生物活性的純化HspE7組合物的製作方法
2023-05-20 03:44:36 4
專利名稱：生物活性的純化HspE7組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及免疫學領域。進一步，本發明提供包含HspE7的組 合物及其使用方法。
背景技術：
疫苗接種和免疫治療指的是一 系列複雜設計的細胞相互作用序 列的操作。細胞相互作用包括免疫監視，從而總的來說抗原呈遞細胞
肽表位，並加載表位到由主要組織相容性複合體(MHC)編碼的分子的 識別槽裂(recognition ceft)中。在輸出到DC表面後，負載有表位的 MHC分子向T細胞呈遞表位-MHC複合體並激活T細胞。激活的 CD4+ T輔助(Th)細胞向其它的DC傳遞趨化因子和細胞因子信號，使 它們隨之能夠激活幼稚CD8+T細胞，從而將這些細胞轉化成抗原特 異性的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)。激活的T輔助細胞也與B細胞相 互作用，從而向它們提供控制分化、克隆擴增和在發生適應性免疫的 體液應答時分泌的抗體同種型定義的分子信號。
疫苗接種和免疫治療是預防或治療多種病症(如特定的傳染性疾 病或癌症)的有吸引力的途徑。但是，這種治療的成功經常受到免疫 治療方案固有的幾種缺陷的限制，例如，所選擇的細胞毒性T淋巴細 胞(CTL)表位的免疫原性較差。增強免疫應答的標準方法是使用與免 疫原隔離的且通常在使用前與免疫原混合的佐劑。明礬(Alum)和弗氏 不完全佐劑(IFA)是公知的佐劑的例子。特定的微生物天然產物也已顯 示可用作佐劑。常用的實例包括來自革蘭氏陰性細菌的脂多糖(LPS) 及來自革蘭氏陰性和革蘭氏陽性兩種細菌的細菌胞壁糖肽，也稱作胞 壁質或肽聚糖(PG)。
4微生物佐劑被認為通過激活哺乳動物細胞中的模式識別受體
(PRR)發揮其促炎性(pro-inflammatory)效應。稱作Toll樣受體(TLR) 的哺乳動物表面受體是PRR系統中的關鍵受體種類之一。TLR的激 活引發導致轉錄因子NFkB和API的誘導產生的細胞內信號級聯，轉 錄因子NFkB和API的誘導隨之激發編碼促炎介體(如趨化因子和特 定的細胞因子)的基因的表達。到目前為止已經在人體中鑑定了 11種 不同的TLR,且各TLR具有識別微生物化合物的獨特亞類的能力。
例如，LPS是TLR4的配體，肽聚糖是TLR2的配體。TLR也可 以形成具有獨特配體特異性的異二聚體。例如，來自支原體的巨噬細 胞活化脂肽-2 (MALP-2)是TLR2/TLR6異二聚體的配體，而細菌脂肽 Pam3Cys-Ser-Lys(4)是TLR1/TLR2異二聚體的配體。
人乳頭狀瘤病毒(HPV)的E7蛋白是小的(大約10000Mw)、 Zn-結 合磷蛋白，它很可能由於其結合視網膜母細胞瘤基因產物Rb(結合併 滅活轉錄因子E2F的腫瘤抑制因子)的能力而具有致癌性。轉錄因子 E2F控制許多生長相關基因(包括編碼胸苷激酶、c-myc、 二氫葉酸還 原酶和DNA聚合酶cc的基因)的轉錄。Rb-E2F複合體的形成阻止後 面的基因在G0和Gl期中的表達，從而將其表達限制在S期中， Rb-E2F複合體在S期中按程序解離而釋放出活性的轉錄因子E2F。 因此E7代表了在乳頭狀瘤病毒感染中用於進行免疫幹預的吸引人的 靶標，因為它在整個病毒生活周期中表達且實際上它是在由HPV感 染引起的晚期宮頸癌期間表達的僅有的兩種病毒蛋白質之一。
已經有人報導了佐劑與HPV 16蛋白的共同施用。例如， Freyschmidt等人(Freyschmidt E-J.等，2004， Antiviral Ther. 9:479-489) 證明脂多糖(LPS)、非曱基化的CpG和山梨糖醇增強了 HPV16L1-E7 融合顆粒誘導的樹突細胞的激發。Kim等人(Kim T-Y.等，2002 Cancer Res. 62:7234-7240)指出HPV E7與CpG寡聚脫氧核苷酸(CpG ODN) 1826共用增強了對抗HPV 16的保護性免疫。Chen等人(Chen Y-F.等, 2004, J. Virol. 78:1333-1343)也報導了利用與CpG ODN 1826或弗氏佐 劑共用的HPV E5消除含E5的腫瘤的生長。
5WO99/07860公開了可在HPV感染期間用作引起抗-E7免疫應答 的疫苗試劑的重組Hsp65-E7融合蛋白(HspE7)的製備。其中描述的 H鄰E7融合蛋白在大腸桿菌(E co/i)中表達且在引起E7特異性CD8免 疫應答的能力方面具有生物活性。
發明內容
本發明涉及包含HspE7的組合物及其使用方法。更具體地i兌， 本發明提供包含純化的Hsp65-HPV E7融合蛋白(HspE7)的組合物及
使用方法。
本發明的目的是提供一種改良的HspE7組合物。
按照本發明，提供了 一種提高純化的HspE7的生物活性的方法， 包括將HspE7與選自CpG、TLR3激動劑、單磷醯脂質A (MPL)、MPL-海藻糖6，6，-二黴菌酸酯(MPL-TDM)和抗-CD40的免疫刺激劑一起混 合。優選地，免疫刺激劑以每劑大約lpg至大約5000pg的量與HspE7 共同施用。在本發明的一些方面中，免疫刺激劑是PolyI:C或與陽離 子聚合物(如聚賴氨酸、聚精氨酸或包括大部分陽離子胺基酸的陽離 子肽)複合的PolyI:C。在本發明的其它方面中，免疫刺激劑是 PolyICLC。另外，純化的HspE7使用凝膠電泳、HPLC或同時使用這 兩種方法測定的HspE7純度為大約95%至大約99.99%。
本發明還涉及包含純化的HspE7和選自CpG、 TLR3激動劑、 MPL、 MPL-TDM和抗-CD40的免疫刺激劑的組合物。優選所述免疫 刺激劑以每劑大約lpg至大約5000pg的量存在。在本發明的一些方 面中，免疫刺激劑是PolyI:C或與陽離子聚合物(如聚賴氨酸、聚精氨 酸或包括大部分陽離子胺基酸的陽離子肽)複合的PolyI:C。在本發明 的其它方面中，免疫刺激劑是PolyICLC。另外，純化的HspE7使用 凝膠電泳、HPLC或同時使用這兩種方法測定的HspE7純度為大約 95%至大約99.99%。
本發明還涉及減低在哺乳動物或對象中腫瘤負荷或病毒發展的 方法，包括向需要的對象施用包含純化的HspE7和選自CpG、 TLR3激動劑、MPL、 MPL-TDM和抗-CD40的免疫刺激劑的組合物。優選 免疫刺激劑以每劑大約l貼至大約5000叫的量共同施用。在本發明 的 一些方面中，免疫刺激劑是PolyI:C或與陽離子聚合物(如聚賴氨酸、 聚精氨酸或包括大部分陽離子胺基酸的陽離子肽)複合的PolyI:C。在 本發明的其它方面中，免疫刺激劑是PolyICLC。另外，純化的HspE7 使用凝膠電泳、HPLC或同時使用這兩種方法測定的HspE7純度為大 約95%至大約99.99%。
本發明進一步提供包括純化的HspE7和選自CpG、TLR3激動劑、 MPL、 MPL-TDM和抗-CD40的免疫刺激劑及其使用說明的試劑盒。 優選免疫刺激劑以每劑大約lpg至大約5000pg的量存在。在本發明 的 一 些方面中，免疫刺激劑是PolyI:C或與陽離子聚合物(如聚賴氨酸、 聚精氨酸或包括大部分陽離子胺基酸的陽離子肽)複合的PolyI:C。在 本發明的其它方面中，免疫刺激劑是PolyICLC。另外，純化的HspE7 使用凝膠電泳、HPLC或同時使用這兩種方法測定的HspE7純度為大 約95%至大約99.99%。
本發明涉及所述組合物用於增強抗HPV蛋白質抗原的免疫應答 的用途，及在特別的實施方式中，用於增強抗腫瘤或抗表達HPV蛋 白質抗原的HPV感染細胞的免疫應答的用途。該組合物可以用於在 需要的對象中預防或治療癌症。
本發明還涉及組合物的給藥時間表。在本發明的特定方面中，本 發明的組合物按照包括至少兩個劑量的給藥時間表施用。所述劑量可 以在連續的幾日內施用，或者在非連續的幾日內施用，或者組合這兩 種方式。
該發明內容並不必然地描述本發明的所有特徵。 附圖簡要說明
本發明的這些特徵和其它特徵通過下面參照附圖對本發明所作 的說明將變得更加清楚，附圖中
圖1顯示了各種HspE7製劑的抗肺瘤活性。方法L:方法L HspE7是高純度的HspE7製劑。方法A HspE7是低純度的HspE7 (WO99/07860中進行了描述)。攜帶已建立的表達E7的TC-1腫瘤的 小鼠在頸背部皮下注射梯度劑量的由方法A或方法L製備的HspE7 (n二3/組/劑量)，並隨後使腫瘤生長49天。RD4-方法L HspE7 O); RD5-方法L HspE7 ( ); CL4-方法A HspE7 (。); CL6-方法A HspE7 (□)。 X軸TC-1分析中使用的HspE7的劑量(以pg計)。
圖2顯示HspE7在包含CpG的寡核苷酸(TLR9激動劑)存在的情 況下誘導E7-特異性CD8陽性T淋巴細胞的能力得到增強。給幼稚 C57B1/6小鼠皮下注射單獨的HspE7或HspE7+30pg CpG寡核苷酸， 且通過ELISPOT測量E7-特異性脾細胞的數目。從左至右(每項處理 兩隻小鼠為一組)，免疫抗原為400|ng方法A HspE7 (WO99/07860中 描述的低純度HspE7)、 400|ig方法A HspE7+30pg CpG寡核苷酸、 400pg方法L HspE7 (高純度HspE7)、 400)^g方法L HspE7+30|ug CpG 寡核苷酸。用於ELISPOT分析的回憶抗原為HBV核心抗原(HBVcAg) (93-100)無關對照肽(實心條)、E 09-5"特異性肽(灰色條)、僅具有培 養基的對照(空心條)。
圖3顯示通過方法L HspE7 (純化的HspE7)和Poly I:C (TLR3激 動劑)或CpG寡核香酸(TLR9激動劑)而非PAM3CysSK4 (TLR2激動 劑)的共注射，HspE7誘導E7特異性CD8-陽性T淋巴細胞的能力得 到增強。小鼠以標示劑量皮下注射方法L HspE7加TLR激動劑的混 合物(溶液)，且E7-特異性脾細胞的數目通過ELISPOT進行測量。從 左至右(每項處理兩隻小鼠為一組)，免疫抗原為50^g方法L HspE7 + 10|1^20寡核普酸、50|ug方法LHspE7+100ngPoly I:C、 50嗎方法 LHspE7+20pg PAM3CysSK4或幼稚小鼠。用於ELISPOT分析的回憶 抗原為HBVcAg(93-100)無關對照肽(陰影條)、E7(49-57)特異性肽(實 心條)、僅具有培養基的對照(空心條)。
圖4顯示在單磷醯脂質A (MPL, TLR4激動劑)存在下方法L HspE7誘導E7特異性CD8-陽性T淋巴細胞的能力得到增強。幼稚 C57B1/6小鼠皮下注射單獨的方法L HspE7 (純化的HspE7)或者HspE7加上MPL+TDM,且E7-特異性脾細胞的數目通過ELISPOT進 行測量。從左至右(每項處理兩隻小鼠為一組)，免疫抗原為400ng方 法L HspE7、 MPL+TDM (Ribi)中的400jug方法L HspE7或幼稚小鼠。 用於ELISPOT分析的回憶抗原為HBVcAg(93-100)無關對照肽(實心 條)、E7(49-57)特異性肽(陰影條)、僅具有培養基的對照(空心條)。
圖5顯示在Poly ICLC (TLR3激動劑)存在下方法L HspE7誘導 E7特異性CD8-陽性T淋巴細胞的能力得到增強。給幼稚C57B1/6小 鼠皮下注射單獨的方法L HspE7 (純化的HspE7)或者HspE7加上梯度 劑量的Poly ICLC，且E7-特異性脾細胞的數目通過ELISPOT進行測 量。從左至右(每項處理兩隻小鼠為一組)，免疫抗原為400pg方法L HspE7、 400/ig方法L HspE7+100|iig Poly ICLC 、 400jug方法L HspE7+10|ngPolyICLC、 400|ug方法L HspE7+l |iig Poly ICLC 、 400pg 方法LHspE7+0.1pgPoly ICLC、僅lOO^ig Poly ICLC或幼稚小鼠。用 於ELISPOT分析的回憶抗原為HBVcAg(93-IOO)無關對照肽(灰色 條)、E7(49-57)特異性肽(點畫條)、僅具有培養基的對照(空心條)。
圖6顯示方法LHspE7或方法AHspE7對腫瘤發病率的影響。各 種HspE7製劑的抗胂瘤活性通過施用方法A HspE7 C(氐純度的HspE7， 在WO99/07860中進行了描述)或者共同施用方法L HspE7 (純化的 HspE7)和CpG寡核苷酸來確定。攜帶已建立的表達E7的TC-1肺瘤 的小鼠在頸背部皮下注射單獨的方法A HspE7或與不同劑量CpG寡 核苷酸混合的梯度劑量的方法LHspE7 (n-30/組)，並隨後使腫瘤生長 49天。3iugCpG寡核普酸+方法LHspE7(,); lOpg CpG寡核苷酸+方 法L HspE7 (▲); 30pg CpG寡核普酸+方法L HspE7 (，);方法A HspE7 ( );平均的方法A HspE7歷史數據(。)。X軸TC-1分析中 <吏用的HspE7
的jLlg數。
圖7顯示通過結合Poly I:C和方法L HspE7 (純化的HspE7)使得 方法LHspE7的抗腫瘤活性增力o。攜帶已建立的表達E7的TC-1胂瘤 的小鼠在頸背部皮下注射單獨的梯度劑量的方法L HspE7或與Poly I:C組合的方法L HspE7 (n=20/grp),並隨後使胂瘤生長49天。注射
9鼠中大約50%在第49天具有腫瘤。HspE7(隨);HspE7+Polyl:CO)。 X軸:TC-1分析中使用的HspE7的數。
圖8顯示與純化的HspE7 (方法L HspE7)混合的佐劑明礬或弗氏不完全佐劑(IFA)對於誘導E7特異性、CD8-陽性T淋巴細胞的作用。小鼠以標示劑量皮下注射單獨的方法L HspE7或者方法L HspE7、CpG寡核苷酸、明礬和弗氏不完全佐劑(IFA)的各種組合，且E7-特異性脾細胞的數目通過ELISPOT進行測量。從左至右(每項處理兩隻小鼠為一組)，免疫抗原為400pg方法LHspE7、 IFA中的400pg方法LHspE7、 IFA中的400pg方法L HspE7+CpG寡核苷酸、400pg方法LHspE7+明石凡、400)ig方法LHspE7+明礬+CpG寡核苷酸、400|tig方法L HspE7+ CpG寡核苷酸或幼稚小鼠。用於ELISPOT分析的回憶抗原為HBVcAg(93-IOO)無關對照肽(陰影條)、E7(49-57)特異性肽(點畫條)、僅具有培養基的對照(空心條)。
圖9顯示HspE7在各種TLR激動劑或激動性抗-CD40抗體存在的情況下共同施用時誘導E7特異性CD8-陽性T淋巴細胞的能力的對比。在將HspE7與咪喹莫特(TLR7激動劑)、PAM3CysSK4 (TLR1/2激動劑)或LPS (TRL4激動劑)共同施用後，誘導的E7特異性T細胞的數目是微不足道的。相反，在將HspE7與CpG寡核苷酸或激動性抗-CD40抗體共同施用後誘導出大量的E7特異性T細胞。給小鼠皮下注射純化的HspE7 (方法L HspE7)加所示的TLR激動劑的混合物，且E7-特異性脾細胞的數目通過ELISPOT進行測量。從左至右(每項處理兩隻小鼠為一組)，免疫抗原為400pg方法LHspE7、 400pg方法LHspE7+100叫咪喹莫特、400|iig方法LHspE7+30iugLPS、 400|tig方法L HspE7+25|ig PAM3CysSK4、 400pg方法L HspE7+25|Ug抗-CD40抗體(克隆ICIO)、 400|ug方法LHspE7+30pgCpG寡核苷酸或幼稚小鼠。用於ELISPOT分析的回憶抗原為HBVcAg(93-100)無關對照肽(實心條)、E7(49-57)特異性肽(陰影條)、僅具有培養基的對照(空心條)。
圖10顯示每日初免-加強(prime-boost)策略對通過IFN-y ELISPOT測量的誘導I類限制CD8+ T細胞應答的能力的影響。C57B1/6小鼠(每
10組兩隻)按每日間隔用HspE7 (100嗎)和Poly ICLC (10jag)進行免疫， 每天一次，最多進行4天。在第一次抗原刺激(antigen exposure)後7 天，將所有動物無痛致死並取脾細胞進行分析。使用IFN-yELISPOT 評定在用16E7.49-57.Db肽刺激時的I類限制CD8+ T細胞應答(回憶 抗原-空心條；僅培養基對照-實心條)。從左至右(每項處理兩隻小鼠 為一組)免疫抗原為40pg Poly ICLC與400貼方法L HspE7 (—劑)、 10jig Poly ICLC與100pg方法L HspE7 (—劑)、10pg Poly ICLC與 1 OOpg方法L HspE7 (兩劑)、10pg Poly ICLC與1 OOpg方法L HspE7 (三 劑)、lOiugPolyICLC與100jug方法LHspE7(四劑)、幼稚小鼠。
圖11顯示HspE7加Poly ICLC的耳關合免疫對體液免疫的影響。 C57B1/6小鼠的組(i^5)用(X軸上從左至右)緩沖液、500pg HspE7、 12.5pg p。ly ICLC、 500pg HspE7+1.25|ug Poly ICLC、 500|ug HspE7+ 12.5pg Poly ICLC或500|ug HspE7+125|iig Poly ICLC按月間隔免疫兩 次(第1、 28天)。在給藥之前7天(d-7，基線)和在第21、 49和77天 採取血樣進行血清抗體分析。通過標準ELISA檢測取自小鼠個體的 血清中抗E7和HspE7的抗體(IgGl、 IgG2b和IgG2c)的存在。數據表 示為獲得高於分析板背景(確定為0.2 OD單位)的吸光度的血清最高 稀釋度。圖A)抗-E7IgGl效價；B)抗-HspE7 IgGl效價；C)抗-E7 IgG2b效價；D)抗-HspE7 IgG2b效價；E)抗-E7 IgG2c效價；F)抗 -HspE7IgG2c效價。空心條-預取血對照；陰影條-第21天取血；實心 條—第49天取血；帶狀條-第77天取血。
圖12顯示外源抗原加Poly ICLC進行免疫誘導抗原特異性CD8+ t細胞應答的結果。C57B1/6小鼠(每組兩隻小鼠)用單獨的400|ig HspE7、 100|ig Poly ICLC與400|ug HspE7、 10嗎Poly ICLC與400|ug HspE7、 l|ug Poly ICLC與400|ug HspE7、 0,1 (ig Poly ICLC與400|ug HspE7、單獨的lOOiiig Poly ICLC或緩衝液(對照)進行皮下免疫。免疫 後七天，通過IFN-y ELISPOT評價對H-2Db限制性表位E7養57的抗原 特異性CD8T細胞應答。用於ELISPOT的回憶抗原空心條-培養基 對照；灰色條-E7肽；黑色條-HBVCor肽。圖13顯示HspE7力。Poly ICLC的多劑量免疫誘導大的、已建立 的TC-1肺瘤發生退化的結果。C57B1/6小鼠(每組15隻小鼠)在第0 天用表達E7的TC-1.K腫瘤細胞(6xl0,接種並在接種後的第28天開 始用4個連續日劑量的單獨緩衝液(空心方塊)、100pgHspE 蛋白(空 心三角)、10pg Poly ICLC(空心圓圈)或100|dg HspE7蛋白+10]Lig Poly 1CLC(實心圓圏)進行處理。數據表示為隨時間變化的各組的中值腫瘤 體積(圖面A)或表示為隨時間變化的各組內動物個體的腫瘤體積(圖 面B)。
圖14顯示使用HspE7抗原加TLR3激動劑的多劑量免疫策略的 結果。(A) C57B1/6小鼠(每組2隻小鼠)用重組HspE7蛋白(100pg)加 TLR3激動劑Poly ICLC (1 Ojug)進行皮下免疫，在第0天免疫一次(實 心方塊)，或者在第0和2天免疫兩次(空心方塊)，或者在第0和4天 免疫兩次(實心圓圈)。在所示的時間點(第 一 次免疫後的天數)通過 IFN-y ELISPOT評定對H-2Db限制性表位E749_57的抗原特異性CD8 T 細胞應答。(B) C57B1/6小鼠(每組4隻小鼠)用重組HspE7蛋白(100貼) 加TLR3激動劑Poly ICLC (lOiig)進行皮下免疫，連續4天每天一起 免疫，或者僅在第1天一起免疫一次，或者在第1天一起免疫一次後 在第2、 3和4天僅使用Poly ICLC(10iig)進行免疫。第一次免疫後七 天，通過IFN-y ELISPOT評價對H-2Db限制性表位E749-57的抗原特異 性CD8 T細胞應答。
圖15顯示使用HspE7抗原加TLR3激動劑的多劑量免疫策略的 結果。(A) C57B1/6小鼠(每組2隻小鼠)用重組HspE7蛋白(100pg)加 Poly ICLC (10)ig)在所示數目的連續數天內每天進行免疫或者用單劑 量的HspE7蛋白(400)ig)加PolylCLC(40)Lig)進行免疫。第一次免疫後 七天，通過IFN-y ELISPOT評價對H-2Db限制性表位E749—57的抗原特 異性CD8T細胞應答。(B)來自幼稚小鼠(右圖面)或接受了四個連續 曰劑量的HspE7蛋白(100ng)加Poly ICLC (10貼)的小鼠(左圖面)的脾 細胞用負載有E7,57肽的PE偶聯的H-2Db五聚體(Proimmune)進行染 色且用抗-CD8和抗-CD44 mAb進行表面染色。顯示出的細胞表示選
12出的(gated)CD8+陽性群。(C) C57B1/6小鼠(每組2隻小鼠)用重組 HspE7蛋白(1 OOpg)加Poly ICLC (1 Opg)在所示數目的連續數天內每天 進行免疫。在所示的時間點(第 一次免疫後的天數)通過IFN-y ELISPOT評價對H-2Db限制性表位E749.57的抗原特異性CD8 T細胞應答。
具體實施例方式
本發明涉及包含HspE7的組合物及其使用方法。 下面是對優選實施方式的"^兌明。
本發明提供包含與免疫刺激劑(例如，但不限於TLR激動劑)和任 選的其它藥物學上可接受的成分在一起的純化HspE7的組合物。免疫 刺激劑可以是TLR3或TLR9激動劑，但也可以採用其它TLR激動劑。 可以與純化的HspE7混合的免疫刺激劑的例子包括，但不限於包含 CpG的寡核苷酸(TLR9激動劑)、TLR3激動劑(例如雙鏈RNA (dsRNA) 或PolyI:C，或者具有聚-L-賴氨酸的Poly I:C(polyICLC))、單磷醯脂 質A(MPL，TLR4激動劑)或MPL-海藻糖6,6，-二黴菌酸酯(MPL-TDM) 和抗-CD-40。
純化的HspE7意思是特徵為包含約95%至約99.99%的HspE7或 該範圍內的任何量的HspE7的HspE7製劑，其餘的成份包括在HspE7 製備和純化後存在的成分。例如，純化的HspE7其特徵可以是包含約 95%至約98%或該範圍內的任何量的HspE7，或者約97至約99.6%或 該範圍內的任何量的HspE7。純化的HspE7可以包含約95、 96、 97、 98、 99、 99.2、 99.4、 99.6、 99.8、 99.9、 99.95、 99.99%或其間的任何 量的HspE7。純化的HspE7的例子是方法L HspE7 (Process L HspE7)。
確定，包括例如，但不限於HPLC或凝膠電泳。例如，還原和非還原 凝膠電泳的組合(含有SDS± (3-巰基乙醇的1%PAGE)應當是本領 域^支術人員已知的。
Hsp65-HPVE7融合產物(HspE7)可以按照多種方法產生，例如在
13WO99/07860(其通過引用併入本申請)中公開的方法。為了如這裡所述 進行應用，HspE7製備之後進行進一步的純化。進一步的純化可以使 用任何已知的純化方法完成，包括利用尺寸排阻、離子交換(陽離子、 陰離子或兩者)、親和、反相中的一種或多種的色語方法或其它色語 方法，根據尺寸、電荷或者兩者進行的凝膠電泳，使用離液劑(例如， 但不限於脲或鹽酸胍)的變性，鹽或pH沉澱，膜過濾等等，這些應當 是本領域技術人員已知的。
WO99/07860中公開的HspE7是純度比此處描述的高純度 HspE7(方法LHspE7)低的製劑(例如，包含低於約95%的純度)。HspE7 的低純度形式稱作方法A HspE7 (Process A HspE7)或者方法A。不希 望受到理論的限制，方法AHspE7包含一種或一種以上的導致其生物 活性與進一步純化的HspE7(例如方法LHspE7)相比提高的成分(例如 參見圖1和2)。但是，如此處所描述的，當現有技術的HspE7(方法A HspE7)進一步純化到約95%至約99.99%或其間的任何值的純度(方法 L HspE7)以產生低毒性HspE7時，觀察到了 HspE7生物活性的損失(見 圖1和2,方法L HspE7對方法A HspE7，及實施例2和3)。如圖1 中所示，使用方法L HspE7(純化的HspE7)沒有表現出與在相似的劑 量範圍內使用低純度方法A HspE7觀察到的同樣顯著的腫瘤發病率 的降低。但是，如下面所描述的，高純度的HspE7(例如，但不限於 方法LHspE7)在與免疫刺激劑(例如，但不限於TLR激動劑)共同施用 時表現出生物活性。包含純化的HspE7和免疫刺激劑的純化HspE7 組合物可以進一步包含其它藥物上可接受的成分。免疫刺激劑可以是 TLR3或TLR9激動劑，但是，也可以採用其它TLR激動劑或佐劑， 例如CD40。
可以與純化的HspE7混合的免疫刺激劑的例子包括，但不限於包 含CpG的寡核苷酸(TLR9激動劑)、Polyl:C、PolylCLC (TLR3激動劑)、 單磷醯脂質A (MPL， TLR4激動劑)、MPL-海藻糖6，6，-二黴菌酸酯 (MPL-TDM)和抗-CD-40抗體。CpG寡核苷酸的非限制性的例子可以 包括例如，包含B類型式的核心序列(class B type core sequence):GACGTT的CpG,例如並不認為是限制性的CpG 1982、 1826或1668。 CpG 1982具有以下序列TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (SEQ ID NO: 1)。 CpG 1982可採用硫逐磷酸酯骨架(來自Invitrogen,且表示 為ZOO FZE FOE ZZO OZE FZE OT)獲得。CpG 1826具有以下序列 TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (SEQ ID NO: 2)。 CpG 1668包括 以下序列TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (SEQ ID NO: 3)。優選 地，CpG寡核苷酸1982和1668包括硫逐磷酸酯骨架。具有最佳的鼠 B類型式核心序列(GACGTT)的幾種包含CpG的寡核苷酸(包括1668) 顯示出在增強方法LHspE7的活性方面是高活性的。類似地，CpGC 類型式的寡核苷酸(2395)被發現是高活性的。但是A類型式的包含 CpG的寡核苷酸在ELISPOT試驗中增強HspE7活性的效率要低得多。 對於CpG的A、 B和C類的解釋參見Vollmer J.等的文章(Vollmer J. 等，2004， Eur J. Immunol. 34:251-262)。
PolyIC核糖核酸(包括與其它物質結合的雙鏈核糖核酸(dsRNA)) 顯示出改善的穩定性特徵，例如對外源RNA水解酶的感受性降低。 dsRNA可以例如包被在脂嚢泡中或與聚陽離子聚合物複合。這種聚合 物的例子包括，但不限於包括大部分陽離子胺基酸的肽、聚賴氨酸、 聚精氨酸等等，美國專利4346538描述了包括相對高分子量的 polyl:C、MW範圍為13-35kD的聚-L-賴氨酸和羧甲基纖維素的polyIC 複合物("polyICLC")、製備方法和使用該複合物的方法。也已有人提 出將polyICLC用作治療某些癌症、某些病毒性疾病(如HIV或伊波拉) 及多發性硬化的治療劑(美國公開2006/0223742)。
雙鏈RNA PolyIC核糖核酸在某些實施方式中可以包括反平行鹼 基配對結構的polyl寡核苷酸和polyC寡核苷酸。這種雙鏈核酸分子 的鏈按照有序的方式通過氫鍵發生相互作用(也稱為"沃森-克裡克" 鹼基配對)。也可以通過非規範氫鍵產生變異的鹼基配對(包括 Hoogsteen鹼基配對)。在某些熱力學、離子或pH條件下，可以產生 三重螺旋，特別是對於核糖核酸。這些和其它的變異氫鍵或鹼基配對 是現有技術中已知的，且可以在例如Lehninger - Principles ofBiochemistry,第三版(Nelson和Cox編輯，Worth Publishers, NewYork.)中找到，此處通過引用併入本申請中。
"polyl"寡核苷酸包括大部分的肌苷、肌苷類似物核苷或其組合。肌苷類似物核苷包括例如7-脫氮肌苷、2，-0-曱基-肌苷、7-硫-7，9-二脫氮肌苷、間型黴素B、 8-氮肌苷、9-脫氮肌普、別。票呤醇核糖核苷、8-溴-肌苷、8-氯肌苷等等。
"polyC"寡核苷酸包括大部分的胞香、胞苷類似物核苷或其組合。胞苷類似物核苷包括例如5-曱基胞苷、2，-〇-曱基-胞苷、5-(l-炔丙基)胞苷等等。
包含非規範核苷和/或核苷間連接的核酸在用作佐劑時還可以提供改善的穩定性特徵，並引起免疫刺激效應的改變，或改變這裡描述的HspE7組合物的生物活性。"規範"核苷包括天然發生的核苷，如脫氧腺苷、脫氧鳥苷、脫氧胸苷、脫氧尿苷、脫氧胞苷、脫氧肌苷、腺苷、鳥苷、5-甲基尿苷、尿苷和胞苷。改變的免疫刺激效應可以表現為更快的適應性應答、先天或體液免疫應答，或者可以是持續更長時間但更少即時性的應答。
非規範核苷的例子在本領域中是公知的，且包括例如，"鎖核酸"或"LNA"。 LNA是一種如在WO 99/14226、 WO 00/56746、 WO00/56748、 WO 01/25248、 WO 0148190、 WO 02/28875、 WO 03/006475、WO 03/09547、 WO 2004/083430、 US 6268490、 US 679449、 US 7034133中描述的具有2'-4'環連接的核苷。其它非LNA雙環核苷在本領域中也是乂〉^口的，例^口
-具有附加的C-3',C-5'-亞乙基橋的雙環[3.3.0]核苷；-具有附加的C-l',C-6'-或C-6',C-4'亞甲基橋的雙碳環[3.1.0]核苷；-與未修飾的核苷合成為二聚體的包含附加的C-2'，C-3'二氧戊環(dioxalane)的雙環[3.3.0]-和[4.3.0]核苷，其中附加的環為代替天然的磷酸二酯鍵的核苷間連接的部分；二聚體包含具有作為醯胺-和磺醯胺-型核苷間連接的部分的C-2'，C-3'-亞曱基橋的雙環[3丄0]核苦；-通過核脊間縮醛4建(formacetal internucleoside linkage)力口入到三聚體的中間的雙環[3.3.0]葡萄糖衍生的核苷類似物；-兩個五元環和一個三元環構成骨架的三環-DNA;-1，5-失水己糖醇核酸；以及
-具有附加的C-2',C-3'-連接的六元和五元環的雙環[4.3.0]-和核苷。
可用於dsRNA中的其它非規範核苷和非規範核苷間連接("骨架")描述於如Freier， 1997 (Nucleic Acids Res. 25:4429-4443)或Praseuth等人(Biochimica et Biophysica Acta 1489:181-206)中。
本發明的純化HspE7稱為方法L HspE7(或方法L)。不期望被理論限制， 一種或多於一種成分可以在方法L HspE7的純化過程中從HspE7製劑中除去，而該一種或多於一種成分可能賦予低純度的(方法A) HspE7製劑佐劑樣活性。但是，為了 HspE7組合物的臨床試驗和獲得監管部門批准，需要將未知成分在組合物中的百分比最小化。
HspE7的生物活性是指HspE7對體外或體內生物活性的任何調節、增強或刺激。生物活性也可以包括HspE7對體外和體內生物活性的抑制。許多這種活性是已知的並且可用作確定HspE7的生物活性的基礎。例如，其不被認為是限制性的，E7-特異性CD8陽性T淋巴細胞的誘導可用於確定HspE7的生物活性。在設計用於測量這種性質的一種類型的分析中(ELISPOT),在用試驗化合物或混合物處理C57B1/6小鼠之後，確定每一給定數目的脾細胞中產生IFN-y的細胞的數目(見實施例2)。另一種分析方法包括通過用試驗化合物或混合物處理具有TC-1肺瘤的小鼠並在一段時間(例如49天間隔)後確定腫瘤發病率的百分比來確定HspE7的抗胂瘤活性(見實施例2)。可選擇地，如本領域技術人員應知道的，也可以採用細胞溶解活性的刺激
應答的或體液應答的誘^,、包括各種U類型、^亞型的特異性抗體的產生。
由HspE7的純化導致的活性損失可以通過向HspE7組合物中力口入適當的佐劑或免疫刺激劑(例如，但不限於TLR激動劑)來恢復。為
17了設計-回復HspE7組合物，測試了佐劑恢復HspE7活性的效能。這些佐劑包括CpG寡核苷酸、PolyI:C、 PolyICLC、 MPL、 MPL-TDM、咪p奎莫特、粗糙型LPS(脂多糖)、光滑型LPS、Pam3CysSK4、抗-CD40、明礬和弗氏不完全佐劑(IFA)。
"佐劑"或"免疫刺激劑"是當與免疫原結合時增強或增加對免疫原的免疫應答的物質或化合物的組合。可以採用標準分析方法(包括這裡描述的那些分析方法)確定免疫應答的增強或增加。佐劑或免疫刺激劑可以由 一 種或多於 一 種化合物組成。
"免疫應答"指免疫系統的促炎症反應或抗炎症反應，包括適應性、體液、先天和細胞介導的體系。術語"調節(modulate)"或"調節(modulation)"等指增大或減小選定的參數。
向純化HspE7中加入幾種公知的佐劑，例如明礬或弗氏不完全佐劑(IFA;見圖8,實施例6)，沒有恢復純化後所觀察到的與HspE7(例如，但不限於方法LHspE7)相關的生物活性的損失。類似地，粗糙型LPS(實施例7、圖9)、咪p奎莫特(實施例7、圖9)或Pam3CysSK4(實施例7、圖9)的混合也沒有增加HspE7生物活性。然而，純化HspE7與CpG寡核苷酸(例如實施例3、圖2和3)、 PolyI:C(實施例4、圖3)、PolyICLC(圖5)、單磷醯脂質A (MPL;圖4)或抗-CD40(圖9)的混合引起與高純度HspE7相關的生物活性的恢復。當CpG寡核苷酸、PolyI:C或PolyICL在不存在HspE7的情況下施用時，它們的加入沒有表現出這種活性。
因此，本發明還涉及一種增加高純度HspE7的生物活性的方法，包括將純化HspE7與選自CpG寡核苷酸、PolyI:C、 PolyICLC、單磷醯脂質A (MPL)、 MPL-TDM和抗-CD40的免疫刺激劑一起混合或共同施用。優選地，免疫刺激劑以大約0.1|ig至大約20mg的量或其間內的任何量存在，例如大約lpg至大約5000pg/劑或其間的任何量，大約lOpg至大約1000|ig或其間的任何量，或者大約30|iig至大約1000pg或其間的任何量。例如，可以採用大約O.l、 0.5、 1.0、 2.0、5.0、 10.0、 15.0、 20.0、 25.0、 30.0、 35.0、 40.0、 50.0、 60.0、 70.0、
1880.0、 90.0、 100、 120、 140、 160、 180、 200、 250、 500、 750、 1000、1500、 2000、 5000、 10000、 20000|ug的劑量或其間的任何量。類似地，純化HspE7以大約O.lpg至大約20mg的量或其間的任何量存在，例如大約lpg至大約2000i!g/劑或其間的任何量，大約lOpg至大約lOOOpg或其間的任何量，或者大約30pg至大約lOOOpg或其間的任何量。例如，可以採用大約O.l、 0.5、 1.0、 2.0、 5.0、 10.0、 15.0、 20.0、25.0、 30.0、 35.0、 40.0、 50.0、 60.0、 70.0、 80.0、 90.0、 100、 120、140、 160、 180、 200、 250、 500、 750、 1000、 1500、 2000、 5000、10000、 20000|ug的劑量或其間的任何量。
指出的免疫或治療效果的量。在哺乳動物或對象中要達到的劑量的非限制性實例是大約0.3mg/kg的HspE7、免疫刺激劑或這兩者，並且該劑量可以按照需要為大約0.03 mg/kg至大約30.0mg/kg的HspE7、免疫刺激劑或這兩者，或者其間的任何量。然而，也可以採用低於0.3mg/kg或高於30.0mg/kg的HspE7、免疫刺激劑或這兩者的劑量，並且其也包括在本發明中。本領域的技術人員應該能夠確定HspE7 、免疫刺激劑或這兩者的適當的劑量。
此外，本發明提供包含純化HspE7和選自CpG、 TLR3激動劑(例如PolyI:C或PolyICLC)、 MPL和抗-CD40的免疫刺激劑的組合物。優選地，免疫刺激劑如以上所限定的以每劑大約O.l)dg至大約20mg的量，或者其間的任何量存在。
本發明還涉及在對象、動物或患者中減低腫瘤生長的方法，包括施用包含純化HspE7和選自CpG、 TLR3激動劑(例如PolyI:C或PlyICLC)、 MPL和抗-CD40的免疫刺激劑的組合物。優選地對於需要的對象、動物或患者，免疫刺激劑如以上所限定的以每劑大約0.1 pg至大約20mg的量，或者其間的任何量存在。
術語"患者"或"對象，，指包括人類和其它靈長類、寵物、動物園和農場動物(包括但不限於貓、狗、嚙齒類、大鼠、小鼠、倉鼠、兔、馬、牛、綿羊、豬、山羊)、禽類等的哺乳動物和其它動物。本發明的HspE7組合物可以與任何適合的藥用載體或鹽混合。"藥物學上可接受的鹽"指相對無毒的、本發明化合物的無機和有機酸加成鹽和鹼加成鹽。這些鹽可以在化合物的最後的分離和純化過程中原位製備。特別地，可以通過獨立地使游離鹼形式的純化化合物分別與適合的有機或無機酸反應並分離如此形成的鹽來製備酸加成鹽。示例性的酸加成鹽包括氫溴酸鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、醋酸鹽、草酸鹽、戊酸鹽、油酸鹽、棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、月桂酸鹽、硼酸鹽、苯甲酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、甲苯磺酸鹽、檸檬酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、萘曱酸鹽
(naphthylate)、曱磺酸鹽、葡萄糖酸鹽、乳糖醛酸鹽(lactiobionate)、氨基磺酸鹽、丙二酸鹽、水楊酸鹽、丙酸鹽、亞曱基-雙-|3羥基萘甲酸鹽、龍膽酸鹽、羥乙基磺酸鹽、雙對曱苯醯酒石酸鹽、曱烷磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對曱苯磺酸鹽、環己基氨基磺酸鹽和奎尼酸月桂基磺酸酯(quinateslaurylsulphonate)鹽等等。參見，例如S. M. Berge等人，"Pharmaceutical Salts," J. Pharm. Sci.， 66, 1-19 (1977),其通過引用併入本申請。可以通過獨立地使酸形式的純化化合物與合適的有機或無機鹼反應並分離如此形成的鹽來製備石鹹加成鹽。力鹹加成鹽包括藥物學上可接受的金屬和胺鹽。適合的金屬鹽包括鈉、鉀、鉤、鋇、鋅、鎂和鋁鹽。優選為鈉和鉀鹽。適合的無機石鹹加成鹽優選由金屬石鹹製備，所述金屬鹼包括氫化鈉、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化釣、氫氧化鋁、氫氧化鋰、氫氧化鎂、氫氧化鋅。適合的胺鹼加成鹽由具有足夠形成穩定的鹽的鹼度的胺製備，並且優選包括由於其低毒性和可醫用性而常用於藥物化學中的那些胺，例如氨、乙二胺、N-曱基-葡糖胺、賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、膽鹼、N，N'-二千基乙二胺、氯普魯卡因、二乙醇胺、普魯卡因、N-千基苯乙胺、二乙胺、哌嗪、三(羥甲基)-氨基曱烷、氫氧化四甲銨、三乙胺、二卡胺、二苯羥甲胺(ephenamine)、脫氫抓胺、N-乙基哌咬、千胺、四甲銨、四乙銨、甲胺、二曱胺、三甲胺、乙胺、鹼性胺基酸(例如賴氨酸、精氨酸)和二環己基胺等等。本發明的HspE7組合物可以通過任何合適的途徑施用，包括注
20射、皮膚貼片或口服。因此，在一個方面中，本發明提供一種用於人 類和獸醫學用途的藥物組合物，該組合物包括包含與免疫刺激劑(例
如，抗-CD40或包括CpG、 TLR3激動劑(如PolyI:C或PolyICLC)、
或MPL的TLR激動劑)混合的純化HspE7或其藥物學上可接受的鹽 的複合物，以及一種或多種藥物學上或生理學上可接受的緩沖液、載 體、賦形劑或稀釋劑，和任選地其它治療劑。應注意，本發明的化合 物可以單獨施用或者以包含兩種或多種化合物的混合物施用。本發明 還包括包含與TLR激動劑(包括CpG或PolyI:C)混合的純化HspE7或 其藥物學上可接受的鹽的複合物用於製備預防或治療其中炎症免疫 應答有益的感染或病狀、或者疾病狀態或情況的藥劑的用途。
本發明的化合物可以以藥物學上或生理學上可接受的溶液施用， 所述溶液可以含有藥物學上或生理學上可接受的濃度的鹽、緩衝劑、 防腐劑、相容的載體、稀釋劑、賦形劑、分散劑等，和任選的其它治 療成分。因此，如本領域技術人員應知道的，本發明的化合物和組合 物可以被配製成各種標準的藥物學上可接受的非腸道劑型。
本發明的藥物組合物可以包含有效量的目前公開的化合物或組 合物，任選包括在藥物學上或生理學上可接受的緩衝液、載體、賦形 劑或稀釋劑中。術語"藥物學上或生理學上可接受的緩沖液、載體、 賦形劑或稀釋劑"指適於向人類或其它動物施用的一種或多種相容的 固體或液體填充劑、稀釋劑(dilutant)或包封物質。術語"載體"指天 然或合成的有機或無機成分，活性成分與其結合以利於應用。藥物組 合物中的成分能夠與本發明的聚合物以不存在實質上會破壞所需的 活性化合物的藥物功效的相互作用的方式彼此混合。
適合非腸道施用的組合物方便地包括可以與接受者的血液等滲 的無菌水性製劑。可接受的載體和溶劑為水、林格氏液和等滲氯化鈉 溶液。此外，無菌的非揮髮油通常被用作溶劑或懸浮介質。為了這個 目的，可以使用任何溫和的非揮髮油，包括合成的甘油一酯或甘油二 酯。另外，如油酸的脂肪酸可用於製備可注射劑。適合於皮下、肌肉 內、腹膜內、靜脈內等施用的載體配方可以在Remington: The Science
21and Practice of Pharmacy, 第 19版,A. R. Germaro編輯，Mack Publishing Co" Easton， Pa. (1995)中找到,其通過引用併入本文。
組合物可以方便地以單位劑型或劑量單位形式存在，並且可以通 過藥劑學領域中公知的任何方法製備。所有方法包括將化合物與構成 一種或多種輔助成分的載體結合的步驟。 一般而言，通過將化合物均 勻且緊密地與液體載體、細微分割的固體載體或者這兩者結合來製備 組合物。本發明的化合物可以凍幹貯存，並且以使用前混合的試劑盒 形式提供。
其它給藥系統可以包括長效的(time-release)、 延釋的 (ddayed-release)或緩釋給藥系統。這些系統可以避免重複施用本發明 的組合物，從而提高了對於對象和醫師的便利性。
含有藥物的前述聚合物的微嚢在如美國專利5075109中進行了描 述。給藥系統也包括非聚合物系統，例如脂質，包括甾醇類(如膽 固醇、膽固醇酯)以及脂肪酸或中性脂肪(如甘油一酯、甘油二酯和甘 油三酯)、水凝膠釋放系統、矽橡膠系統、基於肽的系統、蠟包衣、 使用常規粘合劑和賦形劑的壓製片劑、局部融合埋植劑(partially fused implant)等等。
對需要預防或治療慢性HPV感染或與HPV感染有關的病狀、或 者其中免疫系統的刺激有益的疾病或障礙的人類或動物患者施用化 合物的最佳量的確定以及施用包含這些化合物的治療或藥物組合物 的方法是藥學、醫學和獸醫領域中的技術人員所熟知的。人類或動物 患者的給藥劑量(dosing)取決於要治療的慢性HPV感染或與HPV感 染有關的病狀或者其它疾病或障礙的性質、患者的狀態、體重、 一般 健康狀況、性別、飲食、施用時間、持續時間和施用途徑、化合物的 吸收率、分布、代謝速率、排洩、與其它藥物的結合、要治療的慢性 HPV感染或與HPV感染有關的病狀或者其它疾病或障礙的嚴重度以 及治療的病狀或疾病狀況的反應性，並且可以容易地進行優化以獲得 所需水平的效應。療程可以持續幾天至幾周或幾個月，或者直到實現
治癒或達到疾病狀況可接受的減輕或防止。可以結合治療效果由頂'j量患者體內的免疫應答來計算最佳給藥時間表。普通技術人員可以容易
地確定最佳劑量、給藥方法和重複率。最佳劑量可以根據免疫調節聚 合化合物的效力進行變化，並且通常可以根據在體外和體內動物模型 中發現有效的EDso值來估計。用於治療或預防要治療的慢性HPV感
有效量、含有這些化合物的輸送載體、激動劑和治療方案可以通過常 規方法確定。例如，醫生或獸醫可以對第一個對象或患者或者第一組 對象或患者以低劑量的化合物開始治療，然後對第二個或後續的對象 或患者、或者第二組或後續組的對象或患者增加劑量或系統地改變給 藥方案，監控其對於患者或對象的效果並調整劑量或治療方案以使所 希望的治療效果最大化。劑量和治療方案最優化的進一 步的討論可以
在 Goodman & Gilman's 中 Benet等人(1996, The Pharmacological
Basis of Therapeutics,第九版,Hardman等人編輯，McGraw-Hill, New York, Chapter 1, pp. 3- 27;其通過引用併入本文)或Bauer (L. A. Bauer 1999，在Pharmacotherapy, A Pathophysiologic Approach中,第四版， DiPiro等人編4專,Appleton & Lange, Stamford, Connecticut,, Chapter 3， pp.21-43;其通過引用併入本文)的文章中找到。
可以採用多種給藥途徑。所選擇的特定的方式將取決於選擇哪種 化合物、被治療的特定的病症以及達到治療效果所需的劑量。 一般來 說，可以採用醫學上可接受的任何給藥方式實施本發明的方法，這意 味著可以採用產生有效水平的免疫應答而不引起臨床上不能接受的
副作用的任何方式。儘管也可以採用口服，但是優選的給藥方式為非 腸道途徑。術語"非腸道"包括皮下、真皮內、靜脈內、肌肉內或腹 腔內注射或者灌注技術。
在本發明的上下文中，如此處所用的術語"治療，，、"治療用途"、 "治療方案"指的是包括施用本發明的組合物的預防、減輕和治療的 用藥程式，並且包括目前要求保護的化合物對要治療的由慢性HPV 感染引起的疾病狀態、狀況、症狀、徵兆或障礙或與HPV感染有關 的病狀或者其它疾病或障礙進行治療，或者預防、阻礙、延緩或逆轉
染或與HPV感身
23與其有關的症狀、徵兆、狀況或障礙的進展的任何和所有的用途。因 此，對與慢性HPV感染有關的不希望的疾病狀態、症狀、狀況、徵 兆或障礙或與HPV感染有關的病狀，或者其中刺激機體免疫應答有 益的其它疾病或障礙的任何預防、改善、減輕、逆轉或完全消除都被
本發明包括。
為了本發明的目的，如用於癌症治療的術語"治療(treating和 treatment)"的含義是廣義的，並且包括本領域通常接受的很多種不同 的概念。因此，如此處所使用的，這個術語包括，但不限於進行性疾 病的時間延長、腫瘤減小、疾病減輕、痛苦緩解、生存質量改善、生 命延長、如疼痛、呼吸困難、食欲不振和體重減輕、疲勞、衰弱、抑 鬱和焦慮、意識模糊等症狀的改善或控制、患者舒適度提高等等。個 別的目標甚至可以是完全治癒疾病。
本發明的HspE7可用於治療非腫瘤、HPV感染細胞或HPV誘導 的疾病狀態，例如但不限於生殖器疣、過度增殖狀態、病毒感染細胞、 慢性病毒感染細胞等等。
術語"癌症"具有許多定義。根據美國癌症協會的定義，癌症是 一類以異常細胞的不受控生長(並且有時擴散)為特徵的疾病。儘管癌 症經常指單一的狀況，但是它事實上包括多於200種不同的疾病。當 這種細胞阻止了重要器官的正常功能時，腫瘤生長可以具有殺傷性或 在體內擴散，從而破壞重要的系統。本發明的組合物可以通過包括向 需要的動物或對象施用有效量的本發明的化合物或組合物的方法用 於治療動物或對象中的易感肺瘤。
本發明的化合物作為治療劑可有效對抗的不同類型的癌症的非 限制性例子包括惡性腫瘤，例如包括多形性成膠質細胞瘤、星形細 胞瘤、少突膠質細胞瘤、室管膜和脈絡叢瘤、松果體瘤、神經元腫瘤、 成神經管細胞瘤、神經鞘瘤、腦脊膜瘤和腦膜肉瘤的中樞神經系統腫 瘤；包括基底細胞癌、鱗狀細胞癌、黑素瘤、橫紋肌肉瘤和視網膜母 細胞瘤的眼部肺瘤；包括垂體瘤、曱狀腺瘤、腎上腺皮質瘤、神經內 分泌系統瘤、胃腸胰內分泌系統瘤和生殖腺瘤的內分泌腺腫瘤；包頭頸癌，口腔、咽和喉部腫瘤，以及牙源性腫瘤的頭頸部腫瘤；包括 大細胞肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、惡性間皮瘤、胸腺癌和胸
部原發性生殖細胞腫瘤的胸部腫瘤；包括食管、胃、肝、膽嚢、胰腺 外分泌部、小腸、闌尾和腹膜腫瘤、結直腸腺癌和肛門腫瘤的消化道 腫瘤；包括腎細胞癌、腎盂、輸尿管、膀胱、尿道、前列腺、陰莖、 睪丸胂瘤的泌尿生殖道腫瘤；以及女性生殖器官，包括外陰和陰道、 子宮頸鍾瘤、子宮體腺癌、卵巢癌、子宮肉瘤(gynecologic sarcomas) 和乳腺癌；包括基底細胞癌、鱗狀細胞癌、皮膚纖維肉瘤、Merkel 細胞瘤和惡性黑色素瘤的皮膚腫瘤；包括骨源性肉瘤、惡性纖維組織 細胞瘤、軟骨肉瘤、尤因氏肉瘤、原發性神經外胚層瘤和血管肉瘤的 骨和軟組織腫瘤；包括骨髓發育異常症候群、急性骨髓性白血病、慢 性骨髓性白血病、急性淋巴細胞性白血病、HTLV-1和5T-細胞白血 病/淋巴瘤、慢性〉林巴細胞性白血病、毛細月包性白血病、何杰金氏病、 非何杰金氏淋巴瘤和肥大細胞白血病的造血系統腫瘤；以及包括急性 成淋巴細胞性白血病、急性骨髓性白血病、成神經細胞癌、骨肺瘤、 橫紋肌肉瘤、淋巴瘤和腎腫瘤的兒童腫瘤。
除了製備HspE7的方法之外，PCT專利申請WO 99/07860提供 了關於多種類型的HP V和由慢性HPV感染引起的、與其相聯繫或相 關的一些病狀或與HPV感染伴隨的病狀的非限制性的討論。本發明 的化合物作為治療劑可有效對抗的不同類型的慢性HPV感染或與 HPV感染相關的病狀的其它(非限制性)例子包括宮頸上皮內瘤變 (例如，HPV型16、 18、 31、 33、 35、 39)、鮑恩樣丘滲病(例如，HPV 型16、 18、 33、 39)、布-勒二氏瘤(Buschke-Lowenstein tumor)(例如， HPV型6、 11)、尋常疣/屠夫疣(Butcher's warts)(例如，HPV型7)、皮 膚鱗狀細胞癌(例如，HPV型38、 41、 48)、疣狀表皮發育不良(例如， HPV型1-5、 7-9、 10、 12、 14、 15、 17 — 20、 23 — 25、 36、 47、 50)、 角化棘皮瘤(例如HPV型77)、 口腔局灶性上皮增生病(Heck's病)(例 如，HPV型13、 32)、腎移植病人中的疣(例如，HPV型75 - 77)、單 純疣(尋常性疣)、絲狀疣、扁平疣、腳底、手掌或鑲嵌疣、曱周疣、難治性祝、生殖器疣、溼疣、尖銳溼疣、性病疣、皮膚乳頭瘤病毒病、 鱗狀細胞乳頭狀瘤、移行細胞乳頭狀瘤(膀胱乳頭狀瘤)等等。
特定的治療方案可以持續 一 段時間，其可以根據要治療的具體的
慢性HPV感染或與HPV感染相關的病狀或者其它疾病或障礙的性 質、其嚴重程度和患者的總體狀況而改變，並且可以包括幾天、幾周、 幾個月或更長時間內每天一次至幾次施用含有化合物的組合物。治療
的減輕。在患者對目前的劑量水平反應不明顯的情況下組合物的劑量 可以增加，或者如果觀察到障礙或疾病狀態的症狀得到減輕或障礙或 疾病狀態已經除去，則可以減小劑量。
最佳給藥時間表用於遞送治療有效量的本發明的化合物。為了本 發明的目的，此處公開的關於化合物的"有效量"或"治療有效量" 的術語指對達到預期目的有效的而優選沒有不希望的副作用(如毒 性、刺激或過敏反應)的化合物的量。儘管個別患者的需要可能改變， 但是藥物組合物有效量最佳範圍的確定在本領域技術人員已知範圍 內。從動物研究可以推知出人類劑量(A. S. Katocs, Remington: The Science and Practice of Pharmacy,第19版,A.R. Gennaro編輯，Mack Publishing Co.， Easton， Pa" (1995), Chapter 30;其通過引用併入本文)。 一般來說，提供治療有效量的藥物組合物所需要的劑量(其可以被本 領域技術人員調整)將根據接受者的年齡、健康、身體狀況、體重、 疾病或障礙的類型和程度、治療頻率、共同治療的性質以及預期效果 的性質和範圍進行變化。
在本發明的 一些實施方式中，給藥時間表(也稱為治療方案)可以 包括在至少兩天、至少三天、至少四天或更多天內施用有效量的此處 描述的組合物。例如，對於四天的劑量時間表(其中第0天(零)是初始 劑量日)，可以在連續的幾日內、或者在非連續的幾日內、或者組合 這兩種方式施用藥物。在一些實施例中，給藥時間表可以包括在第O 和第1天、第0和第2天、第0和第3天、第0和第4天、第0、第 1和第2天、第0、第1和第3天、第0、第1和第4天、第0、第2和第3天、第0、第2和第3天、第0、第2和第4天、第0、第3 和第4天施用，等等。
在另一實施方式中，給藥時間表可以是有效地持續的，例如以通 過皮膚貼片或植入片施用的緩釋劑型。
在本發明的一些實施方式中，提供包括純化HspE7、免疫刺激劑 及使用說明的試劑盒。免疫刺激劑可以包括包含CpG的寡核苷酸、 TLR3激動劑(如PolyI:C或PolyICLC)、單磷醯脂質A (MPL)、 MPL-海藻糖6，6，-二黴菌酸酯(MPL-TDM)和抗-CD40,包括但不限於具有任 何核苷、核苷間連接和此處描述的組成的PolyIC核酸。試劑盒可以 提供預先包裝在一次性使用裝置(例如貼片、植入片或注射器)中的純 化HspE7和免疫刺激劑的單劑量製劑。或者，試劑盒可以提供多劑量 製劑，其可以在藥房或者在施用的地點被醫師或其它適當的人分成單 劑量單位。
本發明利用分子生物學、微生物學、病毒學、重組DNA技術、 液相肽合成法、固相肽合成法和免疫學的常規技術。這些過程在例如 以下文獻(其通過引用併入本文)中被描述
1. Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York,第二版(1989), 全I, II和III巻；
2. Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (M. J. Gait編輯 1984) IRL Press, Oxford,包括Gait, pp. 1-22; Atkinson等人，pp. 35-81; Sproat等人，pp. 83- 115;和Wu等人，pp. 135-151;
3. Animal Cell Culture: Practical Approach,第三版(John R.W. Masters編輯，2000)， ISBN 0199637970;
4. Immobilized Cells and Enzymes: A Practical Approach (1986) IRL Press, Oxford,全文；
5. J. F. Ramalho Ortigao， "The Chemistry of Peptide Synthesis" In: Knowledge database of Access to Virtual Laboratory website (Interactive Germany);
276. Barany, G.和Merrifield, R.B. (1979) in The Peptides (Gross, E. 和Meienhofer, J.編輯)，vol. 2, pp. 1-284, Academic Press, New York;
7. Bodanszky, M. (1984) Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag， Heidelberg; Bodanszky, M, & Bodanszky, A. (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer- Verlag， Heidelberg;
8. Handbook of Experimental Immunology, Vols. 1-IV, D. M. Weir 和C. C. Blackwell編輯，1986， Blackwell Scientific Publications.
本發明將在以下實施例中進一步說明。 實施例
實施例1: HspE7製備
按照WO99/07860(其通過引用併入本文)中描述的得到Hsp65-E7 融合物(HspE7)。 HspE7為包括插入在Hsp65基因(pET65H)的羧基端 末端的完整HPV16 E7-編碼區的融合蛋白。該HspE7稱作方法A HspE7， 並且可以4安照、需要乂人Nventa Biopharmaceuticals Corporation得到。
在使用前，將HspE7純化至高於95%的純度。表達HspE7的大 腸桿菌的種子培養物用於接種250 L發酵培養基。在發酵過程中，加 入酵母提取液和葡萄糖作為養料，並向發酵容器中發散純氧以提供充 分的換氣。通過加入IPTG(異丙基-P-D-硫代吡喃半乳糖苷)誘導HspE7 的表達。然後將發酵器的內容物冷卻至低於20 並通過離心收集細胞 漿(cell paste)。將細胞漿重懸於含有尿素和亞硫酸鹽解試劑的緩沖液 中。亞硫酸鹽解試劑將HspE7中的巰基轉化成S-磺醯半胱氨酸。通 過用PEI(聚乙烯亞胺)沉澱使HspE7溶液變得澄清，隨後在其pl處使 產物沉澱。然後採用一系列陽離子和陰離子交換層析步驟將HspE7 純化至均質，並用DTT(二硫蘇糖醇)還原修飾的巰基。最後，HspE7 進行超濾和透濾以進入組氨酸/甘露醇緩沖液中並在-70 貯存。將 HspE7的純化形式稱為方法LHspE7。通過凝膠電泳法確定HspE7的 純度。
如下所述，與低純度的(方法A HspE7)產品相比，高度純化的方
28法LHspE7觀察到生物活性的損失。如WO99/07860中所公開的，低 純度的HspE7產品(方法AHspE7)表現出生物活性。 實施例2:HspE7製劑的生物活性的測定 脾細胞產生ifn- y的抗原特異性刺激elispot分析 在E7肽存在的情況下通過ELISPOT(Asai, T.等人,2000, Clin. Diagn. Lab. Immunol. 7(2): 145- 154)如下測定HspE7誘導E7-特異性 CD8陽性T淋巴細胞(IFN-Y產生細胞)的能力的增強在頸背處皮下 用HspE7(加入或不加入佐劑)以200(il的總體積對小鼠進4亍免疫。五 至七天後將小鼠處死，取它們的脾臟並處理成單細胞懸液。將細胞接 種在預先用抗小鼠IFN-y抗體包被的微孔濾板上的完全RPMI中。將 微孔濾板在37 醉育20小時。洗掉細胞，並通過用生物素化二抗小 鼠IFN-y抗體孵育微孔濾板來檢測IFN-y斑點。用Vectastain ABC Elite 試劑盒和AEC底物使斑點可見。利用Zeiss Automated ELISPOT計數 器計算斑點。
腫瘤退化分析
採用包括腫瘤細胞系TC-l.K(一種用HPV16 E6和E7月中瘤基因穩 定轉染的肺上皮細胞瘤)分析測定肺瘤退化。將TC-1.K細胞植入到小 鼠體內，7天後施用測試樣品，隨後定期進行腫瘤觸診。基本上如Chu N.R.等人(Chu N.R.等人，2000， Clin Exp Immunol 121 (2):216-225)所 描述的，分析包括接種用於培養的TC-l.K腫瘤細胞並在植入到7-14 周齡的C57BL/6小鼠之前擴增細胞數目。腫瘤植入後7天，用測試和 對照樣品處理荷瘤小鼠。通常180隻小鼠的組分成6個等分組，並且 各組被注射對照樣品(只具有溶劑)、或者50、 100、 200、 400或800(ig 的HspE7參比樣品。在14、 28和49天觸診小鼠腫瘤。
如圖1所示，方法AHspE7的抗肺瘤活性大於方法LHspE7的抗 肺瘤活性，與類似劑量的方法L HspE7相比，方法A HspE7以較低的 劑量達到相同或更低的腫瘤發病率。對於這個分析，給攜帶已建立的 tc-1胂瘤的小鼠頸背部皮下注射由方法A或方法L製備的梯度刺量 的HspE7(n = 30Z組/劑量)，之後胂瘤生長49天。實施例3: TLR9激動劑CpG對HspE7的影響
在CpG寡核苷酸(TLR9激動劑)存在的情況下測定HspE7誘導 E7-特異性CD8陽性T淋巴細胞能力的增強。用由兩種不同的純化方 法製備的單獨的HspE7(400pg方法A HspE7或400pg方法L HspE7) 或HspE7 (400pg方法A HspE7或400|ug方法L HspE7)力口 30|ig的CpG (TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT; SEQ ID NO: 1;從Invitrogen獲得， 包括硫代磷酸酯骨架並指明為ZOO FZE FOE ZZO OZE FZE OT )如 實施例2中所述的對幼稚C57B1/6小鼠進行皮下注射。五天後，從小 鼠摘取脾臟，並採用E7特異性I類MHC結合肽E749_57(RAHYNIVTF; Dalton Chemical Laboratories)或對照肽HBCAg93-1QQ(MGLKFRQL; Dalton Chemical Laboratories)作為回憶抗原通過ELISPOT測量E7特 異性脾細胞的數目。
圖2中示出的結果說明純化的HspE7(方法L HspE7)表現出最小 的誘導E7-特異性CD8陽性T淋巴細胞的作用。方法A HspE7表現 出較大的E7-特異性CD8陽性T淋巴細胞誘導作用。然而，在TLR9 激動劑CpG存在的情況下(方法A HspE7 + CpG或方法L HspE7 + CpG),方法L HspE7和方法A HspE7的誘導作用均被提高了 3至100 倍。
具有最佳鼠類B類型式核心序列(GACGTT)的幾種包含CpG的寡 核苷酸(包括1668)在ELISPOT分析和TC-1腫瘤退化分析中顯示出在 HspE7活性增強方面是高度活性的(數據未示出)。同樣也發現CpG C 類型式寡核苷酸(2395)是高度活性的。但是發現A類型式包含CpG的 寡核苷酸在ELISPOT測定中增強HspE7活性的效應要低得多(見 Vollmer J.等人.2004 Eur, J. Immunol. 34:251-262)。
這些數據證明純化的HspE7是具有生物活性的，並且通過加入免 疫刺激劑CpG可以提高HspE7(方法A或方法LHspE7)的生物活性。
實施例4:另外的TLR激動劑對HspE7的影響
採用TLR3激動劑PolyI:C (Sigma Cat #P1913)、 TLR2激動劑 PAM3CysSK4 (Invivogen Cat# TLR1-pms)和TLR9激動劑CpG(見實施例3)測定替代的TLR激動劑增強HspE7(方法L HspE7)誘導E7-特異 性CD8陽性T淋巴細胞的能力。
用HspE7加TLR激動劑的混合物對小鼠進行皮下共注射。對於 這個試驗，將50嗎方法L HspE7與lO[ig的CpG、 20pg的Pam3CysSK4 或100嗎的PolyI:C—起共注射。五天後，從小鼠摘取脾臟，並採用 E7特異性I類MHC結合肽E7養57或對照肽HBCAg93-剛作為回憶抗 原通過ELISPOT(如實施例3中描述的)測量E7特異性脾細胞的數目。 結果示於圖3中。
如在圖3中可以看到的，HspE7與CpG的共注射引起E7-特異性 CD8陽性T淋巴細胞的顯著增加。TLR3激動劑PolyI:C的共注射也 觀察到相似的增加。但是，TLR2激動劑Pam3CysSK4隻引起IFNy 產生細胞孩i不足道的增加。
這些結果說明CpG和PolyI:C對增強純化HspE7(方法L HspE7) 的生物活性是有效的，而Pam3CysSK4是無效的，並且不是所有的佐 劑對增強純化HspE7的生物活性均有效。另外的試驗(圖4和5)證明， 將純化HspE7與PolyICLC (Oncovir， 3203 Cleveland Ave NW, Washington DC)或與MPL-海藻糖6，6，-二黴菌酸酯(MPL-TDM;得自 Ribi ImminoChem Research Inc.; 也參見Oiso R.等人,Microb Pathog. 2005 JuI-Aug;39(l-2):35-43)混合也有效地增強純化HspE7(即高於95 %純度)的免疫活性。在圖5中，顯示HspE7的免疫活性的增強可以 在免疫刺激劑的1000倍量的範圍內檢測到，O.lpg的PolyICLC至 lOOfig的PolyICLC觀察到活性增強。
實施例5: HspE7的抗肺瘤活性
採用實施例3中所述的方法檢測純化的HspE7製劑對抗胂瘤活性 的影響。數據顯示與單獨的純化HspE7(方法L HspE7)相比，將純化 HspE7與CpG或PolyI:C結合明顯提高了抗腫瘤效力。
用6x 104TC-1肺瘤細胞在肋部對小鼠進行注射。在第7天，用 稀釋的單獨純化HspE7(按照實施例1製備；方法L)、低於95%純度 的HspE7(圖6)或者與不同劑量的CpG(n = 30Z組)或PolyI:C(n = 20/組;圖7)混合的梯度劑量的純化HspE7在頸背部對攜帶已建立的TC-1腫 瘤的小鼠進行皮下注射。讓小鼠腫瘤生長另外的42天。腫瘤植入後 49天不具有肺瘤的小鼠被認為是無腫瘤的。只注射稀釋液的小鼠百分 之百在第49天具有腫瘤。先前的研究證明單獨的CpG或單獨的 Polyl:C對胂瘤生長沒有影響(數據未示出)。
HspE7與CpG共施用的結果示於圖6中，HspE7與PolyI:C共施 用的結果示於圖7中。
參照圖6，施用低於95%純度的HspE7在50至800昭劑量範圍 內(HspE7和平均HspE7歷史數據)降低了腫瘤活性，在高劑量(800(ig) 的HspE7下觀察到大約15%的腫瘤發病率("歷史數據")。然而，純 化HspE7與CpG共注射引起胂瘤發病率的急劇下降，大約25至大約 20fig的HspE7產生低於5%的腫瘤發病率。如歷史數據所預示的， 用400昭方法BHspE7處理的小鼠大約27%在第49天具有腫瘤。但 是，90%的用混合有3昭CpG的低至25|ag的方法L HspE7注射的小 鼠具有完全的腫瘤清除。
參照圖7，可以看出在最高至800lig(HspE7)的劑量範圍內，施用 純化HspE7(高於95%純度；方法L HspE7)在降低肺瘤活性方面不如 95%純度的HspE7有效，在高劑量(800叱)的HspE7下觀察到大約50 %的胂瘤發病率。然而，純化HspE7與IOO叱的PolyI:C共注射引起 腫瘤發病率的急劇下降，大約200(ig的HspE7導致低於5%的腫瘤發
這些數據證明，當與TLR9激動劑(如CpG)或TLR3激動劑PolyI:C 一起施用時，純化HspE7表現出增加大約5至大約80倍的抗腫瘤活性。
實施例6:傳統佐劑對HspE7活性的影響
測定了如明礬、弗氏不完全佐劑(IFA)的傳統佐劑增強純化HspE7 對E7-特異性CD8陽性T淋巴細胞的誘導的能力。
用純化HspE7(400(ig方法L HspE7;方法L)對小鼠進行皮下注射， 或用純化HspE7(400昭)與3QiigCpG(與明礬(Pierce)以1:1混合、或與IFA(Bacto)以1:1混合) 一起、或與明礬+ 30嗎CpG—起、或與IFA 屮3(VgCpG—起對小鼠進行皮下共注射。五天後，從小鼠摘取脾臟， 並採用E7特異性I類MHC結合肽E7(49-57) (16.E7.49-57.Db)或對照 肽HBCAg(93-IOO)作為回憶抗原通過ELISP0T測量E7特異性脾細月包 的數目。結果示於圖8中。
與實施例3和4中給出的結果一致，注射單獨的純化HspE7(方 法L HspE7)沒有增強脾細胞生成IFN-y的作用，但是HspE7和CpG(方 法L HspE7 + CpG)的共注射引起E7-特異性CD8陽性T淋巴細胞的明 顯(超過IO倍)增力口(圖8)。然而，純化HspE7與IFA(方法LHspE7十 FA)或與明礬(方法L HspE7+明礬)的共注射沒有引起E7-特異性T 淋巴細胞刺激的任何可觀察到的增強，與單獨施用純化HspE7的效果 相似。
與CpG和HspE7(方法L HspE7 + CpG)的共注射所觀察到的增強 相似，純化HspE7與CpG及明礬(方法L HspE7 +明礬+ CpG)或 FA(方法L HspE7 + lFA + CpG)的共注射引起E7-特異性T淋巴細胞 刺激的增強。這個數據說明，由於不管明礬或IFA是否存在，CpG對 增強HspE7的活性都具有相似的作用，所以IFA和明礬是中性的， 既不抑制也不刺激HspE7 。
這些數據說明通過將純化HspE7與公知佐劑明礬或弗氏不完全 佐劑(IFA)中的任一個混合沒有增強E7-特異性CD8陽性T淋巴細胞 的誘導。這些結果進一步證明不是所有的佐劑(包括明礬和弗氏不完 全佐劑)對增強純化HspE7的生物活性都是有效的。
實施例7:另外的TLR激動劑對HspE7活性的影響
在這個實施例中，測定了咪p奎莫特、LPS、Pam3CysSK4或抗CD40 增強純化HspE7對E7-特異性CD8陽性T淋巴細胞的誘導的作用。
用純化HspE7(400pg方法L HspE7;方法L)的混合物或者純化 HspE7(400(ig)與10(Vg咪p奎莫特(Invivogen # TLRL-IMQ)、 30ug LPS (Sigma) 、 25ug Pam3CysSK4 (Invivogen Cat# TLRl-pms)、 25ug 抗 -CD40 (R&D Systems;克隆號1C10)或30ug CpG—起對小鼠進行皮
33下注射。五天後，從小鼠摘取脾臟，並採用E7特異性I類MHC結合 肽E7養57通過ELISPOT測量E7特異性脾細胞的數目。結果示於圖9中。
純化HspE7與咪喹莫特(TLR7激動劑)、PAM3CysSK4 (TLR2激 動劑)或LPS(TLR4激動劑)共同施用只微弱地增強了純化HspE7誘導 E7-特異性T淋巴細胞的能力(圖9)。但是，通過將抗-CD40或CpG 加入到HspE7中觀察到對E7-特異性CD8陽性T淋巴細胞生成的刺激。
這些結果進一步證明不是所有的TLR激動劑對增加E7-特異性 CD8陽性T淋巴細胞的產生都是有效的，因為通過將咪奮莫特(TLR7 激動劑)、PAM3CysSK4 (TLR2激動劑)和LPS(TLR4激動劑)加入到 HspE7中只觀察到IFN-Y分泌細胞數目不大的增加。
實施例8:日注射方案
HspE7和PolyICLC被用於評價日注射方案在小鼠中引起CD8+ T 細胞應答的效用。C57B1/6小鼠(每組兩隻)按每日間隔用HspE7 (100|ug) 和Poly ICLC (lOiig)進行免疫，每天一次，最多進行4天。在第一次 抗原刺激後7天，將所有動物無痛致死並取脾細胞進行分析。在用 16E7.49-57.Db肽剌激下使用IFN-y ELISPOT評價I類限制性CD8+ T 細胞應答。
與只接受單次注射的組相比，接受多次HspE7 + polyICLC注射 的組表現出應答頻率可測量的增加。
增加日注射的次數與應答頻率的增加相關。接受最大數目日注射 的組表現出應答頻率的最大增加(圖10)。
曰注射策略的使用應提供在採用polyICLC與其它CoVaFM抗原 結合或與非0^^頂抗原結合引起€08+ T-細胞應答增強的方面的效 用。另夕卜，這一策略可以產生較大的CD8+記憶池(memory pool),所 述記憶池在按每周或每兩周間隔再次激發時可以具有更高的增強隨 後的免疫應答的能力。
實施例9:對HspE7 + poly-ICLC免疫的體液應答
34已經證明poly-ICLC增強對抗原的細胞和體液免疫應答。為了研 究HspE7 + poly-ICLC聯合免疫對體液免疫的影響，C57Bl/6雌性小 鼠(n二5/組)按月間隔免疫兩次(第1、 28天)。小鼠的各組用緩沖液、 500)agHspE7、 12.5|ug Poly-ICLC、 500pg HspE7+l .25pg Poly-ICLC、 500|ug HspE7+ 12.5|ug Poly-ICLC或500pg HspE7+125pg Poly-ICLC進 行免疫。在給藥之前7天(d-7，基線)和在第21、 49和77天採取血樣 進行血清抗體分析。通過標準ELISA檢測取自小鼠個體的血清中抗 E7和HspE7的抗體(IgGl、 IgG2b和IgG2c)的存在。簡單地說，用E7 或HspE7包被％孔板過夜，洗滌並用1.5。/。BSA溶液封閉。以血清 在BSA溶液中的1:50的稀釋開始將血清以2倍的系列稀釋加入到單 個孔中。洗滌後，通過與生物素偶聯的抗適當免疫球蛋白同種型的抗 體一起孵育來檢測結合的抗HspE7(圖11 B、 D、 F)或E7(圖11 A、 C、 E)的IgGl(圖11 A、 B)、 IgG2b(圖11 C、 D)或IgG2c(圖11 E、 F)抗體。 然後洗滌板並與抗生蛋白鏈菌素偶聯的辣根過氧化物酶一起孵育。使 用四曱基聯苯胺(TMB)底物進行顯色，並用自動EUSA讀^1儀在450 nm處讀取有色產物。圖11中的數據表示為給出高於分析板背景(確 定為0.2 OD單位)的吸光度的血清最高稀釋度。
用單獨的HspE7進行免疫對HspE7和E7均產生明顯的抗體應答， 其中單次注射後抗HspE7應答顯著，而單次注射後抗E7應答較弱而 在兩次免疫後發展得更充分。在兩種情況中，產生的抗體同種型主要 是IgGl(圖11 A、B)，表明為Th2轉換的體液應答。用單獨的Poly-ICLC 免疫未產生對E7或HspE7的抗體應答。用HspE7 + poly-ICLC免疫 導致更強和更快地形成抗體應答。這在E7的情況中是最顯著的，其 中當poly-ICLC與HspE7聯合免疫時，單次注射後免疫應答是顯著的。 此外，存在明顯更強的Thl體液應答，從而引起更大比例的IgG2b和 IgG2c (圖11 C-F)抗體同種型的產生。由於這種應答在較高劑量的 polyICLC時更顯著，所以它是劑量依賴的。當HspE7和poly-ICLC 共注射時免疫應答的Thl轉換的增加與通過ELISPOT觀察到的IFNy 生成CD8陽性T淋巴細胞數目的增加一致。
35實施例10: HspE7與polyICLC的劑量範圍
研究了當TLR3激動劑與HspE7共同給予時，其能夠促進E7特 異性CD8 T細胞的交叉激發(cross-priming)的劑量範圍。如圖12中所 示，我們觀察到，如通過IFN-y ELISPOr所測得的，用HspE7加TLR3 激動劑polyICLC對小鼠進行免疫在誘導e749.57特異性T細胞方面高 度有效。誘導的e749—57特異性細胞的數目依賴於所使用的polyICLC 佐劑的劑量，但是甚至非常低的劑量(0.1(ig polyICLC)也能夠增強 HspE7的交叉激發。
實施例11:連續曰劑量的HspE7加polylCLC引起的大的、已 建立的腫瘤的退化
表達E7的TC-1腫瘤細胞係為廣泛用於評價E7指引的疫苗接種 方案的侵襲性、快速生長的腫瘤模型。通常，向小鼠植入TC-1腫瘤 細胞系的105至106個細胞，並在7至14天後用試驗物質進行處理， 此時肺瘤是可觸及的。在該肺瘤模型中，存在治療窗，在這個時間後 由於腫瘤生長得如此快，以至於抗原特異性T細胞的克隆擴增不能在 肺瘤負荷佔據優勢之前戰勝肺瘤，因此免疫千預不再有用。
用於這些試驗中的TC-1腫瘤模型體系允許形成更加進展的肺 瘤。如圖13中所示，在處理前TC-1腫瘤允許在體內生長28天，而 不是通常的7至14天。儘管在這個時間點存在大範圍的平均腫瘤大 小，但是所有的動物具有可觸及的腫瘤，並且一些動物具有超過2000 mn^體積的胂瘤。顯著地是，隨後接受4個連續的HspE7加PolyICLC 日免疫的小鼠通常在開始該4個連續日劑量免疫方案的一周內開始使 這些非常大的、已建立的腫瘤退化。在處理期中每天測量腫瘤體積， 在這之後每2至3天測量肺瘤體積。肺瘤使用電子數字卡尺(Fowler Sylvac Ultra-Cal Mark III)測量並以寬2><長乂0.5計算。在多數(9隻中的 7隻)小鼠中腫瘤在處理後繼續退化17天。在再度出現腫瘤的小鼠中， 只表示逃逸變體(escape variant),不再表達E749-57表位(數據未示出)。 接受4個連續日劑量的僅緩沖液、僅HspE7蛋白或僅polyICLC佐劑 的小鼠沒有表現出這些大肺瘤的退化。實施例12: CD8應答的擴增期(expansion phase)中重複免疫的加
強效應
當小鼠使用HspE7力口 polyICLC免疫連續1天、2天、3天或4 天時，在各相繼的日免疫之後誘導的E7養57特異性T細胞的水平經歷 急劇的增加(圖15A)。在用100嗎HspE7力口 10pg polyICLC進行4次
連續日免疫後，響應E749.57刺激的離體的直接產生IFN-y的細胞數目
接近每106個脾細胞10000個。事實上為了準確的IFN-y ELISPOT定 量，來自免疫動物的脾細胞必須用來自幼稚動物的脾細胞按1:16稀 釋，以使斑點降低至自動ELISPOT讀取分析儀"可計數的"數目。 這是在接受單劑量HspE7加polyICLC的動物中觀察到的抗原特異性 細胞數目的大約10倍。更令人驚奇的是，這些非常高數目的抗原特 異性細胞在最後免疫的3天內達到(所有小鼠組在第一次免疫後7天 進行分析)。4次連續免疫不只是表示小鼠接受的抗原數量的累加性的 增加，因為給予存在於單次免疫中的包含4倍量的抗原/佐劑的單次免 疫小鼠具有E7體57特異性T細胞數目的增加，但遠低於在接受4次連 續免疫的小鼠中所觀察到的E7養57特異性T細胞的數目(圖15A)。 E7叫s7特異性T細胞也可以使用H-2Db/E749-57五聚體試劑通過流式細 胞儀方便地檢測(圖15B)。在用HspE7力口 polyICLC進行4次連續日 免疫後， 一些動物中的E749—57特異性T細胞的數目高達CD8+脾細胞 的總數的2.9%。採用MHC I類五聚體試劑進行E7特異性T細胞的 流式細胞定量與ELISPOT相比有一些低估了抗原特異性細胞的數目， 但是，這很可能是抗原特異性T細胞上的表面TCR的下調的反映， 特別是由於流式細胞分析是在4次連續免疫的最後一次免疫後僅3天 進行的。事實上，圖15B中示出的流式細胞數據的更嚴格的檢查證實， 與幼稚小鼠相比在接受4次連續日免疫的小鼠中存在更高數目的 H-2DbZE749-57五聚體陰性的CD8+細胞,但是它們表達CD44激活標 志。這些具有激活表型的CD8+細胞很可能對應於由於其體內激活狀 態而下調其表面TCR的抗原特異性細胞。此外，我們也分析了免疫 應答的縮減期(contraction phase)以評價是否連續多天的免疫對隨後的免疫應答的持續時間具有明顯影響。如圖15C中所示，雖然在免疫後 第7天觀察到的峰免疫應答存在很大的不同，但是不管第1天至第4
天進行的連續免疫的次數，所有小鼠免疫後第13天￡7特異性008+ 細胞數目均發生明顯縮減。然而，應該注意，E7特異性CD8+細胞在 免疫後第13天仍可通過ELISPOT輕易檢測到，並且更重要的是，在 初級應答的峰值時較高的抗原特異性T細胞數目與第13天觀察到的 殘存E7特異性CD8+細胞的數目相關。
研究了在應答的擴增期內給予兩次注射但在第一次和第二次注 射間具有不同時間間隔的方式對於增強隨後的初級CD8 T細胞應答 的效果。在試驗過程中以不同的間隔收集脾臟以研究隨後的應答的動 力學。給予HspE7加polylCLC單次注射的小鼠建立的應答在免疫後 5天很容易檢測到且隨後在免疫後第7天達到峰值(圖14A)。這種應 答到第9天下降，併到第11天基本上減小至較低(但穩定)且易於檢測 到的水平。與此相反，在第0天給予HspE7力卩polyICLC的初次免疫 然後在第2天給予第二次的相同免疫的小鼠建立的應答遠強於在接受 單次免疫的小鼠中引起的應答。如同在接受單次免疫的小鼠中觀察到 的，CD8 T細胞應答在第7天最高，但抗原特異性細胞的總體數量達 到明顯更高的水平。而且，儘管抗原特異性細胞的數目到第9天下降， 但是此時存在的抗原特異性細胞的總數目仍明顯高於在接受單次免 疫的小鼠中觀察到的數目。當第二次免疫延遲至初次免疫後第4天時， 效果甚至更加顯著。在這種情況中，抗原特異性T細胞的數量繼續增 加到第7天並直到第9天才達到最大值，此時抗原特異性細胞的頻率 是單次免疫後觀察到的最大數目的大約4倍。
可觀察到，單劑量的HspE7加polyICLC之後接著3個連續劑量 的單獨polyICLC與接受單劑量HspE7加polyICLC的小鼠相比，沒 有引起E7特異性CD8+細胞數目的明顯增力口(圖14B)。這個結果表明 在接受連續日免疫的小鼠中引起的E7特異性CD8+細胞的急劇擴增不 只是佐劑連續存在的間接結果，而是依賴於特異性抗原的存在。
所有的引文特此通過引用併入本申請。本發明通過一個或多個實施方式進行說明。然而，對本領域技術 人員顯而易見的是，在不偏離如權利要求書所限定的本發明的範圍的 情況下可以對本發明進行許多變化和改進。
權利要求
1、一種提高純化的HspE7的生物活性的方法，包括與選自包含CpG的寡核苷酸、TLR3激動劑、單磷醯脂質A(MPL)、MPL-海藻糖6，6』-二黴菌酸酯(MPL-TDM)和抗-CD40的免疫刺激劑一起施用HspE7。
2、 按照權利要求1所述的方法，其中所述免疫刺激劑以大約0.1|ig 至大約20mg/ml的量存在。
3、 按照權利要求1所述的方法，其中所述純化的HspE7使用1% PAGE測定的HspE7純度為大約95%至大約99.99%。
4、 按照權利要求1所述的方法，其中所述免疫刺激劑是TLR3 激動劑。
5、 按照權利要求4所述的方法，其中所述TLR3激動劑是 PlyICLC或PolyI:C。
6、 一種包含純化的HspE7和選自包含CpG的寡核苷酸、TLR3 激動劑、單磷醯脂質A (MPL)、 MPL-海藻糖6，6，-二黴菌酸酯 (MPL-TDM)和抗-CD40的免疫刺激劑的組合物。
7、 按照權利要求6所述的組合物，其中所述免疫刺激劑以大約 O.l嗎至大約20mg/ml的量存在。
8、 按照權利要求6所述的組合物，其中所述純化的HspE7使用 1% PAGE測定的HspE7純度為大約95%至大約99.99%。
9、 按照權利要求6所述的組合物，其中所述免疫刺激劑是TLR3 激動劑。
10、 按照權利要求9所述的組合物，其中所述TLR3激動劑是 PolyICLC或PolyI:C。
11、 一種減低對象中腫瘤或病毒的發展的方法，包括向需要的對 象施用權利要求6的組合物。
12、 一種包括純化的HspE7和選自包含CpG的寡核苷酸、TLR3 激動劑、單磷醯脂質A (MPL)、 MPL-海藻糖6,6，-二黴菌酸酯(MPL-TDM)和抗-CD40的免疫刺激劑及使用說明的試劑盒。
13、 按照權利要求11所述的試劑盒，其中所述免疫刺激劑以大 約O.lpg至大約20mg/ml的量存在，且所述純化的HspE7使用1% PAGE測定的HspE7純度為大約95%至大約99.99%。
14、 按照權利要求11所述的試劑盒，其中所述免疫刺激劑是TLR3 激動劑。
15、 按照權利要求11所述的試劑盒，其中所述TLR3激動劑是 PolyICLC或PolyI:C。
16、 權利要求6的組合物用於在需要的對象中預防或治療癌症的用途。
17、 權利要求6的組合物用於在需要的對象中減低腫瘤或病毒的發展的用途。
18、 按照權利要求11所述的方法，其中所述組合物按照包括至 少兩個劑量的給藥時間表施用。
19、 一種在對象中預防肺瘤或病毒的發展的方法，包括向需要的 對象施用權利要求6的組合物。
全文摘要
本發明提供一種提高純化的Hsp65-E7融合蛋白(HspE7)的生物活性的方法。該方法包括將HspE7與選自CpG、TLR3激動劑(如PolyLC、PolyICLC)、單磷醯脂質A(MPL)、MPL-海藻糖6，6』-二黴菌酸酯(MPL-TDM)和抗-CD40的免疫刺激劑一起混合。本發明還提供包括HspE7和CpG、TLR3激動劑(如PolyIC、PolyICLC)、單磷醯脂質A(MPL)、MPL-海藻糖6，6』-二黴菌酸酯(MPL-TDM)和抗-CD40中的一種或多種的組合物及通過使用該組合物在需要的哺乳動物或對象中減低腫瘤或病毒的發展的方法。
文檔編號A61K39/39GK101489588SQ200780025766
公開日2009年7月22日 申請日期2007年5月30日 優先權日2006年5月31日
發明者G·羅斯, J·韋布, M·西格爾, P·埃姆塔格 申請人:恩文塔生物製藥公司