抑制C型肝炎病毒感染人細胞的12肽za及製備方法和用途的製作方法

2023-05-04 00:49:16

專利名稱：：抑制C型肝炎病毒感染人細胞的12肽za及製備方法和用途的製作方法
技術領域：
：本發明屬於病毒的分子生物學領域。更具體涉及一種抑制C型肝炎病毒感染人細胞的12肽ZA，還涉及抑制C型肝炎病毒結合人肝細胞和DC-SIGN+的靶細胞的多肽的製備方法，同時還涉及一條能靶向結合C肝病毒包膜糖蛋白E2的小分子12肽，即多肽ZA在製備治療或預防C型肝炎病毒感染人細胞的藥物中的用途，該多肽同時還作為檢測C型肝炎病毒包膜抗原的試劑盒中的應用。
背景技術：
：丙型病毒性肝炎(簡稱C型肝炎)是由C型肝炎病毒(HepatitisCVirus,HCV)引起的肝臟炎症性疾病。HCV感染呈全球性分布,主要通過血液傳播。據世界衛生組織統計,全球HCV感染率約為3%，估計有l.7億人感染HCV,每年新發C型肝炎病例約3.5萬。我國血清流行病學調査資料顯示,一般人群抗HCV陽性率為3.2%，各地區感染率有一定差異。急性HCV感染者約80%發展為慢性C型肝炎(CHC)，在20年間約20%可發展為肝硬化,每年約有1%4%肝硬化患者發展為肝癌。CHC已成為不可忽視的重要疾病，及早發現和治療CHC患者已受到重視。CHC治療目的包括根除或長期抑制病毒複製，減輕肝內炎症和纖維化,最終阻止進展為肝硬化、肝癌和肝功能衰竭,並提高患者的生活質量。抗病毒是CHC治療的關鍵，目前抗病毒治療主要有幹擾素(Interferon,IFN)治療，包括普通IFN-a、複合幹擾素(CIFN)、聚乙二醇化幹擾素a(PGE—IFNa)。自20世紀卯年代應用IFN治療CHC以來,其遠期療效從IO%15%提高至50%60%。其次，幹擾素與利巴偉林聯合治療是當前CHC治療的一大進展，利巴韋林的抗病毒機制屬於免疫調節作用，它通過對T細胞介導的細胞毒性作用，調節免疫應答。利巴韋林單一治療並沒有抗HCV作用，IFNa與利巴韋林聯合應用卻能使患者獲得更好的恢復。此外，基因治療是將一種新的遺傳物質導入患者細胞內並能給患者帶來治療作用。HCV基因治療需要導入的基因特異性的阻斷或抑制病毒基因的表達或病毒蛋白合成的功能，除了細胞內幹擾外，基因治療還包括通過刺激特異性免疫應答使體內產生持續性表達的抑制性分泌蛋白,阻止細胞外水平HCV的播散。上述治療方法雖然能使部分患者(30X40X)獲得持續性病毒應答(SVR)，但半數以上患者無法達到SVR，並且幹擾素治療容易引起一系列的副作用，如對神經系統、血液系統的影響，PGE—IFNa與利巴偉林聯合治療的患者中有37%的人會出現抑鬱症狀，約20%的患者出現粒細胞減少，血小板減少及貧血。此外，利巴偉林還易引起患者乾咳、皮肽騷癢、皮疹及視網膜疾病。慢性C型肝炎治療會產生嚴重的不良反應，從而限制用藥劑量，並造成患者的個體差異性。因而研製新型的抗HCV藥物迫在眉睫。隨著對C肝病毒生物學行為基礎研究的深入，如何抑制病毒感染和入侵人肝細胞成為科研工作者尋求的更普遍，更有效控制和更治C型肝炎的方法。
發明內容本發明的目的是在於提供一種C型肝炎病毒感染人細胞的12肽ZA，該多肽分子量小，易於合成，應用方便、特異性高、無免疫原性、無毒副作用，該多肽能特異性與C肝病毒E2包膜糖蛋白結合，並阻止C肝病毒侵入靶細胞，可作為治療C肝病毒感染的新型藥物。本發明另一個目的是在於提供了一種抑制C型肝炎病毒感染人細胞的12肽的製備方法，該方法簡便，成本低廉，易於推廣。本發明的再一個目的是在於提供了一種多肽，即多肽ZA,在製備治療或預防C型肝炎的藥物中的應用。本發明還有一個目的在於提供了一種多肽，即多肽ZA在檢測C型肝炎病毒包膜抗原的試劑盒中的應用。為了實現上述目的，本發明採用以下技術措施核糖體文庫篩選技術是將編碼隨機肽的DNA文庫在體外轉錄、翻譯，轉錄產物mRNA由於缺乏終止子，不能從核糖體上釋放，而與新生多肽、核糖體以共價鍵結合，形成mRNA—核糖體一蛋白質三聚體結構，此三聚體形式將蛋白6和mRNA信息連接在一起，使基因型和表型得到統一。利用固相化抗原或受體的特異性的單克隆抗體親和篩選核糖體表面的隨機多肽，分離特異性結合的mRNA—核糖體一多肽複合物，通過降低Mg^濃度，核糖體解離，釋放mRNA，回收核糖體富集庫中的mRNA,逆轉錄成cDNA,PCR擴增，其產物可作為下一輪體外合成的模板，經過幾輪篩選，能找到與抗體特異性結合的多肽。近年來，應用核糖體展示技術已進行了許多研究，如篩選配體或受體，篩選抗體或確定抗原表位，開發新的蛋白酶抑制物和新的藥物。一種抑制C肝病毒與人肝細胞結合的多肽具體製備步驟如下一、製備E2-GST融合蛋白的歩驟如下A.挑取含有表達E2-GST融合蛋白的質粒pGEX-KG-E2(見參考文獻Li，etal.，Engineeringof7V國glycosylationofHepatitisCVirusEnvelopeProteinE2EnhancesTcellresponsesforDNAimmunization,J^cc/e.2007.25:1544-1551.)的大腸桿菌BL21DE3(購自美國invi加gen公司)接種於3ml含有氨節青黴素(50pg/ml)的LB培養基中，對照組別接種含有pGEX-KG(GST蛋白的原核表達載體，購自AmershamBiosciences公司)的大腸桿菌BL21DE3,37'C培養12~16小時。B.將小試管中的菌液分別轉移到200ml含有氨苄青黴素(50pg/ml)的LB液體培養基(LB液體培養基為lOg胰蛋白腖，5g酵母提取物，10g氯化鈉，溶解至1000ml雙蒸水)中，37。C培養到OD600為12。C.加入100mM異丙基-(3-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，使其終濃度為0.1mM,3(TC誘導45小時。D.將誘導以後的菌液分裝到250ml的離心管中，4。C，7700g,5min離心，棄上清。E.沉澱物用磷酸鹽緩衝液PBS(140mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀，10mM磷酸氫二鈉，1.8mM磷酸二氫鉀)洗滌1次,4。C，7700g，5min離心，棄上清。F.將沉澱重懸於8ml含1mM苯甲基磺醯氟(PMSF:17.42mgPMSF溶於lml異丙醇中，-20'C保存)的PBS中。G.將菌液放置冰中，超聲碎菌，加入20。/。曲通X-100(TritonX-100:1mlTritonX-100溶於4ml無菌雙蒸水中)，使其終濃度1%,4°C,輕混30分鐘。H.每EP管中加入1ml超聲降解的菌液，4°C,12000g,10min離心，取上清。I.4°C,12000g,離心10min，再取上清。J.各EP管加入20pi瓊脂糖凝膠4B(Sepharose4B:購自AmershamBiosciences公司)，混勻，室溫2025。C孵育30min。4°C，5000rpm，5min，離心，棄上清。K.每個EP管中各加入100pi0.01MPBS洗滌，離心洗滌後將含有Separose4B的懸濁液收集於一管，4'C,5000rpm,5min，離心，棄上清，共洗滌3次。L.加入與Sepharose4B等量的谷光苷肽洗脫緩衝液(GlutathioneElutionBuffer:0.0154g谷光苷肽溶解於0.25mlpH8.0的1M過濾除菌，分裝，4。C保存)，室溫2025。C輕輕混勻10min，4'C，5000rpm,5min，取上清。M.重複步驟L兩次。收集的上清則為E2-GST融合蛋白。二、製備E2-GST融合蛋白抗體的步驟如下A.將表達純化的E2-GST融合蛋白用PBS稀釋至1mg/ml，加入完全弗氏佐劑(CFA)，注射至紐西蘭家兔(購自武漢大學醫學院實驗動物中心)脊椎兩側6點皮下及腹股溝淋巴結，每點O.10.2ml，每隻兔子抗原免疫劑量為1mg。B.兩周後，用同樣抗原量再次免疫家兔，以不完全弗氏佐劑(IFA)為佐劑。免疫位點及數量選擇同基礎免疫。C.共免疫4次，間隔時間為2周，後兩次免疫劑量為第一次劑量的1.5倍。末次免疫後第10天心臟釆血，室溫靜置凝固後，轉入4"C冰箱靜置過夜，分離血清，血清即為E2-GST融合蛋白的抗體，置於-8(TC冰箱保存備用。8三、製備隨機DNA文庫的步驟如下A.寡核昔酸為3，-CCTCTATATAGGTACCGATCG(NNM)i2AGGCCGGTAGTAGTAGTAGTAGTACCT4G(FCCA-5'(90bp)(劃線部分分別為SD序列、啟始密碼子、HisTag、斜體部分為Sflw/ZI酶切位點)(N代表A,C,T或G，M代表A或C)B.第一輪PCR的上遊引物Ul為5'-GCTCGTATAATGTGTGGCCACAACGGA4GG4(ATATATCCATG-3'(43bp)(劃線部分為5'端莖環和斜體部分為核糖體結合位點:RBS)，下遊引物Dl為3'-GTAGTAG-5，(52bp)(劃線部分分別為^zwffl酶切位點、Gly-Ser序列和3，端莖環)C.第二輪PCR的上遊引物U2為5'-GCGCTGCAGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTG-3'(42bp)，(劃線部分分別為/VI酶切位點和Tac啟動子)。下遊引物為D1。隨機ssDNA文庫和引物由上海博亞生物有限公司合成。隨機DNA文庫和引物由上海博亞生物有限公司合成。隨機DNA文庫的構建示意圖見圖1。D.以寡核普酸為模板，用引物U1和D1進行第一輪PCR，反應體系為10XTagDNAPolymerasebuffer(含Mg2+)5^1dNTPmix(10mM)1fil引物Ul(20|aM)1pi引物Dl(20|uM)1[il寡核苷酸(0.05|ag^l)1pi雙蒸水40|alTagDNA聚合酶1(al總體積50|al反應程序a.95°C，2分鐘b.95°C,36秒；63°C，36秒；72°C，84秒；共25個循環。c.72°C，5分鐘E.PCR產物經2。/。的瓊脂糖凝膠(0.4g瓊脂糖粉末溶解於20mllXTAE溶9液)電泳，然後用回收試劑盒(QIAEXIIgelExtractionKit,美國promega公司)回收。F.經步驟E回收所得的PCR產物作為模板，進行第二輪PCR擴增，反應體系為10XTagDNAPolymerasebuffer(含Mg2+)5|aldNTPmix(10mM)1jal引物Ul(20nM)1|al引物Dl(20pM)1|al第一輪PCR產物4(il雙蒸水37nlTagDNA聚合酶1pi總體積50pl反應程序a.95°C，2分鐘b.95°C，36秒；62°C，36秒；72°C，84秒；共25個循環。c.72°C，5分鐘G.步驟F所得得PCR產物經2。/。的瓊脂糖凝膠電泳，然後用回收試劑盒回收，回收所得片段即可用於體外轉錄翻譯DNA文庫。四、製備核糖體文庫的步驟如下A.核糖體文庫構建及篩選流程(見參考文獻Wu,etal.,26(11):2057-2063.)如圖2所示將編碼IO"個隨機12肽的DNA庫在體外進行偶聯的轉錄/翻譯，轉錄產物mRNA由於缺乏終止子，不能從核糖體上釋放，從而形成一個穩定的mRNA-核糖體-新生多肽複合體結構。利用連接有S印harose4B(sigma公司)的E2-GST融合蛋白(E2-GST-Sepharose4B)親和篩選核糖體表面的隨機多肽，分離特異性結合的mRNA—核糖體一多肽複合物，通過降低Mg^濃度，核糖體解離，釋放mRNA，回收核糖體富集庫中的mRNA，逆轉錄成cDNA.PCR擴增，其產物可作為下一輪體外合成的模板，經過六輪篩選，能找到與E2蛋白特異性結合的多肽。10B.反應體系:DNA模板(0.3mg/ml)10piS30PremixwithoutAminoAcids20pi胺基酸混合液(無甲硫氨酸)2.5pi胺基酸混合液(無亮氨酸)2.5(ilE.coliS30Extract15pi總體積50pi輕輕混勻EP管中各混合物，5000rpm，離心30秒，讓混合物沉積於EP管底部。C.3(TC孵育2.5小時。D.EP管冰上放置5分鐘中止反應，EP管中物質即為核糖體展示文庫。五、核糖體展示文庫篩選與C肝病毒E2糖蛋白結合的多肽的步驟如下A.在100|al體外轉錄翻譯混合物中加入6單位的無RNA酶的DNase(Promega公司，美國)，10XDNaseI緩衝液(Promega公司，美國)6pl，37。C溫育30min。然後加6中止緩衝液，65°C，10min滅活DNase。B.取60(^1E2-GST-Sepharose4B,4°C，5000rpm，5min離心，棄上清。C.沉澱用500pi洗脫緩衝液(washingbuffer:50mMpH7.5的Tris-醋酸，150mM氯化鈉NaCl,0.1%Tween-20,50mM醋酸鎂)洗滌3次。D.將100pi體外轉錄/翻譯混合物加入到洗滌過的E2-GST-Sepharose4B中，4'C搖動1小時。E.4°C，5000rpm，5min離心，棄上清，沉澱用washingbuffer洗滌3次。F.沉澱中加入100|alelutionbuffer,4'C搖動10min使mRNA與核糖體解離，4°C，5000rpm，5min離心，取上清。G.用RNaidKit(購自bio101公司，美國)回收mRNA，具體方法如下a.上清中加入3倍體積的RNABindingSalt(RNaidKit成份)混勻。b.再加入10^RNAMATRIX(RNaidKit成份)，室溫放置5min。c.13000rpm，lmin離心，棄上清。d.用RNAwash(RNaidKit成份)洗滌2次，(RNAwash:乙醇=1:1)。e.加入lOp無RNase的1120，4555。C溫育5min。f.13000rpm，2min離心，取上清，上清即是RNA模板，可用於RT-PCR。H.RT-PCR，其反應體系為AMV/Tfl5XReactionbuffer10pidNTPmix混合物1|al引物U1(20mM)1pi引物D1(20mM)1piMgS04(25mM)2piAMVReverseTranscription1jalTflDNAPolymerase1(XlRNA模板1pi無酶水29^總體積50(al反應程序為48°C，45分鐘；94'C，2分鐘；94°C，30秒；63°C,l分鐘，72°C，2分鐘；共31個循環；72°C，7分鐘I.2%瓊脂糖瓊脂糖凝膠電泳。J.回收分子量大小為155bp的RTPCR產物。K.以回收產物為模板，再行第二輪PCR擴增，回收分子量大小為181bp的PCR產物。L.將回收的第二輪PCR產物連接至載體pUC19(購自美國invitrogen公司)上，具體步驟為a.將PCR產物及載體pUC19酶切，反應體系為10XY+Buffer2pi6薩HI1)alM1|alddH2017pi總體積20pi37'C水浴2小時M.分別回收分子量大小為128bp的DNA片段以及分子量大小為2.668kb12的pUC19目的片斷，然後用回收試劑盒(QIAEXIIgelExtractionKit,美國promega公司)回收。a.用DNA連接酶將步驟b所的DNA和載體pUC19連接，反應體系為DNA4(alpUC192|al10XBuffer2(ilT4連接酶2pi雙蒸水10|al總體積20pi16'C孵育20小時b.將步驟c所得的連接產物分別轉化至大腸桿菌DH5a。取連接產物10^1，加入100plDH5a感受肽細胞，冰浴30分鐘，42°C90秒，再冰浴5分鐘，加入80(^1LB液體培養基(LB液體培養基為10g胰蛋白腖，5g酵母提取物，10g氯化鈉，溶解至1000ml雙蒸水)，37°C，225rpm振搖4050分鐘。取200(^1菌液均勻塗在有氨節青黴素(Amp。抗性的LB固體培養基(LB固體培養基為lOg胰蛋白腖，5g酵母提取物，10g氯化鈉，15g瓊脂粉溶解至1000ml雙蒸水)上(氨苄青黴素濃度為50lVml)，37'C培養過夜。c.挑取單個克隆菌落，置於3mlLB液體培養基(含氨苄青黴50Pg/ml)培養過夜。d.提取步驟e獲得的菌液的質粒DNA。e.PCR鑑定步驟f所得的DNA，反應體系為10XTaqDNApolymerasebuffer5|aldNTPmix混合物(IOmM)1pi引物U2(20pM)1pi引物D1(20|_iM)1nl質粒DNA1pi雙蒸水40piTaqDNAPolymerase1pi13總體積50pi反應程序為95°C，2分鐘；95°C，30秒；62°C，1分鐘，72°C，l分鐘24秒；共25個循環；72°C，5分鐘f.將步驟g所得產物經5amM和i^rt鑑定，正確的克隆送至上海華諾公司測序。根據測序結果，請西安美聯公司合成的，得到了一種分離的多肽，其胺基酸序列為ZA(SEQIDNO:l):GFGRYRRHGSPW六、表面等離子共振技術(SPR)檢測多肽與E2蛋白的親和力的步驟如下A.讓測試儀器Biocore(美國)通過一段HBS緩衝液直至基線穩定。B.注射40nl氨基偶聯試劑(含0.02M的EDC禾卩0.05M的NHS)，活化CM5傳感片上的羧基。C.用pH值為5.0的醋酸緩衝液將E2蛋白稀釋至5mg/ml，注射該溶液40pl。D.上機檢測，流速為20nl/min。E.將多肽ZA、ZC(對照多肽)稀釋為不同濃度，以2pl/min上機與CM5傳感片上的E2蛋白作用7分鐘。F.以2|al/min的流速注射10pl的HC1再生液使基線恢復，實時採集響應信號。G.用測試儀器Biocore(美國)上的專用軟體進行數據分析。分析結果見圖3，顯示多肽與E2蛋白的親和力是ZA>>ZC。七、流式細胞儀檢測多肽與靶分子細胞結合的步驟如下A.培養人肝癌細胞Huh7.5(見參考文獻Zhong,etal.,RobusthepatitisCvirusinfectioninvitro,2005,PNAS，102:9294-9299)和DC-SIGN+-NIH3T3(表面有DC-SIGN分子的小鼠的成纖維細胞)細胞(見參考文獻Wu，etal.,FunctionalevaluationofDC-SIGNmonoclonalantibodiesrevealsDC-SIGNinteractionswithICAM-3donotpromotehumanimmunodeficiencyvimstypeItransmission.J.virol.2002,76:5905-5914)。培養條件均為10%胎牛血清的DMEM培養基(Gibco公司購買)，培養於37。C，含5%二氧化碳的培養箱中。B.將多肽PE2A、PE2B、PE2C、PE2D分別與E2-GST蛋白混合(對照管加入GST蛋白)，總體積為50(il，其中多肽的濃度均為500iaM，E2-GST蛋白和GST蛋白的濃度均為20pg/ml，37。C孵育30分鐘。C.將步驟B所得的多肽與蛋白的混合物分別與收穫的Huh7.5和DC-SIGN+-NIH3T3細胞混合，總體積為100(il，其中細胞個數為2X106個。37。C孵育30分鐘。D.每管加入1mlPBS洗滌，1000rpm，5min，棄上清，用80(il重懸細胞。E.加入20pi1:500的E2-GST抗體，37'C孵育30分鐘。F.重複D步驟一次。G.加入1plPE標記的羊抗兔的二抗，37。C孵育30分鐘。H.每管加入1mlPBS洗滌，1000rpm，5min，棄上清，用500pl重懸細胞。I.上機檢測，結果見圖4，圖5，顯示多肽ZA(SEQIDNO:l)能顯著抑制E2蛋白與Huh7.5及DC-SIGN+-NIH3T3細胞結合，而多肽ZC(另一對照12肽)的抑制作用較弱。本發明的優點本實驗首次應用核糖體文庫篩選了與C肝病毒E2糖蛋白結合的多肽。篩選到的多肽ZA抑制與C肝病毒E2糖蛋白蛋白具有高親和力，且能抑制E2蛋白侵襲人體肝臟細胞Huh7.5和DC細胞。該多肽ZA作為兩種特異性抗病毒多肽，可與抗C肝病毒藥物協同作用，以抑制病毒對人體細胞特異性感染，競爭性抑制病毒HCVE2與病毒的細胞受體CD81的結合。該多肽的篩選，為預防和治療C肝病毒感染以及闡明C肝病毒與宿主細胞相互作用的機制奠定了基礎。本發明所提供的針對C肝病毒E2糖蛋白的小分子多肽彌補了以上提及的幹擾素及其它藥物治療C型肝炎的不足，並且顯示出了明顯的抑制病毒入侵作用。其最大的優點是可以高效、特異、快速的抑制C肝病毒結合到肝細胞上，並且分子量小、安全性高、毒副作用小、和免疫原性低等。1圖l.隨機DNA文庫的構建流程圖。RBS表示核糖體結合位點，N代表A,C,T或G，M代表A或C圖2.核糖體展示文庫篩選與C肝病毒E2糖蛋白結合的多肽的構建流程圖。圖3.SPR檢測多肽ZA、多肽ZC與E2蛋白的親和力，它們結合的親合力大小是多肽ZA))多肽ZC。圖4.流式細胞儀檢測多肽ZA、多肽ZC分別抑制E2蛋白結合人肝癌細胞Huh7.5的能力；A—多肽ZA能顯著抑制E2蛋白結合人肝細胞Huh7.5，而多肽C的抑制作用較弱，B—多肽ZA抑制E2蛋白與人肝細胞Huh7.5細胞的結合，且呈劑量依賴關係。圖5.流式細胞儀檢測多肽ZA抑制E2蛋白結合DC-SIGN+-NIH3T3細胞的能力；八一多肽2八顯著抑制￡2蛋白結合人細胞00516^-1}13，B—多肽ZA抑制E2蛋白與DC-SIGN靶細胞結合，多肽2八抑制￡2蛋白結合0(]-310]^373的能力的一定劑量依賴性。圖6.流式細胞儀檢測E2-GST蛋白顯著大於對照GST蛋白與人靶細胞(如人肝細胞Huh7.5，或DOSIGN+NIH3T3細胞)的結合能力。具體實施例方式實施例1一、製備E2-GST融合蛋白的步驟如下A.挑取含有pGEX-KG-E2的大腸桿菌BL21DE3(購自美國invitrogen公司)培養於3ml含有氨苄青黴素(50g/ml)的LB培養基中，對照組別接種含有pGEX-KG(GST蛋白的原核表達載體，購自AmershamBiosciences公司)，37°。培養1216小時。B.將小試管中的菌液分別轉移到200ml含有氨苄青黴素(50g/ml)的LB液體培養基(LB液體培養基為10g胰蛋白腖，5g酵母提取物，10g氯化鈉，溶解至1000ml雙蒸水)中，37r培養到OD600為12。C.加入100mM異丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，使其終濃度為0.1mM,30'C誘導45小時。D.將誘導以後的菌液分裝到250ml的離心管中，4t:,7700g,5min離心，16棄上清。E.沉澱用磷酸鹽緩衝液PBS(140mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀，10mM磷酸氫二鈉，1.8mM磷酸二氫鉀)洗滌1次,4'C，7700g,5min離心，棄上清。F.將沉澱重懸於8ml含1mM苯甲基磺醯氟(PMSF:17.42mgPMSF溶於lml異丙醇中，-20'C保存)的PBS中。G.將菌液放置冰中，超聲碎菌後加入20。/。曲通X-100(20%TritonX-100:1mlTritonX-lOO溶於4ml無菌雙蒸水中)，使其終濃度1%，4°C,輕混30分鐘。H.每EP管中加入1ml超聲降解的菌液，4°C,12000g,10min離心，取上清。I.上清再次離心，4°C,12000g,10min，再取上清。J.各EP管加入20nl瓊脂糖凝膠4B(Sepharose4B:購自AmershamBiosciences公司)，室溫(20陽25。C,以下相同)輕混30min。4'C，5000rpm，5min，離心，棄上清。K.每個EP管各加入100pi0.01MPBS洗滌，離心洗滌後將含有Separose4B的懸濁液收集於一管，4°C,5000rpm,5min，離心，棄上清，共洗滌3次。L.加入與Sepharose4B等量的GlutathioneElutionBuffer(0.0154g谷光苷肽溶解於0.25mlpH8.0的1MPBS過濾除菌，分裝，4'C保存)，室溫輕混10min，4。C,5000rpm,5min，取上清。M.重複步驟L兩次。收集的上清則為所需E2-GST融合蛋白。二、製備E2重組蛋白抗體的步驟如下A.將表達純化的E2-GST融合蛋白用PBS稀釋至1mg/ml，加入完全弗氏佐劑(CFA)，注射至紐西蘭家兔脊椎兩側6點皮下及腹股溝淋巴結，每點0.10.2ml，每隻兔子抗原免疫劑量為1mg。B.兩周後，用同樣抗原量再次免疫家兔，以不完全弗氏佐劑(IFA)為佐劑。免疫位點及數量選擇同基礎免疫。C.共免疫4次，間隔時間為2周，後兩次免疫劑量為第一次劑量的1.5倍。末次免疫後第IO天心臟採血，室溫靜置凝固後，轉入4'C冰箱靜置過夜，分離血清，血清即E2-GST融合蛋白抗體，置於-8(TC冰箱保存備用。三、製備隨機DNA文庫的步驟如下(見圖1):A.寡核昔酸為3'-CCTCTATATAGGTACCGATCG(NNM)12AGGCCGGTAGTAGTAGTAGTAGTACCT/4GGCCA-5'(90bp)(劃線部分分別為SD序列、啟始密碼子、HisTag、斜體部分為S"附/ZI酶切位點)(N代表A,C，T或G,M代表A或C)B.第一輪PCR的上遊引物Ul為5'-GCTCGTATAATGTGTGGCCACAACGGA4GATATATCCATG-3'(43bp)(劃線部分為5'端莖環和斜體部分為核糖體結合位點:RBS)，下遊引物Dl為3'-GTAGTA￡￡IQ-5'(52bp)(劃線部分分別為5flwHI酶切位點、Gly-Ser序列和3，端莖環)C.第二輪PCR的上遊引物U2為5'-GCGCTGCAGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTG-3'(42bp),(劃線部分分別為戶M酶切位點和Tac啟動子)。下遊引物為Dl。隨機DNA文庫的構建示意圖見圖D.以寡核普酸為模板，用引物Ul和Dl進行第一輪PCR,反應體系為10XTagDNAPolymerasebuffer(含Mg2+)5jildNTPmix(10mM)1pi引物Ul(20pM)1jal引物Dl(20jaM)1(il寡核苷酸(0.05嗎小1)雙蒸水40nlTagDNA聚合酶1jal總體積50nl反應程序a.95°C，2分鐘18b.95°C，36秒；63°C，36秒；72°C，84秒；共25個循環。c.72°C，5分鐘E.PCR產物經2%的瓊脂糖凝膠(0.4g瓊脂糖粉末溶解於20milXTAE溶液)電泳，然後用回收試劑盒(QIAEXIIgelExtractionKit,美國promega公司)回收。F.經步驟E回收所得的PCR產物作為模板，進行第二輪PCR擴增，反應體系為10XTagDNAPolymerasebuffer(含Mg2+)5^1dNTPmix(10mV01pi引物Ul(20pM)1pi引物Dl(20pM)1pi第一輪PCR產物—I雙蒸水37plTagDNA聚合酶1pi總體積50pl反應程序a.95°C，2分鐘b.95°C，36秒；62°C，36秒；72°C，84秒；共25個循環。c.72°C，5分鐘G.步驟F所得得PCR產物經2。/。的瓊脂糖凝膠電泳，然後用回收試劑盒回收，回收所得片段即可用於體外轉錄翻譯DNA模板。四、製備核糖體展示文庫的步驟如下A.核糖體文庫製備及篩選(見參考文獻Wu,etal.,Pep/zWM26(11):2057-2063.),構建及篩選流程如圖2所示將編碼IO"個隨機12肽的DNA庫在體外進行偶聯的轉錄/翻譯，轉錄產物mRNA由於缺乏終止子，不能從核糖體上釋放，而與新生多肽、核糖體以共價鍵結合，形成一個穩定的複合體結構。利用連接有S印harose4B的E2-GST蛋白(E2-GST—S印harose4B)親和篩選核糖體表面的隨機多肽，分離特異性結合的mRNA19一核糖體一多肽複合物，通過降低Mg^濃度，核糖體解離，釋放mRNA，回收核糖體富集庫中的mRNA，逆轉錄成cDNA.PCR擴增，其產物可作為下一輪體外合成的模板，經連接有S印harose4B的GST蛋白(GST—S印harose4B)反篩以去除非特異性結合的多肽，E2-GST—S印harose4B正篩，經過六輪篩選，篩選到與E2蛋白特異性結合的多肽。B.反應體系DNA模板(0.3mg/ml)10plS30PremixwithoutAminoAcids20jjl胺基酸混合液(無甲硫氨酸)2.5pi胺基酸混合液(無亮氨酸)2.5piE.coliS30Extract15pi總體積50pi輕輕混勻步驟B中各混合物，5000rpm，離心30秒，讓混合物沉積於EP管底部。C.3(TC孵育2.5小時。D.EP管冰上放置5分鐘中止反應。即得到核糖體展示文庫。五、核糖體展示文庫篩選與C肝病毒E2糖蛋白結合的多肽的步驟如下(見圖2):A.在100體外轉錄翻譯混合物中加入6單位的無RNA酶的DNase(Promega公司，美國)，10XDNaseI緩衝液(Promega公司，美國)6pl，37。C溫育30min。然後加6|al中止緩衝液，65°C，10min滅活DNase。B.取60|ilE2-GST-Sepharose4B，4°C，5000rpm，5min離心，棄上清。C.沉澱用500piwashingbuffer(50mMpH7.5的Tris-醋酸，150mMNaCl，0.1%Tween-20,50mM醋酸鎂)洗滌3次。D.將100|il體外轉錄/翻譯混合物加入到洗滌過的E2-GST-Sepharose4B中，4'C搖動1小時。E.4°C，5000rpm，5min離心，棄上清，沉澱用洗脫緩衝液洗滌3次。F.沉澱中加入100pielutionbuffer,4'C搖動10min使mRNA與核糖體解離，4°C，5000rpm,5min離心，取上清。G.用RNaidKit(購自biol01公司，美國)回收mRNA，具體方法如下g.上清中加入3倍體積的RNABindingSalt(RNaidKit成份)混勻。h.再加入10WRNAMATRIX(RNaidKit成份)，室溫放置5min。i.13000rpm，lmin離心，棄上清。j.用RNAwash(RNaidKit成份)洗滌2次，(RNAwash:乙醇=1:1)。k.加入10)al無RNase的H20，55。C溫育5min。1.13000rpm，2min離心，取上清，上清即是RNA模板，可用於RT-PCR。H.RT-PCR，其反應體系為AMV/Tfl5XReactionbuffer10pidNTPmix混合物1pi引物U1(20)_iM)1pi引物D1(20pM)1|il硫酸鎂(25mM)2piAMYReverseTranscription1(xlTflDNA聚合酶1^RNA模板1無酶水29|al總體積50pi反應程序為48°C，45分鐘；94°C，2分鐘；94°C，30秒；63°C，l分鐘，72°C，2分鐘；共31個循環；72°C，7分鐘I.2%瓊脂糖瓊脂糖凝膠電泳。J.回收分子量大小為155bp的RTPCR產物。K.以回收產物為模板，再行第二輪PCR擴增，回收分子量大小為181bp的PCR產物。L.將回收的第二輪PCR產物連接至載體pUC19(購自美國invitrogen公司)上，具體歩驟為a.將PCR產物及載體pUC19酶切，反應體系為10XY+Buffer2pi21屍Wl1|LllddH2017(il總體積20pi37。C水浴2小時b.分別回收分子量大小為128bp的DNA片段以及分子量大小為2.668kb的pUC19目的片斷(回收方法同上)。c.用DNA連接酶將步驟b所的DNA和載體pUC19連接，反應體系為DNA4pipUC192pi10XBuffer2piT4連接酶2pi雙蒸水10W總體積20pi16'C孵育20小時d.將步驟c所得的連接產物分別轉化至大腸桿菌DH5a。取連接產物lOpl，加入100plDH5a感受肽細胞，冰浴30分鐘，42°C90秒，再冰浴5分鐘，加入800^1LB液體培養基(LB液體培養基為10g胰蛋白腖，5g酵母提取物，10g氯化鈉，溶解至lOOOml雙蒸水)，37°C，225rpm振搖4050分鐘。取200|xl菌液均勻塗在有氨苄青黴素(Am-)抗性的LB固體培養基(LB固體培養基為lOg胰蛋白腖，5g酵母提取物，10g氯化鈉，15g瓊脂粉溶解至lOOOml雙蒸水)上(氨苄青黴素濃度為50Pg/nil),37t:培養過夜。e.挑取單個克隆菌落，置於3mlLB液體培養基(含氨苄青黴50Pg/ml)培養過夜。f.提取步驟e獲得的菌液的質粒DNA。g.PCR鑑定步驟f所得的DNA，反應體系為10XTaqDNApolymerasebuffer5pidNTPmix混合物(10mM)1(il22引物U2(20mM)1(al引物D1(20mM)11^1質粒DNA1pl雙蒸水40plTaqDNAPolymerase1(il總體積50(il反應程序為95°C，2分鐘；95°C，30秒；62°C，1分鐘，72°C，l分鐘24秒；共25個循環；72°C，5分鐘h.將步驟g所得產物經5tra//1和i^I鑑定，正確的克隆送至上海華諾公司測序。M.根據測序結果，請西安美聯公司合成12肽，見表l。表l篩選出的與E2蛋白結合的多肽序列分離的肽胺基酸序列ZAGFGRYRRHGSPWSEQIDNO:1zc(對照)LSVLV工SMEWW實施例2表面等離子共振技術(SPR)檢測多肽與E2蛋白的親和力的歩驟如下A.讓測試儀器Biocore(美國)通過一段HBS緩衝液直至基線穩定。B.注射40)al氨基偶聯試劑(含0.02M的1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺(EDC)和0.05M的N-羥基琥珀醯亞胺(NHS))，活化CM5傳感片上的羧基。C.用pH值為5.0的醋酸緩衝液將E2蛋白稀釋至5mg/ml,注射該溶液40pl。D.上機檢測，流速為20nl/min。E.將多肽AA、ZC稀釋為不同濃度，以2pl/min上機與CM5傳感片上的E2蛋白作用7分鐘。F.以2pl/min的流速注射10pi的HCl再生液使基線恢復，實時釆集響應信號。G.用該儀器Biocore(美國)的專用軟體進行數據分析，我們發現分析ZA與E2蛋白的親和力最高，結果見圖3，其親和力有關參數見表2。表2多肽與E2蛋白相互結合作用的動力學數據多tableseeoriginaldocumentpage24實施例3流式細胞儀檢測多肽與靶分子細胞結合的步驟如下A.培養人肝癌細胞Huh7.5(見參考文獻Zhong,etal.，RobusthepatitisCvirusinfectioninvitro,2005,PNAS,102:9294-9299)和DC-Sign-NIH3T3(表面有DC-Sign分子的小鼠的成纖維細胞)細胞(見參考文獻Wu,etal.,FunctionalevaluationofDC-SIGNmonoclonalantibodiesrevealsDC-SIGNinteractionswithICAM-3donotpromotehumanimmunodeficiencyvirustypeItransmission.J.virol.2002,76:5905-5914)。培養條件均為10%胎牛血清的DMEM培養基(Gibco公司購買)，培養於37°C，含5%二氧化碳的培養箱中。B.將多肽ZA、ZC分別與E2-GST蛋白混合(對照管加入GST蛋白)，總體積為50pl，其中多肽的濃度均為500pM，E2-GST蛋白和GST蛋白的濃度均為20|ag/ml,37。C孵育30分鐘。C.將步驟B所得的多肽與蛋白的混合物分別與收穫的Huh7.5和DC-SIGN+-皿113丁3細胞混合，總體積為100pl，其中細胞個數為2乂106個。37°C孵育30分鐘。D.每管加入1mlPBS洗滌，1000rpm，5min，棄上清，用80pi重懸細胞。E.加入20pll:500的E2-GST抗體，37。C孵育30分鐘。F.重複D步驟一次。G.加入1piPE標記的羊抗兔的二抗，37'C孵育30分鐘。H.每管加入1mlPBS洗滌，1000rpm，5min，棄上清，用500pi重懸細胞。I.經上機檢測，申請人發現ZA能顯著抑制E2蛋白結合到Huh7.5細胞(圖4)及00810>^+->^1313細胞(圖5),且成劑量依賴關係，多肽劑量愈大，其與E2的親合力愈強，抑制HCVE2侵襲靶細胞能力愈強(圖4B和圖5B)。而E2-GST結合人Huh7.5細胞及00810#^1113丁3細胞的能力顯著大於對照蛋白GST與人Huh7.5細胞及DC-SIGN+-NIH3T3細胞沒有結合能力(圖6)。實施例4多肽的細胞毒性實驗，即分離得到的多肽對人源性細胞系的毒性作用。利用MTT法檢測多肽對人Molt4細胞的毒性，A.培養人MoIt4細胞(見參考文獻MinowadaJ,etal.Rosette-forminghumanlymphoidcelllines,Establishmentandevidencefororiginofthymus-derivedlymphocytes.J.Natl.CancerInst.49:891-895,1972.)於96孔板，每孔5X106個細胞。B.分別加入不同濃度的PE2A、PE2B、PE2D於Molt4細胞，每個濃度做6個復孔。C.37'C培養細胞72小時，在培養結束前4小時加入20ml5mg/ml的MTT。D.2000轉/分鐘離心細胞IO分鐘，棄上清。E.每孔加入100ml二甲亞碸(DMSO)室溫(2026°C)孵育10分鐘。F.酶標儀測量各孔細胞的OD580值。結果顯示，ZA,ZC的半數致死劑量(IC50)均大於200iaM,表明它們的毒性很小，具備用於臨床實驗的基本要求。SEQUENCELISTING武漢大學抑制C型肝炎病毒感染人細胞的12肽ZA及製備方法和用途抑制C型肝炎病毒感染人細胞的12肽ZA及製備方法和用途1Patentlnversion3.1112PRT人工合成<400〉1GlyPheGlyArgTyrArgArgHisGlySerProTrp1510權利要求1.一種分離得到的多肽ZA，其序列為SEQIDNO1所示的胺基酸序列。2.—種製備權利要求1所述的多肽方法，它包括下列步驟A、製備E2-GST融合蛋白的步驟首先是挑取含有pGEX-KG-E2的大腸桿菌BL21DE3於3ml含有氨節青黴素的LB培養基中，對照組別接種含有pGEX-KG的大腸桿菌BL21DE3，37'C培養1216小時；其次是將試管中的菌液分別轉移到200ml含有氨苄青黴素的LB液體培養基中，37'C培養到OD600為12;第三是加入100mM異丙基-P-D-硫代半乳糖苷，使其終濃度為0.1mM,30'C誘導45小時；第四是將誘導以後的菌液分裝到250ml的離心管中，離心，棄上清，沉澱物用磷酸鹽緩衝液PBS洗滌1次，離心，棄上清，將沉澱重懸於8ml含lmM苯甲基磺醯氟的PBS中；第五是將菌液放置冰中，超聲碎菌後加入20%曲通X-IOO，使其終濃度1%,4'C,混30分鐘，每EP管中加入1ml超聲降解的菌液，離心，取上清，上清再次離心，再取上清；第六是各EP管加入20pl瓊脂糖凝膠4B,室溫混勻，離心，棄上清，各EP管加入100|al0.01MPBS洗滌，離心洗滌後將含有Separose4B的懸濁液收集於一管，離心，棄上清，共洗滌3次；最後是加入與Sepharose4B等量的谷光苷肽洗脫緩衝液，室溫下輕輕混，取上清，重複第六步驟兩次，收集的上清則為E2-GST融合蛋白；B、製備E2-GST融合蛋白抗體的步驟是首先是將表達純化的E2-GST融合蛋白用PBS稀釋至1mg/ml，加入完全弗氏佐劑，注射至紐西蘭家兔脊椎兩側6點皮下及腹股溝淋巴結，每點0.10.2ml，每隻兔子抗原免疫劑量為1mg;其次是兩周後，用同樣抗原量再次免疫家兔，以弗氏佐劑為佐劑，免疫位點及數量選擇同基礎免疫；第三是共免疫4次，間隔時間為2周，後兩次免疫劑量為第一次劑量的l.5倍，末次免疫後第IO天心臟採血，室溫靜置凝固後，轉入4。C冰箱靜置過夜，分離血清，血清即為E2-GST融合蛋白的抗體，置於-8(TC冰箱保存備用；C、製備隨機DNA文庫的步驟首先是寡核昔酸為3'-CCTCTATATAGGTACCGATCG(NNM)12AGGCCGGTAGTAGTAGTAGTAGTACCA-5，(90bp);其次是第一輪PCR的上遊引物U1為5'-GCTCGTATAATGTGTGGCCACAACGGA4GGL4GATATATCCATG-3'(43bp，下遊引物Dl為CATACGG-5，(52bp);第三是第二輪PCR的上遊引物U2為5'-GCGCTGCAGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTG-3'(42bp)，，下遊引物為Dl,隨機DNA文庫的構建；第四是PCR產物經2。/。的瓊脂糖凝膠電泳，然後用回收試劑盒回收；第五是經第四步驟回收所得的PCR產物作為模板，進行第二輪PCR擴增；第六是經第五步驟所得得PCR產物經2。/。的瓊脂糖凝膠電泳，然後用回收試劑盒回收，回收所得片段用於體外轉錄翻譯；D、製備核糖體文庫的步驟首先是核糖體文庫構建及篩選，將編碼IO"個隨機12肽的DNA庫在體外進行偶聯的轉錄/翻譯，轉錄產物tnRNA由於缺乏終止子，不能從核糖體上釋放，與新生多肽、核糖體以共價鍵結合，形成一個複合體結構，利用E2-GSTS印harose4B親和篩選核糖體表面的隨機多肽，分離特異性結合的mRNA—核糖體一多肽複合物，通過降低Mg"濃度，核糖體解離，釋放mRNA，回收核糖體富集庫中的mRNA,逆轉錄成cDNA.PCR擴增，其產物可作為下一輪體外合成的模板，經過六輪篩選，能找到與E2蛋白特異性結合的多肽；其次是反應體系DNA模板10)alS30PremixwithoutAminoAcids20)nl胺基酸混合液2.5pi胺基酸混合液2.5^S30Extract,linear15pi總體積50pi混勻反應體系中各混合物，5000rpm，離心30秒，讓混合物沉積於EP管底部，3(TC孵育2.5小時；最後是EP管冰上放置5分鐘中止反應，EP管中物質即為核糖體展示文庫；E、核糖體展示文庫篩選與C肝病毒E2糖蛋白結合的多肽的步驟是首先是在100pi體外轉錄翻譯混合物中加入6單位的無RNA酶的DNase,10XDNaseI緩衝液6(il，溫育，然後加6pl中止緩衝液，滅活，取60plE2-GST-Sepharose4B,4°C，5000rpm，5min離心，棄上清，沉澱用500pl洗脫緩衝液洗滌3次；其次是將100pl體外轉錄/翻譯混合物加入到洗滌過的E2-GST-Sepharose4B中，搖動，離心，棄上清，沉澱用washingbuffer洗滌3次，沉澱中加入100pielutionbuffer,搖動10min使mRNA與核糖體解離，離心，取上清；最後用RNaidKit回收mRNA，2%瓊脂糖瓊脂糖凝膠電泳，以回收產物為模板，再行第二輪PCR擴增，回收分子量大小為181bp的PCR產物；第四是將回收的第二輪PCR產物連接至載體pUC19上，具體步驟為a.將PCR產物及載體pUC19酶切，反應體系為lOXY十Buffer2|_dBa附HI1|al屍M1(alddH2017|il總體積20^37'C水浴2小時，b.分別回收分子量大小為128bp的DNA片段以及分子量大小為2.668kb的pUC19目的片斷；c.用DNA連接酶將步驟b所的DNA和載體pUC19連接，d.將所得的連接產物分別轉化至大腸桿菌DH5ci，取連接產物10pl，加入100^DH5a感受肽細胞，加入800|alLB液體培養基，取200W菌液塗在有氨苄青黴素抗性的LB固體培養基上，培養過夜；e.挑取單個克隆菌落，置於3mlLB液體培養基培養過夜，提取獲得的菌液的質粒DNA，PCR鑑定所得的DNA，將所得產物經和屍M鑑定，最後得到測序結果。3、多肽在製備治療或預防C型肝炎的藥物中的應用。4、多肽在檢測C型肝炎病毒包膜抗原的試劑盒中的應用。全文摘要本發明公開了一種抑制C型肝炎病毒感染人細胞的多肽ZA及製備方法和用途，其步驟是首先製備E2-GST融合蛋白；其次是製備E2-GST融合蛋白抗體；第三是構建隨機DNA文庫；第四是製備核糖體文庫；第五是核糖體展示文庫篩選與C肝病毒E2糖蛋白結合的多肽，得到與E2蛋白特異性結合的12肽(ZA)。該多肽ZA與C肝病毒E2糖蛋白有高親和性，多肽ZA能顯著降低HCV侵襲人肝細胞和DC細胞，並抑制E2蛋白與人細胞的結合，抑制能力強，該多12肽ZA可作為製備或治療預防C型肝炎病毒感染的藥物。多肽在檢測C型肝炎病毒包膜抗原的試劑盒中的應用。文檔編號C07K7/08GK101456901SQ200710168889公開日2009年6月17日申請日期2007年12月14日優先權日2007年12月14日發明者章曉聯申請人:武漢大學