進行冷卻。而且，在其它的研究中(參見實施例4)發現，在收集和冷凍分類之間於環境溫度進行精子的淨分類要優於將其進行稀釋。表16.田間試驗7的結果—科羅拉多州的雜種肉母牛，1999年處理/部位 精子數 母牛數 懷孕母牛數(33天到37天)區分性別的，冷凍 1.5×1068634(40％)a的/子宮體區分性別的，冷凍 1.5×1068653(62％)b的/子宮角對照，冷凍的/子 20×1063518(51％)a，b宮體a，b無共同上標的平均值不同(P＜0.01)。
田間試驗8(表17)考慮的是沒有植入生長促進劑的飼養場母牛；在診斷出懷孕的時候它們流產了，所以沒法得到小牛的數據。該實驗表明也可以以雄性為指導進行有效的性別確定。對這兩頭公牛來說，懷孕率為50和61％。表17.田間試驗8的結果--Nebraska的Angus母牛，1999年處理/部位精子數母牛數 懷孕母牛數a(74 雄性胎兒數天到76天)區分性別的，冷 1×10618 7(39％) 6(86％)凍的，72mW雷射/子宮體區分性別的，冷 1×10618 13(78％)12(92％)凍的，135mW雷射/子宮體a無顯著差異。
田間試驗9是唯一表現出3.0對1.5×106的區分性別的、冷凍精子/受精劑量具有令人信服優勢的試驗。該優勢對兩位輸精員都是這樣。對來自這兩頭公牛的區分性別的精子來說，懷孕率為62和75％。表18.田間試驗9的結果--Nebraska的Red Angus母牛，1999年處理/部位 精子數 母牛數懷孕母牛數(60 雌性胎兒數天到63天)a區分性別的， 1.5×10615 8(53％)7(88％)冷凍的/子宮體區分性別的， 3.0×10614 12(86％) 9(75％)冷凍的/子宮體區分性別的， 1.5×10616 9(56％)7(78％)冷凍的/子宮角區分性別的， 3.0×10616 12(75％) 11(92％)冷凍的/子宮角對照，冷凍的/20×10630 21(70％) 13(62％)子宮體a3.0×106的區分性別的精子(80％)比1.5×106的區分性別的精子(55％)的懷孕率要高，P＜0.05，1-尾χ2。在田間試驗10(表19)中，用區分性別的、冷凍精液的懷孕率與對照的相似；確定精子性別的精確度僅為82％，然而這與我們目標規定的90％的精確度並沒有明顯的差別。對區分性別的精液而言，公牛AN4、AN7和AN8的懷孕率分別是54、66和50％(P＞0.1)。18頭在該試驗中受精的母牛是在田間試驗1中由區分性別的精子所產生的小牛。表19.田間試驗10的結果—懷俄明州的Angus母牛，1999年處理/部位 精子數 母牛數 懷孕母牛數(61 雌性胎兒數天到63天)a區分性別的，1×1064426(59％) 23(85％)冷凍的/子宮體區分性別的，3×1064323(53％) 17(74％)冷凍的/子宮體對照，冷凍的/ 20×1063520(57％) 12(57％)子宮體a無顯著差異。表20.田間試驗11的結果—科羅拉多州的Holstein母牛，1999年處理/部位 精子數 母牛數 懷孕母牛數(28 懷孕母牛數(56天到30天)a天到58天)a，b區分性別的，1×10612 8(67％) 24(41％)冷凍的/子宮體區分性別的，3×10612 6(50％) 16(31％)冷凍的/子宮體區分性別的，1×1067 4(57％) 4(57％)冷凍的/子宮角區分性別的，3×1067 4(57％) 4(57％)冷凍的/子宮角對照，冷凍的/ 20×1069 4(44％) 3(33％)子宮體a無顯著差異，χ2。b由區分性別的精子受精的17頭胎牛中有16頭是雌性的；兩頭在體腔中太深無法進行超聲性別鑑定。
來自進行了同樣處理(除了將1×10和1.5×106精子劑量合在一起這一點不同以外)的試驗的數據被結合了在一起(表21)。表21.將用區分性別的、冷凍的精液和冷凍對照的試驗結合在一起的摘要試驗組合 精子數/部位 母牛數懷孕數5，6，9，111-1.5×106/子宮體 77 36(47％)3×106/子宮體 76 38(50％)1-1.5×106/子宮角 72 32(44％)3×106/子宮角 72 39(54％)20×106/子宮體，對照93 61(66％)4，5，6，9，10，11 1-1.5×106/子宮體 176 98(56％)3×106/子宮體 171 88(51％)20×106/子宮體，對照 183124(68％)5，6，7，9，11 1.5×106/子宮體163 70(43％)1.5×106/子宮角158 85(54％)20×106/子宮體，對照 128 79(62％)在用多7到20倍的精子進行的實驗中，使用區分性別精子的懷孕率通常為未區分性別的對照的70-90％。在最近的試驗中，該差異更小，這可能反應了性別確定和精子處理方法的進步。
在有些試驗中，用超聲波對受精後1和2個月的母牛進行懷孕檢測。對區分性別的(23/261；8.8％)精子處理和對照(9/145；6.2％)精子處理來說，在這期間的懷孕失敗是相似的(P＞0.1)，這是對由於很難確定性別而產生的遺傳損傷的一種測定方法。因為大部分較早試驗的牲畜都被賣掉而較晚試驗的牲畜還沒有產仔，所以僅從幾頭懷孕母牛的身上獲得了產仔的信息。由區分性別的精液產生以用來收集數據的小牛種群看上去與對照種群並無差別。
結論牲畜的性別比例可以通過用細胞計/細胞分類器、基於DNA含量將精子進行分類，然後通過低溫貯藏和相關的常規人工受精，偏離至一種性別佔到約90％的水平。由區分性別的精子產生的小牛看上去是正常的。對本研究中的大部分公牛來說，用1.0到1.5×106區分性別的、冷凍的精子的懷孕率是用20或40×106非區分性別的、冷凍精子對照按常規方法受精的70到90％。這些結果適用於由受過很好訓練的輸精員、使用適當處理的精液繁殖的管理完善的母牛品種。與標準的子宮體受精相比，用區分性別的精子在子宮角裡受精也許會稍有優勢。
本發明已於此通過參考某一特定方法和材料進行了必要的討論。應該知道，這些特定方法和材料的討論無法對本發明的範圍形成任何的限制，其可擴展至任何及所有的、可替代的、適於完成本發明之目的的材料和方法。
此處所述的所有專利和公開文本都以整體的形式併入本文以作參考。
權利要求
1.低溫貯藏精子的方法，該方法包括(a)獲得選定的精子樣品；(b)冷卻所說的選定精子樣品；(c)從所說的選定精子樣品中分離精子以產生分離的精子；(d)向所說的分離的精子中添加終增容劑以產生精子懸浮液；及(e)冷凍所說的精子懸浮液。
2.權利要求1所述的方法，其中所說的選定精子樣品包括一部分在源樣品中存在的精子，所說的精子部分按某一特徵選出，並且其中該精子在選定精子樣品中的濃度低於在源樣品中的濃度。
3.權利要求1所述的方法，其中所說的選定精子樣品包括按性別選擇的精子。
4.權利要求1所述的方法，其中所說的選定精子樣品包括哺乳動物的精子。
5.權利要求4所述的方法，其中所說的選定精子樣品包括牛的精子。
6.權利要求4所述的方法，其中所說的選定精子樣品包括馬的精子。
7.權利要求4所述的方法，其中所說的選定精子樣品包括豬的精子。
8.權利要求1所述的方法，其中所說的選定精子樣品包括通過下列方法之一選出的精子流動細胞計量術、磁力技術、柱技術、比重技術、生物化學技術、基於精子運動性的技術、基於精子電學性質的技術和其任何組合。
9.權利要求8所述的方法，其中所說的選定精子通過流動細胞計量術選出。
10.權利要求1所述的方法，其中通過將選定精子樣品的溫度降低到約5攝氏度來進行冷卻。
11.權利要求10所述的方法，其中冷卻進行約60分鐘到約240分鐘。
12.權利要求1所述的方法，其中加到所說的選定精子樣品中的每種終增容劑，除了低溫保護劑以外，還含有下列一個或多個成分保持重量摩爾滲透壓濃度和緩衝液pH的成分、減少冷激並保持精子生育力的有機物質、能源、有利於精子獲能的物質和抗生素。
13.權利要求12所述的方法，其中所說的低溫保護劑選自二糖、三糖和其任何組合。
14.權利要求12所述的方法，其中所說的低溫保護劑選自甘油、二甲基亞碸、乙二醇、丙二醇和其任何組合。
15.權利要求12所述的方法，其中所說的保持重量摩爾滲透壓濃度和緩衝液pH的成分選自含鹽的緩衝液、含碳水化合物的緩衝液和其任何組合。
16.權利要求12所述的方法，其中所說的保持重量摩爾滲透壓濃度和緩衝液pH的成分選自檸檬酸鈉、Tris[羥甲基]氨基甲烷、N-Tris[羥甲基]甲基-2-氨基乙磺酸、穀氨酸單鈉、乳、HEPES緩衝介質和其任何組合。
17.權利要求12所述的方法，其中所說的有機物質選自卵黃、卵黃抽提物、乳、乳抽提物、酪蛋白、清蛋白、卵磷脂和其任何組合。
18.權利要求12所述的方法，其中所說的能源為選自葡萄糖、果糖、甘露糖和其任何組合的單糖。
19.權利要求12所述的方法，其中所說的抗生素選自太樂菌素、慶大黴素、林古黴素、林古-大觀黴素、大觀黴素、青黴素、鏈黴素和其任何組合。
20.權利要求1所述的方法，其中在加入終增容劑之後，精子樣品和精子懸浮液分別含有甘油、檸檬酸鈉、Tris[羥甲基]氨基甲烷、卵黃、果糖和一或多種抗生素。
21.權利要求1所述的方法，其中在加入終增容劑之後，所說的精子樣品和精子懸浮液各自含有甘油、檸檬酸鈉、卵黃和一或多種抗生素。
22.權利要求1所述的方法，其中在加入終增容劑之後，所說的精子樣品和精子懸浮液各自含有甘油、卵黃、乳、果糖和一或多種抗生素。
23.權利要求1所述的方法，其中所說的增容劑的pH在約6.5到約7.5的範圍內。
24.權利要求1所述的方法，其中該精子通過離心分離自所說的選定精子樣品。
25.權利要求24所述的方法，其中所說的離心使得回收至少約50％到約90％的精子。
26.權利要求1所述的方法，其中冷凍前在所說懸浮液中的精子濃度約為1×106/ml到約300×106/ml。
27.一種冷凍的選定精子樣品，其含有存在於源樣品的精子的一部分，所說的部分因具有一特徵而被選取。
28.權利要求27所述的冷凍的選定精子樣品，其中所說的冷凍的選定精子樣品含有按性別選擇的精子。
29.權利要求27所述的冷凍的選定精子樣品，其中所說的冷凍的選定精子樣品含有哺乳動物的精子。
30.權利要求29所述的冷凍的選定精子樣品，其中所說的冷凍的選定精子樣品含有牛的精子。
31.權利要求29所述的冷凍的選定精子樣品，其中所說的冷凍的選定精子樣品含有馬的精子。
32.權利要求29所述的冷凍的選定精子樣品，其中所說的冷凍的選定精子樣品含有豬的精子。
33.權利要求27所述的冷凍的選定精子樣品，其中用來選擇所說的選定精子樣品的方法包括下列技術之一流動細胞計量術、磁力技術、柱技術、比重技術、生物化學技術、基於精子運動性的技術、基於精子電學性質的技術和其任何組合。
34.權利要求33所述的冷凍的選定精子樣品，其中所說的冷凍的選定精子樣品含有通過流動細胞計量術選擇的精子。
35.權利要求27所述的冷凍的選定精子樣品，其中所說的冷凍的選定精子樣品通過如下一種方法產生，該方法包括(a)獲得選定的精子樣品；(b)冷卻所說的選定精子樣品；(c)從所說的選定精子樣品中分離精子以產生分離的精子；(d)向所說的分離的精子中添加終增容劑以產生精子懸浮液；及(e)冷凍所說的精子懸浮液。
36.一種包括使用權利要求27所述的冷凍的選定精子樣品進行人工受精或體外受精的方法。
37.權利要求36所述的方法，該方法包括使用所說的冷凍精子樣品進行低劑量人工受精。
全文摘要
本發明提供了一種低溫貯藏精子的方法，該精子由於具有某種特殊特徵而被選。在一個優選的實施方案中，該方法被用來冷凍按性別選擇的精子。雖然本發明的低溫貯藏方法可用於冷凍各種選擇方法選擇出的精子，但是使用流動細胞計量術所進行的選擇為優選。本發明也提供了一種冷凍的精子樣品，該精子由於具有某種特殊特徵，例如性別類型，而被選擇。在優選的實施方案中，該冷凍的精子樣品包括哺乳動物的精子，例如人的、牛的、馬的、豬的、綿羊的、麋鹿的或野牛的精子。該冷凍的選定精子樣品可在各種應用中使用。具體說來，該樣品可被解凍然後用於受精。因此，本發明也包括使用該冷凍的選定精子樣品進行人工受精或體外受精的方法。
文檔編號A01N1/00GK1424873SQ00818617
公開日2003年6月18日 申請日期2000年11月22日 優先權日1999年11月24日
發明者約翰·申克 申請人:Xy公司