一種組合物的新用途的製作方法

2023-05-03 22:21:36 2

本發明涉及一種包含黃芪、葛根和桑白皮的組合物的新用途，尤其涉及該組合物在預防或治療肥胖症或高同型半胱氨酸血症的食品、藥物和保健品中的用途。

背景技術：

黃芪，又名綿芪，其主要活性成分是黃芪甲苷，具有抑制代謝症候群、延緩心肌缺血中心肌病變和改善心功能等作用，現代醫學研究表明，黃芪有增強機體免疫功能、保肝、利尿、抗衰老、抗應激、降壓和較廣泛的抗菌作用。能消除實驗性腎炎蛋白尿，增強心肌收縮力，調節血糖含量。黃芪不僅能擴張冠狀動脈，改善心肌供血，提高免疫功能，而且能夠延緩細胞衰老的進程。

葛根，為豆科植物野葛的乾燥根，習稱野葛。葛根中主要活性部位為總黃酮，其中葛根素是其主要活性成分之一。葛根素具有降糖、降脂、改善胰島素抵抗作用，以及降壓、擴張冠狀動脈、改善心肌缺血、抗缺氧再灌注損傷、保護內皮功能以改善血液動力學、抑制血小板聚集等多種心血管保護作用，因此葛根素被廣泛的應用於臨床治療糖尿病型冠心病和多種心血管疾病。

桑白皮為桑科植物桑的乾燥根皮。其含黃酮類成分:桑素、桑皮色烯素、環桑素等。桑白皮中分離並證實了降血糖成分脫二氧亞胺基葡萄醇和morana降糖物質，經過試驗，已經證實morana對四氧嘧啶誘發的高血糖小鼠有劑量依賴的降糖效果。

肥胖症是一種常見的代謝疾病。據報導，2008年全世界共有2億成年男性、3億成年女性患有肥胖症。估計到2030年，全球肥胖人數將會高達10億。肥胖症會使高血壓、糖尿病和心腦血管疾病等的發病率及死亡率顯著增加，已成為危害全球人類健康的重要問題之一,成為社會廣泛關注的焦點。肥胖的預防和治療已成為現代醫學面臨的一項挑戰。2008年，僅美國用於肥胖的醫療費用就高達1470億美元。據博思數據統計，2012年全球減肥藥市場規模為15.6億美元,我國減肥藥零售市場規模30.5億元，其中減肥藥(處方藥)市場規模為16.8億元。按現在的市場預測未來可能全球將達到700億，其中中國將近100億元。

高同型半胱氨酸(highhomocysteine，hhcy)血症為同型半胱氨酸(homocysteine，hcy)在血液中升高所形成的一種代謝性疾病，hhcy血症是多種疾病的危險因子，一般而言，同型半胱氨酸水平升高可使心血管疾病死亡危險性增加4～6倍，有研究顯示，當血漿總hcy水平每升高5umol/l冠心病危險性男性則增加60％，女性則增加80％，而重度同型半胱氨酸血症多發生在伴有其它疾病的人群，特別是糖尿病、冠狀動脈粥樣硬化、老年性痴呆、中風、靜脈栓塞等疾病，這些患者同型半胱氨酸血症水平明顯高於正常人。

已有將黃芪、葛根和桑白皮通過一定的比例組合用於治療糖尿病、高脂蛋白血症的的報導，但將黃芪、葛根和桑白皮用於治療肥胖症和高同型半胱氨酸血症，目前還未有任何研究及報導。

技術實現要素：

一方面，本發明的目的在於克服上述現有技術的不足之處而提供了包含黃芪、葛根和桑白皮的組合物在用於製備預防或治療肥胖症的食品、藥物和保健品中的用途。

本發明採用的技術方案為：一種組合物在用於製備預防或治療肥胖症的食品、藥物和保健品中的用途，其中，所述組合物包含黃芪、葛根和桑白皮，且所述黃芪、葛根和桑白皮的質量比為黃芪：葛根：桑白皮＝(1～2)：(1～2)：(0～2)。

本申請發明人經過大量研究及試驗發現，如上所述特定比例關係的黃芪、葛根和桑白皮組成的組合物，在備預防或治療肥胖症方面有著尤其顯著的效果。

作為本發明所述組合物在用於製備預防或治療肥胖症的食品、藥物和保健品中的用途的優選實施方式，所述黃芪、葛根和桑白皮的質量比為黃芪：葛根：桑白皮＝2:1:1。

作為本發明所述組合物在用於製備預防或治療肥胖症的食品、藥物和保健品中的用途的優選實施方式，所述黃芪、葛根和桑白皮的質量比為黃芪：葛根：桑白皮＝1:2:1。

作為本發明所述組合物在用於製備預防或治療肥胖症的食品、藥物和保健品中的用途的優選實施方式，所述黃芪、葛根和桑白皮的質量比為黃芪：葛根：桑白皮＝1:1:2。

作為本發明所述組合物在用於製備預防或治療肥胖症的食品、藥物和保健品中的用途的優選實施方式，所述黃芪、葛根和桑白皮的質量比為黃芪：葛根：桑白皮＝1:1:1。

作為本發明所述組合物在用於製備預防或治療肥胖症的食品、藥物和保健品中的用途的優選實施方式，所述黃芪、葛根和桑白皮的質量比為黃芪：葛根：桑白皮＝2:1:0。

作為本發明所述組合物在用於製備預防或治療肥胖症的食品、藥物和保健品中的用途的優選實施方式，所述組合物通過降低肥胖症中的白色脂肪積累來預防或治療肥胖症。

作為本發明所述組合物在用於製備預防或治療肥胖症的食品、藥物和保健品中的用途的優選實施方式，所述組合物能夠降低肥胖症引起的同型半胱氨酸升高。

另一方面，本發明還提供了一種組合物在用於製備預防或治療高同型半胱氨酸血症的食品、藥物和保健品中的用途，其中，所述組合物包含黃芪、葛根和桑白皮，且所述黃芪、葛根和桑白皮的質量比為黃芪：葛根：桑白皮＝(1～2)：(1～2)：(0～2)。

本申請發明人經過大量研究及試驗發現，如上所述特定比例關係的黃芪、葛根和桑白皮組成的組合物，在備預防或治療高同型半胱氨酸血症方面有著尤其顯著的效果。

作為本發明所述組合物在用於製備預防或治療高同型半胱氨酸血症的食品、藥物和保健品中的用途的優選實施方式，所述黃芪、葛根和桑白皮的質量比為黃芪：葛根：桑白皮＝2:1:1。

作為本發明所述組合物在用於製備預防或治療高同型半胱氨酸血症的食品、藥物和保健品中的用途的優選實施方式，所述黃芪、葛根和桑白皮的質量比為黃芪：葛根：桑白皮＝1:2:1。

作為本發明所述組合物在用於製備預防或治療高同型半胱氨酸血症的食品、藥物和保健品中的用途的優選實施方式，所述黃芪、葛根和桑白皮的質量比為黃芪：葛根：桑白皮＝1:1:2。

作為本發明所述組合物在用於製備預防或治療高同型半胱氨酸血症的食品、藥物和保健品中的用途的優選實施方式，所述黃芪、葛根和桑白皮的質量比為黃芪：葛根：桑白皮＝1:1:1。

作為本發明所述組合物在用於製備預防或治療高同型半胱氨酸血症的食品、藥物和保健品中的用途的優選實施方式，所述黃芪、葛根和桑白皮的質量比為黃芪：葛根：桑白皮＝2:1:0。

本發明首次發現包含黃芪、葛根和桑白皮的組合物能夠有效用於肥胖症的預防和治療，可產生顯著的效果。本發明還發現包含黃芪、葛根和桑白皮組合物能夠有效治療高同型半胱氨酸血症，為肥胖症和高同型半胱氨酸血症的治療提供了新的選擇。

附圖說明

圖1為經連續7周的高脂飼料餵養後得到的模型組大鼠(hfd組)與正常組大鼠(sd組)的體重以及fpg、tc、tg、ldl-c水平的對比圖。

圖2為預防性給藥以及治療性給藥期間，各組大鼠不同時期的體重變化對比圖。

圖3為預防性給藥以及治療性給藥期間，各組大鼠的飲食量對比圖。

圖4為預防性給藥7周後，各組大鼠fpg、tc、tg、ldl-c水平變化對比圖。

圖5為治療性給藥9周後，各組大鼠fpg、tc、tg、ldl-c水平變化對比圖。

圖6為預防性給藥12周後，各組大鼠fpg、tc、tg、ldl-c水平變化對比圖。

圖7為治療性給藥14周後，各組大鼠fpg、tc、tg、ldl-c水平變化對比圖。

圖8預防性給藥15周以及治療性給藥15周後，勻漿肝臟，經檢測得到的各組大鼠肝臟中同型半胱氨酸水平對比圖。

圖9為預防性給藥15周以及治療性給藥15周後，勻漿肝臟，經檢測得到的各組大鼠肝臟中穀氨醯轉肽酶水平對比圖。

圖10為預防性給藥15周以及治療性給藥15周後，勻漿肝臟，經檢測得到的各組大鼠肝臟中脂質(tc、tg)水平對比圖。

圖11為預防性給藥15周以及治療性給藥15周後，各組大鼠肝細胞進行油紅o染色後的脂肪變性對比圖。

圖12為預防性給藥15周以及治療性給藥15周後，各組大鼠的棕色脂肪與附睪脂肪之比對比圖。

圖13為預防性給藥15周以及治療性給藥15周後，各組大鼠的棕色脂肪與腎周脂肪之比對比圖。

圖14為治療性給藥15周後，各組大鼠的骨重量係數比對比圖。

圖15為利用lathetalct200對活體大鼠進行全身掃描得到的micro-ct掃描圖。

圖16為預防性給藥14周後，各組大鼠活體中的白色脂肪含量對比圖；

圖17為預防性給藥14周後，各組大鼠肝臟中的脂肪含量對比圖。

圖18為預防性給藥14周後，各組大鼠股骨皮質骨密度、松質骨密度、總骨密度對比圖。

圖19為治療性給藥12周後，各組糖尿病大鼠ucp-1表達量對比圖。

圖20為治療性給藥12周後，各組糖尿病大鼠cidea表達量對比圖。

圖21為治療性給藥12周後，各組糖尿病大鼠mcp-1表達量對比圖。

圖22為治療性給藥12周後，各組糖尿病大鼠prdm16轉錄因子mrna表達量對比圖。

具體實施方式

為更好的說明本發明的目的、技術方案和優點，下面將結合附圖和具體實施例對本發明作進一步說明。

組合物實施例1～組合物實施例5中給出了可用於製備預防或治療肥胖症或高同型半胱氨酸血症的食品、藥物和保健品的包含黃芪、葛根和桑白皮的組合物的實例。

組合物實施例1

一種組合物，其包含黃芪、葛根和桑白皮，且所述黃芪、葛根和桑白皮的質量比為黃芪：葛根：桑白皮＝2:1:1。

組合物實施例2

一種組合物，其包含黃芪、葛根和桑白皮，且所述黃芪、葛根和桑白皮的質量比為黃芪：葛根：桑白皮＝1:2:1。

組合物實施例3

一種組合物，其包含黃芪、葛根和桑白皮，且所述黃芪、葛根和桑白皮的質量比為黃芪：葛根：桑白皮＝1:1:2。

組合物實施例4

一種組合物，其包含黃芪、葛根和桑白皮，且所述黃芪、葛根和桑白皮的質量比為黃芪：葛根：桑白皮＝1:1:1。

組合物實施例5

一種組合物，其包含黃芪、葛根和桑白皮，且所述黃芪、葛根和桑白皮的質量比為黃芪：葛根：桑白皮＝2:1:0。

以下通過具體實施例來說明包含黃芪、葛根和桑白皮的組合物在預防或治療肥胖症或高同型半胱氨酸中的用途。

實施例1包含黃芪、葛根、桑白皮的組合物在預防和治療肥胖症中的應用

1.試驗分組

本實驗包括組合物(hqs)預防給藥和治療給藥兩部分。健康雄性sd大鼠應性飼養一周後，隨機分為正常組(sd)和造模組，正常組採用基礎飼料餵養，造模組採用高脂飼料餵養，自由飲水和進食，同時選取10隻造模組大鼠為模型組(hfd)。組合物預防給藥：將造模組大鼠隨機分為hqs-l—組合物低劑量組(1.2g/kg.d)、hqs-h—組合物高劑量組(2.4g/kg.d)，每組8隻，同時造模同時給藥。組合物治療給藥：將造模組大鼠連續高脂餵養7周後，造模組體重明顯高於正常組(餵食基礎飼料的sd大鼠)，造模組fpg、tc、tg、ldl-c水平也明顯高於正常組，表明此時模型成功，具有統計學差異，具體如附圖1所示。選擇超過正常大鼠體重20％的大鼠為肥胖大鼠模型，隨機分為hqs-l—組合物低劑量組(1.2g/kg.d)、hqs-h—組合物高劑量組(2.4g/kg.d)、立普妥陽性藥組(lipitor，2mg/kg)，每組8隻，高脂餵養7周後再開始給藥。正常組和模型組大鼠分別給予等量的生理鹽水，各給藥組給予相應試藥，每日一次。其中，組合物高、低劑量組的給藥為本發明的降脂保肝組合物，其中黃芪：葛根：桑白皮的質量比為1:2:1。

2.給藥方法

2.1預防性給藥(預防組是邊高脂飼料餵養邊給藥)；

2.1.1劑量設置

組合物低劑量(hqs-l)和組合物高劑量(hqs-h)的劑量設置根據前期多次藥效試驗所設的有效劑量，劑量分別為1.2g/kg.d和

2.4g/kg.d。

2.1.2給藥方法

每日一次，連續給藥15周。

2.2治療性給藥(治療組是高脂餵養7周後再開始給藥)。

2.2.1劑量設置

組合物低劑量(hqs-l)和組合物高劑量(hqs-h)的劑量設置根據前期多次藥效試驗所設的有效劑量，劑量分別為1.2g/kg.d和

2.4g/kg.d。立普妥劑量是按照人臨床等效劑量所設，劑量為2g/kg.d。

2.2.2給藥方法

每日一次，連續給藥15周。

3.試驗操作方法

3.1體重

實驗過程中每天觀察各組大鼠體重變化、進食、皮毛、活動等情況，每周記錄體重變化。

3.2糖脂生化指標

預防給藥：於給藥7周末及給藥12周末，大鼠禁食不禁水12h，乙醚麻醉，眼底靜脈叢取血，肝素抗凝，4℃離心(3000r/min，15min)分取血漿，測定空腹血糖(fpg)、膽固醇(tc)、甘油三酯(tg)、低密度脂蛋白(ldl-c)；

治療給藥：於給藥9周末及給藥14周末，大鼠禁食不禁水12h，乙醚麻醉，眼底靜脈叢取血，肝素抗凝，4℃離心(3000r/min，15min)分取血漿，測定fpg、tc、tg、ldl-c。

3.3實驗取材及臟器係數

實驗結束時，各組大鼠稱重，並用10％水合氯醛腹腔注射(0.35ml/100g體重)，將大鼠麻醉，大鼠麻醉後仰臥固定於解剖板上，進行腹主動脈取血處死，所獲血標本一部分靜置2h後3000r/min離心30min得血清，一部分為全血，並分裝置於-20℃冰箱備用。迅速取出心、肝、脾、肺、腎、附睪脂肪組織、腎周脂肪組織、棕色脂肪組織、股骨等臟器組織，稱重，分裝，放置凍存管-80℃冷凍保存。同時計算各臟器係數，臟器係數＝臟器質量/體重×100％。同時取一部分肝臟組織用於he染色，一部分肝臟組織用於油紅o染色。

3.4肝臟脂質水平測定

從-80℃冷藏冰箱裡取一管肝臟組織。檢測時取組織約100mg，加入異丙醇，體積1ml/50mg。勻漿後放置過夜。第二天離心後取上清，測定其中tc和tg含量，測得的結果換算為每千克臟器中含有的脂質含量以g計，結果換算成g/kg。分子量：甘油三酯639g/mol；總膽固醇386.65g/mol。

3.5肝臟同型半胱氨酸、穀氨醯轉肽酶測定

從-80℃冷藏冰箱裡取一管肝臟組織。檢測時取組織約100mg，用pbs洗去血汙。剪成小塊放入組織研磨器中，加入1mlpbs，製成勻漿，然後置於-20℃過夜。經過反覆凍融2次處理破壞細胞膜後，將組織勻漿於4℃5000g離心5分鐘取上清，取適量上清液立即實驗。測定方法按照elisa法，按照試劑盒說明書操作。

3.6大鼠活體micro-ct實驗

預防給藥組大鼠在解剖前的一周，進行活體micro-ct實驗。利用lathetalct200小動物ct，一款針對大鼠、小鼠及兔子等動物進行多功能3d掃描的micro-ct系統。實驗前，各組大鼠先用10％水合氯醛腹腔注射麻醉1-2h，放入槽中行腹平掃描，對大鼠骨參數、皮下脂肪、內臟脂肪、脂肪肝ct值等參數進行測定。該實驗在南方醫科大學第三附屬醫院醫學實驗研究中心進行。

4.試驗結果

4.1體重曲線變化比較

在預防給藥和治療給藥期間，各組大鼠不同時期的體重變化如表1～2和圖2所示。

表1預防給藥期間，各組大鼠不同時期的體重變化結果(n＝8)

表2治療給藥期間，各組大鼠不同時期的體重變化結果(n＝8)

結果分析：如表1～2和附圖2所示，正常組(sd組)與模型組(hfd組)大鼠體重相比可知：模型組的體重持續增加，且具有統計學差異，表明大鼠肥胖模型成功。從組合物預防給藥和治療給藥後大鼠的體重結果分析可知：組合物高劑量組(hqs-h組)、組合物低劑量組(hqs-l組)均對肥胖具有較好的預防作用，給藥組體重明顯低於模型組，接近於正常組體重，且明顯優於立普妥組(lipitor組)，立普妥組體重顯著增加，接近模型組。預防組大鼠在給藥前一周做了microct實驗，明顯感覺大鼠體重增長緩慢，尤其組合物給藥組大鼠體重有所下降。

如附圖3所示，通過統計各組大鼠平均每天每隻的飲食情況，可知餵高脂飼料的各組大鼠飲食情況之間無差異。表明各組大鼠體重的變化與飲食量無關。

4.2糖脂生化指標比較

4.2.1預防給藥7周以及治療給藥9周後糖脂生化指標比較

預防給藥7周以及治療給藥9周後，各組大鼠fpg、tc、tg、ldl-c水平變化如圖4～5所示。

從附圖4～5所示的預防給藥7周和治療給藥9周糖脂結果來看，模型組(hfd組)與正常組(sd組)相比，fpg、tc、tg、ldl-c水平均顯著升高，且具有統計學差異。與模型組相比，組合物高劑量組(hqs-h組)、組合物低劑量組(hqs-l組)均有較好的降糖、降脂作用，且有一定的劑量依賴性。

4.2.2預防給藥12周以及治療給藥14周後糖脂生化指標比較

預防性給藥12周以及治療給藥14周後，各組大鼠fpg、tc、tg、ldl-c水平變化如附圖6～7所示。

從圖6～7所示的預防給藥12周和治療給藥14周糖脂結果來看，模型組(hfd組)與正常組(sd組)相比，fpg、tc、tg、ldl-c水平均顯著升高，且具有統計學差異。與模型組相比，組合物高劑量組(hqs-h組)、組合物低劑量組(hqs-l組)均能較好的降糖、降脂，且具有一定劑量依賴性。並且在降糖降脂方面，組合物優於立普妥組。

4.3同型半胱氨酸、穀氨醯轉肽酶比較

預防性給藥15周以及治療性給藥15周後，各組大鼠肝臟中同型半胱氨酸水平和穀氨醯轉肽酶水平如圖8～9所示。

同型半胱氨酸(hcy)是人體內的一種含硫胺基酸，為蛋氨酸和半胱氨酸代謝過程中的重要中間產物。hcy過高是心腦血管疾病、骨質疏鬆、神經系統疾病的危險因素。如附圖8所示，通過檢測各組大鼠肝臟中hcy水平，發現模型組(hfd組)水平顯著升高，而組合物高、低劑量組(hqs-h組、hqs-l組)均顯著降低，表明給藥組的大鼠脂肪肝明顯得到改善。

穀氨醯轉肽酶(gtt1)已經是肝功能檢查項目之一。如附圖9所示，通過檢測肝臟中gtt1水平，可知模型組水平顯著升高，而組合物高、低劑量組(hqs-h組、hqs-l組)、立普妥組(lipitor組)均可顯著降低。

4.4肝臟脂質比較

預防性給藥15周以及治療性給藥15周後，各組大鼠肝臟中脂質(tc、tg)水平如圖10所示。

脂質異位沉積是指體內脂質堆積在非脂肪組織，多發生在肝臟、肌肉和胰腺，最易發生的部位是肝臟。如附圖10所示，通過檢測肝臟中脂質(tc、tg)，發現模型組(hfd組)肝臟脂質顯著升高，而給藥組均可顯著改善肝臟脂質沉積，且預防組較治療組更加顯著。

4.5肝臟油紅o染色比較

預防性給藥15周以及治療性給藥15周後，各組大鼠肝細胞進行油紅o染色後的脂肪變性對比如圖11所示。

如附圖11所示，正常組肝細胞內幾乎未見脂滴。模型組染色後大量大泡樣的脂滴，相互融合，且高脂餵養時間越久，脂滴越明顯。組合物預防高、低劑量組(預防hqs-h組、預防hqs-l組)的肝細胞脂肪變性明顯減輕，優於組合物治療高低劑量組(治療hqs-h組、治療hqs-l組)，均以高劑量組減輕程度更明顯。組合物高低治療劑量組的肝細胞脂肪變性與模型組相比，也明顯得到改善，且優於立普妥組；其中，a代表正常組，i代表模型組，k代表立普妥組。

4.6棕色、白色脂肪係數比較

4.6.1白色脂肪係數比較

哺乳動物主要含有白色脂肪(wat)棕色脂肪組織(bat)兩種。而白色脂肪通常又包括皮下白色脂肪和內臟白色脂肪。目前認為皮下白色脂肪和棕色脂肪參與維持機體能量的穩態和代謝的平衡，而內臟白色脂肪則參與代謝性疾病的發生。皮下白色脂肪主要包括腹股溝、腋下、甲狀腺旁脂肪；內臟白色脂肪主要包括附睪脂肪、腎周脂肪、腸繫膜脂肪。人體的相關研究認為，內臟白色脂肪與胰島素抵抗、糖尿病等心血管疾病危險因素的相關性比皮下白色脂肪更高。探討動物不同部位脂肪組織形態和功能差異，可以更好地為代謝症候群的發病機制提供依據。

研究發現，白色脂肪組織在受到某些生理刺激(冷暴露)，激素刺激(如irisin)以及機體接受藥物治療(如pparγ激動劑或β-腎上腺素能刺激)後，可出現棕色脂肪表型特徵，如脂滴變小，線粒過數目過多。由於白色脂肪棕色化顯示了能量平衡由能量儲存轉為能量支出，因而成為治療肥胖等代謝性疾病的新靶點。

預防性給藥15周以及治療性給藥15周後，各組大鼠的附睪脂肪和腎周脂肪係數如表3～4所示。

表3預防性給藥15周以及治療性給藥15周後，各組大鼠的附睪脂肪和腎周脂肪係數

表4治療性給藥15周以及治療性給藥15周後，各組大鼠的附睪脂肪和腎周脂肪係數

結果分析：如表3～4所示，附睪脂肪和腎周脂肪作為白色脂肪，組合物高、低劑量組(hqs-h組、hqs-l組)均顯著降低白色脂肪係數，且優於立普妥組。

4.6.2棕色/白色脂肪係數比較

預防性給藥15周以及治療性給藥15周後，各組大鼠的棕色脂肪與白色脂肪之比如圖12～13所示。

如附圖12～13所示，通過將棕色脂肪與白色脂肪之比也可以看出來，組合物高、低劑量組(hqs-h組、hqs-l組)均可提高棕白比，優於立普妥(lipitor組)。

綜上，採用純高脂餵養造模建立的肥胖大鼠模型的附睪脂肪係數、腎周脂肪係數都明顯高於正常組大鼠。從給藥上來看，組合物給藥組能明顯降低模型動物的附睪脂肪係數、腎周脂肪係數(降低白色脂肪、提高棕白比)，且降低明顯，並且對白色脂肪棕色化的基因影響明顯；在降低白色脂肪、提高棕色脂肪的同時消耗了大量的脂肪酸起到了降血脂的作用(降血脂的機理之一)。

4.7骨重量係數比比較

如附圖14所示，通過股骨與體重的比，發現正常組(sd組)與模型組(hfd組)之間無差異，而組合物高、低劑量組(hqs-h組、hqs-l組)與模型組相比，骨重量係數均顯著升高，且具有統計學差異，表明組合物具有提高骨質量的效果，且優於立普妥(lipitor組)。

4.8活體成像觀察藥物的影響

通過活體成像顯示藥物對骨胳、肝、脂肪的影響如圖15～18所示。利用lathetalct200對活體大鼠進行全身掃描，通過計算脂肪率，我們發現與正常組相比，模型組大鼠脂肪率和肝脂肪率明顯升高，且具有統計學差異。與模型組相比，組合物高低劑量組的脂肪率和肝臟脂肪率明顯降低，且具有劑量依賴性。同時對股骨的總骨密度也有所提升。

如附圖16所示，其顯示了預防給藥14周後各組大鼠的白色脂肪含量，從圖中可以看出降脂保肝組合物高低劑量組的脂肪率明顯降低。

如附圖17所示，其顯示了預防性給藥14周後，各組大鼠肝臟中的脂肪含量對比，從圖中可以看出降脂保肝組合物高低劑量組的肝臟脂肪率明顯降低。

如附圖18所示，其顯示了預防性給藥14周後，各組大鼠皮質骨密度、松質骨密度、總骨密度(圖18中從左至右依次為各組的皮質骨密度、松質骨密度、總骨密度)。從圖中可以看出降脂保肝組合物高低劑量組對股骨的總骨密度也有所提升。

實施例2包含黃芪、葛根和桑白皮的組合物改善肥胖的基因

1、試驗分組

本試驗共分為8組，每組分別如下：

a——sd組，n＝8

b——sd+gc組，n＝10

c——hfd組，n＝8

d——hfd+gc組，n＝12

i——hfd+gc+實施例2組合物組，n＝10

j——sd+gc+實施例2組合物組，n＝10

2.試驗方法

spf級別sd大鼠在普通級動物房適應性飼養兩周後(約200-220g)，將大鼠隨機分為正常組、糖皮質激素組、高脂飼料組、高脂加糖皮質激素組、高脂加糖皮質激素+組合物組、糖皮質激素加組合物組。正常組、糖皮質激素組和糖皮質激素加組合物組餵以基礎飼料，其他各組餵以高脂飼料。除正常組和高脂飼料組給予等量生理鹽水外，其餘各組開始灌胃醋酸潑尼松3.5mg/kg，一天一次，同時1小時後開始灌胃給藥組合物(2.96g/kg)，其中黃芪：葛根：桑白皮的質量比為1:2:1，連續12周。其後，按照以下方法進行試驗操作：

(1)總rna的提取

①收集動物的白色脂肪與棕色脂肪，用rna保存液保存。存放於-80℃冰箱。

②解凍組織，先用鑷子拿出樣本，放於濾紙上吸乾保存液，稱重，後轉移到另一乾淨的1.5mlep管中，加入1mltrizol，用小剪刀在trizol液中剪碎，於玻璃勻漿器中砧碎至肉眼看不到大顆粒。於10000rpm離心5min，仔細將上層油狀透明層棄去(脂肪層)。

③每管加氯仿0.2ml，劇烈振搖混勻15s，置室溫5min使之分層，4℃10000×g離心5min，仔細將上層水相移至另一1.5ml離心管中。

④每管加入0.5ml異丙醇，室溫放置10min，4℃10000×g離心10min。小心將上層清液棄去，用70％乙醇1ml洗滌沉澱，4℃5000×g離心5min，棄上清，室溫放置使乙醇完全揮發，管底可見白色小點即rna。

⑤沉澱中加入30μl無rnase水，58℃水浴10min使沉澱充分溶解。

(2)rna濃度、純度的檢測

用du800核酸/蛋白分析儀在波長260nm和280nm處分別測定rna樣本的od—a260和a280(rna純度高的樣本的a260/a280比值>1.7)，並計量rna濃度。取少量用核酸蛋白測定儀測定a260，計算rna含量。並測定a260/a280為1.8～2.0，證實rna的純度。其餘放-80℃凍存備用。

(3)rt合成cdna

利用上步提取的rna樣品，參照rt試劑說明書進行rt反應。rt反應體系如下表所示。

*根據rna濃度計算所加總rna量3.0μg的rna體積，再調整無rna酶超純水用量，使反應總體積為20μl。

在rt-pcr熱循環儀中設置如下熱循環程序進行反應(下表)：

反應結束後，所得cdna產物置-20℃保存。

(4)realtimepcr

①pcr引物設計與合成

按照realtimepcr引物設計原則設計引物。檢索ncbigenbank資料庫，所設計引物分別針對不同的外顯子，以β-actin作為內參對照的校準基因。應用primerpremier5.0軟體分別設計mcp-1、ucp-1、prdm16、cidea和β-actin的pcr引物，不同引物的序列見表15，所有pcr引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

②realtimepcr反應產物驗證

按sybrqpcrmix試劑盒的操作說明書配製如下反應體系(下表)

用abi7500型realtimepcr儀進行realtimepcr，擴增條件如下表所示：

③realtimepcr檢測目的基因和內參β-actin基因在各組脂肪組織中的表達

在50μl反應體系內，含有模板cdna200ng，其餘的反應成分、擴增條件及融解曲線的設置均同產物驗證實驗。分別擴增mcp-1、ucp-1、prdm16、cidea和β-actin的dna片段。採用2-△△ct法對realtimepcr結果進行數據分析，其中正常對照組的數值均為1。

3.試驗結果

3.1棕色脂肪組織中ucp-1基因表達

ucp-1基因在棕色脂肪組織中表達豐富，在白色脂肪組織中極少表達，為棕色脂肪細胞特異性基因。如附圖19所示，除高脂飼料組外，其餘各組在ucp-1基因表達上都明顯下降，其中i組(hfd+gc+實施例2組合物組)的ucp-1基因表達明顯高於d組(hfd+gc組)，說明組合物能夠促進棕色脂肪細胞特異性基因ucp-1的表達，說明組合物在抵抗肥胖上具有積極意義。

3.2棕色脂肪組織中cidea基因表達

如附圖20所示，i組(hfd+gc+實施例2組合物組)在cidea基因表達上明顯上升，高於其他各組，說明組合物在抵抗肥胖上具有積極意義。

3.3白色脂肪組織中mcp-1基因表達

如附圖21所示，與正常組相比，其餘各組在mcp-1基因表達上都明顯上升。較d組(高脂飼料加糖皮質激素組)，組合物給藥組(i、j組)在mcp-1基因表達上都有明顯下降。

3.4棕色脂肪組織中prdm16基因表達

附圖22顯示，prdm16轉錄因子在調控棕色脂肪和成肌細胞轉化中起重要作用，是保持棕色脂肪表型所必需的，也可促進棕色脂肪形成、能量消耗。

綜上可知，組合物對白色脂肪棕色化的基因影響明顯。

最後所應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非對本發明保護範圍的限制，儘管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和範圍。