使用PNA探針的熔解曲線分析、使用熔解曲線分析用於分析核苷酸多態性的方法和試劑盒與流程
2023-05-20 13:35:21 1
本發明涉及用於檢測靶基因的核苷酸多態性的修飾的PNA探針、使用包含報告物(reporter)和與其偶聯的淬滅物(quencher)的PNA探針的熔解曲線分析方法，使用所述PNA探針分析靶基因的核苷酸多態性的方法，和包含PNA探針的用於檢測靶基因的核苷酸多態性的試劑盒，且更具體地，涉及使用PNA探針的熔解曲線分析方法，通過熔解曲線分析的核苷酸多態性分析方法，和核苷酸多態性分析試劑盒，其中所述PNA探針含有負電荷分子。
背景技術：
單核苷酸多態性(SNP)是由DNA核苷酸中一個核苷酸的取代引起的基因變異，其為每個人帶來在疾病原因、對治療劑的反應等方面的個體差異。注意力已聚焦於SNP的檢測和確認上，因為它們與新藥開發以及個體化用藥相關聯。
為了迅速檢測SNP，已使用了多種檢測方法，其中應用實時PCR技術。作為多種檢測方法的代表性實例，存在使用DNA嵌入式螢光材料的分析方法、使用DNA探針的方法、使用PNA探針的方法等。
使用DNA嵌入式螢光材料的單核苷酸多態性分析方法可通過DNA嵌入式螢光材料的飽和濃度來區分PCR擴增子的核苷酸中的變化而無需對實施PCR反應後獲得的產物進行額外操作。然而，該方法在使用DNA嵌入式螢光材料中具有局限，且具有的劣勢在於僅一個單核苷酸能夠被分析且應使用用於分析熔解曲線的程序[Kirk M.Ririe等,ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 245:154160,1997；U.Hladnik等,Clin Exp Med 2:105108,2002]。
作為用於熔解曲線分析的DNA探針，存在MGB Taqman探針、Molecular Beacon(分子信標)(MB)探針和二元探針。上述方法具有的優勢在於顯示了優異的SNP區分能力，但具有的劣勢在於因為DNA探針的最小長度長約20～40聚物因此難以通過一個反應檢測鄰近的SNP[Hidefumi Sasaki等,Clin Cancer Res 11:2924-2929,2005；Manna Zhang等,HEPATOLOGY 36:3,2002]。
使用特徵在於含有負電荷分子的PNA探針的熔解曲線分析方法具有的優勢在於，相比已有PNA探針，PNA探針能夠迅速而強烈地與靶DNA偶聯，且由於強偶聯能力，能夠使用具有長度較短的探針，使得鄰近的單核苷酸多態性能夠被檢測。
相關領域的文獻
非專利文獻
(非專利文獻1)Chen,C.Y.等,Clin.Chem 50:481-489,2004
(非專利文獻2)M Beau-Faller等,British Journal of Cancer 100:985-992,2009
概述
本發明的一個目的是提供能夠檢測靶基因的核苷酸多態性的PNA探針。具體地，其特徵在於PNA探針含有負電荷分子。
本發明的另一目的是提供使用PNA探針用於檢測靶基因的核苷酸多態性的熔解曲線分析方法和包括所述PNA探針的核苷酸多態性分析方法。
本發明的另一目的是提供含有所述PNA探針的用於檢測靶基因的核苷酸多態性的試劑盒。
附圖簡述
圖1是顯示與靶DNA偶聯的PNA探針的示意圖和熔解曲線圖；
(a)使用與具有負電荷的胺基酸側鏈偶聯的PNA探針的情況。
(b)使用未修飾的PNA探針的情況。
圖2顯示通過將PNA探針與具有單核苷酸多態性的雜合樣品偶聯而獲得的熔解曲線圖；
(a)使用含有未修飾的PNA探針和以1:1比例混合的表2中的SEQ ID NO:10和11的DNA寡聚物的樣品的情況。
(b)使用含有與γ-穀氨酸偶聯的PNA探針和以1:1比例混合的表2中的SEQ ID NO:10和11的DNA寡聚物的樣品的情況。
(c)使用含有未修飾的PNA探針和以1:1比例混合的表2中的SEQ ID NO: 10和12的DNA寡聚物的樣品的情況。
(d)使用含有與γ-穀氨酸偶聯的PNA探針和以1:1比例混合的表2中的SEQ ID NO:10和12的DNA寡聚物的樣品的情況。
(e)使用含有未修飾的PNA探針和以1:1比例混合的表2中的SEQ ID NO:10和13的DNA寡聚物的樣品的情況。
(f)使用含有與γ-穀氨酸偶聯的PNA探針和以1:1比例混合的表2中的SEQ ID NO:10和13的DNA寡聚物的樣品的情況。
圖3顯示通過將PNA探針與具有單核苷酸多態性的雜合樣品偶聯獲得的熔解曲線圖；
(a)未與γ-穀氨酸偶聯的PNA探針的情況。
(b)與兩個γ-穀氨酸偶聯其間具有兩個核苷酸的PNA探針的情況。
(c)與兩個γ-穀氨酸連續偶聯而其間無兩個核苷酸的PNA探針的情況。
(d)與兩個γ-穀氨酸偶聯其間具有一個核苷酸的PNA探針的情況。
圖4顯示使用與γ-穀氨酸偶聯的三個PNA探針的多重檢測，黑線指示通過SEQ ID NO:2的PNA探針的熔解曲線，藍線指示通過SEQ ID NO:7的PNA探針的熔解曲線，且紅線指示通過SEQ ID NO:8的PNA探針的熔解曲線。
(a)使用由三個PNA探針和與每個探針互補結合的靶DNA寡聚物組成的純合樣品的實驗情況，其中所述三個PNA探針包含與其偶聯的γ-穀氨酸。
(b)使用由三個PNA探針和由於單核苷酸多態性所致的與每個探針錯配的靶DNA寡聚物組成的純合樣品的實驗情況，其中所述三個PNA探針包含與其偶聯的γ-穀氨酸。
(c)使用含有三個PNA探針和彼此以1:1的比例混合的上述(a)和(b)中使用的靶DNA寡聚物的雜合樣品的實驗情況，其中所述三個PNA探針包含與其偶聯的γ-穀氨酸。
圖5顯示多重檢測，該情況中包含與其偶聯γ-穀氨酸的三個PNA探針與單核苷酸多態性相鄰；且黑線指示SEQ ID NO:2的PNA探針的熔解曲線，藍線指示SEQ ID NO:7的PNA探針的熔解曲線，且紅線指示SEQ ID NO:8的PNA探針的熔解曲線。
(a)使用三個PNA探針和表2中SEQ ID NO:19的DNA寡聚物的情況，其中所述三個PNA探針包含與其偶聯的γ-穀氨酸。
(b)使用三個PNA探針和表2中SEQ ID NO:20的DNA寡聚物的情況，其中所述三個PNA探針包含與其偶聯的γ-穀氨酸。
(c)使用三個PNA探針和彼此以1:1的比例混合的表2中SEQ ID NO:19和20的DNA寡聚物的情況，其中所述三個PNA探針包含與其偶聯的γ-穀氨酸。
圖6顯示通過將PNA探針與具有單核苷酸多態性的多個雜合樣品偶聯而獲得的熔解曲線圖；
(a)使用含有表1中SEQ ID NO:9的PNA探針和彼此以1:1的比率混合的表2中的SEQ ID NO:21和22的DNA寡聚物的樣品的情況。
(b)使用含有表1中SEQ ID NO:9的PNA探針和彼此以1:1的比率混合的表2中的SEQ ID NO:25和26的DNA寡聚物的樣品的情況。
(c)使用含有表1中SEQ ID NO:9的PNA探針和彼此以1:1的比率混合的表2中的SEQ ID NO:21和23的DNA寡聚物的樣品的情況。
(d)使用含有表1中SEQ ID NO:9的PNA探針和彼此以1:1的比率混合的表2中的SEQ ID NO:25和27的DNA寡聚物的樣品的情況。
(e)使用含有表1中SEQ ID NO:9的PNA探針和彼此以1:1的比率混合的表2中的SEQ ID NO:21和24的DNA寡聚物的樣品的情況。
(f)使用含有表1中SEQ ID NO:9的PNA探針和彼此以1:1的比率混合的表2中的SEQ ID NO:25和28的DNA寡聚物的樣品的情況。
發明詳述
本發明提供用於檢測靶基因的核苷酸多態性的PNA探針，其包含報告物和與其偶聯的淬滅物。
其特徵在於PNA探針包含負電荷分子，其中所述負電荷分子可為選自由所有的酸組成的組的至少一種，所有的酸包括胺基酸、胺基酸側鏈、磷酸、羧酸、磺酸、硝酸和硼酸。
此外，負電荷分子可與PNA探針的N末端、C末端，或PNA骨架的α、β和γ位置偶聯，且至少一種負電荷分子可與探針的鹼基連續或間歇偶聯。
本發明提供使用PNA探針的熔解曲線分析方法，所述PNA探針包含報告物和與其偶聯的淬滅物。
其特徵在於所述熔解曲線分析方法中使用的PNA探針含有負電荷分子，且由於使用含有負電荷分子的PNA探針，熔解曲線的解析/解析度(resolution)增加，從而易於分析雜合樣品。
根據本發明含有負電荷分子的PNA探針可含有選自由所有的酸組成的組的至少一種負電荷分子，所有的酸包括胺基酸、胺基酸側鏈、磷酸、羧酸、磺酸、硝酸和硼酸。負電荷分子可與PNA探針的N末端、C末端，或PNA骨架的α、β和γ位置偶聯，且至少一種負電荷分子可與探針的鹼基連續或間歇偶聯。
此外，PNA探針可含有螢光材料。螢光材料可以是報告物、淬滅物或嵌入式螢光材料。
本發明提供使用含有負電荷分子的PNA探針的靶基因的核苷酸多態性分析方法。
可通過分析熔解曲線使用靶基因的核苷酸多態性分析方法。
由於PNA具有優異的熱穩定性和生物穩定性，及與DNA相比對靶DNA的高識別能力和與靶DNA的高偶聯能力，PNA可用作實時PCR技術的探針用於檢測單核苷酸多態性(SNP)。然而，由於實時PCR方法使用螢光材料檢測樣品中的靶DNA，為了檢測在一個位置的SNP，存在的問題是需要具有兩種螢光材料(其具有不同波長)的探針。上述問題在實施多重檢測中是顯著的限制，而本發明可通過螢光探針的熔解曲線分析解決了所述問題。然而，在其中使用未修飾的PNA探針實施熔解曲線分析的情況中，由於在熔解曲線圖一半最大值處的半寬度是大的，存在的劣勢是用雜合樣品的分析結果並不精確。因此，本發明的發明人嘗試將PNA探針的骨架與具有負電荷的胺基酸的側鏈偶聯，從而隨著溫度增加，PNA探針和靶DNA迅速解離，由此能夠精確分析熔解曲線。因此簡化的示意圖示於圖1。
由於在熔解曲線圖的半最大值處較小的半寬度，根據本發明的PNA探針可應用於多種分子診斷技術，如下述實例。例如，在其中核苷酸多態性發生於短核苷酸序列中多個位置處的密碼子的情況中，由於熔解曲線的解析/解析度很高，可使用一個PNA探針檢測核苷酸多態性是否在一個位置或在兩個或多個位置發生。此外，由於高解析/解析度，熔解曲線可根據核苷酸多態性發生的位置處的鹼基而區分，且因此，具有修飾的核苷酸序列可簡單地得出而無需單獨的分析(如序列分析)。
由於增加的熔解曲線解析/解析度，根據本發明使用PNA探針用於檢測核苷酸多態性的熔解曲線分析方法可使得實施核苷酸多態性的多重檢測成為可能，且此外，甚至在其中SNP彼此相鄰的情況中，可實施多重檢測。
此外，甚至其中引入根據本發明與具有負電荷的胺基酸的側鏈偶聯的PNA探針以及在並非靶DNA的SNP修飾位置的不同位置形成錯配的鹼基的情況中，可獲得與上述情況類似的效果。
本發明提供靶DNA的核苷酸多態性分析方法，其包括：
從測試樣品分離靶DNA；
將靶DNA與PNA探針雜交，所述PNA探針含有報告物和與其偶聯的淬滅物；
通過熔解由雜交獲得的產物同時改變溫度而獲得熔解曲線；並
分析獲得的熔解曲線。
其特徵在於靶基因的核苷酸多態性分析方法中使用的PNA探針，和熔解曲線分析方法含有負電荷分子，其中含有負電荷分子的PNA探針可含有選自由所有的酸組成的組的至少一種負電荷分子，所有的酸包括胺基酸、胺基酸側鏈、磷酸、羧酸、磺酸、硝酸和硼酸。負電荷分子可與PNA探針的N末端、C末端，或PNA骨架的α、β或γ位置偶聯，且至少一種負電荷分子可與PNA探針的每個鹼基連續或間歇偶聯。
此外，在根據本發明的核苷酸多態性分析方法和熔解曲線分析方法中使用的PNA探針可包含螢光材料。探針可具有報告物和淬滅物的螢光材料，所述淬滅物能夠淬滅與其兩末端都偶聯的報告物的螢光，並可包含嵌入式螢光材料。報告物可為選自下組的至少一種：FAM(6-羧基螢光素)、德州紅(Texas red)、JOE、TAMRA、CY5和CY3，且淬滅物優選是TAMRA(6-羧基四甲基-羅丹明)、BHQ1、BHQ2或Dabysyl，但本發明不限於此。嵌入式螢光材料可選自下組：吖啶同二聚體及其衍生物、吖啶橙及其衍生物、7-氨基放線菌素D(7-AAD)及其衍生物、放線菌素D及其衍生物、9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶(ACMA)及其衍生物、DAPI及其衍生物、二氫乙錠及其衍生物、溴化乙錠及其衍生物、乙錠同型二聚體-1(EthD-1)及其衍生物、乙錠同型二聚體-2(EthD-2)及其衍生物、乙錠單疊氮化物(ethidium monoazide)及其衍生物、碘化己啶及其衍生物、雙苯醯亞胺(bisbenzimide)、Hoechst 33258及其衍生物、Hoechst 33342及其衍生物、Hoechst 34580及其衍生物、羥芪巴脒(hydroxystilbamidine)及其衍生物、LDS751及其衍生物、碘化丙啶(PI)及其衍生和Cy-染料衍生物。
用於靶基因的核苷酸多態性分析方法的PNA探針可含有報告物和淬滅物，其中所述PNA探針含有與其偶聯的負電荷分子。含有負電荷分子、報告物和淬滅物的PNA探針與靶DNA雜交且隨後生成螢光信號，且隨溫度增加，由於負電荷效應，PNA探針和靶DNA在探針的最佳熔解溫度迅速熔解，從而淬滅螢光信號。與無負電荷的PNA探針相比，含有負電荷的PNA探針迅速從靶DNA解離以增加熔解曲線的解析/解析度。通過從根據溫度變化的螢光信號獲得的具有高解析/解析度的熔解曲線分析，可分析靶DNA的核苷酸多態性。
此外，用於靶基因的核苷酸多態性的PNA探針可含有嵌入式螢光材料，其中所述PNA探針含有與其偶聯的負電荷分子。含有與其偶聯的嵌入式螢光材料和負電荷分子的探針與靶DNA雜交且隨後生成螢光信號，且由於負電荷效應，PNA探針和靶DNA在探針的最佳熔解溫度迅速熔解，從而淬滅螢光信號。通過根據螢光信號的溫度獲得的具有高解析/解析度的熔解曲線分析，可分析靶DNA的核苷酸多態性。
此外，根據本發明的靶基因的核苷酸多態性分析方法可包括分析通過使用螢光信號檢測獲得的熔解曲線而不將嵌入式螢光材料與探針直接偶聯。
本發明提供使用PNA探針的熔解曲線分析方法用於分析靶基因的核苷酸多態性的試劑盒，所述PNA探針包含報告物和與其偶聯的淬滅物。
其特徵在於PNA探針含有負電荷，且試劑盒優選含有PNA探針，所述PNA探針包含報告物和與其偶聯的淬滅物，但本發明不限於此。
用於分析核苷酸多態性的試劑盒可通過分析多重靶DNA或單靶DNA的核苷酸多態性而使用。
此後，將參照下述實施例詳細描述本發明。這些實施例僅用於例示本發明，且根據本發明的精髓對於本領域的技術人員顯而易見的是，本發明的範圍不應理解為受限於這些實施例。
實施例1熔解曲線分析實驗中使用的PNA探針、靶DNA寡聚物合成和熔解曲線分析方法
為了實施本發明的熔解曲線分析，合成了如下表1所示的PNA探針來使用。
[表1]本發明中使用的PNA探針的序列
在上文表1中，O指示接頭，粗體字母指示γ-穀氨酸-PNA單體且K指示賴氨酸。
根據韓國專利公開號464261[Lee等,Org.Lett.,9:3291-3293,2007]所述的方法，通過固相合成通過從苯並噻唑磺醯基(Bts)保護的PNA單體和官能化的樹脂合成PNA寡聚物而製備PNA探針。除上述的方法外，PNA探針可使用9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)或叔丁氧基羰基(t-Boc)合成方法合成[Kim L.等,J.Org.Chem.59:5767-5773,1994；Stephen A.等,Tetrahedron,51:6179-6194,1995]。根據本領域廣泛已知的方法在PNA探針上標記報告物材料和淬滅物材料。
作為將與PNA探針偶聯的靶DNA寡聚物，使用了由Bioneer Corporation(韓國)合成的DNA寡聚物。
[表2]本發明中使用的DNA寡聚物的序列
添加了1.25μM上表1中所列的PNA探針、0.25μM上表2中所列的DNA寡聚物和PCR擴增溶液(Enzynomics Co.,Ltd.,Korea)並彼此混合，然後是使用實時PCR儀(CFX96TM實時PCR系統)在95℃反應5分鐘，溫度以0.1℃/秒的速率減少直至40℃並將反應物保持5分鐘，然後測量螢光同時從40℃以0.5℃將溫度增加至95℃，由此實施熔解曲線分析。
實施例2使用包含與其偶聯的γ-穀氨酸的PNA探針進行的具有單核苷酸多態性的雜合樣品的熔解曲線分析
為了比較包含與其偶聯的γ-穀氨酸的PNA探針與未修飾的PNA探針之間的熔解曲線中的差異，通過實施例1的方法，通過實驗分析了熔解曲線，所述實驗使用包含表1中的SEQ ID NO:1和2的PNA探針和寡聚物的樣品，所述寡聚物通過將表2中SEQ ID NO:10的DNA寡聚物以1:1的比例分別與表2中的SEQ ID NO:11至13的DNA寡聚物之一混合而製備。
其結果示於圖2。可以理解的是在其中使用了包含與其偶聯的γ-穀氨酸的PNA探針(即，包含引入其中的負電荷分子的PNA探針)的情況中，由於負電荷效應，根據溫度的增加，PNA探針從靶DNA迅速解離，從而具有SNP的雜合樣品中熔解曲線的解析/解析度顯著增加。
實施例3根據與PNA探針偶聯的γ-穀氨酸的位置具有單苷酸多態性的雜合樣品的熔解曲線分析
為根據γ-穀氨酸(其為與PNA探針偶聯的負電荷分子)的位置比較熔解曲線的差異，通過上述實施例1的方法，使用樣品通過實驗分析了熔解曲線，所述樣品分別包含表1中的SEQ ID NO:3、4、5和6的PNA探針和以1:1的比例彼此混合的表2中的NO:13至14的DNA寡聚物。其結果示於圖3。
在使用與兩個γ-穀氨酸偶聯、其間具有兩個核苷酸的PNA探針的情況中，將兩條熔解曲線在具有SNP的雜合樣品中最精確地彼此分開。
實施例4含有三個不同PNA探針的三個不同的純合樣品或包含單核苷酸多態性的雜合樣品的熔解曲線分析，其中三個不同PNA探針含有與其偶聯的γ-穀氨酸
通過確認上述實施例2是否能夠用於多重檢測，進行了實施例4。通過上述實施例1的方法，分別使用下述樣品通過實驗分析熔解曲線：包含表1中SEQ ID NO:2的PNA探針與靶寡聚物的組合的樣品，所述靶寡聚物通過包含表2中SEQ ID NO:10或11的DNA寡聚物或通過以1:1的比率彼此混合兩種DNA寡聚物而製備；包含表1中SEQ ID NO:7的PNA探針與靶寡聚物的組合的樣品，所述靶寡聚物通過包含表2中SEQ ID NO:15或16的DNA寡聚物或通過以1:1的比率彼此混合兩種DNA寡聚物而製備；和包含表1中SEQ ID NO:8的PNA探針與靶寡聚物的組合的樣品，所述靶寡聚物通過包含表2中SEQ ID NO:17或18的DNA寡聚物或通過以1:1的比率彼此混合兩種DNA寡聚物而製備。
其結果示於圖4。確認了多重檢測能夠使用PNA探針執行，所述PNA探針包含與其偶聯的γ-穀氨酸。
實施例5使用三個不同的PNA探針在具有相鄰的不同的單核苷酸多態性的雜合樣品中的熔解曲線分析，其中三個不同的PNA探針包含與其偶聯γ-穀氨酸
通過確認由上述實施例4確認的多重檢測能力是否能夠甚至在SNP彼此相鄰的情況中進行，進行了實施例5。使用包含表1中的SEQ ID NO:2、7和8的三個PNA探針和靶寡聚物的樣品通過實驗分析了熔解曲線，所述靶寡聚物通過包含表2中的SEQ ID NO:19或20的DNA寡聚物或通過以1:1的比率將兩者DNA寡聚物彼此混合而製備。
其結果示於圖5。通過使用包含與其偶聯的γ-穀氨酸的PNA探針，確認了多重檢測甚至在SNP彼此相鄰的情況中能夠執行。
實施例6使用PNA探針在具有不同的單核苷酸多態性的雜合樣品中的熔解曲線分析，所述PNA探針具有引入其中的鹼基，所述鹼基在並非靶DNA的SNP修飾位置的不同位置處形成錯配
為比較具有引入其中的在並非靶DNA的SNP修飾位置的不同位置處形成錯配的鹼基的PNA探針的效果，通過實施例1的方法，分別使用下述樣品通過實驗分析了熔解曲線：包含表1中SEQ ID NO:9的PNA探針和靶寡聚物的樣品，所述靶寡聚物通過將SEQ ID NO:21的DNA寡聚物與表2中的SEQ ID NO:22至24的DNA寡聚物之一以1:1比例混合而製備，包含表1中SEQ ID NO:9的PNA探針和靶寡聚物的樣品，所述靶寡聚物通過將SEQ ID NO:25的DNA寡聚物與表2中的SEQ ID NO:26至28的DNA寡聚物之一以1:1比例混合而製備。
其結果示於圖6。通過使用具有引入其中的在並非靶DNA的SNP修飾位置的不同位置處形成錯配的鹼基的PNA探針，確認了兩條熔解曲線在具有SNP的雜合樣品中最精確地彼此分開。
在本發明中開發的PNA螢光探針不僅可用於上文實施例清楚描述的熔解曲線分析方法，還可用於能夠使用螢光探針分析靶DNA的所有方法，例如，實時PCR方法；然而，其僅通過實施例的方式描述，且本發明並不限於此。本領域的技術人員可以理解的是可使用所有已知的方法。
工業實用性
根據本發明的PNA探針的骨架可與具有負電荷的胺基酸的側鏈偶聯，從而PNA探針可具有對於靶DNA的高識別能力和對於靶DNA的高偶聯能力且可通過熱迅速解離。因此，本發明的使用包含負電荷的PNA探針的核苷酸多態性分析方法具有的優勢在於甚至在顯示兩條熔解曲線圖的雜合樣品中可相對容易地進行核苷酸多態性分析，且可同時分析兩個和更多個鄰近的單核苷酸多態性。此處，容易實施的熔解曲線分析不限於雜合樣品，還可應用於包括純合樣品的所有樣品。
已基於其具體特徵詳細描述了本發明，而且對於本領域的技術人員顯而易見的是這些特定的技術僅為優選的實施方案且因此本發明的範圍不限於所述實施方案。因此，本發明實質的範圍由所附的權利要求及其等同物限定。
序列表自由文本
附於本文件。
序列表
帕納金股份有限公司(PANAGENE INC.)
使用PNA探針的熔解曲線分析、使用熔解曲線分析用於分析核苷酸多態性的方法和試劑盒
PF-B1787
PCT/KR2014/002909
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PatentIn version 3.2
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DNA
人工的
K(D)-0T
24
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25
21
DNA
人工的
K(D)-0A
25
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26
21
DNA
人工的
K(D)-1A
26
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27
21
DNA
人工的
K(D)-2A
27
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28
21
DNA
人工的
K(D)-3A
28
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