短效因子VII多肽的製作方法

2023-05-03 19:22:32 1

本申請是國際申請日為2013年12月23日、國際申請號為pct/us2013/077405、進入國家階段的申請號為201380073743.5、發明名稱為「短效因子vii多肽」的pct申請的分案申請。

相關申請的交叉引用

本申請要求2012年12月24日提交的美國申請序號61/745,674和2013年3月15日提交的美國申請序號61/787,026的優先權，它們在此通過引用整體併入。

本文中提供了人凝固因子vii變體和編碼這樣的變體的多核苷酸，包含和表達這樣的變體的載體和宿主細胞，得到這樣的變體的方法，使用這樣的變體的方法，所述變體的組合物，和與之相關的額外發明特徵。

背景技術：

血液凝固是由各種血液組分(或因子)的複雜相互作用組成的過程，所述複雜相互作用最終產生纖維蛋白凝塊。通常，參與已被稱為凝固「級聯」的血液組分是在酶促方面失活的蛋白質(前酶或酶原)，其通過活化劑(其自身是活化的凝固因子)的作用而轉化成蛋白水解酶。已經經歷這樣的轉化的凝固因子一般被稱為「活性因子」，並且通過向凝固因子的名稱添加字母「a」來命名(例如，因子viia)。

止血過程的開始由組織因子(其在血管壁損傷以後暴露於循環血液)和因子viia(其以對應於總因子vii蛋白質量的約1%的量存在於循環中)之間的複合物的形成介導。該複合物錨定至帶有組織因子的細胞並在細胞表面上將因子ix和x轉化成它們的活性形式因子ixa和因子xa。因子xa在帶有組織因子的細胞上將凝血酶原轉化成凝血酶，所述凝血酶活化因子viii、因子v、因子xi和因子xiii。此外，在止血的該初始步驟中形成的有限量的凝血酶也活化血小板。在凝血酶作用於血小板以後，血小板改變形狀並將帶電荷的磷脂暴露在它們的表面上。該活化的血小板表面形成其它因子x活化和完整凝血酶產生的模板。在活化的血小板表面上的其它因子x活化經由在活化的血小板的表面上形成的因子ixa和因子viiia複合物而發生，且因子xa然後將凝血酶原轉化成凝血酶，同時仍然在表面上。凝血酶然後將纖維蛋白原轉化成纖維蛋白，所述纖維蛋白是不溶性的且穩定化最初的血小板栓。該過程定位至組織因子暴露部位，由此使凝固系統的全身活化的風險最小化。近年來，已經發現因子vii和組織因子是血液凝固的主要引發劑。

因子viia從它的前體因子vii產生，所述因子vii是在肝臟中合成並分泌進血液中，它在血液中作為單鏈糖蛋白(約50,000da的分子量)進行循環。本文中使用的野生型因子vii具有在圖1和2中公開的胺基酸序列和核苷酸序列。術語「因子vii」意在包括處於它們的未切割形式(酶原形式)的因子vii多肽以及已經蛋白水解地或以其它方式加工以產生它們各自的生物活性形式(其可以被稱作因子viia)的那些。野生型因子vii通常在殘基152和153之間被切割以產生因子viia。

因子vii在體外被因子xa、因子xiia、因子ixa或凝血酶轉化成雙鏈形式因子viia。象參與止血的幾種其它血漿蛋白一樣，因子vii的活性依賴於維生素k，其是簇集在該蛋白的氨基端附近的多個穀氨酸殘基的γ-羧基化所必需的。這些γ-羧化的穀氨酸是金屬離子誘導的因子vii與磷脂的相互作用所必需的。在有組織因子、磷脂和鈣離子存在下，雙鏈因子viia通過有限的蛋白酶解快速地活化因子x或因子ix。因子viia易於發生蛋白水解性裂解，從而產生許多不具有凝固活性的降解產物。

已經公開了因子vii變體，其具有通過一個或多個胺基酸的取代、缺失和/或插入而從野生型因子vii衍生出的胺基酸序列。例如，dickinson等人(proc.natl.acad.sciusa(1996)93,14379-14384)涉及因子vii變體，其中lys157、val158、glu296、met298、asp334、ser336或lys227已經個別地被ala替換。iwanaga等人(thromb.haemost.(1999年8月增刊),466,摘要1474)涉及因子viia變體，其中殘基316-320缺失或殘基311-322被得自胰蛋白酶的對應殘基替換。bolt等人的美國專利申請公開2008/0058255a1涉及在n145或n322處、或者在n145和n322二者處具有破壞糖基化的取代的因子vii變體。toso等人報導了一系列基於天然存在的突變的因子vii結構-功能研究。突變體重組因子vii蛋白包括t324m、e385k和兩種在因子vii重鏈(n322q)或因子vii輕鏈(n145q)中缺少糖基化核心序列的突變體因子vii蛋白。toso等人,「lackofheavychainglycosylationinpatientwithfactorviideficiencynotresponsibleformutantfviiaactivity,」blood,第96卷,第11期,第2部分(2000年11月16日),第79b頁(美國血液學會第42屆年會(42ndannualmeetingoftheamericansocietyofhematology))。

大多數天然存在的肽和蛋白含有碳水化合物部分，所述碳水化合物部分沿著肽或蛋白主鏈的長度經由與選定數目的胺基酸的特定鍵而連接至所述肽或蛋白。因而，許多天然存在的肽和蛋白分別被稱作「糖肽」或「糖蛋白」。在任何給定的肽或蛋白上的糖基化模式的變異性可以影響該肽或蛋白的功能。例如，在肽或蛋白上的n-連接的聚糖的結構可以影響肽或蛋白的多種特徵，包括蛋白酶易感性、細胞內運輸、分泌、組織靶向、生物半衰期以及所述肽或蛋白在細胞或生物體中的抗原性。這些特徵中的一種或多種的改變可以影響肽或蛋白在它的天然場合中的效力，且也可以影響肽或蛋白作為治療劑的效力(在所述肽或蛋白已經為該目的而製備的情況下)。

與肽或蛋白鏈連接的碳水化合物結構被稱作「聚糖」分子。存在於肽或蛋白上的具體聚糖結構影響肽或蛋白的可溶性和聚集特徵、肽或蛋白主鏈的摺疊，且因此影響它的功能或酶活性、肽或蛋白對蛋白水解性攻擊的抵抗力、以及導致無活性形式的肽或蛋白向活性形式的轉化的蛋白酶解的控制。例如，存在於聚糖分子上的末端唾液酸殘基影響肽或蛋白在哺乳動物循環系統中的半衰期的長度。其聚糖不含有末端唾液酸殘基的肽和蛋白通常被肝臟更快速地從循環中除去。

在天然存在的糖肽和糖蛋白中發現的聚糖結構通常分成兩類：n-連接的聚糖和o-連接的聚糖。野生型因子viia含有兩個n-連接的糖基化位點和兩個o-連接的糖基化位點。n-連接的糖基化是在真核生物中最常見的共價修飾。n-連接的糖基化發生在共有序列asn-x-ser/thr處，在該處聚糖連接至天冬醯胺的胺基，且x代表除了脯氨酸以外的任何胺基酸。n-連接的聚糖是基於共同核心戊糖man3(glcnac)2，其可以通過添加單糖(諸如n-乙醯基半乳糖胺、半乳糖、神經氨酸、n-乙醯基葡糖胺、果糖、甘露糖和巖藻糖)而進一步修飾。具有不同單糖(包括末端唾液酸)的man3(glcnac)2核心可以經由n-乙醯基葡糖胺連接在asn-x-ser/thr共有序列的asn處。該化學上複雜的共翻譯修飾用於多個目的，並以多種方式(包括適當摺疊、官能團取向和清除率)影響蛋白的生物學。

在本領域中已經提出了多種定製肽或蛋白的糖基化模式的方法，包括在defrees等人的美國專利號8,008,252中描述的那些。

經常期望，刺激或提高受試者中的凝固級聯。已經使用因子viia來控制由凝固因子缺乏(例如，a和b型血友病，或凝固因子xi或vii的缺乏)或凝固因子抑制劑造成的出血障礙。重組因子viia(由novonordisk在商業名稱novoseven®下製造和銷售)被批准用於治療具有因子viii或因子ix的抑制劑的a或b型血友病患者中和具有獲得性血友病的患者中的出血發作；預防具有因子viii或因子ix的抑制劑的a或b型血友病患者中和具有獲得性血友病的患者中在外科手術幹預或侵入性手術中的出血；治療具有先天性因子vii缺乏的患者中的出血發作和預防具有先天性因子vii缺乏的患者中在外科手術幹預或侵入性手術中的出血。hedner的美國專利號5,180,583公開了使用因子viia來控制並非由凝固因子缺陷或凝固因子抑制劑造成的情形下的過度出血。hedner公開了治療例如由缺陷性血小板功能、血小板減少症或馮威裡氏病造成的出血障礙和用於那些用途的組合物。

需要治療並非由先天性的或發展的凝固因子缺乏或凝固因子抑制劑引起的障礙的出血。幾個臨床試驗已經證實了重組因子viia用於控制出血的效力。但是，存在關於使用該分子引起的不希望的血栓栓塞性事件的增加的擔憂。出血在許多障礙中是一個重大問題，諸如關於外科手術、外科手術以後的併發症、幹(stem)和器官移植物、顱內出血、主動脈瘤和創傷或某些抗凝劑的劑量過量。

技術實現要素：

一個目的是用短效的因子vii多肽治療出血障礙和發作。本工作的一個目的是，提供短效的因子vii多肽(野生型或變體)的組合物，其特徵在於一個或多個藥代動力學特性，諸如縮短的半衰期。一個目的是提供這樣的因子vii分子，其在靶位和治療時間範圍以外具有減小的血栓性事件的機會。一個目的是提供由於改變的糖基化模式而具有增強的清除率的因子vii多肽(野生型或變體)。

本文描述了變體因子vii多肽的組合物，其中所述變體因子vii多肽包含與seqidno:16的胺基酸序列相比具有至少2個序列改變的胺基酸序列，其中所述至少2個序列改變是(1)穀氨醯胺殘基取代位置10的脯氨酸殘基，和(2)穀氨酸殘基取代位置32的賴氨酸殘基；且其中所述組合物中綴合的唾液酸的摩爾數與n-連接的聚糖的摩爾數的比率小於0.05、小於0.1、小於1.0、小於2.0、小於3.0、小於4.0、小於5.0或小於6.0。本文還描述了變體因子vii多肽的組合物，其中所述變體因子vii多肽包含與seqidno:16的胺基酸序列相比具有至少2個序列改變的胺基酸序列，其中所述至少2個序列改變是(1)穀氨醯胺殘基取代位置10的脯氨酸殘基，和(2)穀氨酸殘基取代位置32的賴氨酸殘基；且其中綴合的唾液酸的摩爾數與n-連接的聚糖的摩爾數的比率是在選自以下的範圍內：(1)0-5；(2)0-4；(3)0-3；(4)0-2；(5)0-1和(6)0-0.5。

本文還描述了一種分離的變體因子vii多肽，其包含與seqidno:16的胺基酸序列相比具有至少2個序列改變的胺基酸序列，其中所述至少2個序列改變是(1)穀氨醯胺殘基取代位置10的脯氨酸殘基，和(2)穀氨酸殘基取代位置32的賴氨酸殘基，其中所述多肽具有小於0.05、小於0.1、小於1.0、小於2.0、小於3.0、小於4.0、小於5.0或小於6.0的綴合的唾液酸的摩爾數與n-連接的聚糖的摩爾數的比率。本文還描述了因子vii多肽的組合物，其中所述因子vii多肽包含seqidno:16的胺基酸序列(野生型因子vii)且所述組合物中綴合的唾液酸的摩爾數與n-連接的聚糖的摩爾數的比率是在選自以下的範圍內：(1)1-5；(2)1-4；(3)1-3；(4)1-2；和(5)0.5-1；或綴合的唾液酸是不可檢測的。

本文還描述了一種分離的變體因子vii多肽，其選自：

(1)多肽，其包含與seqidno:16的序列相比具有序列改變的因子vii胺基酸序列，其中所述序列改變由以下組成：(1)穀氨醯胺殘基取代位置10的脯氨酸殘基，(2)穀氨酸殘基取代位置32的賴氨酸殘基，和(3)使得在位置145處的n-連接的糖基化被破壞的序列改變；

(2)多肽，其包含與seqidno:16的序列相比具有序列改變的因子vii胺基酸序列，其中所述序列改變由以下組成：(1)穀氨醯胺殘基取代位置10的脯氨酸殘基，(2)穀氨酸殘基取代位置32的賴氨酸殘基，和(3)使得在位置322處的n-連接的糖基化被破壞的序列改變；

(3)多肽，其包含與seqidno:16的胺基酸序列相比具有序列改變的因子vii胺基酸序列，其中所述序列改變由以下組成：(1)穀氨醯胺殘基取代位置10的脯氨酸殘基，和(2)穀氨酸殘基取代位置32的賴氨酸殘基，和(3)使得在位置145和322處的n-連接的糖基化被破壞的序列改變；

(4)多肽，其包含與seqidno:16的胺基酸序列相比具有序列改變的因子vii胺基酸序列，其中所述序列改變由以下組成：(1)穀氨醯胺殘基取代位置10的脯氨酸殘基，和(2)穀氨酸殘基取代位置32的賴氨酸殘基，其中位置145和322是天冬醯胺且具有連接的n-連接的糖基化；

(5)多肽，其包含與seqidno:16的胺基酸序列相比具有序列改變的因子vii胺基酸序列，其中所述序列改變由以下組成：(1)穀氨醯胺殘基取代位置10的脯氨酸殘基，(2)穀氨酸殘基取代位置32的賴氨酸殘基，(3)穀氨酸殘基取代位置34的丙氨酸殘基，(4)穀氨酸殘基取代位置36的精氨酸殘基，和(5)使得在位置145處的n-連接的糖基化被破壞的序列改變；

(6)多肽，其包含與seqidno:16的胺基酸序列相比具有序列改變的因子vii胺基酸序列，其中所述序列改變由以下組成：(1)穀氨醯胺殘基取代位置10的脯氨酸殘基，(2)穀氨酸殘基取代位置32的賴氨酸殘基，(3)穀氨酸殘基取代位置34的丙氨酸殘基，(4)穀氨酸殘基取代位置36的精氨酸殘基，和(5)使得在位置322處的n-連接的糖基化被破壞的序列改變；

(7)多肽，其包含與seqidno:16的胺基酸序列相比具有序列改變的因子vii胺基酸序列，其中所述序列改變由以下組成：(1)穀氨醯胺殘基取代位置10的脯氨酸殘基，(2)穀氨酸殘基取代位置32的賴氨酸殘基，(3)穀氨酸殘基取代位置34的丙氨酸殘基，(4)穀氨酸殘基取代位置36的精氨酸殘基，和(5)使得在位置145和322處的n-連接的糖基化被破壞的序列改變；和

(8)多肽，其包含與seqidno:16的胺基酸序列相比具有序列改變的因子vii胺基酸序列，其中所述序列改變由以下組成：(1)穀氨醯胺殘基取代位置10的脯氨酸殘基，(2)穀氨酸殘基取代位置32的賴氨酸殘基，(3)穀氨酸殘基取代位置34的丙氨酸殘基，和(4)穀氨酸殘基取代位置36的精氨酸殘基，其中位置145和322是天冬醯胺且具有連接的n-連接的糖基化。

本文還描述了具有減少的唾液酸與因子vii多肽的綴合的因子vii多肽。在某些實施例中，所述因子vii多肽是產生改變的糖基化模式的變體多肽。在其它實施例中，所述因子vii多肽是具有減少的唾液酸綴合的野生型因子vii多肽。在某些實施方案中，減少的唾液酸綴合可以通過用唾液酸酶處理多肽來實現。在其它實施方案中，減少的唾液酸綴合可以如下實現：在部分地或完全地缺乏肽的唾液酸化的細胞系中生產重組因子vii多肽。在其它實施方案中，減少的唾液酸綴合可以如下實現：在細胞系中共表達重組因子vii多肽和重組的或外源的唾液酸酶。

還描述了一種用於治療患有需要血塊形成的疾病或障礙的哺乳動物的方法，所述方法包括：給有此需要的哺乳動物施用有效量的具有減少的唾液酸綴合的因子vii多肽。在某些實施方案中，綴合的唾液酸的摩爾數與n-連接的聚糖的摩爾數的比率小於0.05。在其它實施方案中，所述因子vii多肽包含seqidno:16的胺基酸序列。在其它實施方案中，所述因子vii多肽包含野生型因子vii。在其它實施方案中，要治療的疾病或障礙選自：出血、胃腸出血、失控的出血、經歷移植或切除術或外科手術的哺乳動物中的出血、靜脈曲張所致的出血、血小板減少症、血友病、顱內出血、主動脈瘤和抗凝血劑的過度施用。

在下面詳細公開了其它變體、組合物、方法和有關的產品和工藝。

附圖說明

圖1a-1h顯示了在本申請中使用的三種因子vii分子的核苷酸序列。「v1」是與seqidno:16的野生型人胺基酸序列相比具有4個胺基酸突變的人因子vii變體：(p10q、k32e、t106n和v253n)。「v2」是與seqidno:16的野生型人胺基酸序列相比具有6個胺基酸突變的人因子vii變體：(p10q、k32e、a34e、r36e、t106n和v253n)。圖1還顯示了在實施例中使用的各種構建體的核苷酸序列。

圖2顯示了在本申請中使用的三種因子vii分子的胺基酸序列。本文中使用的野生型人因子vii具有seqidno:16的胺基酸序列。v1具有seqidno:17的胺基酸序列。v2具有seqidno:18的胺基酸序列。在v1和v2中，seqidno:16的野生型因子vii的變化以粗體顯示。

圖3的圖示描繪了在本申請的實施例中使用的三種因子vii分子。顯示了聚糖在n-糖基化位點處的連接。為了描述聚糖，實心框代表n-乙醯基葡糖胺，帶陰影的橢圓形代表甘露糖，空心橢圓形代表半乳糖，黑色菱形代表唾液酸(也被稱作n-乙醯基神經氨酸)，且封閉的三角形代表巖藻糖。用聚糖的一種可能變體描繪聚糖結構，且不代表實際測量的聚糖。

圖4的圖示描繪了n-連接的聚糖，其顯示了在asn-x-ser/thr共有序列中的asn處的連接。顯示了具有不同單糖(包括末端唾液酸)的man3(glcnac)2核心。

圖5的圖示描繪了參考v2舉例說明的在本公開內容中使用的兩個方案，其用於減小因子vii變體的半衰期。

圖6是低糖基化的因子vii分子的表格。

圖7顯示了根據實驗條件去唾液酸化以後，用lc-ms方法鑑別在v2的重鏈上剩餘的唾液酸的結果。

圖8顯示了去唾液酸化的v2的唾液酸含量分析。

圖9顯示了磷脂fx活化測定的結果。

圖10顯示了關於去唾液酸化的蛋白的pl-tga測定的結果。

圖11顯示了低糖基化的因子vii變體的表達。

圖12的表格顯示了使用轉染上清液確定低糖基化的fvii變體的「比活性」。

圖13顯示了關於純化的低糖基化的變體pmb121的pl-tga測定的結果。

圖14顯示了去唾液酸化的v2相對於野生型因子vii的體外肝細胞清除。

圖15顯示了使用因子vii變體的體外肝細胞清除的結果。低糖基化的變體在該模型中沒有顯示出清除的增加。該結果提示這些分子的清除機制不同於去唾液酸化的v2所利用的清除機制。

圖16顯示了在大鼠中的藥代動力學研究結果。如通過因子viielisa所測得的，在spraguedawley大鼠中，去唾液酸化的v2和v1的半衰期顯著低於它們的未修飾的母體分子。

圖17顯示了在hema小鼠中的藥代動力學研究結果。

圖18顯示了在hema小鼠中的去唾液酸化的v2效力研究。

圖19顯示了在tvthema模型中的去唾液酸化的v2效力研究。

圖20顯示了與因子vii相比，用去唾液酸化的v2在hema小鼠中製備凝血酶-抗凝血酶(「tat」)的結果。

圖21顯示了在凝固活性的小鼠中的去唾液酸化的v2效力研究。

圖22顯示了與具有正常唾液酸綴合的野生型因子vii相比，去唾液酸化的野生型因子vii(dwtviia)的體外肝細胞清除。

圖23顯示了與野生型因子vii相比，在人組織因子敲入(knock-in)(tfki)小鼠中關於dwtviia的尾巴切割研究結果。發現去唾液酸化的因子vii比野生型因子vii明顯更有效。

圖24顯示了施用dwtviia或野生型因子vii以後，凝血酶-抗凝血酶(tat)複合物的elisa分析的結果。

圖25顯示了在fecl3血栓形成模型中血栓形成分析的結果。與野生型因子vii相比，給定劑量的dwtviia產生了極大減少的血栓形成。

圖26顯示了用發螢光的底物測得的，dwtviia和野生型因子vii對可溶性組織因子的表觀結合親合力。

圖27顯示了可溶性組織因子與dwtviia或野生型因子vii的複合物將因子x轉化為因子xa。

具體實施方式

本文描述了用於調節重組因子vii多肽(野生型或變體)的藥代動力學以限制急性出血的治療中的血栓性併發症的方法。還描述了具有減少的唾液酸綴合的因子vii多肽。另外描述了重組因子vii的變體，其具有增強的血液清除率和效力持續時間的下降。由於改變的糖基化模式，這樣的變體具有比重組野生型因子vii更短的體內半衰期。還描述了這樣的短效因子vii多肽的生產和使用方法。

為了解釋因子vii和糖基化，提供了圖3和4。圖3示意地顯示了因子vii分子的3個實施例和它們的結構域。因子vii是由gla、egf和催化結構域組成且含有2個n-連接的聚糖(n145和n322)的蛋白。v1是具有4個突變(p10q、k32e、t106n、v253n)的因子vii變體。v2是具有6個突變(p10q、k32e、a343、r36e、t106n、v253n)的因子vii變體。v1和v2都具有增加的對活化的血小板的親和力且含有2個額外的n-糖基化位點，從而導致與野生型因子vii相比更長的半衰期。認為僅存在於v2中的2個突變(a34e、r36e)造成了它的組織因子無關性。

圖4示意地顯示了n-連接的聚糖的一個實施例，其顯示了在asn-x-ser/thr共有序列中的asn處的連接。顯示了具有不同單糖(包括末端唾液酸)的man3(glcnac)2核心。

本文中提供了製備具有期望的短半衰期的因子vii多肽的方法。提供了兩種一般方法來製備短效因子vii多肽，所述方法可以單獨地或組合地使用。如在圖5中使用因子vii變體的一個實施例示意地顯示的，可以通過去唾液酸化或去糖基化來加工糖基化的因子vii變體以改變變體的糖基化模式和由此改變和優選地縮短它的半衰期。該方法也可以用於將野生型因子vii多肽去唾液酸化。

可以通過本領域已知的任意方法，進行去唾液酸化。合適的方法的例子包括通過與起去唾液酸化功能的任何已知酶接觸進行的酶促去唾液酸化，所述酶包括、但不限於，唾液酸酶包括神經氨酸酶-瓊脂糖珠子(sigman5254)以及在gi:40479和在febslett.238(1),31-34(1988)中鑑別出的得自產氣莢膜梭菌(clostridiumperfringens)的神經氨酸酶。這樣的去唾液酸化可以如下完成：在合適的條件下使部分地純化的重組因子vii多肽與唾液酸酶在體外接觸，或在表達重組因子vii多肽的宿主細胞中共表達唾液酸酶。所述體外接觸可以是使得僅發生部分去唾液酸化的持續時間。例如，如果在因子vii多肽的組合物中以0.5-1的綴合的唾液酸的摩爾數與n-連接的聚糖的摩爾數的比率可以從分子得到期望的半衰期，那麼推薦在完全去唾液酸化發生之前與唾液酸酶接觸有限的時間段。也可以如下使用經修飾的唾液酸酶得到部分去唾液酸化：在減慢或損害唾液酸酶的完全功能的條件下使因子vii多肽與唾液酸酶接觸，或通過本領域技術人員明白的產生僅部分地去唾液酸化的多肽的其它方法。通過與已經完全去唾液酸化的參比製品中的綴合的唾液酸/聚糖的比率進行對比，可以測量部分去唾液酸化。

通過在缺少或缺乏唾液酸添加所需的一種或多種細胞組分的細胞系中表達因子vii多肽(野生型或變體)，也可以完成去唾液酸化。某些細胞系已經或可以進行修飾以減少或除去唾液酸化。例如，具有中國倉鼠卵巢(「cho」)起源的lec2細胞產生具有比野生型細胞少大約10倍的唾液酸的糖蛋白。據信，聚糖的去唾液酸化產生這樣的分子：其可以被肝受體(包括無唾液酸糖蛋白受體(asgpr))主動清除，且由於該原因其半衰期被縮短。

第二個方案是將因子vii變體去糖基化，且由此得到具有縮短的半衰期的分子。糖基化的減少增強通過腎清除(50-60kd截止，綜述見calicetip和veronesefm,「pharmacokineticandbiodistributionpropertiesofpoly(ethyleneglycol)-proteinconjugates,」advdrugdelivrev.2003;55(10):1261-77,weinsteint等人,「distributionofglycosaminoglycansinratrenaltubularepithelium,」jamsocnephrol.1997;8(4):586-95,choihs等人,「renalclearanceofquantumdots,」natbiotechnol.2007;25(10):1165-70)、表面電荷和等電點(pi)變化(其已經與糖蛋白循環的增加相關聯，參見綜述byrneb.等人,「sialicacids:carbohydratemoietiesthatinfluencethebiologicalandphysicalpropertiesofbiopharmaceuticalproteinsandlivingcells,」drugdiscoverytoday2007;12(7-8):319)和通過對於任何數目的血漿蛋白酶的更少的糖蛋白介導的保護(tong.,等人,2005,niey等人,2006)對因子vii的清除。

本文中使用的去糖基化包括、但不限於，產生與參比因子vii多肽相比改變的胺基酸序列的因子vii多肽的遺傳修飾，所述改變除去n-連接的糖基化位點。例如，可以用在n-連接的聚糖共有序列(即，asn-x-ser/thr，其中x代表除了脯氨酸以外的任意胺基酸)所需的一個或多個胺基酸殘基處的破壞糖基化的改變產生因子vii變體。本文中使用的因子vii胺基酸序列的「破壞糖基化的改變」表示相對於野生型因子vii的改變：其導致一個或多個胺基酸殘基的取代、添加或缺失，且其導致n-連接的糖基化的一個或多個位點的缺失。例如，可以通過用任何胺基酸(天然存在的或非天然存在的)替換均存在於野生型因子vii中的n145和/或n322，除去n-連接的糖基化位點。應當鑑別出當被改變以破壞糖基化時對活性具有最小影響的糖基化位點。在另一個實施例中，可以通過在缺少糖基化機制的細胞系中表達因子vii多肽(野生型或變體)，而發生去糖基化。例如，預期在細菌細胞中產生的因子vii是完全未糖基化的，因為細菌細胞缺少糖基化的細胞機制。在另一個實施方案中，在這樣的細胞系中生產因子vii多肽：其缺少末端糖基化酶，或其具有這樣的酶，但是一種或多種酶的活性小於在野生型細胞系中發現的活性。參見，例如，appar.等人,201,naritam等人,1998,seested等人,2010。在另一個實施方案中，在這樣的細胞系中生產因子vii多肽：其在參與聚糖的合成或聚糖與因子vii的連接的酶中具有缺陷，或在參與cmp-唾液酸轉運蛋白的合成的酶中具有缺陷。在另一個實施方案中，將因子vii多肽用去糖基化酶或化學物質處理以去糖基化。

用唾液酸酶、去糖基化酶或化學物質處理以從因子vii多肽減少或除去聚糖，可以發生在表達、純化或純化後階段。

在一個實施方案中，選擇性地除去因子vii變體v1(n322、n145)或因子vii變體v2(n322、n145、n106、n253)中的至少一個n-連接的糖基化位點，且對活性具有最小影響。通過破壞n-聚糖共有序列，在dna水平刪除n-聚糖位點。這通過除去n(天冬醯胺)密碼子和用q(穀氨醯胺)密碼子替換而實現。圖6的表格顯示了低糖基化的變體的實施例。在野生型因子vii(在本文中被稱作「f7」)、v1和v2主鏈上製作糖基化變體。在v1和v2中的經工程改造的n-聚糖位點(n106、n253)恢復成它們的野生型序列(t106、v253)。變體pmb113、pmb117和pmb121是野生型因子vii、v1和v2構建體，其分別含有2個內源性n-糖基化位點(n145、n322)。圖6中的所有其它變體通過引入n至q突變(n145q、n322q)而除去了它們的內源性n-聚糖位點中的一個或兩個。該去糖基化方案導致更快的清除。

在本公開內容的一個方面，將去糖基化和去唾液酸化組合以產生具有合乎需要的縮短的半衰期的因子vii多肽。例如，可以將因子vii分子遺傳修飾以包括除了存在於野生型因子vii中的2個以外的額外n-連接的糖基化位點。然後可以使用本文所述的方法之一將該變體去唾液酸化。得到的分子然後可以保留在每個n-連接的糖基化位點處的聚糖結構，其沒有末端唾液酸。在本文報告的實驗中，申請人報告了這樣的變體：其消除時間快於具有更少n-連接的糖基化位點的類似的去唾液酸化的因子vii變體。類似地，僅具有在野生型因子vii中發現的2個n-連接的糖基化位點的因子vii多肽可以在這些位點之一處去糖基化，並然後進行去唾液酸化。基於本文中報告的實驗證據，得到的具有一個n-連接的聚糖(其缺乏唾液酸)的因子vii變體的藥代動力學不同於不缺少第二個n-連接的糖基化位點的類似因子vii多肽。

定義和實施方案

除非另外定義，否則在本文中使用的所有技術和科學術語通常具有與本公開內容所屬領域的普通技術人員通常理解的相同的含義。通常，在本文中使用的命名法以及在細胞培養、分子遺傳學、有機化學和核酸化學和雜交中的實驗室規程是本領域中眾所周知的和常用的那些。將標準技術用於核酸和多肽合成。在本文中使用的命名法以及在下面描述的分析化學和有機合成中的實驗室規程是本領域中眾所周知的和常用的那些。將標準技術或其改進用於化學合成和化學分析。用於基因工程的規程是眾所周知的，且可以見於，例如，sambrook等人,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharbor,n.y.。

術語「唾液酸」或「唾液酸基」表示九碳羧化的糖家族中的任何成員。唾液酸家族的最常見成員是n-乙醯基-神經氨酸(2-酮-5-乙醯氨基-3,5-二脫氧-d-甘油-d-半乳壬酮吡喃-1-糖酸(常常縮寫為neu5ac、neuac或nana))。

術語「多肽」和「蛋白」在本文中可互換地使用，且表示這樣的聚合物：其中單體是胺基酸且通過醯胺鍵連接在一起。另外，也包括非天然的胺基酸，例如，β-丙氨酸、苯基甘氨酸和高精氨酸。不是由基因編碼的胺基酸也可以與本文中公開的技術一起使用。此外，還可以使用已經被修飾以包括反應基團、糖基化位點、聚合物、治療部分、生物分子等的胺基酸。在本文中使用的所有胺基酸可以是d-或l-異構體。l-異構體通常是優選的。本文中使用的「多肽」和「蛋白」分別表示糖基化的和未糖基化的多肽和蛋白。

術語「胺基酸」表示天然存在的和合成的胺基酸，以及以與天然存在的胺基酸類似的方式起作用的胺基酸類似物和胺基酸模擬物。天然存在的胺基酸是由遺傳密碼編碼的那些，以及以後經過修飾的那些胺基酸，例如，羥脯氨酸、γ-羧基穀氨酸和o-磷酸絲氨酸。「胺基酸類似物」表示這樣的化合物：其具有與天然存在的胺基酸相同的基本化學結構，即，與氫、羧基、氨基和r基團結合的α碳，例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞碸、甲硫氨酸甲基鋶。這樣的類似物具有經修飾的r基團(例如正亮氨酸)或經修飾的肽主鏈，但是保留與天然存在的胺基酸相同的基本化學結構。「胺基酸模擬物」表示這樣的化學化合物：其結構不同於胺基酸的一般化學結構，但是其以與天然存在的胺基酸類似的方式起作用。

在給患者施用多肽或蛋白藥物的背景下，本文中使用的術語「半衰期」或「t1/2」被定義為，使藥物在患者中的血漿濃度減小一半所需的時間。

可以在試驗動物中確定半衰期，例如，通過施用約25-250微克/kg的劑量的製品；在施用以後的預定時間得到血漿樣品；和使用凝固測定(或任何生物測定)、免疫測定或等效測定中的一種或多種確定樣品中的因子vii多肽的含量。可以用圖形展示數據，並然後將生物利用度確定為曲線下面積。在某些實施例中，將大鼠或鼠模型用於半衰期測量。因子vii多肽或其組合物的相對生物利用度表示短效因子vii多肽的曲線下面積與野生型因子vii或另一種適當的比較多肽或蛋白的曲線下面積的比率。具有因子vii的血液凝固活性的任何因子vii變體可用於本文描述的目的和方法。本文中使用的因子vii變體是多肽。術語「變體因子vii多肽」和「因子vii變體」在本文中可互換地使用。在一個實施方案中，因子vii變體具有通過一個或多個胺基酸的取代、缺失和/或插入而從野生型因子vii(seqidno:16)衍生出的胺基酸序列。在命名胺基酸取代中，第一個字母代表在一個位置存在於野生型人因子vii中的胺基酸。後面的數字代表在人野生型因子fvii中的位置。第二個字母代表替換在野生型中發現的胺基酸的胺基酸。例如，「p10q」代表穀氨醯胺(q)取代在胺基酸位置10處的脯氨酸(p)。

在某些實施例中，所述因子vii變體包含選自以下的一個或多個胺基酸取代：p10q、k32e、r36e、a34e、t106n和v253n。在其它實施例中，所述因子vii變體包含這些取代中的至少2、3、4、5或6個。在其它實施例中，所述因子vii變體包含與seqidno:16的胺基酸序列(野生型人因子vii)相比具有至少2個序列改變的胺基酸序列，其中所述至少2個序列改變是(1)穀氨醯胺殘基取代位置10的脯氨酸殘基，和(2)穀氨酸殘基取代位置32的賴氨酸殘基。在另一個實施例中，所述因子vii變體包含與seqidno:16的胺基酸序列相比具有至少3個序列改變的胺基酸序列，其中所述至少3個序列改變是：(1)穀氨醯胺殘基取代位置10的脯氨酸殘基，(2)穀氨酸殘基取代位置32的賴氨酸殘基，和(3)穀氨酸殘基取代位置36的精氨酸殘基。在另一個實施例中，所述因子vii變體包含與seqidno:16的胺基酸序列相比具有至少4個序列改變的胺基酸序列，其中所述至少4個序列改變是：(1)穀氨醯胺殘基取代位置10的脯氨酸殘基，(2)穀氨酸殘基取代位置32的賴氨酸殘基，(3)穀氨酸殘基取代位置36的精氨酸殘基，和(4)穀氨酸殘基取代位置34的丙氨酸殘基。在一個特定實施例中，所述因子vii變體包含與seqidno:16的胺基酸序列相比具有至少6個序列改變的胺基酸序列，其中所述至少6個或6個序列改變是：(1)穀氨醯胺殘基取代位置10的脯氨酸殘基，(2)穀氨酸殘基取代位置32的賴氨酸殘基，(3)穀氨酸殘基取代位置36的精氨酸殘基，(4)穀氨酸殘基取代位置34的丙氨酸殘基，(5)天冬醯胺殘基取代位置106的蘇氨酸殘基，和(6)天冬醯胺殘基取代位置253的纈氨酸殘基。在另一個特定實施例中，所述因子vii變體僅包含這6個改變。關於這些變體的更多細節參見maxygen的wo200158935和pedersen等人的美國專利號7,371,543，它們二者通過引用整體併入本文。

可以使用任意功能因子vii多肽作為起始多肽，設計本文描述的因子vii變體。在某些實施方案中，所述因子vii多肽是人因子vii多肽。在其它實施方案中，所述因子vii多肽是seqidno:16的人因子vii多肽或其經修飾的形式或等位基因變體。有用的起始多肽還包括修飾的或變體因子vii多肽，其包含與野生型人因子vii(seqidno:16)的序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%或66%同一性的胺基酸序列，且其也具有因子vii活性。此外，在某些實施例中，本公開內容的變體因子vii多肽包括與seqidno:16的序列具有至少約99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%或66%同一性的任意多肽，其具有因子vii功能性的且也含有本文中討論的相對於seqidno:16的胺基酸改變中的一個或多個。在另一個實施方案中，所述因子vii多肽包含與seqidno:16具有超過99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%或66%同源性的胺基酸序列且具有因子vii活性，且其也具有一個或多個本文中提及的胺基酸改變。

本文中使用的因子vii變體也包括野生型因子vii的糖基化變體。例如，部分地去唾液酸化的野生型因子vii變體及其組合物可以是有用的，因為它具有比野生型因子vii更短的半衰期。在本文中還有用的是，部分地或完全地去唾液酸化的野生型因子vii的藥物製劑，以及這樣的多肽和製劑在治療本文中列舉的疾病中的用途，所述疾病受益於具有因子vii活性的短效多肽。通過如本文中所述的因子vii多肽的組合物中綴合的唾液酸的摩爾數與n-連接的聚糖的摩爾數的比率，可以測量部分的或完全的去唾液酸化。

編碼本文中的因子vii變體的核苷酸序列也是有用的。在一個實施方案中，所述因子vii多肽由這樣的核苷酸序列編碼：其在全長中與野生型因子vii的核苷酸序列(seqidno:1)具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%或66%同一性，且其編碼功能因子vii多肽。在某些實施例中，所述核苷酸序列也編碼含有本文中討論的相對於seqidno:16的胺基酸改變中的一個或多個的多肽。在另一個實施方案中，所述因子vii多肽由這樣的核苷酸序列編碼：其與野生型因子vii的核苷酸序列(seqidno:1)具有超過99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%或66%同源性，且其編碼功能因子vii多肽。在某些實施例中，所述核苷酸序列也編碼含有本文中討論的相對於seqidno:16的胺基酸改變中的一個或多個的多肽。

在整個胺基酸或核酸序列區域上計算同一性百分比值。技術人員可得到基於多種算法的一系列程序用於對比不同的序列。在至少一個實施方案中，如下確定2個胺基酸序列之間的同一性百分比：使用needleman和wunsch算法(needleman1970,j.mol.biol.(48):444-453)，所述算法已經併入emboss軟體包的針程序中(emboss:theeuropeanmolecularbiologyopensoftwaresuite,rice,p.,longden,i.,和bleasby,a,trendsingenetics16(6),276-277,2000)，使用blosum45或pam250評分矩陣(對於遠距離相關蛋白)或blosum62或pam160評分矩陣(對於更緊密地相關的蛋白)以及16、14、12、10、8、6或4的缺口開放罰分和0.5、1、2、3、4、5或6的缺口延伸罰分。可以在emboss.sourceforge.net找到關於emboss包的本地安裝的指導以及與web-services的連結。要使用所述針程序比對2個胺基酸序列的參數的一個非限制性例子是默認參數，包括eblosum62評分矩陣、10的缺口開放罰分和0.5的缺口延伸罰分。在另一個實施方案中，如下確定2個核苷酸序列之間的同一性百分比：使用emboss軟體包中的針程序(emboss:theeuropeanmolecularbiologyopensoftwaresuite,rice,p.,longden,i.,和bleasby,a,trendsingenetics16(6),276-277,2000)，使用具有16、14、12、10、8、6或4的缺口開放罰分和0.5、1、2、3、4、5或6的缺口延伸罰分的ednafull評分矩陣。要使用所述針程序比對2個胺基酸序列的參數的一個非限制性例子是默認參數，包括ednafull評分矩陣、10的缺口開放罰分和0.5的缺口延伸罰分。可以進一步將核酸和蛋白序列用作「查詢序列」以執行針對公開資料庫的檢索，例如，以鑑別其它家族成員或有關的序列。這樣的檢索可以使用altschul等人的blast系列的程序(2.2版)進行(altschul1990,j.mol.biol.215:403-10)。使用本公開內容的核酸序列作為查詢序列的blast可以用blastn、blastx或tblastx程序使用默認參數執行，以得到與本公開內容的核酸序列編碼的序列同源的核苷酸序列(blastn、tblastx)或胺基酸序列(blastx)。使用由本公開內容的核酸序列編碼的蛋白序列作為查詢序列的blast可以用blastp或tblastn程序使用默認參數執行，以得到與本公開內容的序列同源的胺基酸序列(blastp)或核酸序列(tblastn)。為了得到用於對比目的的含缺口比對，可以如在altschul等人,1997,nucleicacidsres.25(17):3389-3402中所述利用使用默認參數的gappedblast。

本公開內容的多核苷酸基本上由前述核苷酸序列組成，或者包含前述核苷酸序列。因而，它們同樣可以含有其它核苷酸序列。在某些實施方案中，除了開放讀碼框以外，所述多核苷酸還可以包含在編碼基因區域的3'末端和/或5'末端處的其它非翻譯序列，例如在編碼區的5'末端的上遊的序列的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500或更多個核苷酸和/或在編碼基因區域的3'末端的下遊的序列的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500或更多個核苷酸。此外，所述多核苷酸可以編碼融合蛋白，其中所述融合蛋白的一個配偶體是由上面列舉的核苷酸序列編碼的多肽。這樣的融合蛋白可以包含所謂的「標籤」，其可以充當可檢測的標誌物或充當用於純化目的的輔助措施。用於不同目的的標籤是本領域眾所周知的，且包含flag-標籤、6-組氨酸-標籤、myc-標籤等。在一個實施方案中，所述多核苷酸進一步包含與核苷酸序列可操作地連接的表達控制序列。

在某些實施方案中，將編碼因子vii多肽的核酸序列插入合適的載體中。眾多可用於不同目的的載體是本領域眾所周知的，且本領域技術人員能夠為他們的期望應用容易地選擇適當的載體。在某些實施例中，所述載體可以是克隆載體或表達載體。在其它實施例中，所述載體可以是質粒、病毒載體、粘粒或人工染色體。在某些實施例中，可以將編碼因子vii多肽的核酸放置在適當的啟動子附近和/或在適當的啟動子控制下。眾多可用於不同目的的啟動子是本領域眾所周知的，且本領域技術人員能夠為他們的期望應用容易地選擇適當的啟動子。在某些實施例中，所述啟動子可以是組成型啟動子、誘導型啟動子或組織特異性的啟動子。

在某些實施方案中，在細胞、組織或生物體中重組地生產因子vii多肽。在某些實施方案中，這樣的重組生產如下完成：用編碼變體多肽的核酸分子或含有這樣的核酸的載體轉化或轉染宿主細胞。眾多轉化和轉染方法是本領域眾所周知的，且本領域技術人員能夠為他們的期望應用容易地選擇適當的方法。

這樣的重組生產還可以使用任意合適的宿主細胞、組織或生物體完成。合適的細胞、組織和生物體是本領域眾所周知的，且本領域技術人員能夠為他們的期望應用容易地選擇適當的宿主。在某些實施方案中，所述宿主細胞是哺乳動物。合適的哺乳動物細胞系的例子是cos-1(atcccrl1650)、幼倉鼠腎(bhk)、hek293(atcccrl1573;graham等人,j.gen.virol.36:59-72,1977)、hek293t(atcccrl11268;dsmacc2494)和hek293f(invitrogenr79007)細胞系。一種有用的bhk細胞系是tk31ts13bhk細胞系(waechter和baserga,proc.natl.acad.sci.usa79:1106-1110,1982,通過引用併入本文)，在下文中被稱作bhk570細胞。bhk570細胞系已經在atcc登錄號crl10314下保持於美國典型培養物保藏中心(americantypeculturecollection,12301parklawndr.,rockville,md.20852)。tk-ts13bhk細胞系也可在登錄號crl1632下從atcc得到。另外，在本公開內容內可以使用許多其它細胞系，包括rathepi(大鼠肝細胞瘤;atcccrl1600)、rathepii(大鼠肝細胞瘤;atcccrl1548)、tcmk(atccccl139)、人肺(atcchb8065)、nctc1469(atccccl9.1)、cho(atccccl61)、chok1(atcccci61)、dukx細胞(urlaub和chasin,proc.natl.acad.sci.usa77:4216-4220,1980)和cho-dg44細胞(urlaub等人.cell33:405-412,1983)。

這樣的因子vii多肽的組合物是有用的：其中因子vii多肽如本文中所定義，且所述組合物中綴合的唾液酸的摩爾數與n-連接的聚糖的摩爾數的比率小於0.05、小於0.1、小於1.0、小於2.0、小於3.0、小於4.0、小於5.0或小於6.0，或其中綴合的唾液酸的摩爾數與n-連接的聚糖的摩爾數的比率是在選自以下的範圍內的組合物：(1)0-8；(2)0-7；(3)0-6；(4)0-5;(5)0-4；(6)0-3；(7)0-2；(8)0-1和(9)0-0.5，或1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-8、4-7、4-6、4-5和0.1-1的比率。所述比率是與糖蛋白結合的唾液酸的摩爾數相對於糖蛋白上的聚糖的數目的量度。聚糖的數目表示糖蛋白中與n-連接的聚糖連接的糖部分的數目，其中一個n-連接的糖基化位點僅可以支持一個用於該比率目的的如本文中定義的聚糖。使用唾液酸螢光標記試劑盒諸如由takarabioinc.銷售的試劑盒(目錄號4400)，確定所述比率。這樣的唾液酸螢光標記試劑盒包括從結合的糖蛋白釋放唾液酸的步驟，諸如通過部分酸水解或通過使用唾液酸酶，諸如產脲節桿菌(arthrobacterureafaciens)唾液酸酶。然後用螢光團諸如1,2-二氨基-4,5-亞甲基氧基苯(「dmb」)標記游離的唾液酸。然後使用hplc定量地測量經標記的唾液酸，並將峰高與校正曲線進行對比。因而，測量的比率是唾液酸的摩爾數與從組合物的所有因子vii多肽釋放的聚糖的摩爾數的比率。

在一個系列的實施方案中，因子vii多肽的組合物或分離的多肽本身具有如在人或哺乳動物血漿(例如鼠或大鼠血漿)中測得的以下半衰期：小於2小時，小於1.5小時，小於1小時，小於75小時，小於5小時，小於25小時，小於0.1小時，或短至它不可適當地測量。

本文中使用的因子vii活性是可以如下定量的生物活性：如本領域眾所周知的，使用因子vii-缺陷血漿和促凝血酶原激酶測量製品的促進血液凝固的能力。在某些實施例中，具有因子vii活性的因子vii多肽顯示出在相同條件下測量的野生型因子vii的活性的至少25%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。

因子vii多肽的藥物製劑及其包含因子vii多肽和藥學上可接受的賦形劑或載體的組合物也是有用的。在某些實施例中，所述藥物製劑用於胃腸外施用，諸如通過靜脈內、皮下或肌肉內施用，且施用可以是作為單個單次劑量、間歇施用或作為連續靜脈內輸注。局部製劑也是有用的。一個實施方案包含這樣的藥物製劑：其含有如本文中所述的分離的因子vii多肽，或含有如本文中所述的因子vii多肽的組合物，呈在使用時重構的低壓凍幹製品的形式。可替換地，所述藥物製劑可以是穩定的現成即可使用的液體製劑，不需要重構。所述藥物製劑可以是在一次性使用的管形瓶中的1、2、5或8mg因子vii多肽的低壓凍乾粉末。在用指定體積的液體(諸如含有組氨酸的無菌水)重構以後，最終的溶液可以含有產生治療效果的任意合適量的因子vii多肽，例如，但不限於，1mg/ml(1000微克/ml)、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、1-2mg/ml、1-3mg/ml、1-5mg/ml、1-10mg/ml、0.5-1mg/ml或0.5-2mg/ml的因子vii多肽。本領域技術人員基於例如患者的重量、要治療的出血障礙或發作的類型、和採用的特定因子vii多肽的活性，可以容易地確定用於施用給患者的適當劑量。在某些實施例中，施用可以是在70-110微克/kg、70-90微克/kg、或80-100微克/kg的範圍內，且可以是90微克/kg。低壓凍乾粉末可以用水性載體(諸如水、緩衝的水、0.4%鹽水、0.3%甘氨酸等)重構。用於製備胃腸外施用的組合物的實際方法是本領域技術人員已知的或顯而易見的，並且更詳細地描述在，例如，remington'spharmaceuticalsciences,第18版,mackpublishingcompany,easton,pa.(1990)。局部施用(諸如在創傷的情況下是適當的)可以藉助於噴霧劑、灌注法、導管、支架、血管移植物或支架、軟膏劑或本領域已知的其它製品來實現。在某些實施例中，局部施用可以是通過固體或半固體基質，諸如外科手術海綿或膠原基質，其已經用包含因子vii變體的組合物處理、浸漬、包被或浸泡。製備這樣的基質的方法是本領域眾所周知的(參見，例如，thrombosis/hemostasis12:445,2006)，且技術人員能夠容易地確定適當的劑量和將組合物應用於給定基質上的方法。

在一個實施方案中，本公開內容涉及包含因子vii多肽的試劑盒。在某些實施例中，所述試劑盒含有瓶，所述瓶裝有現成即可使用的液體，所述液體含有在合適的藥物組合物中的因子vii多肽。在其它實施例中，所述試劑盒含有瓶，所述瓶裝有低壓凍幹的因子vii多肽、或包含多肽的低壓凍幹製劑以及用於重構的稀釋劑。在其它實施例中，所述試劑盒含有因子vii多肽的局部製劑，例如，軟膏劑、噴霧劑或液體，和在施用給患者之前可以向其應用局部製劑的基質，諸如海綿或其它醫學基質。

本文描述的因子vii多肽的組合物也是有用的。因子vii與它的天然降解產物一起存在於混合物中。因此，因子vii多肽的組合物包括具有如本文中列舉的完整胺基酸序列之一的多肽和具有本文描述的那些的部分胺基酸序列的降解產物。此外，因為因子vii是糖蛋白，可以預期因子vii的組合物含有因子vii多肽的異質混合物，其中所述組合物中的每種糖蛋白不具有與其它糖蛋白完全相同的糖基化。對因子vii多肽的組合物或分離的因子vii多肽的提及意在包括這樣的多肽的混合物，其中所述各種多肽具有不同的糖基化，且因而術語「組合物」或「分離的因子vii多肽」包括在所述多肽內的糖基化模式的異質性。

本文描述的因子vii多肽和組合物可用於治療血液凝固障礙，和從血液凝固受益的那些障礙，且特別是對於使用具有比野生型因子vii更短的半衰期的藥物的凝固。因此，本文中的因子vii多肽和組合物可用於穿透性創傷損傷；鈍性創傷損傷；在可選的外科手術中的出血；在心臟外科手術中的出血；在脊柱外科手術中的出血；矯形外科手術；神經外科；腫瘤學外科手術；產後外科手術；月經過多；在幹細胞移植中的出血；在肝移植中的出血；胃腸出血；在肝硬化中的活躍靜脈曲張所致的出血；在肝硬化中的非靜脈曲張所致的出血；瀰漫性肺泡出血；主動脈瘤；腦內出血；創傷性腦損傷；腦挫傷；華法林的反轉；肝素的反轉；抗凝血劑的反轉；抗血栓劑的反轉；因子vii缺乏；燒傷；用抑制劑在血友病患者中的預防；無肝硬化的和肝硬化的患者的部分肝切除術；獲得性血友病；特發性血小板減少性紫癜；glanzmann氏血小板無力症；血小板輸注難治的glanzmann氏血小板無力症和bernard-soulier症候群。

本文中還公開了一種用於測量凝固因子(諸如因子vii)的半衰期的有用測定。存在一種確定凝固因子的半衰期的方法，所述方法包括，將活的大鼠肝細胞與凝固因子一起溫育，在試驗時間點1取出樣品，將樣品中的上清液與細胞分離，和定量樣品的上清液中的凝固因子的活性或量，其中所述凝固因子的活性或量使用雙抗體夾心elisa測定來確定。可以在不同的時間點重複該方法，以形成血液凝固因子的活性或量隨時間的圖。

實施例

得到去唾液酸化的因子vii多肽的方法

採用眾多方法來製備去唾液酸化的因子vii多肽(野生型和變體)，包括將多肽酶促去唾液酸化、在唾液酸化-缺陷型細胞系中生產因子vii多肽和在重組細胞中共表達因子vii和唾液酸酶。

唾液酸缺陷型細胞系的製備

在包含由32種酶組成的複雜途徑的哺乳動物細胞中合成內源性唾液酸(wickramasinghe和medrano2011)。唾液酸的生物合成在胞質溶膠中開始，其將udp-n-乙醯基葡糖胺(udp-glcnac)轉化成neu5ac，涉及幾種酶，諸如udp-n-乙醯基葡糖胺-2-差向異構酶/n乙醯基甘露糖胺激酶(gne)、唾液酸9-磷酸合酶(nans)和唾液酸9-磷酸磷酸酶(nanp)。胞質溶膠中的neu5ac穿過核孔輸入核中並通過被稱作cmp-sia合酶(cmas)的酶轉化成cmp-neu5ac。合成的cmp-neu5ac再次經由核孔運輸回胞質溶膠中用於在高爾基體中進一步修飾和綴合。胞質溶膠中neu5ac向neu5gc的轉化由酶cmp-neuac-羥化酶(cmah)催化。然後，cmp-neu5ac和cmp-neu5gc經由位於中間反-高爾基體(trans-golgi)的膜中的疏水3型膜轉運蛋白cmp-唾液酸轉運蛋白(slc35a1)運輸進高爾基體隔室中。cmp-唾液酸轉運蛋白是細胞唾液酸化途徑中的一個關鍵元件(hirschberg,等人.1998)。該基因的純合突變在小鼠中造成出生後致死(mgi4.32,同源基因)。在人類中，slc35a1中的突變與唾液酸基綴合物的減少或完全缺少有關。slc35a1中的一些插入和缺失突變與人類的糖基化的先天性障礙有關，從而導致神經系統發育、凝固和免疫缺陷的缺陷(martinez-duncker,等人,2005)。cmp-neu5ac/cmp-neu5gc一旦被運輸進高爾基體中，它們就通過具有20個成員的唾液酸轉移酶(st)家族中的酶與碳水化合物、糖蛋白和糖脂綴合。

cmp-唾液酸轉運蛋白(slc35a1)是支持高爾基體中的唾液酸綴合的關鍵分子，且該轉運蛋白的突變導致缺乏適當唾液酸化的蛋白的合成。為了生產去唾液酸化的因子vii，製備敲除了cmp-唾液酸轉運蛋白基因的因子vii生產細胞系。可替換地，可以通過在生產在治療分子上具有非常低唾液酸化水平或沒有唾液酸化的蛋白治療劑的細胞系中表達因子vii變體，實現去唾液酸化。該技術可以用於生產在患者中具有短t1/2的治療性蛋白。

鑑別出具有中國倉鼠卵巢(cho)起源的lec2細胞，其具有生產比各野生型細胞少大約10倍的糖蛋白和糖脂中的唾液酸的性質(stanley和siminovitch,1977,stanley,1980和1983)。以後的研究表明，lec2突變體不能在體外測定中跨高爾基囊泡的膜轉移cmp-唾液酸，而其它核苷酸衍生物的易位在突變細胞中是比較正常的(deutscher,等人,1984)。通過使用表達克隆，報告了得自lec2細胞的編碼cmp-唾液酸轉運蛋白的基因(eckhardt等人,1996)。進一步研究指示，cmp-唾液酸轉運蛋白基因中的核苷酸575-751的缺失引起lec2表型(eckhardt,等人,1998)。cmp-唾液酸轉運蛋白基因中的其它突變(諸如在1e3、6b2、8g8和9d3細胞的情況下)也導致lec2表型(eckhardt,等人,1998)。

實驗1

設計該實驗以確定cmp-唾液酸轉運蛋白的基因中的突變(諸如在lec2細胞的情況下)是否導致表達的重組蛋白(例如，因子vii)與從正常cho細胞表達的相同蛋白相比具有唾液酸化缺陷。

(1)試驗得自lec2細胞的重組蛋白(諸如因子vii)的表達。在正常轉染條件下將含有因子vii變體基因的表達載體(例如，pmb117和pmb121)轉染進lec2細胞和正常cho細胞中。通過因子vii活性測定，監測得自這些細胞的細胞培養物的因子vii的表達水平。將轉染的細胞的培養放大，並將培養條件培養基收穫用於純化因子vii。

(2)試驗純化的從lec2細胞表達的因子vii相對於從正常cho細胞表達的相同蛋白的唾液酸含量。按照正常因子vii純化方法，從這些條件培養基純化因子vii。關於純化的因子vii的唾液酸含量，分析純化的得自lec2細胞或正常cho細胞的因子vii。如本文中所述，分析生物活性和藥代動力學(pk)參數。

實驗2

為了生產製造細胞系以表達因子vii變體(其在表達的重組蛋白上沒有唾液酸)，使用靶向cmp-唾液酸轉運蛋白基因的基因刪除方法以修飾表達因子vii的細胞系(例如，cho細胞系)。為了完全抑制細胞中的唾液酸化，還可以任選地刪除其它靶標，諸如上面在介紹中列出的udp-n-乙醯基葡糖胺-2-差向異構酶/n乙醯基甘露糖胺激酶(gne)、唾液酸9-磷酸合酶(nans)、唾液酸9-磷酸磷酸酶(nanp)和cmp-sia合酶(cmas)，以增強cmp-neu5ac生物合成的抑制，所述生物合成為cmp-唾液酸轉運蛋白提供底物。

兩種基因刪除技術，得自lifetechnologies的talenucleases(talens)和得自sangamobiosciences/sigma-aldrich的zfpnucleases(zfns)，可以用於進行cmp-唾液酸轉運蛋白基因的敲除或唾液酸合成途徑中的多個基因的敲除。

評價敲除了cmp-唾液酸轉運蛋白基因的因子vii表達細胞系以證實cmp-唾液酸轉運蛋白基因的刪除。培養經證實的細胞系以生產因子vii。如本文中所述純化和評價得自刪除了cmp-唾液酸轉運蛋白基因的細胞系的因子vii，並針對分子上的唾液酸含量與得自親本因子vii表達細胞系的因子vii進行對比。

通過因子vii和細菌唾液酸酶的共表達來生產去唾液酸化的因子vii

為了製備去唾液酸化形式的fvii，我們將fvii與衍生自產脲節桿菌唾液酸酶(au唾液酸酶)(n-乙醯神經氨酸糖水解酶,ec3.2.1.18)的細菌唾液酸酶變體一起共表達。使用pj608表達載體，用au唾液酸酶進一步轉染穩定地表達fvii(例如，具有p10q、k32e、a34e和r36e突變的seqidno16)的cho細胞。表達的蛋白具有在n-端處的生長激素信號序列以促進蛋白的分泌。選擇生產au唾液酸酶的穩定克隆，如通過產色測定針對培養基中的唾液酸酶所檢測的。我們還證實，所述細胞繼續表達高水平的fvii蛋白，這使用fvii特異性抗體作為探針通過elisa測定、sdspage和蛋白質印跡法檢測到。使用凝集素印跡測定，我們使用純化的fvii不能檢測條件培養基中的fvii蛋白上的唾液酸。相反，經純化的從未用唾液酸酶轉染的細胞衍生出的fvii的類似水平表明強凝集素結合信號。總之，我們的數據表明，在cho細胞培養基中表達的au唾液酸酶的水平足以有效地去唾液酸化所述細胞共表達的fvii。

使用可溶性唾液酸酶處理酶促地製備去唾液酸化的因子vii

在該實驗性試驗中利用下述起始原料：

因子vii：20mg野生型因子viia，濃度約1mg/ml

唾液酸酶：20ug，0.25mg/ml，50000u/ml，p0720l，購自newenglandbiolabs

緩衝溶液a：25mm組氨酸，50mmnacl，ph6.4

緩衝溶液b：25mm組氨酸，1mnacl，ph6.4

fviia配製緩衝液:2.3mg/ml氯化鈉,1.5mg/ml脫水氯化鈣,1.3mg/ml甘氨醯甘氨酸,0.1mg/ml聚山梨酯80,25mg/ml甘露醇,10mg/ml蔗糖,0.5mg/ml甲硫氨酸,1.6mg/ml組氨酸,ph6.0

純化柱:5mlhitrapqsepharosehp柱。

使用這些材料，進行下述規程：

1.向20mgfviia(約1mg/ml)中加入20ug唾液酸酶(0.25mg/ml,1:1000質量比)

2.將反應物在室溫溫育過夜(約19小時)，然後如下所述通過色譜法純化去唾液酸化的fviia。

3.如下在5mlhitrapqsepharosehp柱上純化去唾液酸化的fviia：

a)用5柱體積的緩衝液a(25mm組氨酸,50mmnacl,ph6.4)平衡q-sepharose柱。

b)在上柱之前，用200ml緩衝液a稀釋fviia和唾液酸酶反應物，並將ph調至6.4。

c)使用aktaexplorer系統以2.5ml/min的流速加載，同時監測a280。收集穿流級分。

d)加載結束以後，用10柱體積的緩衝液a洗滌柱。

e)在40min中用20柱體積的0-50%緩衝液b(25mm組氨酸,1mnacl,ph6.4)洗脫柱。收集峰級分(desialylatednovoseven)

f)在4℃在fviia配製緩衝液中透析峰級分過夜。

g)在-80℃冷凍樣品的等分試樣。

通過sds-page、asec證實產物是高純度的，且其在關於fviia的生物學測定中具有活性。關於唾液酸含量的測定表明沒有殘餘的唾液酸，且重鏈的lc-ms分析表明，除了唾液酸的除去以外沒有顯著的聚糖結構改變。

使用神經氨酸酶-瓊脂糖珠子酶促製備去唾液酸化的因子vii

本文中使用的重組野生型因子vii是從novonordisk得到的novoseven®，且在本文中被稱作「f7」。其它起始原料是如上所述的v1和v2。

將冷凍的起始原料在37℃水浴中快速融化和合併。通過離心使蛋白濃縮2.5倍；通過吹打使濃縮物輕輕混合，以使在蛋白-過濾器界面處的任何超濃縮(聚集)最小化。

將v2從它的v2配製緩衝液(含有組氨酸、cacl2、海藻糖、甲硫氨酸和痕量水平的吐溫®-20，在ph6.4-6.6)緩衝液交換進mes緩衝液(含有10mmmes、10mmcacl2、50mmnacl，ph6.0，無菌過濾)中。這通過三種方式之一實現。在第一種選擇中，將v2用nap-10重力流動柱(ge,17-0854-01)緩衝液交換，所述柱每次用3柱體積的mes緩衝液預洗滌3-5次。然後將v2加載到柱上，並用1.5倍加載體積的mes緩衝液洗脫。在第二種選擇中，通過在mes緩衝液中透析過夜對v2進行緩衝液交換。將透析盒預浸泡在mes緩衝液中，並用注射器將v2加載進3.500mwcoslide-a-lyzer盒(thermoscientific,66130)中在含有無菌過濾的mes緩衝液的10l容器(pitcher)中在4℃過夜。在第三種選擇中，將v2穿過sephadexg-25(sigma,g-25-80)凝膠過濾柱緩衝液交換進mes緩衝液中，並用mes緩衝液平衡。

將緩衝液交換的v2用神經氨酸酶-瓊脂糖(sigman5254)去唾液酸化。將瓊脂糖珠子產品提供在50%漿混合物中，在硫酸銨緩衝液中儲存；將珠子在mes緩衝液中預洗滌3-5次；通過在4℃在1000rcf離心3min，分離珠子/緩衝液混合物，並將上清液液體用移液器移出和拋棄。向經洗滌的珠子中加入緩衝液交換的v2，並通過在室溫旋轉16-22小時輕輕混合。將2.08ml填充的珠子/mg蛋白用於去唾液酸化；對於更大規模的製備，將其1:10減小，達到0.208ml珠子/mg蛋白。此後，將去唾液酸化的v2通過離心回收並用移液器移出。通過在1:1體積的新鮮mes緩衝液中旋轉，將珠子再次輕輕洗滌5分鐘；如前將洗液混合物離心，並將上清液與v2合併。最後通過穿過0.2微米注射器式濾器的無菌過濾或通過穿過0.45微米濾器的真空過濾，除去珠子。

用endotraphd樹脂(hyglos)進行幾輪內毒素除去。將樹脂在mes緩衝液中洗滌3-5次，並拋棄洗滌緩衝液。在兩批中，將1-3ml經洗滌的樹脂與去唾液酸化的v2一起在室溫輕輕混合過夜。通過離心除去樹脂，然後穿過注射器或真空濾器過濾。

通過在ultracels中離心10-分鐘循環，將去唾液酸化的v2濃縮4.75倍至2.1mg/ml；將濃縮物通過吹打輕輕混合，以減少在蛋白-過濾器界面處的任何聚集。

用hiload26/60superdex200尺寸排阻柱，將去唾液酸化的v2與較高分子量物質(和聚集的內毒素)進一步分離。將柱和akta純化器系統用0.1nnaoh+20%etoh預消毒。將該系統進行ph中和，用水衝洗，並用重構的和合併的v2配製緩衝液平衡。將幾批濃縮物手工地注射進12ml樣品環中，並以3ml/min的流速加載到尺寸排阻柱上；將洗脫液回收，並用frac-900分級分離進聚苯乙烯試管(17x100mm,fisherbrand,14-956-6d)中。在早期，將高分子量峰排除，並將期望的v2級分合併，並使用charlesriverendosafepts和nanodropnd-1000試驗內毒素水平和濃度。使用v2緩衝液洗脫去唾液酸化的v2。

進行5批尺寸排阻，並將收集的洗脫液合併成一批，將其在ultracels中濃縮至1.0mg/ml。將最終的製品穿過0.2微米注射器式濾器進行無菌過濾，並試驗內毒素和濃度。將1ml等分試樣移入標記的2ml試管(sarstedt,72.694.006)中，在乙醇/乾冰批中快速冷凍，並在-80℃在標記的盒子中儲存備用。

表徵-蛋白分析和體外測定

通過使用在mes運行緩衝液中的4-12%bis-trisnupage(novexnp0335box)的蛋白凝膠分析和通過分析尺寸排阻(tsk3000柱；運行緩衝液:200mmkh2po4,150mmkcl,ph6.8,流速:0.15ml/min,螢光檢測)，表徵最終的製備材料以及未處理的起始原料。與使用本文中討論的takarabioinc.試劑盒進行總蛋白的dmb-標記的唾液酸定量一樣，通過lc-ms分析小試驗樣品中因子vii重鏈上的唾液酸含量。通過磷脂依賴性的因子x活化和凝血酶產生測定，試驗活性。

唾液酸含量分析

對於未處理的對照和去唾液酸化的因子vii，使用lc-ms方法鑑別因子vii的重鏈的n-聚糖上的唾液酸。將10µg蛋白用10mmdtt混合物在37℃還原30min，然後在agilent1200capillarylc系統上分析：柱：plrp-s8µm4000a，0.3x150mm，75℃。緩衝液系統：a：含有0.2%甲酸+0.01%tfa的水；b：含有0.2%甲酸+0.01%tfa的acn。梯度：50µl/min,在2min中達到10%b，在25min中達到90%b，90%b洗滌5min，10%b平衡5min。

agilent6520q-tof系統：dualesi源，氣體溫度：350℃，乾燥氣體：7psi，噴霧器：10psi，掃描範圍：500-3000amu，1波譜/s。參考離子：1221.990637和2421.91399amu，50ppm窗，min1000計數。

結果報告在圖7中。

使用dmb標記試劑盒的唾液酸定量

將唾液酸螢光標記試劑盒(takarabioinc.,目錄號4400)用於唾液酸糖綴合物的定量和高靈敏度分析。使用1,2-二氨基-4,5-亞甲基氧基苯(dmb)的該基於hplc的唾液酸螢光標記技術是一種簡單的且高靈敏度的定量方法。在該方法中，在通過dmb標記以後，通過反相hplc(glycosepr，得自glyko，#1-4727)分析游離的唾液酸。

結論

v2重鏈具有2個n-糖基化位點。n-聚糖是巖藻糖基化的、重度唾液酸化的二-、三-和四-結構。在去唾液酸化的樣品上沒有發現末端唾液酸，這提示樣品被完全去唾液酸化，並且已經除去了因子viin-聚糖上的>99.9%的唾液酸。

使用大鼠肝細胞的半衰期測定

肝細胞的製備

從cellzdirect(invitrogen)得到冷凍保存的原代大鼠肝細胞。將每個含有大約500萬個細胞的瓶融化，並將細胞加入10ml融化培養基中，隨後在60g離心3分鐘。將細胞再懸浮於溫育培養基+0.25%bsa(約4ml)中，並使用血球計數器計數細胞。在用錐蟲藍染色以鑑別死細胞以後，計數活細胞。細胞生存力是80-82%。在計數以後立即在清除測定中使用細胞。

融化培養基：將invitrogencm3000thawing/platingsupplementpack加入500mlwilliamse培養基中。溫育培養基：將invitrogencm4000cellmaintenancesupplementpack加入500mlwilliamse培養基中。

體外肝細胞清除測定

在eppendorf管中將原代大鼠肝細胞(100萬活細胞/ml)與25ng/ml不同因子vii變體一起在cellzdirect溫育培養基+0.25%bsa中在輕輕翻滾式混合下在37℃溫育，開始體積為1.2ml。在每個指定的時間點，將0.25ml混合物除去並立即離心以沉澱細胞(1000rpm，3分鐘，在eppendorf離心機中)。將0.18ml澄清的上清液取出，快速冷凍，並在-80℃儲存過夜。在次日，使用elisa測定定量上清液中的因子vii，其中使用對應的經純化的突變蛋白作為標準品。使用無細胞對照上清液(其中將因子vii變體在單獨培養基中在37℃溫育2小時)作為零時間點值。一式三份地進行每次溫育。基於lu等人(lu參考文獻)的方法，使用方程式clint=0.693/體外t1/2，計算固有清除率值，針對溫育體積和細胞數目標準化。使用程序winnonlin(pharsightcorporation,sunnyvale,ca)，計算體外半衰期(t1/2)。使用雙抗體夾心elisa形式，測定得自肝細胞溫育的上清液。將0.1ml/孔的抗-因子vii單克隆抗體(1.0µg/ml,在pbs中)加入greinermicrolon65506196-孔平板中。在4℃溫育過夜以後，將平板用0.2ml/孔的1%酪蛋白封閉緩衝液(50mmtrishcl,100mmnacl,0.05%吐溫20ph7.2)在37℃封閉1.5小時。將平板用0.3ml/孔pbs+0.05%吐溫20(使用biotekelx405平板清洗機)洗滌4次，然後將有關的因子vii標準品和未知樣品加入平板中。通過加入0.18ml稀釋緩衝液(50mmtrishcl,100mmnacl,0.1%酪蛋白,0.05%吐溫20ph7.2)，將0.18ml每種肝細胞上清液稀釋2倍。將0.10ml每種稀釋的上清液一式三份地加入elisa板中。從在稀釋緩衝液中稀釋的對應的經純化的因子vii變體製備標準品。在稀釋緩衝液中製備標準品的2倍系列稀釋物，以產生在50-0.8ng/ml終濃度的範圍內的稀釋液。將因子vii標準品和樣品(0.1ml/孔)在室溫(21℃)溫育2小時。如上所述將平板洗滌4次，然後加入1µg/ml的在稀釋緩衝液(50mmtrishcl,100mmnacl,0.1%酪蛋白,0.05%吐溫20ph7.2)中的生物素化的檢測抗體(0.1ml/孔)，然後在室溫溫育1.5小時。如上所述將平板洗滌4次，然後加入在稀釋緩衝液中1/1000稀釋的抗生蛋白鏈菌素-辣根過氧化物酶(0.1ml/孔)，隨後在室溫溫育1小時。將平板再次洗滌，並加入0.1ml/孔的ultra-tmb。在室溫溫育10-15分鐘以後，通過加入0.05ml/孔的2mh2so4，停止反應。使用moleculardevicesspectramaxm2平板讀數器，在450nm讀出吸光度。使用softmaxpro5.4(moleculardevices)進行數據分析。

冷凍保存的大鼠肝細胞、融化培養基和溫育培養基(cellzdirect)得自invitrogen/lifetechnologies(grandisland,ny)。1-stepultra-tmb(onestep)底物，目錄號34028，得自thermoscientific(rockford,il)。抗生蛋白鏈菌素-辣根過氧化物酶(sa-hrp)，目錄號dy998，得自r&dsystems,minneapolis,mn。磷酸鹽緩衝鹽水(ph7.2)得自invitrogen(carlsbad,ca)。sprague-dawley大鼠血漿(5%檸檬酸鈉抗凝血劑)得自bioreclamation(westbury,ny)。通過fisherscientific(pittsburgh,pa)得到greinermicrolon平板(目錄號655061)。

得到去糖基化的變體的方法：分子變體

野生型因子viia具有2個n-聚糖(n322和n145)，且v1和v2各自具有4個n-聚糖(n106、n145、n253、n322)。最初設計了在v1和v2中發現的另外2個n-聚糖(n106、n253)以增加半衰期。為了該工作，通過將它們恢復成野生型因子vii的內源性胺基酸序列(t106、v253)來除去這些位點。然後通過在這些位點處工程設計n→q突變(圖6)，在dna水平除去剩餘的2個內源性n-聚糖位點(n145和n322)。

將野生型因子vii克隆進pmcmv中以製備pmb113。合成了含有在胺基酸位置145或322處的單個n至q突變以及雙突變體(胺基酸145和322)的插入序列，並使用xbai和pmli位點克隆進pmb113中，產生克隆pmb114-116。然後使用asci和afei將編碼v1和v2的gla結構域的插入序列克隆進pmb113-116中，並產生構建體pmb117-120(基於v1的變體)和pmb121-124(基於v2的變體)。對所有構建體進行序列驗證(mclab)。經由電穿孔，以6孔形式用每種構建體瞬時轉染哺乳動物細胞(cho衍生出的細胞系)。轉染後4天，收集上清液，並通過蛋白質印跡測定表達，隨後進行hfviielisa(assaypro)和fvii活性測定。然後將一個變體子集進行單細胞克隆。將被稱作pmb121的v22-n聚糖變體純化和活化用於進一步分析。

從10lwave表達純化/活化fviia的方法

方法簡介

使用歷時幾天進行的多步法，從滲濾的濃縮條件培養基純化和活化fvii。首先將培養基融化和離心，以除去在冷凍/融化過程中可能已經形成的任何聚集體。使用假親和捕獲步驟(其採用用cacl2洗脫的陰離子交換柱(q-sepharose))進一步濃縮fvii蛋白和改變緩衝液。接著，使用羥磷灰石柱進一步純化fvii蛋白。然後使用更小的q-sepharose柱進一步純化fvii，然後將它在ph7.8-8.2的溶液中活化24小時。通過將ph降低至4.0，停止活化反應。最後將fviia在配製緩衝液(ph6.5)中透析並冷凍保存。

通過sds-page、asec、elisa、糖分析、內毒素和fviia活性測定，表徵最終的純化的蛋白。

fviielisa

zymutestfvii酶聯免疫測定(aniara,westchester,ohio)。elisa是使用與96-孔微量培養板的孔結合的兔抗-fvii多克隆抗體的雙位點免疫測定。引入樣品，隨後引入與辣根過氧化物酶(hrp)偶聯的兔抗-fvii多克隆抗體。按照生產商的說明書進行測定。簡而言之，在96-孔圓底聚丙烯稀釋板中將樣品和校準品在測定緩衝液中稀釋。將50µl稀釋的樣品的等分試樣轉移至提供的兔抗-fvii包被的平板，並在室溫溫育15分鐘。加入200µlhrp偶聯的兔抗-fvii，並在室溫溫育1小時。將平板用300µl提供的洗滌緩衝液洗滌5次。以200µl/孔加入tmb並在室溫溫育大約5分鐘。通過引入50µl0.45m硫酸，停止反應。在450nm讀出吸光度。通過將樣品值與使用4-參數曲線擬合產生的v2校正曲線進行對比，推導出因子vii水平。

因子vii產色測定

使用biophenfvii產色測定(aniara,westchester,ohio)。產色測定原理涉及由得自樣品的因子vii和生產商供給的兔促凝血酶原激酶(組織因子)組成的酶複合物的形成。以過量加入的fx被活化成fxa，其又切割fxa特異性的生色底物(sxa-11)，從而產生pna。釋放的pna的量與fxa活性直接成比例。按照生產商的說明書進行測定。簡而言之，在96-孔圓底聚丙烯稀釋板(fisherscientific)中在tris-bsa測定緩衝液中稀釋樣品和校準品。在使用之前，將試劑盒試劑r1、r2和r3和96孔平底聚苯乙烯測定板(costar)溫熱至37℃。將30µl樣品和校準品從稀釋板轉移至測定板，隨後轉移30µl試劑r2，然後轉移60µl試劑r1。將測定板混合併在搖滾式板振蕩器(boekelscientific)中在37℃溫育7分鐘。加入60µlr3，並使用spectramaxplus微量培養板讀數器(moleculardevices)在37℃測量吸光度的變化速率(在405nm/min的od變化)。通過將樣品值與使用4-參數曲線擬合產生的v2校正曲線進行對比，推導出因子vii水平。

磷脂依賴性的凝血酶產生測定

與野生型fviia相比，作為額外γ-羧基化的結果，gla-結構域的修飾(p10q/k32e)增加在有陰離子磷脂或活化的血小板存在下fx活化、凝血酶產生和全血凝固的效能。設計pl依賴性的tga以測量在有陰離子磷脂存在下的rfviia活性，並使用得自thrombinoscope,bv的凝血酶校準品和底物試劑、fluca-試劑盒進行。由20%磷脂醯絲氨酸(ps)、40%磷脂醯乙醇胺(pe)和40%磷脂醯膽鹼(pc)組成的磷脂(pl)囊泡得自avantipolarlipids，並通過在100mmnacl、50mmtris-hcl(ph7.2)中聲處理10分鐘來製備。

將20μlpl-囊泡(500μm)或凝血酶校準品分配進96孔板中。將不同濃度的rfviia在人hema血漿中稀釋，一式三份地加入pl混合物中，並平衡37℃保持10min。通過加入fluca溶液，開始凝血酶產生反應，並按照thrombinoscopebv描述的calibratedautomatedthrombography(cat)方法連續地監測反應60分鐘。使用thrombinoscopebv(3.4.0)軟體獲取和分析數據，將其使用凝血酶校準品校正α2-巨球蛋白活性。分析參數『峰高』代表產生的凝血酶的最大水平，『內源性凝血酶潛力』(etp)對應於產生的凝血酶的總量。使用prism4.0(graphpadinc)用4-參數非線性曲線擬合方法分析凝血酶產生參數。

磷脂依賴性的fx活化測定

使用pl依賴性的fx活化測定，測量fviia在有磷脂囊泡存在下沒有組織因子存在下活化fx的能力。在有磷脂囊泡存在下將因子viia或fviia變體與fx一起溫育。通過加入s-2765(fxa的生色底物)，測量fx的活化。簡而言之，在聚丙烯圓底平板中在tris-hcl緩衝液中稀釋校準品和樣品。將30µl4µg/mlfx(haematologictechnologiesinc.)加入96-孔平底聚苯乙烯平板的所有孔中，隨後加入30µl由重量%比率為20:40:40的磷脂醯絲氨酸、磷脂醯膽鹼和磷脂醯乙醇胺組成的磷脂囊泡。將30µl稀釋的樣品和校準品轉移至fx/磷脂混合物。將平板密封，輕輕混合，並在37℃溫育20-23小時。將40µl5mm的s-2765溶液(diapharma)加入所有孔中。將平板密封，並在37℃溫育6小時。在微量培養板讀數器中在405nm讀出吸光度。通過將樣品的fx活化水平與f7校正曲線進行對比，確定樣品的活性。

大鼠pk研究-動物、研究方案(製品的注射、血液和製品的取樣、elisa、數據分析、動物的處死)。

將0.1mg/kg的蛋白(f7、v2、v1、dv2和dv1)靜脈內地施用進spraguedawley大鼠中。在施用後1min開始取血漿樣品，並通過fviielisa進行分析。

hema-pk研究

將1.0mg/kg的蛋白(f7、dv1)靜脈內地施用進hema小鼠中。在施用後5min開始取血漿樣品，並通過fviielisa和stf-pt測定進行分析。

對血漿樣品的fviielisa

材料

使用針對fviia的單克隆抗體。此外將一種單克隆抗體生物素化。使用經純化的fviia變體(野生型或去唾液酸化的)作為測定校準品和測定對照品。封閉緩衝液是在30mmtrisph7.2、60mmnacl、0.03%吐溫-20中的1%(w/v)酪蛋白。測定稀釋緩衝液(adb)是0.1%(w/v)酪蛋白、50mmtrisph7.2、0.1mnacl、0.05%吐溫-20。測定洗滌緩衝液是pbs+0.05%吐溫-20。免疫測定平板是greinermicrolon高結合平板(#655061)。抗生蛋白鏈菌素-辣根過氧化物酶(sa-hrp)得自r&dsystems。hrp底物ultra-tmb得自thermofisherpierce。空白小鼠血漿商業地(bioreclamation)或通過內部來源得自cd1或hema小鼠。所有其它材料(酪蛋白、tris、nacl、吐溫-20、pbs、硫酸)具有試劑級質量。

用於fviia夾心免疫測定的方法

在4℃用0.1ml/孔的針對fviia的抗體(1µg/ml在pbs中)包被96-孔測定平板過夜。將平板抽吸並用0.2ml/孔的封閉緩衝液在室溫在旋轉(150rpm)下封閉至少2小時。封閉以後，用4x0.3ml/孔的洗滌緩衝液洗滌孔。將fviia樣品或標準品在adb中1:20稀釋至5%血漿的終濃度，並在室溫在旋轉下溫育0.1ml/孔至少1.5小時。一式三個孔地測量所有標準品、對照品和樣品。如前所述洗滌平板以後，加入生物素化的針對fviia的抗體(42ng/ml在adb中，0.1ml/孔)，並將平板在室溫在旋轉下溫育至少1小時。將平板洗滌，隨後與抗生蛋白鏈菌素-hrp(在adb中1:1000)一起溫育，在室溫在旋轉下溫育至少1小時。最終的平板洗滌以後，用0.1ml/孔的ultra-tmb使孔顯影，用0.05ml/孔的2m硫酸停止反應。在od-450nm讀出停止的反應物，並將數據分析和校準。測定的定量下限(lloq)通常是在100%血漿中的15-30ng/mlfviia。

用於測量rfviia活性的、基於可溶性組織因子(stf)的改進的pt測定

進行凝血酶原時間(pt)測定以測量hema小鼠離體血漿樣品中的人rfviia的活性。

簡而言之，將50µl含有在aptt緩衝液(0.15mnacl,0.05mtrisph7.5,0.1%bsa)中的10%的hema小鼠血漿和50%的人fvii-缺陷血漿(georgekinginc)的樣品與50µlstf-pt試劑混合，並在37℃溫育30秒。stf-pt試劑由1體積的2µm重組人可溶性的tf(stf1-221)和1體積的8µm磷脂囊泡(ps20:pc40:pe40)組成。通過加入50µl25mmcacl2開始凝固，並在sta凝固分析儀(diagnosticastagoinc)上記錄凝固時間。標準品由200-0.78ng/ml的系列稀釋2倍的rfviia(wt-rfvii或修飾的rfviia變體)組成。

去唾液酸化的v2在血友病a(hema)小鼠中的效力

急性尾巴切割效力研究

為了確定失血，用異氟烷麻醉小鼠，並將尾巴放在15ml塑料試管內的37-38℃溫熱的0.9%鹽水中10min。用解剖刀離尖端4mm切割尾巴，並立即放回單獨的預溫熱的含有10ml鹽水的15ml塑料試管中。讓小鼠自由地流血40min。在尾巴切割損傷之後5分鐘或之前15-和30-分鐘，靜脈內地施用去唾液酸化的v2和f7。通過在血液收集之前和之後將試管稱重，通過重量分析法量化失血。

尾靜脈橫斷效力(tvt)研究

通過在尾靜脈橫斷損傷之前1小時或之後5min的尾靜脈注射，給hema小鼠施用去唾液酸化的v2或f7。使用適當的麻醉。用#11解剖刀直刀片橫斷尾靜脈，並啟動計時器。然後讓小鼠返回它的單個清潔籠，該籠具有放在4x8英寸加熱墊的頂部上的白紙墊層(versi-dri™)。在接下來的9小時中每小時和在24小時時間點監測動物活動狀態。在監測表上記錄表現出減少的活動水平徵象的任何小鼠，且立即將表現出過度失血徵象的任何小鼠安樂死。

在hema小鼠血漿中的凝血酶-抗凝血酶(tat)測定

試劑：

(1)捕獲抗體：抗凝血酶多克隆抗體，得自enzymeresearchlabs，目錄號tat-eia-c.；(2)檢測抗體：hrp-綴合的抗-at-iii多克隆抗體，得自enzymeresearchlabs，目錄號tat-eia-d，(3)測定稀釋劑：得自enzymeresearchlabs，目錄號tat-eia-d，(4)hrp底物：amplexred，invitrogen，目錄號a12216，(5)α-凝血酶：得自enzymeresearchlabs，目錄號ht-1002a，在-80℃保存，(6)at-iii：得自enzymeresearchlabs，目錄號hat，在-80℃保存，(7)bsa：得自sigma，目錄號a-7030；(8)at-iii缺陷型血漿：購自enzymeresearchlabs，目錄號：at-dp，在-80℃保存。

緩衝劑

(1)tat標準緩衝液：20mmtris-hcl，ph7.4，0.15mnacl，1mmedta，0.05u/ml肝素；(2)包被緩衝液：1片的碳酸氫鹽+100mldh20，在4℃保存；(3)封閉緩衝液：2%bsa-pbs；(4)樣品稀釋緩衝液：加入0.1mhepes，ph7.4，0.15mnacl，1%bsa，0.05%吐溫20，過濾和等分，在-20℃保存；(5)底物緩衝液：向pbs緩衝液中加入50µl5mg/mlamplexred、20µl3%h2o2。混合，在加入平板之前新鮮製備；(6)1µmtat標準儲備液的製備：將100µl1.36mg/ml的人at-iii和5.93µl3.28mg/ml的人凝血酶加入419µltat緩衝液中，混合，在37℃溫育10-20min；(7)60nmtat標準儲備液的製備：將50µl1µmtat複合物加入783µlat-iii缺陷型血漿中，混合，等分成50µl/管形瓶，在-80℃保存。

測定規程

1.在碳酸氫鹽緩衝液中稀釋抗凝血酶pab(捕獲抗體)(1:100稀釋度：對於一個96-孔板，將110µl抗體加入11ml碳酸氫鹽緩衝液中)。

2.將100µl稀釋的包被抗體加入2hbimmulon96-孔板上的每個孔中。輕輕敲平板以確保所有液體覆蓋平板的底部。密封平板並在4℃溫育過夜。

3.在自動化的平板清洗機中用300µl洗滌緩衝液洗滌4次。在最後一次洗滌以後，倒置平板並在清潔紙巾上輕敲它。

4.將150µl封閉緩衝液(2%bsa-pbs)加入每個孔中。密封平板並在室溫溫育1.5小時。

5.在自動化的平板清洗機中用300µl洗滌緩衝液洗滌4次。在最後一次洗滌以後，倒置平板並在清潔紙巾上輕敲它。

6.將100µl標準品、樣品和質量控制(qc)一式三份地加入每個孔中，並在室溫溫育平板2小時。

7.在自動化的平板清洗機中用300µl洗滌緩衝液洗滌4次。在最後一次洗滌以後，倒置平板並在清潔紙巾上輕敲它。

8.將100µlhrp-檢測抗體(1/100，將110µl抗體加入11ml綴合物稀釋劑中)加入每個孔中。密封平板並在室溫溫育1小時。

9.在自動化的平板清洗機中用300µl洗滌緩衝液洗滌4次。在最後一次洗滌以後，倒置平板並在清潔紙巾上輕敲它。

10.將70µlamplexrd底物(新鮮製備)加入每個孔中。

11.將平板在室溫置於暗處並溫育15-30min。

12.在od485nm/595nm讀出平板。

13.用4-參數曲線擬合繪製標準品；從每個elisa板中的標準品計算得自對照和每個樣品的濃度。

去唾液酸化的v2在凝固活性的小鼠中的效力

進行急性尾巴切割研究以確定dv2在凝固活性的小鼠中的效力。用異氟烷麻醉凝固活性的小鼠，並將尾巴放在15ml塑料試管內的37-38℃溫熱的0.9%鹽水中10min。靜脈內施用5mg/kg組織型纖溶酶原激活物(tpa)以後，用解剖刀離尖端50mm切割尾巴，並放回單獨的預溫熱的含有10ml鹽水的15ml塑料試管中。在尾巴切割損傷之後立即靜脈內地施用去唾液酸化的v2和f7。讓小鼠自由地流血45min。通過在血液收集之前和之後將試管稱重，通過重量分析法量化失血。

結果

去唾液酸化的或去糖基化的蛋白的體外表徵

通過lc-tofms，分析dv2的重鏈。分析表明，在重鏈上的n-聚糖在唾液酸酶處理以後不含有唾液酸。gla結構域的存在，使這樣的對輕鏈的分析複雜化。為了得到經處理的分子的唾液酸含量的總圖像，進行了唾液酸螢光標記。該方法表明，在去唾液酸化過程中除去了v2上的大於99.9%的唾液酸。圖7顯示了去唾液酸化的v2的唾液酸含量分析。利用lc-tofms分析和唾液酸螢光標記。對dv1進行唾液酸含量分析，也得到類似的結果(數據未顯示)。通過磷脂依賴性的xa活化和磷脂依賴性的tga測定，試驗了去唾液酸化的分子的活性。pl-xa和pl-tga測定證實，去唾液酸化以後蛋白的活性沒有降低(參見圖9和圖10)。圖9顯示了對去唾液酸化的蛋白的pl-fxa活化測定。使用磷酸-脂質fxa活化測定，試驗了去唾液酸化的v1和v2(dv1、dv2)的活性。與它們的未修飾的母體分子相比，兩種去唾液酸化的蛋白在該測定中具有稍微較高的活性。圖10顯示了對去唾液酸化的蛋白的pl-tga測定。通過pl-tga，dv2和dv1表現出與它們的未修飾的母體分子相比稍微增加的活性。將結果標準化至f7。

pl-xa測定一致地表明dv2和dv1與它們的未修飾的母體分子相比可測量的活性增加。表達了低糖基化的wtfviia、v2和v1分子(圖11)，並作為粗表達提取物試驗了表達和活性。圖11顯示了低糖基化的fvii變體的表達。針對fvii表達，分析了電穿孔後4天的培養基樣品。使用抗-gla結構域抗體的蛋白質印跡分析顯示變體的表達。當將表達水平標準化時，n-聚糖位點的除去似乎不影響活性。圖12顯示了使用轉染上清液確定低糖基化的fvii變體的「比活性」。通過xa活化測定，測定了得自低糖基化的變體的2次瞬時轉染的粗表達上清液的活性。當將通過elisa測得的表達標準化時，沒有觀察到由n-聚糖除去引起的活性的下降。如在該測定中預見到的，v1和f7蛋白具有類似的活性，而v2分子由於它的tf-無關性而具有更低的活性。這通過在純化的低糖基化的v2(僅具有2n-聚糖(n322和n145)，被稱作pmb121)上進行的pl-tga活性測定進一步證實。圖13顯示了在純化的低糖基化的變體pmb121上的pl-tga測定。通過pl-tga測定，pmb1212顯示出與f7相比增強的活性，類似於未修飾的v2。在肝細胞清除模型中試驗了這些分子的體外清除。dv2在該模型中表現出與未修飾的v2相比顯著的清除(圖14)，而對於低糖基化的變體而言觀察到清除的邊緣增加或無增加(圖15)。

大鼠pk和hemapk

在spraguedawley大鼠中的藥代動力學研究證實，如通過fviielisa測量的，去唾液酸化的和低糖基化的蛋白比它們的未修飾的相應物顯著更快地清除。圖16顯示了大鼠藥代動力學結果。如通過fviielisa測得的，去唾液酸化的v2和v1在spraguedawley大鼠中的半衰期顯著短於它們的未修飾的母體分子。對於去唾液酸化的v2、去唾液酸化的v1和pmb121(低糖基化的v2)而言，這也適用。兩種去唾液酸化的分子的t1/2小於1min，而它們的親本蛋白的t1/2大約2.5小時。低糖基化的v2分子pmb121的清除等同於f7的清除，具有1.6小時的t1/2。在hema小鼠中的pk研究具有類似的結果，其中dv2和f7分別具有大約3min和2.6小時的半衰期(圖17(a))。通過stf-ptt凝固測定證實短半衰期(圖17(b))。圖17顯示了hemapk結果。如通過a)fviielisa和b)stf-pt測定所測得的，去唾液酸化的v2在hema小鼠中的半衰期顯著短於它的未修飾的母體分子。

hema效力模型

在hema小鼠中試驗了dv2的效力。使用hema尾巴切割模型，證實1mg/kg(靜脈內推注)的劑量的dv2是有效的。通過對比，在該模型中，f7的有效劑量是2.5mg/kg(靜脈內推注)。這些結果證實，dv2比f7更有效(圖18(a))。該模型也用於證實，dv2的效力比f7的效力更快地清除(圖18(b))。圖18顯示了在hema小鼠中的去唾液酸化的v2效力研究的結果。使用dv2的研究證實，該分子在hema尾巴切割模型中a)比f7更有效且b)具有比f7更快的效力清除。

使用更靈敏的tvt模型，也證實了dv2與f7相比更快的效力清除，並確認了有效劑量。圖19顯示了在tvthema模型中的dv2效力研究。使用具有較高靈敏度的效力模型(tvt)的tvt研究證實了dv2具有比f7更快的效力清除。在hema小鼠中在施用後30和60min進行的凝血酶-抗凝血酶(tat)測量(作為致血栓性的標誌物)表明dv2的顯著更低的水平。圖20顯示了tat測量結果。在hema小鼠中，與f7的有效劑量(2.5mg/kg)相比，在它的有效劑量(1mg/kg)施用的dv2產生了更少的凝血酶-抗凝血酶(tat)。該數據與效力數據一起提示，dv2具有比f7更有利的治療指數。

在凝固活性的小鼠中的效力

在tpa治療的、凝固活性的小鼠中試驗了dv2的效力。使用尾巴切割模型，證實了dv2在0.3-1mg/kg(靜脈內推注)的劑量是有效的。通過對比，在該模型中，f7的有效劑量是5mg/kg(靜脈內推注)。這些結果證實，dv2比f7更有效(圖21)。圖21顯示了在tpa治療的、凝固活性的小鼠中的去唾液酸化的v2效力研究的結果。

去唾液酸化的野生型因子vii(dwtviia)的清除和效力

使用得自novonordisk的novoseven®作為起始因子vii材料，並如上所述使用可溶性唾液酸酶將該起始多肽去唾液酸化，如上所述生產去唾液酸化的野生型因子vii(dwtviia)。發現dwtviia具有>99%的純度、低內毒素，且不具有可檢測的唾液酸。另外，質譜法分析表明唾液酸的選擇性除去。

使用如上所述的biophenfvii產色測定和改進的pt測定，分析了該dwtviia材料的活性，並與野生型因子vii進行了對比。這些分析中的每一個表明dwtviia具有與野生型因子vii多肽幾乎相同的活性。

還使用人組織因子敲入(tfki)小鼠模型分析和對比了dwtviia和野生型因子vii(1mg/kg)的清除。如在圖22中所示，dwtviia的半衰期顯著短於野生型因子vii，且清除(ml/h/kg)快了超過40倍。

使用tfki小鼠和上述的尾巴切割方法，研究了dwtviia相對於野生型因子vii的效力。簡而言之，將5mg/kgtpa靜脈內地注射進小鼠中，隨後離尖端50mm剪切尾巴。然後以在1-6mg/kg範圍內的劑量靜脈內地注射野生型因子vii(novoseven®)或dwtviia。然後從尾巴收集血液45分鐘，在收集階段中每6分鐘破壞不穩定的凝塊。如在圖23中所示，令人驚訝地發現dwtviia比野生型因子vii明顯更有效。更具體地，3mg/kg劑量的dwtviia造成了與6mg/kg劑量的野生型因子vii相比減少的失血。鑑於該分析的結果，確定2mg/kgdwtviia是6mg/kg野生型因子vii的生物等價劑量。

還通過上述的凝血酶-抗凝血酶(tat)方法研究了dwtviia和野生型因子vii(novoseven®)的造成全身凝固的能力。用生物等價劑量的dwtviia(2mg/kg)和野生型因子vii(6mg/kg)處理小鼠，然後通過elisa測量tat複合物的形成。如在圖24中所示，野生型novoseven®因子vii產生了比dwtviia顯著更高的tat水平。鑑於dwtviia僅產生基線tat水平的事實，該實驗提示該劑量的dwtviia不產生可觀察的全身凝固，儘管事實上該多肽與野生型因子vii一樣有效。

此外，還在fecl3血栓形成模型中研究了dwtviia和野生型因子vii(novoseven®)的造成血栓形成的能力。在血栓形成研究開始之前15分鐘，用生物等價劑量的dwtviia(2mg/kg)和野生型因子vii(6mg/kg)處理小鼠。然後通過施用3.25%fecl3溶液開始血栓形成，然後用doppler測量血栓形成30分鐘。將得到的血流量數據繪製在血流量相對於時間的圖上，然後計算對照樣品的曲線下面積的百分比，以確定每個因子vii治療組中由血栓形成造成的血流量的減小。如在圖25中所示，野生型novoseven®因子vii產生了顯著減小的血流量(平均約40%)，而dwtviia幾乎沒有顯示出血流量的減小(平均>90%)。該實驗證實，給定劑量的dwtviia產生了與野生型因子vii相比極大地減小的血栓形成。

通過使用sn-17c三肽發螢光底物(hti)檢查這些肽對可溶性組織因子(stf)的表觀結合親合力，進一步研究了dwtviia相對於野生型因子vii的活性和效力。如在圖26中所示，該分析證實，dwtviia(df7)和野生型因子vii(f7)對stf具有等同的表觀結合親和力。但是，如在圖27中所示，在通過有stf-因子vii複合物(0.5nm因子vii[dwtviia或野生型],125nmstf)存在下滴定因子x濃度來檢查這些肽的活化因子x的能力的實驗模型中，dwtviia和野生型因子vii的michaelismenten動力學證實，dwtviia(df7)可以比野生型因子vii(f7)更有效地(大約2倍)活化因子x。該數據提示，dwtviia與它的野生型相應物相比能夠在每個因子vii活性部位將更多的因子x轉化成因子xa。

討論

關於開發對於急性出血的治療而言是有效的、但是具有降低的致血栓性的治療藥物，存在未得到滿足的醫學需求。具有短半衰期的有效因子vii多肽可以潛在地產生適合用於急性出血中的具有較大治療窗的分子。

v2和v1是兩種因子viia變體(圖1-3)。這些變體含有對它們的gla結構域的突變，所述突變增加它們對活化的血小板的親和力，且在v2的情況下，導致組織因子無關性。兩種變體還具有2個另外的n-糖基化位點，這導致與野生型因子viia相比延長的半衰期，即對於血友病的治療而言有利的特性。但是，它們作為急性出血的治療劑的用途可以受益於半衰期的縮短。該修飾可以降低脫靶效應的風險，且由此增加它們的治療指數。我們在這裡已經證實，存在於v2和v1的碳水化合物鏈上的唾液酸的除去導致所述分子在體外肝細胞清除模型中的顯著更快的清除。低糖基化的變體在該體外模型中沒有被更快地清除，這提示去唾液酸化的和低糖基化的分子之間的清除機制是不同的。在spraguedawley大鼠中進行的體內研究證實，去唾液酸化的分子(dv2和dv1)以及低糖基化的變體pmb121具有顯著降低的半衰期。令人感興趣的是，與報導的去唾液酸化的野生型fviia的清除率相比(appa等人,thrombosisandhaemostasis104.2/2010)，去唾液酸化的v2和v1都具有增加的清除率，該特徵可能歸因於它們的2個另外的n-聚糖。不對本發明要求保護的內容具有限定作用，該活性的一種可能的理論是，這些額外的n-聚糖在去唾液酸化以後可以變成asgpr或類似受體的額外配體並介導更快的清除。如通過體外活性測定所測得的，與它們的母體分子相比，這些分子的活性得到保留或增加。進一步在hema小鼠pk研究中在體內證實了dv2的更快清除，且在hema尾巴剪切和tvt研究中證實是有效的。

此外，野生型因子vii的去唾液酸化產生比野生型快得多地清除的因子vii多肽，同時也提供增加的效力的驚人結果，如在眾多實驗模型中所證實的。

因子viia或因子viia變體的n-聚糖的除去或n-聚糖的單糖組成的改變產生更快地清除的分子。這些分子保留活性且在體內是有效的。這些更快地清除的因子viia分子的開發對於急性出血適應症的治療而言將是有益的，以及可能成為市場上的各種抗凝劑的解毒劑。

序列表

bayerhealthcarellc

bauzon,maxine

hermiston,terry

短效因子vii多肽

bhc115011pct

61/754,674

2012-12-24

61/787,026

2013-03-15

patentin3.5版

1218

dna

智人

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1219

dna

人工序列

可變的人fvii核苷酸序列

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