懸浮細胞染色裝置的製作方法

2023-05-03 13:15:06 3

專利名稱：懸浮細胞染色裝置的製作方法
技術領域：
本發明屬於免疫學技術和生物學技術領域，涉及細胞染色技術，具體涉及懸浮細胞染色裝置。
背景技術：
細胞學檢測為細胞生物學最常用技術。懸浮細胞免疫學染色檢測方法一直使用離心技術洗滌細胞。其步驟為獲得單個懸浮細胞；固定細胞或不固定細胞；加入抗體(或其它可與細胞標誌物結合的物質)；離心方式洗去未結合的抗體；加入顯色物質；離心方式洗去顯色物質；檢測染色情況。根據加入的抗體或者抗抗體等等各種檢測方式方法，基本為重複上述操作步驟，完成細胞免疫染色，最終檢測細胞標誌物。常規方法檢測細胞對於細胞膜標誌物的檢測尚勉強可實施，但是，檢測細胞漿，細胞核等細胞內標誌物時候非常困難。因為檢測需要打開細胞膜。細胞膜被打通後，細胞滲透壓改變，導致細胞難以通過離心方式回收。細胞染色後洗滌未結合的抗體時，由於細胞滲透壓改變，離心後細胞不能被緊密的壓縮在試管底部，移去上清時候細胞同時被移去。大多數情況是完成細胞染色步驟後大部分細胞丟失，實驗結果不準確或者難以完成實驗。因此，以往基於離心方式的懸浮細胞免疫染色操作非常困難。費時費力且結果難以保障。細胞標誌檢測越來越廣泛地進入應用。細胞染色方法的操作困難嚴重阻礙了流式細胞儀等細胞檢測設備的應用。

發明內容
本發明的目的是提供一種懸浮細胞染色裝置，以克服當前細胞學檢測免疫反應使用離心方式洗滌細胞方法的缺陷，使得懸浮細胞免疫反應能夠快速操作完成，該裝置使懸浮細胞免疫反應可以實施並具有檢測準確性高、重複性好、客觀性強、操作方便快速特點。實現本發明的具體方案是本發明提供的這種懸浮細胞染色裝置，由套管1、推桿2、柱塞密封墊3、截留膜4組成，套管I為中空圓管狀結構，柱塞密封墊3為圓形片狀結構，其位於套管I腔內中上部，柱塞密封墊3的外周與套管I的管腔內壁呈可滑動的密封配合，推桿2為長杆狀結構，其前端與柱塞密封墊3的上部相連接，與柱塞密封墊3成為一體，截留膜4位於套管I腔內下部，將套管I的內腔分為膜上腔和膜下腔兩部分，在截留膜4上方的套管I的管壁上靠近截留膜4處設置有供注入和排出溶液用的膜上開口 5，在截留膜4下方的套管I的管壁上設置有供注入和排出溶液用的膜下開口 6。膜下開口 6可以設置在截留膜4下方的套管I的側面管壁上，也可以設置在截留膜4下方的套管I的底部管壁上；膜上開口 5和膜下開口 6上可以設置有閥門8、9，所設置的閥門可以是單通閥門，也可以是多通閥門；推桿2的後端可設置一個便於操作者把握的推桿手柄7 ;截留膜4可以由尼龍膜構成，也可以由陶瓷膜構成，用以截留細胞或亞細胞結構等相對較大物質，允許抗體等相對較小物質穿過，截留膜4的穿過孔徑為0.1 ii m至50 u m，優選0. 45 ii m ;套管1、推桿2和推桿手柄7可由塑料或不鏽鋼製成，柱塞密封墊(3)可由橡膠製成。本發明提供的懸浮細胞染色裝置可以多個組合使用，形成組合式懸浮細胞染色裝置，以便同時對較多細胞進行染色。本發明提供的這種組合式懸浮細胞染色裝置由並行排列的兩個或兩個以上的上述的懸浮細胞染色裝置和一個由中空管狀結構構成的連通管10組成，每個懸浮細胞染色裝置的膜下開口 6與連通管10相連通，連通管10的兩端設置有供注入和排出溶液用的連通管開口 11，在連通管10的兩端的連通管開口 11上可設置有閥門，在連通管10—端的連通管開口與設置在該連通管開口上的閥門之間可以設置有分流接頭12。本發明裝置用於對懸浮細胞染色，細胞洗滌過程採用壓力將需要分離的抗體和液體穿流過截留膜4，細胞或亞細胞結構被截留膜4截留，完成細胞與各類染色物質的洗滌分離過程。截留膜4可截留細胞、亞細胞結構等相對較大物質，允許抗體等相對較小物質穿過。推桿2和柱塞密封墊3為一體結構，可由手動或機械電動控制，在套管I中進行活塞運動。柱塞密封墊3與套管I形成密封配合，推桿2和柱塞密封墊3向膜方向運動時，將能將截留膜4上的液體通過截留膜4壓出，細胞、亞細胞結構等相對較大物質不能通過膜而被截留。套管I上設置有二個注入和排出溶液的開口，即膜上開口 5和膜下開口 6，膜上開口 5和膜下開口 6可連接閥門或與液體分流接頭連接後再連接閥門，以便於不同溶液的注入或排出，閥門可選不同形式，如多通道或電動，可實現自動化，閥門上可連接不同形式的慄。本發明提供的懸浮細胞染色裝置使用時可按以下方法操作1.加入細胞經膜上開口 5向套管I中的截留膜4上部的腔體中注入固定於70%乙醇中的待染色的懸浮細胞，注入方式可用壓力泵，如蠕動泵、柱塞泵或用注射器等方式注入，注入完後將I旲上開口 5關閉；2.洗滌細胞a.將推桿⑵向下推壓使柱塞密封墊(3)向截留膜4方向加壓移動，使截留膜4上部腔體中的乙醇通過截留膜4後經膜下開口 6排出，排出後將膜下開口 6關閉，此時待染色的細胞被截留在截留膜4的上面；b.用蠕動泵將洗滌溶液由膜下開口 6注入，同時使推桿2及柱塞密封墊3向遠離截留膜4的方向移動，此時洗滌溶液通過截留膜4被注入套管I的截留膜4上部的腔體中。不同染色方法洗滌溶液各不相同，同一染色方法也可使用不同的洗滌溶液，如免疫螢光染色實驗常用無Ca+Mg+Hanks液或PBS溶液，酶免疫染色使用PBST溶液；c.使推桿2及柱塞密封墊3向截留膜4方向加壓移動，使截留膜4上部腔體中的洗滌溶液通過截留膜4後經膜下開口 6排出，此時經洗滌的細胞被截留在截留膜4的上面；重複上述步驟2中的分步驟C，重複7-8次。3.加入染色物質將染色物質如標記抗體、抗抗體、酶、酶底物、生物染料、化學染料等經膜上開口 5向套管I中的截留膜4上部的腔體中注入，可利用壓力泵將染色物質經膜上開口 5加入，注入完後將膜上開口 5關閉，放置適當時間以便免疫反應或染色。
4.洗滌細胞操作同上述步驟2中的分步驟C，重複操作上述步驟2中的分步驟c4-6次，以洗滌未結合的抗體或染色物質。5.收集染色後的細胞打開膜上開口 5，用蠕動泵將洗滌溶液由膜下開口 6注入，同時從膜上開口 5收集含有被染色細胞的流出液，此時即完成細胞染色。本發明適用於醫學和生物技術領域。細胞是醫學和生物技術領域最重要的研究和應用對象。細胞染色，特別免疫染色(如免疫螢光染色、酶免疫染色)是細胞分析常用手段。而採用現有技術對懸浮細胞進行染色因操作困難而導致實驗或檢測失敗率高的問題一直未能解決。本發明懸浮細胞染色裝置克服了上述困難。本發明裝置可有效保障懸浮細胞染色的成功，而傳統離心方法染色常常因發生細胞丟失而以失敗告終。本發明裝置細胞效染色的準確性高、重複性好和客觀強，不受人為因素幹擾，並使所需的染色時間大為縮短傳統離心方法操作時間較長，一個標準的細胞抗體、抗抗體染色程序需要3小時至4小時，而本發明裝置只需要1. 5小時。本發明具有的有益效果⑴保障細胞免疫染色的成功細胞固定後，由於細胞膜被打通，傳統離心方式操作時細胞不能被離心力緊密地壓縮到離心管底部，造成移除上清廢液時候細胞同時被移除，反覆多次的細胞洗滌導致大量細胞丟失，實驗以失敗告終。(2)提高免疫反應染色或其它染色的準確性、重複性和客觀性本發明可以實現自動化操作，克服因不同人員操作產生的實驗誤差。使得懸浮細胞染色實現自動化、標準化、快捷化。(3)節省時間與設備傳統離心方式免疫染色時候，由於細胞難以被離心力緊密地壓縮到離心管底部，需要高轉速、長時間離心，整個免疫反應耗時較長。而本裝置大大節省時間和實驗對離心機的要求。下面通過具體的實施例進一步說明本發明是如何實現的。以下實例不用於限制本發明的範圍。


圖1本發明懸浮細胞染色裝置的一個實施例的結構圖，圖1中數字標識所示部分為1:套管；2 :推桿3 :柱塞密封墊4 :截留膜5:膜上開口6:膜下開口7 :推桿手柄8:膜下開口閥門9:膜上開口閥門圖2為實施例2組合式懸浮細胞染色裝置的結構圖，圖2中數字標識所示部分為5:膜上開口6:膜下開口9:膜上開口閥門
10 :連通管11:連通管開口12:分流接頭13、14:閥門15 :懸浮細胞染色裝置圖3實施例3中的顯微鏡觀察細胞螢光染色結果。圖4實施例3中流式細胞測定儀測定被染色細胞螢光結果。
具體實施例方式實施例1圖1所示為本發明懸浮細胞染色裝置的一個具體實施例的結構，該懸浮細胞染色裝置由套管1、推桿2、柱塞密封墊3、截留膜4組成，套管I由塑料或不鏽鋼製成，套管I為中空圓管狀結構，柱塞密封墊3為圓形片狀結構，其位於套管I腔內中上部，柱塞密封墊3的外周與套管I的管腔內壁呈可滑動的密封配合，推桿2為長杆狀結構，其前端與柱塞密封墊3的上部相連接，與柱塞密封墊3成為一體，推桿2的後端設置有一個便於操作者把握的推桿手柄7，截留膜4位於套管I腔內下部，在截留膜4上方的套管I的側壁上靠近截留膜4處設置有一個供注入和排出溶液用的膜上開口 5，截留膜4下方設置有一個供注入和排出溶液用的膜下開口 6，膜上開口 5上設置有閥門9，膜下開口 6上設置有閥門8，閥門8由一個三通閥構成；截留膜4是尼龍膜或陶瓷膜，該膜可截留細胞或亞細胞結構等相對較大物質，允許抗體等相對較小物質穿過，截留膜4使用的是pirce公司出產的穿過孔徑0. 45 y m的尼龍膜。閥門8使用的是魯爾閥，具體是集優塑件科技開發有限公司出產的醫用三通閥。閥門9使用BD公司16G大號留置針作為三通閥使用。套管(I)由不鏽鋼或塑料製成，套管I的高度為10釐米，內徑I釐米，套管I的管壁的厚度為0. 2釐米。推桿2由不鏽鋼或塑料製成，柱塞密封墊3由橡膠製成。實施例2組合式懸浮細胞染色裝置，即懸浮細胞染色裝置的組合使用。本發明提供的懸浮細胞染色裝置可以組合使用，可以將兩個或兩個以上的懸浮細胞染色裝置組合使用，這樣可以同時處理較多的細胞，即同時對較多的細胞進行染色。圖2為4個懸浮細胞染色裝置組合使用的實施例，具體組合方式是在並行排列的4個懸浮細胞染色裝置的下面設置一個連通管10，將4個懸浮細胞染色裝置外套管I上的溶液注入和排出通道膜下開口 6與連通管10相連通，連通管10的兩端設置有連通管開口11，其中一端的開口上設置有分流接頭12，在該分流接頭12的分流口上設置有閥門14，在另一端的開口上設置有閥門13。連通管10為中空管狀結構，可由橡膠、不鏽鋼、有機玻璃等材料製成。使用時，待染色細胞和染色物質由膜上開口 5注入；細胞洗滌時，洗滌溶液利用壓力泵由膜上開口 5或由連通管10的一端的開口注入，本實施例中由接有分流接頭12的連通管開口注入，洗滌溶液注入連通管10內腔後，經各個懸浮細胞染色裝置的膜下開口 6流入各個懸浮細胞染色裝置的腔體內。在由接有分流接頭12的連通管開口注入洗滌溶液的同時，可配合將推桿2和柱塞密封墊3向遠離截留膜4的方向移動，使注入的洗滌溶液穿過截留膜4流入套管I的截留膜4上部的腔體內；洗滌溶液注入完畢後，關閉接有分流接頭12的連通管開口，本實施例中是通過控制接在分流接頭12上的閥門14實現的。洗滌溶液由連通管10的另一端的開口排出。收集被染色細胞時，將推桿2和柱塞密封墊3向截留膜4的方向移動，使柱塞密封墊3停留在接近截留膜4的位置，開啟膜上開口 5，利用壓力泵將溶液由連通管10的一端的開口注入，此時，連通管10的另一端的開口處於關閉狀態，收集由膜上開口 5流出的溶液，該流出溶液中含有被染色細胞，即由膜上開口 5收集被染色細胞。實施例3使用實施例1製備的懸浮細胞染色裝置進行細胞免疫螢光染色實驗實驗步驟見圖11.加入細胞打開閥門9，向套管I中的截留膜4上部的腔體中注入固定於70%乙醇中的待染色的懸浮細胞，注入完後關閉閥門9 ；2.洗滌細胞a.打開閥門8，使推桿密封墊向截留膜4方向加壓移動，使截留膜4上部腔體中的乙醇通過截留膜4後經溶液注入和排出通道套管膜下開口 6由構成閥門8的三通閥的其中一個通道排出，排出後關閉此閥 門通道。此時待染色的細胞被截留在截留膜4的上面。b.用蠕動泵將洗滌溶液由構成閥門8的三通閥的另一個通道注入，同時使推桿密封墊向遠離截留膜4的方向移動，此時洗滌溶液通過截留膜4被注入套管I的截留膜4上部的腔體中，關閉構成閥門8的三通閥的該洗滌溶液注入通道，開啟構成閥門8的三通閥的另一通道。c.使推桿密封墊向截留膜4方向加壓移動，使截留膜4上部腔體中的洗滌溶液通過截留膜4後經溶液注入和排出通道套管膜下開口 6由構成閥門8的三通閥的其中的開啟的通道排出。此時經洗滌的細胞被截留在截留膜4的上面。重複上述步驟2中的分步驟C，重複8次。3.加入FITC標記抗體打開閥門9，向套管I中的截留膜4上部的腔體中注入200ul FITC標記抗體溶液，注入完後關閉閥門9，室溫放置30分鐘。4.洗滌細胞同上述步驟2中的分步驟C，重複5次。5 收集染色後的細胞打開閥門9，用蠕動泵將洗滌溶液由構成閥門8的三通閥的一個通道注入，同時從閥門9收集含有被染色細胞的流出液，此時即完成細胞染色。實施例4免疫螢光染色實驗一.實驗材料1. PNC-1細胞系細胞培養的PNC-1細胞系細胞胰酶消化後用洗滌液洗滌3次。力口入無水乙醇至70%濃度。室溫放置20分鐘；2. FITC標記兔抗人GAPDH抗體、無關抗體FITC標記兔抗鼠IgG抗體、FITC標記羊抗兔IgG抗體均為武漢市晶賽生物工程技術有限公司產品，稀釋滴度1: 200。3.無水乙醇上海國藥集團。4.洗滌溶液0. 15MoI PBS溶液，按照常規配方配製。二.實驗方法
按實施例3所述的方法進行細胞染色後，得到染色細胞。三.實驗結果將得到的染色細胞用流式細胞測定儀和螢光顯微鏡測定細胞螢光染色結果，二種方式測定結果均說明染色成功。螢光顯微鏡觀察的染色結果見圖3。流式細胞測定儀檢測細胞被螢光染色的結果見表I圖4。表1:流式細胞測定儀測定細胞螢光結果
權利要求
1.一種懸浮細胞染色裝置，其特徵在於，由套管(I)、推桿(2)、柱塞密封墊(3)、截留膜(4)組成，套管(I)為中空圓管狀結構，柱塞密封墊(3)為圓形片狀結構，其位於套管(I)腔內中上部，柱塞密封墊(3)的外周與套管(I)的管腔內壁呈可滑動的密封配合，推桿(2)為長杆狀結構，其前端與柱塞密封墊(3)的上部相連接，與柱塞密封墊(3)成為一體，截留膜(4)位於套管(I)腔內下部，將套管(I)的內腔分為膜上腔和膜下腔兩部分，在截留膜(4)上方的套管(I)的管壁上靠近截留膜(4)處設置有供注入和排出溶液用的膜上開口(5)，在截留膜(4)下方的套管(I)的管壁上設置有供注入和排出溶液用的膜下開口(6)。
2.根據權利要求1所述的懸浮細胞染色裝置，其特徵在於，膜上開口(5)和/或膜下開口(6)上設置有閥門(8、9)，所述的閥門可以是單通閥門，也可以是多通閥門。
3.根據權利要求1所述的懸浮細胞染色裝置，其特徵在於，膜下開口(6)設置在截留膜(4)下方的套管(I)的側面管壁上或設置在截留膜(4)下方的套管(I)的底部管壁上。
4.根據權利要求1所述的懸浮細胞染色裝置，其特徵在於，推桿(2)的後端設置有一個便於操作者把握的推桿手柄(7)。
5.根據權利要求1所述的懸浮細胞染色裝置，其特徵在於，截留膜4由尼龍膜或陶瓷膜構成。
6.根據權利要求1或5所述的懸浮細胞染色裝置，其特徵在於，截留膜(4)的穿過孔徑為 0.1 u m 至 50 u m,優選 0. 45 u m。
7.根據權利要求1所述的懸浮細胞染色裝置，其特徵在於，套管I可由塑料或不鏽鋼製成；推桿(2)和推桿手柄(7)可由塑料或不鏽鋼製成；柱塞密封墊(3)可由橡膠製成。
8.一種組合式懸浮細胞染色裝置，其特徵在於，它由並行排列的兩個或兩個以上的權利要求I至7中任一項所述的懸浮細胞染色裝置和一個由中空管狀結構構成的連通管(10)組成，每個懸浮細胞染色裝置的膜下開口(6)與連通管(10)相連通，連通管(10)的兩端設置有供注入和排出溶液用的連通管開口(11)。
9.根據權利要求8所述的組合式懸浮細胞染色裝置，其特徵在於，在連通管(10)的兩端的連通管開口(11)上設置有閥門。
10.根據權利要求8所述的組合式懸浮細胞染色裝置，其特徵在於，在連通管(10)的一端的開口上設置有分流接頭(12)，在該分流接頭(12)的分流口上設置有閥門(14)，在連通管(10)的另一端的開口上設置有閥門(13)。
全文摘要
本發明公開了一種懸浮細胞染色裝置，該裝置由套管(1)、推桿(2)、柱塞密封墊(3)、截留膜(4)組成，柱塞密封墊(3)位於套管(1)腔內中上部，截留膜(4)位於套管(1)腔內下部，套管(1)的管壁上設置有膜上開口(5)和膜下開口(6)。本裝置用於對懸浮細胞染色，可以有效克服現有細胞染色方法失敗率高，準確性和重複性差、耗時長等不足，具有成功率高、準確性和重複性好、耗時短等優點。
文檔編號G01N1/31GK103063500SQ20111031700
公開日2013年4月24日 申請日期2011年10月19日 優先權日2011年10月19日
發明者封江南 申請人:封江南