用於治療肝細胞癌的方法和組合物的製作方法

2023-04-30 04:51:01 1

專利名稱：用於治療肝細胞癌的方法和組合物的製作方法
關於受到聯邦贊助的研究或開發的聲明本發明是在美國聯邦政府的支持下進行的，合同編號NIH/NCI ROICA 77623。美國聯邦政府對本發明擁有某些權利。
相關申請的交叉參照本申請要求2000年2月10日提交的題目為「用於預防或治療肝細胞癌的方法和組合物」的美國專利申請60/181,966的收益；而且，本申請是2000年9月12日提交的題目為「使用經替代甲胎蛋白的肝細胞癌治療」的美國專利申請09/660,252的部分繼續申請；且是2000年9月14日提交的題目為「使用甲胎蛋白cDNA的肝細胞癌治療」的美國專利申請09/662,505的部分繼續申請；將它們的內容完整收入本文作為參考。
背景原發性肝癌是世界範圍內由癌症引起死亡的主要原因。肝細胞癌(HCC)是原發性肝癌的最常見類型，全球發病率是大約每年120萬例。在有些地區，諸如東南亞和Subsahara Africa，肝細胞癌是最常見的惡性腫瘤之一。這種疾病的高頻率似乎與病毒性肝炎在這些地區的高發病率有關。
肝細胞癌的有效治療目前限於非轉移性疾病個體，而且涉及手術切除腫瘤，伴隨或不伴隨肝臟移植。然而，由於切除後的復發，即使手術切除和移植也不能治癒大多數腫瘤。化療方法在很大程度上也是無效的。
因此，仍然需要針對肝細胞癌的有效治療。理想的是，這種治療方法適用於具有最高發病率的較不發達國家。另外，這種治療方法應當適用於患有不可切除的腫瘤和轉移性疾病的個體。
概述在一個實施方案中，本發明是用於在哺乳動物中預防或治療癌症的方法，其中癌細胞在細胞表面表達甲胎蛋白分子的至少一部分。該方法包括在哺乳動物中引發針對甲胎蛋白分子的至少部分胺基酸序列的免疫應答的步驟，其中免疫應答包括激活針對癌細胞的甲胎蛋白肽特異性T淋巴細胞。在一個實施方案中，甲胎蛋白肽特異性T淋巴細胞是細胞毒性T淋巴細胞。在一個優選的實施方案中，甲胎蛋白分子是SEQID NO2。在一個特別優選的實施方案中，甲胎蛋白分子選自下組SEQ ID NO2的第137-145位殘基、SEQ ID NO2的第158-166位殘基、SEQ ID NO2的第325-334位殘基、和SEQ ID NO2的第542-550位殘基。在一個實施方案中，癌症是肝細胞癌。在另一個實施方案中，哺乳動物是人。
在一個優選的實施方案中，引發免疫應答的步驟包括對哺乳動物施用一種或多種組合物，其中該組合物包含具有甲胎蛋白的至少部分胺基酸序列的肽。在一個特別優選的實施方案中，肽選自下組SEQ IDNO2的第137-145位殘基、SEQ ID NO2的第158-166位殘基、SEQID NO2的第325-334位殘基、和SEQ ID NO2的第542-550位殘基。在另一個優選的實施方案中，該肽選自下組SEQ ID NO2的第1-9位殘基、SEQ ID NO2的第178-186位殘基、SEQ ID NO2的第218-226位殘基、SEQ ID NO2的第235-243位殘基、SEQ ID NO2的第306-315位殘基、SEQ ID NO2的第485-493位殘基、SEQ ID NO2的第492-500位殘基、SEQ ID NO2的第507-516位殘基、SEQ ID NO2的第547-556位殘基、和SEQ ID NO2的第555-563位殘基。
在另一個優選的實施方案中，引發免疫應答的步驟包括對哺乳動物施用一種或多種組合物，其中所述組合物包含經過構成胺基酸序列SEQ ID NO2的至少一部分的一種或多種肽脈衝的樹突細胞。在還有一個優選的實施方案中，引發免疫應答的步驟包括對哺乳動物施用一種或多種組合物，其中所述組合物包含經過編碼甲胎蛋白的重組腺病毒載體轉導的樹突細胞。
在另一個實施方案中，本發明涉及用於在人中預防或治療肝細胞癌的方法，其中癌細胞在細胞表面表達甲胎蛋白分子的至少一部分，該方法包括通過對人施用一種或多種組合物從而針對胺基酸序列SEQID NO2的至少一部分激活針對癌細胞的甲胎蛋白細胞毒性T淋巴細胞的步驟，其中所述組合物包含選自下組的肽SEQ ID NO2的第137-145位殘基、SEQ ID NO2的第158-166位殘基、和SEQ ID NO2的第325-334位殘基。
在另一個實施方案中，本發明是用於在人中預防或治療肝細胞癌的方法，其中癌細胞在細胞表面表達甲胎蛋白分子的至少一部分，該方法包括通過對人施用一種或多種組合物從而針對胺基酸序列SEQ IDNO2的至少一部分激活針對癌細胞的甲胎蛋白細胞毒性T淋巴細胞的步驟，其中所述組合物包含選自下組的肽SEQ ID NO2的第542-550位殘基。
在另一個實施方案中，本發明是用於在人中預防或治療肝細胞癌的方法，其中癌細胞在細胞表面表達甲胎蛋白分子的至少一部分，該方法包括通過對人施用一種或多種組合物從而針對胺基酸序列SEQ IDNO2的至少一部分激活針對癌細胞的甲胎蛋白細胞毒性T淋巴細胞的步驟，其中所述組合物包含選自下組的肽SEQ ID NO2的第1-9位殘基、SEQ ID NO2的第178-186位殘基、SEQ ID NO2的第218-226位殘基、SEQ ID NO2的第235-243位殘基、SEQ ID NO2的第306-315位殘基、SEQ ID NO2的第485-493位殘基、SEQ ID NO2的第492-500位殘基、SEQ ID NO2的第507-516位殘基、SEQ ID NO2的第547-556位殘基、和SEQ ID NO2的第555-563位殘基。
在另一個實施方案中，本發明是用於在人中預防或治療肝細胞癌的方法，其中癌細胞在細胞表面表達甲胎蛋白分子的至少一部分，該方法包括通過對人施用一種或多種組合物從而針對胺基酸序列SEQ IDNO2的至少一部分激活針對癌細胞的甲胎蛋白細胞毒性T淋巴細胞的步驟，其中所述組合物包含經過構成胺基酸序列SEQ ID NO2的至少一部分的一種或多種肽脈衝的樹突細胞。用於脈衝樹突細胞的一種或多種肽選自下組SEQ ID NO2的第137-145位殘基、SEQ ID NO2的第158-166位殘基、SEQ ID NO2的第325-334位殘基、和SEQ IDNO2的第542-550位殘基。
在另一個實施方案中，本發明是用於在人中預防或治療肝細胞癌的方法，其中癌細胞在細胞表面表達甲胎蛋白分子的至少一部分，該方法包括通過對人施用一種或多種組合物從而針對胺基酸序列SEQ IDNO2的至少一部分激活針對癌細胞的甲胎蛋白細胞毒性T淋巴細胞的步驟，其中所述組合物包含經過編碼甲胎蛋白的重組腺病毒載體轉導的樹突細胞。
在另一個實施方案中，本發明是可用於預防或治療癌症的分離肽，該肽選自下組SEQ ID NO2的第137-145位殘基、SEQ ID NO2的第158-166位殘基、和SEQ ID NO2的第325-334位殘基。在一個優選的實施方案中，本發明是用於預防或治療癌症的組合物，其中該組合物包含選自下組的一種或多種肽SEQ ID NO2的第137-145位殘基、SEQ ID NO2的第158-166位殘基、和SEQ ID NO2的第325-334位殘基，其量足以在哺乳動物中引發針對甲胎蛋白的免疫應答。組合物中還可包含佐劑。在另一個實施方案中，本發明是用於在人中預防或治療癌症的方法，包括對人施用這些肽之一或這些組合物之一的步驟。
本發明還包括用於預防或治療癌症的手段，其中包含選自下組的一種或多種肽SEQ ID NO2的第137-145位殘基、SEQ ID NO2的第158-166位殘基、SEQ ID NO2的第325-334位殘基、和SEQ ID NO2的第542-550位殘基。
在另一個實施方案中，本發明是可用於預防或治療癌症的分離肽，該肽具有依照SEQ ID NO2的第542-550位殘基的序列。在一個優選的實施方案中，本發明是用於預防或治療癌症的組合物，其中該組合物包含具有依照SEQ ID NO2的第542-550位殘基的序列的肽。組合物中還可包含佐劑。在另一個實施方案中，本發明是用於在人中預防或治療癌症的方法，包括對人施用這種肽或這些組合物之一的步驟。
本發明還包括用於預防或治療癌症的手段，其中包含具有依照SEQID NO2的第542-550位殘基的序列的肽。
詳述在一個實施方案中，本發明是可單獨或聯合用於治療肝細胞癌的一組肽。在另一個實施方案中，本發明是通過單獨或聯合施用一種或多種本發明肽或者包含一種或多種本發明肽的組合物來預防或治療肝細胞癌的方法。在另一個實施方案中，本發明是通過施用經過一種或多種本發明肽脈衝或者經過編碼甲胎蛋白的重組腺病毒(AdV)載體轉導的樹突細胞來預防或治療肝細胞癌的方法。
大約80％的肝細胞癌重新激活甲胎蛋白的表達。鼠和人的T細胞庫都能夠在I型MHC環境中識別AFP衍生肽表位。因此，儘管在胚胎發育過程中暴露於高血漿水平的這種癌胚蛋白，並非所有的AFP特異性T細胞都在免疫系統的個體發生過程中喪失。
本發明涉及由人甲胎蛋白即SEQ ID NO2衍生的肽的鑑定，其呈現於HLA-A*0201的環境中時受到人T細胞庫的識別。正如下文表1所概述的，鑑定了4種AFP衍生肽，稱為「顯性」肽。它們是PLFQVPEPV，hAFP137-145，SEQ ID NO2的第137-145位殘基；FMNKFIYEI，hAFP158-166，SEQID NO2的第158-166位殘基；GLSPNLNRFL，hAFP325-334，SEQ ID NO2的第325-334位殘基；和GVALQTMKQ，hAFP542-550，SEQ ID NO2的第542-550位殘基。每一種都擁有一個或兩個錨定殘基。
在濃度依賴性I型結合測定法中，每一種顯性肽都在T2細胞上穩定HLA-A*0201。它們在解離動力學測定法中穩定達2-6小時。另外，每一種顯性肽在體外都由幾名正常HLA-A*0201供體誘導肽特異性T細胞。重要的是，這些hAFP肽特異性T細胞還能夠在細胞毒性測定法和IFNγELISPOT測定法中識別HLA-A*0201+/AFP陽性腫瘤細胞。這些信息概述於下文表1。表1顯性肽的概述肽位置 序列錨T2結合濃度 相對解離動力學hAFP137-145137-145 PLFQVPEPV 2 2.5mM 4小時hAFP158-166158-166 FMNKFIYEI 2 0.5mM 4小時hAFP325-334325-334 GLSPNLNRFL 2 10mM2小時hAFP542-550542-550 GVALQTMKQ 1 ＞100mM 6小時正如本發明所證明的，這些T細胞的激活可以通過在免疫刺激環境中呈遞這些顯性肽來實現，包括專職抗原呈遞樹突細胞的呈遞。經過編碼甲胎蛋白cDNA即SEQ ID NO1的重組腺病毒(AdV)載體轉導的樹突細胞將在MHC的環境中加工並呈遞這4種顯性肽表位，還將誘導AFP特異性T細胞激活。類似免疫的HLA-A*0201/Kb小鼠也在細胞因子釋放測定法中識別經過AFP肽脈衝的細胞。另外，經過AFP肽刺激的人和HLA-A*0201/Kb小鼠T細胞應答識別經過hAFP改造的靶和(在較低程度上)天然表達AFP的人肝細胞癌細胞。最後，使用質譜法由自HLA-A*0201+HCC細胞洗脫的複雜肽混合物鑑定了至少3種AFP表位。因而，多種證據表明，這4種顯性肽的每一種都具有免疫原性，而且在HLA-A*0201的環境中得到天然加工和呈遞。
還鑑定了具有微弱或較少可再現應答但在一種以上類型的測定法中呈陽性的另外10種肽，稱為「亞顯性」肽。這10種肽是MKWVESIFL，SEQ ID NO2的第1-9位殘基；ILLWAARYD，SEQ ID NO2的第178-186位殘基；LLNQHACAV，SEQ ID NO2的第218-226位殘基；FQAITVTKL，SEQ ID NO2的第235-243位殘基；TTLERGQCII，SEQID NO2的第306-315位殘基；CIRHEMTPV，SEQ ID NO2的第485-493位殘基；PVNPGVGQC，SEQ ID NO2的第492-500位殘基；NRRPCFSSLV，SEQ IDNO2的第507-516位殘基；TMKQEFLINL，SEQ ID NO2的第547-556位殘基；和NLVKQKPQI，SEQ ID NO2的第555-563位殘基。
雖然本發明公開的組合物和方法主要是使用一種或多種顯性肽hAFP137-145即SEQ ID NO2的第137-145位殘基、hAFP158-166即SEQ ID NO2的第158-166位殘基、hAFP325-334即SEQ ID NO2的第325-334位殘基、和hAFP542-550即SEQ ID NO2的第542-550位殘基，但是使用10種亞顯性肽之一種或多種來替代4種顯性肽中的一種或多種或與之聯合也屬於本發明的範圍之內。
現在要更詳細的討論顯性肽和亞顯性肽的鑑定。首先，由hAFP即SEQ ID NO2(Genbank編號J00077、J00076、和V01514)鑑定潛在結合HLA-A*0201的肽序列。這些肽的長度是9或10個胺基酸，第2位是異亮氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；或者，根據肽的長度，第9或10位是異亮氨酸、亮氨酸、或纈氨酸，或二者兼之。使用威斯康星大學遺傳學計算機小組(University of Wisconsin，Genetics Computer Group)的「尋找樣式」(find patterns)程序篩選hAFP序列即SEQ ID NO2，鑑定了74種這樣的肽。使用標準技術合成了這74種肽。
在HLA-A*0201穩定測定法中，對這74種肽候選物的每一種均測試與T2細胞的濃度依賴性結合。前一天晚上將T2(TAP缺陷型)細胞於室溫保溫以增加細胞表面I型MHC分子的表達，然後與每一種肽保溫過夜，肽的濃度範圍是0.1-100mM。用抗HLA-A2抗體(BB7.2)和山羊抗小鼠-FITC將細胞染色後，通過流式細胞術測定HLA-A*0201的穩定性。將強烈結合Flu基質肽(第58-66位胺基酸)(Flu)的HLA-A*0201用作陽性對照。
然後，通過解離動力學測定法來測定MHC-肽複合物的穩定性。用溫和的pH3.2檸檬酸鹽-磷酸鹽酸性緩衝液剝離HLA-A*0201 LCL。立即以200mM的濃度將每一種肽脈衝到細胞上，即在存在3μg/ml b2微球蛋白時於室溫保溫1小時。洗掉過量的肽，並將細胞於37℃保溫0、2、4、和6小時。在每個時間點結束時清洗細胞，並對細胞表面HLA-A2表達進行染色，然後通過流式細胞術進行分析。若平均螢光強度相對於剝離但未用肽脈衝的細胞升高至少1.5倍，則認為肽-I型MHC複合物是穩定的。在解離動力學測定法中，所有4種顯性肽穩定達2-6小時。
然後對4種顯性肽進行其它免疫學和物理化學研究。這些研究包括體外研究，其中(1)將肽用於生成AFP肽特異性人T細胞培養物，這些培養物既具有肽特異性，又受到天然表達AFP的細胞的識別；(2)將經過AdVhAFP轉導的樹突細胞用於生成識別AFP陽性細胞和經過顯性肽脈衝的AFP陰性細胞的AFP特異性人T細胞。這些研究還包括體內研究，其中(1)用肽免疫的轉基因小鼠具有識別肽和AFP陽性細胞的脾細胞；和(2)AdVhAFP/DC免疫的小鼠識別AFP陽性細胞和經過顯性肽脈衝的AFP陰性細胞。這些研究顯示，顯性肽具有免疫原性，AFP自身具有免疫原性，顯性肽被天然加工和呈遞到AFP陽性細胞表面上，且AFP/DC或顯性肽可用於生成AFP特異性T細胞，這些細胞生成細胞因子並殺傷A即陽性細胞。另外，質譜法被用於在物理上由AFP陽性肝細胞癌細胞表面鑑定AFP肽。
首先，對原初的HLA-A2*0201人T細胞培養物進行反覆肽刺激，以證明肽在人T細胞庫環境中的免疫原性和肽特異性T細胞識別經AFP轉染的靶的能力。由經過每一種顯性AFP衍生肽脈衝(添加KLH、IL-7、和IL-2)的PBMC製備大批T細胞培養物，並在擴增的第3和7周之間測試識別經過肽脈衝和表達AFP的兩種靶的能力。這些培養物擴增肽特異性T細胞，證據是它們在EL ISPOT測定法中能夠在識別經過特定肽脈衝的JY細胞而非經過對照MART-17-35脈衝的JY後分泌IFNγ。相對於未修飾或經過空AdVRR5轉導的親本細胞，AFP肽特異性T細胞群還識別經過AFP陰性穩定轉染和經過AdVhAFP轉導的HLA-A2*0201黑素瘤細胞(M202)，顯示為生成IFNγ的AFP特異性T細胞的頻率增加。為了評估識別HLA-A*0201+的能力，對天然表達AFP的肝細胞癌細胞系HepG2(相對於HLA-A2-/AFP陽性HCC系Hep3B)進行細胞毒性和ELISPOT測定法。
另外，由經過AdV轉導的樹突細胞製備CTL。簡而言之，將由PBMC與GM-CSF和IL-4一起保溫製備的樹突細胞用AdVhAFP或AdVMART1以感染複數(moi)1000轉導達2小時。清洗轉導後的樹突細胞，照射，並以1-2×105細胞/ml塗布，作為CTL製備的刺激物。通過磁珠排除法由自體非貼壁細胞中消除CD4、CD14、CD19、和CD56+細胞以製備CD8+富集的效應細胞(群體中通常80％是CD8+，未顯示)。將CD8+細胞與經轉導樹突細胞一起以2×106細胞/ml在添加10-25ng/ml IL-7的5％自體培養基中進行塗布。每3-4天向培養物中添加10U/ml IL-2。每周用新鮮的自體AdV轉導樹突細胞以1個樹突細胞對10-20個CD8+CTL的比率再次刺激CD8+CTL。每周鑑定大多數培養物的表現，區分CD4+和CD8+細胞。每一種顯性肽在體外都由幾名正常HLA-A*0201供體誘導了肽特異性T細胞。
因為在體外經過AdVhAFP/DC刺激的人T細胞在CTL和ELISPOT測定法中均特異識別經hAFP轉染的靶，所以接著研究這4種顯性肽，測定它們是否受到經過AdVhAFP/DC刺激的T細胞的特異識別。培養7-21天後，對每周用AdVhAFP/DC刺激的CD8富集T細胞測試hAFT肽特異性IFNγ細胞因子生成細胞的細胞毒性和頻率。AdVhAFP/DC T細胞培養物對經過4種AFP肽之一脈衝的JY細胞具有細胞毒性，指示能夠由正常供體的外周血擴增了針對這些肽的CTL。用經自體肽脈衝過的LCL或JY細胞進行再刺激後，這些大批培養物還包含相對於MART-127-35頻率高得多的對AFP肽特異的IFNγ分泌細胞，指示除了hAFP542-550以外，其它3種顯性肽也天然的由經AdVhAFP轉導的樹突細胞得到加工和呈遞。
經AdVhAFP/DC刺激的T細胞培養物還具有低頻率的細胞因子生成細胞，後者可識別A*0201+/AFP陽性肝細胞癌系HepG2，但不識別A*0201-/AFP陽性HCC系Hep3B。檢測到合成Th1細胞因子IFNγ和TNFα的T淋巴細胞，而沒有檢測到Th2細胞因子IL-4。在不含T細胞而塗布肝細胞癌系時還檢測到IL-10，指示這種細胞因子的生成是來自腫瘤細胞。
如下所述將HLA-A*0201/Kb轉基因小鼠用於篩選74種肽，以確定這些肽是否具有免疫原性，是否天然的在HLA-A*0201的環境中得到加工和呈遞。HLA-A*0201/Kb轉基因雌性小鼠最初購自Harlan-SpragueDawley(印第安納波利斯市，印地安那州，美國)，目前由加利福尼亞大學(洛杉磯)放射腫瘤學系的動物房飼養。
關於肽免疫，小鼠皮下接受100μg以1∶1在完全弗氏佐劑中乳化的AFP或對照肽。用在完全弗氏佐劑中乳化的每一種肽免疫後，引流淋巴結細胞在識別經hAFP穩定轉染的細胞後生成IFNγ。另外，可以在經樹突細胞(經過表達AFP的腺病毒(AdVhAFP)的轉導)免疫的小鼠脾中鑑定出甲胎蛋白肽特異性T細胞。因而，4種顯性肽天然的在I型環境中得到加工和呈遞，而且具有免疫原性。
接著，確認這4種顯性肽的體內免疫原性。用脈衝到同系樹突細胞上的每一種顯性肽免疫HLA-A*0201/Kb小鼠。對在體外用免疫顯性肽或MART-1肽或者用經Jurkat/AFP或Jurkat/MART轉染的細胞系再次刺激的脾細胞進行IFNγ特異性ELISPOT測定法。每一種hAFP肽的免疫及隨後每一種肽或Jurkat/AFP的再次刺激誘導了大量的AFP特異性IFNγ生成細胞。不管是否進行再次刺激，來自PBS注射小鼠的淋巴細胞不顯示細胞毒性和IFNγ生成。用MART-127-35肽免疫的小鼠生成MART-1特異性應答而不生成AFP肽應答。
然後，通過在GM-CSF和IL-4中的分化而由骨髓祖細胞製備樹突細胞，並用包含hAFP cDNA即SEQ ID NO1的重組腺病毒載體(AdVhAFP)進行轉導。在RPMI/2％FCS中以moi 100轉導體外培養的樹突細胞。轉導於37℃進行2小時。然後清洗樹突細胞並以每隻動物0.2ml PBS 5×105個樹突細胞重懸，用於注射。在所有情況中，存活率超過95％。免疫後2周，用經hAFP(Jurkat/AFP)或MART-1(Jurkat/MART)穩定轉染的Jurkat細胞再次刺激小鼠脾細胞。通過ELISPOT測定AFP特異性與MART-1特異性IFNγ釋放的頻率，計算3組獨立實驗的平均值，p＜0.02。在5小時51Cr釋放測定法中測定了針對Jurkat/AFP和Jurkat/MART的細胞毒性。
其次，對由HLA-A*0201人肝細胞癌系洗脫的顯性肽進行了HPLC和質譜鑑定。這些分析結果的概述顯示於下文表2。
為了洗脫肽，將HepG2和Hep3B細胞用PBS清洗3次之後，在5ml檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝液pH3.2中保溫1分鐘。將懸浮液離心(800×g，5分鐘)，獲得上清液，合計每種細胞系收集了500ml無細胞上清液。將實驗材料凍幹並保存於-20℃。
將凍乾材料重新溶於30ml水/乙腈/三氟乙酸(W/A/TFA體積比95/5/0.1)。將該溶液以0.2ml/min流速抽吸到分析性反相HPLC柱(Keystone Scientific C18Betasil，250mm×2mm，5mm顆粒大小，100孔徑)上，層析柱事先用W/A/TFA平衡。使用0.1％TFA在乙腈中的漸增線性梯度(時間/％乙腈＝0/5、5/5、55/100、60/100)進行洗脫。在215和280nm處監測層析柱洗脫液吸光值，並收集1分鐘的級分。在不同的層析柱上使用相同的分離梯度獲得了具有對應於免疫刺激肽的胺基酸序列的合成肽的停留時間。
進行MALDI-TOF質譜法，以分析由AFP生成肝細胞癌細胞系HepG2(HLA-A2+)和Hep3B(HLA-A2-)酸性洗脫的HPLC分級分離肽。將Voyager-REACTION PRODUCTS(PerSeptive Biosystems，弗雷明漢市，麻薩諸塞州)Matrix Assisted Laser DesorptionIonization/Time-Of-Flight(MALDI-TOF)用於獲得質譜。該設備使用不鏽鋼靶，樣品在其上存放和乾燥。所有光譜用胰島素進行外部校準，導致質量精確度通常在±0.1％以內。將凍幹的HPLC級分重懸於10μl含0.1％TFA的70％乙腈。將1μl這種材料與1μl基質α-氰基-4-羥基肉桂酸(Sigma，以10mg/ml溶於70％ACN/0.1％TFA)一起點樣。掃描m/z 500-7000獲得光譜。
HPLC級分的MALDI分析確定了幾乎所有的級分都包含多達20種質量範圍700-1500Da的不同肽，儘管常常存在優勢信號。在這種複雜混合物中，鑑定出m/z值對應於hAFP158-166即SEQ ID NO2的第158-166位殘基、hAFP325-334即SEQ ID NO2的第325-334位殘基、和hAFP542-550即SEQ ID NO2的第542-550位殘基的計算所得單各向同性質子化分子((M+H)+)的峰，hAFP542-550、hAFP158-166和hAFP325-334存在於由HepG2細胞洗脫的肽集合中。在來自HepG2肽集合的一份HPLC級分中鑑定出m/z 975.6的肽。hAFP542-550的計算所得(M+H)+是975.5，具有對應於hAFP542-550即SEQ ID NO2的第542-550位殘基的胺基酸序列的合成肽的停留時間是21.2分鐘。另外，在僅含基質的樣品和來自Hep3B洗脫的HPLC級分18-22中沒有觀察到在m/z 975.5±1處的信號。相似的，根據標準肽表現的預測，在衍生自HepG2的適當級分中還發現了m/z對應於hAFP158-166即SEQ ID NO2的第158-166位殘基和hAFP325-334即SEQ IDNO2的第325-334位殘基的計算所得(M+H)+的峰。在由Hep3B洗脫的肽集合的級分中不存在這些峰。在一份級分中觀察到m/z 1152.2的峰，說明存在hAFP325-334即SEQ ID NO2的第325-334位殘基的鈉加合物。
因此，在由HLA-A*0201陽性HepG2細胞而非HLA-A*0201陰性Hep3B細胞洗脫的HPLC分級分離肽集合中鑑定了這4種肽中的3種的潛在質量候選。在所鑑定的3種肽中，峰是在對點樣的重複掃描中觀察到的。在來自HepG2肽集合的一份級分中在m/z 1020.9處觀察到寬峰，超過了這種物理化學分析的容許誤差範圍。因此，不可能證明HepG2細胞的表面上存在hAFP137-145即SEQ ID NO2的第137-145位殘基。
為了在免疫學上確認這些級分中存在顯性肽，在ELISPOT測定法中將1ml來自HepG2或Hep3B細胞的各種HPLC級分用於再次刺激經AdVhAFP/DC免疫的鼠脾細胞。由包含顯性肽的級分觀察到200-250個斑點/106個細胞，由其它級分觀察到100-130個斑點/106個細胞，由Hep3B級分觀察到最多50個斑點/106個細胞。這進一步支持了顯性肽的質譜鑑定。
腳註1.肽標識；2.對照合成肽的典型HPLC停留時間；3.預期質量/電荷測量；4.在來自HepG2的酸性洗脫肽中觀察到的質量/電荷測量值；5.在來自Hep3B的酸性洗脫肽中觀察到的質量/電荷測量值；6.在來自HepG2的酸性洗脫肽中觀察到hAFP肽質量/電荷測量值的級分(分鐘)；7.通過IFNγ ELISPOT含有能夠再次刺激經AdVhAFP/DC肽引發的脾細胞的級分。
實施例實施例1通過施用肽來預防或治療肝細胞癌的方法依照本發明的一個實施方案，提供了用於預防或治療肝細胞癌患者的方法。該方法包括選擇合適的患者，諸如患有AFP陽性肝細胞癌的HLA-A*0201+患者，然後對患者施用一種或多種本發明肽。對患者施用足夠劑量的肽，而且優選多次重複施用，從而引發針對AFP的免疫應答，並由此引發針對肝細胞癌的免疫應答。
在一個優選的實施方案中，肽是hAFP137-145即SEQ ID NO2的第137-145位殘基、hAFP158-166即SEQ ID NO2的第158-166位殘基、hAFP325-334即SEQ ID NO2的第325-334位殘基、和hAFP542-550即SEQ ID NO2的第542-550位殘基的聯合。在另一個優選的實施方案中，所述一種或多種肽被施用了2-5次。在一個特別優選的實施方案中，肽施用了3次。在另一個優選的實施方案中，所述一種或多種肽以2周的間隔施用了3次。
在一個優選的實施方案中，肽是皮內施用的，儘管本領域技術人員參照本公開書可以領會其它施用路徑也是合適的。
在一個優選的實施方案中，一種或多種肽的每一種都是在0.5mlMontanide ISA-51中乳化後施用的。因此，在聯合四種肽時，它們是在合計2ml Montanide ISA-51中乳化後施用的。將乳化後的肽分成四等份，每份施用於不同位點。在一個優選的實施方案中，該一種或多種肽是以每種大約50-2000μg的劑量施用的。在一個優選的實施方案中，該一種或多種肽是以每種大約100-1000μg的劑量施用的。在一個特別優選的實施方案中，該一種或多種肽是以每種大約500μg的劑量施用的。
將本發明的方法和組合物用於治療幾名AFP陽性/A2.1+肝細胞癌患者。依照該方法，用四種肽hAFP137-145即SEQ ID NO2的第137-145位殘基、hAFP158-166即SEQ ID NO2的第158-166位殘基、hAFP325-334即SEQ ID NO2的第325-334位殘基、和hAFP542-550即SEQ ID NO2的第542-550位殘基免疫每位患者。將肽在0.5ml Montanide ISA-51中乳化，聯合後合計2ml。將乳化後的肽分成四等份，每份施用於不同位點。通過ELISPOT和四聚體測定法來測量外周T細胞應答。這些試驗顯示這四種AFP衍生肽在體內具有免疫原性，甚至在免疫前AFP血清水平極高的患者中也是如此。
第一位患者(稱為AFP-A1)患有復發的、不可切除的AFP陽性/A2.1+肝細胞癌。以2周的間隔對他施用三次免疫，每次免疫均是在MontanideISA中含有這四種肽，每種100μg。同時，由該第一位患者的免疫前血液建立平行體外PBMC培養物，並用每種肽重複脈衝。根據ELISPOT的檢查，在第28天的培養物中所有肽都存在清楚的體外識別；根據四聚體測定法的檢查，發現對3種肽的2種存在清楚的體外識別，即hAFP137-145即SEQ ID NO2的第137-145位殘基和hAFP325-334即SEQ ID NO2的第325-334位殘基有，而對hAFP158-166即SEQ ID NO2的第158-166位殘基卻沒有。四聚體測定法不能評估AFP542特異性T細胞的存在與否，因為AFP542肽四聚體不能被製備這些試劑的設備摺疊。體內應答指示對hAFP137-145即SEQ ID NO2的第137-145位殘基、hAFP158-166即SEQ ID NO2的第158-166位殘基、和hAFP542-550即SEQ ID NO2的第542-550位殘基的清楚識別，並且在第二次和第三次免疫後趨向於識別hAFP325-334即SEQ ID NO2的第325-334位殘基。
第二位患者(稱為AFP-A2)是具有酒精誘發肝硬化病史的70歲白人男性，其B肝和C肝都是陰性。他呈現腫脹，而且在肝臟左葉發現8cm硬塊。他的AFP水平當時是10,400ng/ml。肝臟活檢在硬化肝臟揭示了充分分化的肝細胞癌。對他進行實驗性抗真菌劑FV-462嘗試，但是病情發展且產生耳毒性。檢查後7個月，使用依照本發明的方案，對他施用四種肽hAFP137-145即SEQ ID NO2的第137-145位殘基、hAFP158-166即SEQ ID NO2的第158-166位殘基、hAFP325-334即SEQ ID NO2的第325-334位殘基、和hAFP542-550即SEQ ID NO2的第542-550位殘基的聯合。他接受了兩次免疫，間隔兩周。兩次免疫後的四聚體和ELISPOT數據顯示，檢測到針對所有4種AFP肽表位的T細胞應答。
因此，這些結果指示，本方法在病情嚴重的肝細胞癌患者中引發了由AFP特異性T細胞進行的可檢測免疫應答。實施例2通過施用經過本發明肽脈衝的樹突細胞來預防或治療肝細胞癌的方法依照本發明的一個實施方案，提供了用於預防或治療肝細胞癌患者的方法。該方法包括選擇合適的患者，諸如患有AFP陽性肝細胞癌的HLA-A*0201+患者，然後對患者施用經過一種或多種本發明肽脈衝的樹突細胞。對患者施用足夠劑量的樹突細胞，而且優選多次重複施用，從而引發針對AFP的免疫應答，並由此引發針對肝細胞癌的免疫應答。
在一個優選的實施方案中，樹突細胞是用hAFP137-145即SEQ ID NO2的第137-145位殘基、hAFP158-166即SEQ ID NO2的第158-166位殘基、hAFP325-334即SEQ ID NO2的第325-334位殘基、和hAFP542-550即SEQID NO2的第542-550位殘基的聯合脈衝的。在另一個優選的實施方案中，樹突細胞施用了2-5次。在一個特別優選的實施方案中，樹突細胞施用了3次。在另一個優選的實施方案中，樹突細胞間隔2周施用了3次。
在一個優選的實施方案中，樹突細胞是皮內施用的，儘管本領域技術人員參照本公開書可以領會其它施用路徑也是合適的。在一個實施方案中，樹突細胞是以大約1×105與1×108之間的劑量施用的。在另一個優選的實施方案中，樹突細胞是以大約1×106與1×107之間的劑量施用的。在一個特別優選的實施方案中，樹突細胞是以大約5×106的劑量施用的。
依照本領域技術人員知道的技術，由在組織培養中暴露於粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素-4(IL-4)達1周的貼壁自體外周血單核細胞製備樹突細胞。通過Ficoll-Hypaque離心由得自一次白細胞單採法(leukapheresis)的細胞分離單核細胞，並凍存於液氮中直至用於生產樹突細胞。將解凍的單核細胞用鹽水清洗一次，並以2-4×107個細胞/25cm2Costar瓶的密度以2.5-5×106個存活細胞/ml培養基(RPMI 1640+5％熱滅活自體血清+慶大黴素)的濃度塗布。使之於37℃貼壁2小時後，通過鹽水清洗除去非貼壁細胞。將貼壁細胞在完全培養基中在存在rhGM-CSF(800U/ml)和rhIL-4(500U/ml)時培養7天。臨床級GM-CSF由Immunex提供，IL-4由Schering-Plough提供。
對患者進行一次白細胞單採法(leukapheresis)以獲得至少2×109個PBL，並冷藏於70％RPMI 1640、20％自體血清、和10％DMSO。在研究的第-7、7、和21天各取等分液解凍。在第一次免疫那天，在進行白細胞單採法(leukapheresis)時取用於製備自體血清的血液(60ml)，這足夠用於所有的細胞培養。依照本領域技術人員知道的技術，製備並純化本發明的AFP衍生免疫顯性肽。
如下免疫患者。在免疫那天，收穫樹突細胞，用無菌鹽水清洗一次，並以適當濃度(諸如106)重懸於1ml無血清RPMI 1640和50mg/ml四種免疫顯性肽的每一種。最短保溫1小時後，沉澱AFP肽/DC，並用無菌鹽水清洗3次。在錐蟲藍中進行細胞計數，並將細胞重懸於0.1ml無菌鹽水，用於皮內注射。
在足量施用前，受試者將接受皮試，即0.1ml鹽水中含1％的劑量。30分鐘觀察期後，他們將接受0.1ml鹽水中足量的經過AFP肽脈衝的樹突細胞，即在腋窩下兩側或腹股溝上下皮內注射。免疫後對患者監控2小時。優選的是，患者接受50mg苯海拉明(diphenhydramine)和650mg撲熱息痛(Tylenol)的預處理，二者皆口服。實施例3通過施用經過人AFP腺病毒轉導的樹突細胞來預防或治療肝細胞癌的方法依照本發明的一個實施方案，提供了用於預防或治療肝細胞癌患者的方法。該方法包括選擇合適的患者，諸如患有AFP陽性肝細胞癌的HLA-A*0201+患者，然後對患者施用經過人AFP腺病毒轉導的樹突細胞。對患者施用足夠劑量的樹突細胞，而且優選多次重複施用，從而引發針對AFP的免疫應答，並由此引發針對肝細胞癌的免疫應答。
在另一個優選的實施方案中，樹突細胞施用了2-5次。在一個特別優選的實施方案中，樹突細胞施用了3次。在另一個優選的實施方案中，樹突細胞以2周的間隔施用了3次。
在一個優選的實施方案中，樹突細胞皮內施用於腋窩下或腹股溝兩側，儘管本領域技術人員參照本公開書可以領會其它施用路徑也是合適的。在一個實施方案中，樹突細胞是以大約1×105與1×108之間的劑量施用的。在另一個優選的實施方案中，樹突細胞是以大約1×106與1×107之間的劑量施用的。在一個特別優選的實施方案中，樹突細胞是以大約5×106的劑量施用的。
通過Ficoll-Hypaque離心由白細胞單採法(leukapheresis)產物分離單核細胞，並保存於10％DMSO/20％自體血清中。在DC接種前一周，將細胞解凍，用PBS清洗一次，並以2-4×107個細胞/25cm2Costar瓶的密度以2.5-5×106個存活細胞/ml培養基(RPMI 1640+5％熱滅活自體血清)的濃度塗布。使之於37℃貼壁2小時後，通過PBS清洗溫和除去非貼壁細胞。將貼壁細胞在完全培養基中在存在rhGM-CSF(800U/ml)和rhIL-4(500U/ml)時培養7天。臨床級GM-CSF和IL-4由Schering-Plough提供。
AdVhAFP是E1缺失的複製缺陷型5型腺病毒載體，其中人AFP cDNA由CMV增強子/啟動子驅動。每批病毒終產物的病毒滴度是根據基因組DNA定量和感染滴度來提供的。病毒顆粒產物對生物學活性病毒的比率低於100∶1被認為是可接受的。
如下免疫患者。在免疫那天，收穫樹突細胞，用無菌鹽水清洗一次，並以106-107的濃度重懸於1ml 2％自體血清-RPMI 1640和109-1010pfu/ml AdVhAFP(感染複數＝1000∶1)。於37℃保溫2小時後，將AdVhAFP/DC重懸於RPMI 1640-5％自體血清以滅活未吸附的腺病毒載體，然後沉澱並用無菌鹽水清洗3次。在錐蟲藍中進行細胞計數，並將適當數目(根據患者群不同，在105與108之間)的細胞重懸於無菌鹽水，用於皮內注射。
對患者施用經過AdVhAFP轉導的DC，即在腋窩下或腹股溝的兩側皮內注射0.1ml普通鹽水。免疫後對患者監控2小時。優選的是，患者接受50mg苯海拉明(diphenhydramine)和650mg撲熱息痛(Tylenol)的預處理，二者皆口服。
雖然通過參照某些優選實施方案已經相當詳細的討論了本發明，但是其它實施方案也是可能的。因此，所附權利要求的範圍不應當限於本公開書所含優選實施方案的描述。
序列表110 The Regents of the University of CaliforniaEconomou，JamesButterfield，LisaRibas Bruguera，Antoni120 用於治療肝細胞癌的方法和組合物130 11969-5PCT140 to be assigned141 2001-02-12150 US 60/181,966151 2000-02-10150 US 09/660,252151 2000-09-12150 US 09/662,505151 2000-09-14160 2170 PatentIn version 3.0210 1211 2032212 DNA213 人(Homo sapiens)220221 CDS222 (48)..(1874)400 1tccatattgt gcttccacca ctgccaataa caaaataact agcaacc atg aag tgg56Met Lys Trp1gtg gaa tca att ttt tta att ttc cta cta aat ttt act gaa tcc aga104Val Glu Ser Ile Phe Leu Ile Phe Leu Leu Asn Phe Thr Glu Ser Arg
5 10 15aca ctg cat aga aat gaa tat gga ata gct tcc ata ttg gat tct tac 152Thr Leu His Arg Asn Glu Tyr Gly Ile Ala Ser Ile Leu Asp Ser Tyr20 25 30 35caa tgt act gca gag ata agt tta gct gac ctg gct acc ata ttt ttt 200Gln Cys Thr Ala Glu Ile Ser Leu Ala Asp Leu Ala Thr Ile Phe Phe40 45 50gcc cag ttt gtt caa gaa gcc act tac aag gaa gta agc aaa atg gtg 248Ala Gln Phe Val Gln Glu Ala Thr Tyr Lys Glu Val Ser Lys Met Val55 60 65aaa gat gca ttg act gca att gag aaa ccc act gga gat gaa cag tct 296Lys Asp Ala Leu Thr Ala Ile Glu Lys Pro Thr Gly Asp Glu Gln Ser70 75 80tca ggg tgt tta gaa aac cag cta cct gcc ttt ctg gaa gaa ctt tgc 344Ser Gly Cys Leu Glu Asn Gln Leu Pro Ala Phe Leu Glu Glu Leu Cys85 90 95cat gag aaa gaa att ttg gag aag tac gga cat tca gac tgc tgc agc 392His Glu Lys Glu Ile Leu Glu Lys Tyr Gly His Ser Asp Cys Cys Ser100 105 110 115caa agt gaa gag gga aga cat aac tgt ttt ctt gca cac aaa aag ccc 440Gln Ser Glu Glu Gly Arg His Asn Cys Phe Leu Ala His Lys Lys Pro120 125 130act cca gca 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gtt aat ttt act gaa atc cag aaa cta gtc824Ser Gln Lys Phe Thr Lys Val Asn Phe Thr Glu Ile Gln Lys Leu Val245 250 255ctg gat gtg gcc cat gta cat gag cac tgt tgc aga gga gat gtg ctg872Leu Asp Val Ala His Val His Glu His Cys Cys Arg Gly Asp Val Leu260 265 270 275gat tgt ctg cag gat ggg gaa aaa atc atg tcc tac ata tgt tct caa920Asp Cys Leu Gln Asp Gly Glu Lys Ile Met Ser Tyr Ile Cys Ser Gln280 285 290caa gac act ctg tca aac aaa ata aca gaa tgc tgc aaa ctg acc acg968Gln Asp Thr Leu Ser Asn Lys Ile Thr Glu Cys Cys Lys Leu Thr Thr295 300 305ctg gaa cgt ggt caa tgt ata att cat gca gaa aat gat gaa aaa cct1016Leu Glu Arg Gly Gln Cys Ile Ile His Ala Glu Asn Asp Glu Lys Pro310 315 320gaa ggt cta tct cca aat cta aac agg ttt tta gga gat aga gat ttt1064Glu Gly Leu Ser Pro Asn Leu Asn Arg Phe Leu Gly Asp Arg Asp Phe325 330 335aac caa ttt tct tca ggg gaa aaa aat atc ttc ttg gca agt ttt gtt1112Asn Gln Phe Ser Ser Gly Glu Lys Asn Ile Phe Lau Ala Ser Phe Val340 345 350 355cat gaa tat tca aga aga cat cct cag ctt gct gtc tca gta att cta 1160His Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Gln Leu Ala Val Ser Val Ile Leu360 365 370aga gtt gct aaa gga tac cag gag tta ttg gag aag tgt ttc cag act 1208Arg Val Ala Lys Gly Tyr Gln Glu Leu Leu Glu Lys Cys Phe Gln Thr375 380 385gaa aac cct ctt gaa tgc caa gat aaa gga gaa gaa gaa tta cag aaa 1256Glu Asn Pro Leu Glu Cys Gln Asp Lys Gly Glu Glu Glu Leu Gln Lys390 395 400tac atc cag gag agc caa gca ttg gca aag cga agc tgc ggc ctc ttc 1304Tyr Ile Gln Glu Ser Gln Ala Leu Ala Lys Arg Ser Cys Gly Leu Phe405 410 415cag aaa cta gga gaa tat tac tta caa aat gcg ttt ctc gtt gct tac 1352Gln Lys Leu Gly Glu Tyr Tyr Leu Gln Asn Ala Phe Leu Val Ala Tyr420 425 430 435aca aag aaa gcc ccc cag ctg acc tcg tcg gag ctg atg gcc atc acc 1400Thr Lys Lys Ala Pro Gln Leu Thr Ser Ser Glu Leu Met Ala Ile Thr440 445 450aga aaa atg gca gcc aca gca gcc act tgt tgc caa ctc agt gag gac 1448Arg Lys Met Ala Ala Thr Ala Ala Thr Cys Cys Gln Leu Ser Glu Asp455 460 465aaa cta ttg gcc tgt ggc gag gga 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Arg His Asn Cys Phe Leu Ala His115 120 125Lys Lys Pro Thr Pro Ala Ser Ile Pro Leu Phe Gln Val Pro Glu Pro130 135 140Val Thr Ser Cys Glu Ala Tyr Glu Glu Asp Arg Glu Thr Phe Met Asn145 150 155 160Lys Phe Ile Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Phe Leu Tyr Ala Pro165 170 175Thr Ile Leu Leu Trp Ala Ala Arg Tyr Asp Lys Ile Ile Pro Ser Cys180 185 190Cys Lys Ala Glu Asn Ala Val Glu Cys Phe Gln Thr Lys Ala Ala Thr195 200 205Val Thr Lys Glu Leu Arg Glu Ser Ser Leu Leu Asn Gln His Ala Cys210 215 220Ala Val Met Lys Asn Phe Gly Thr Arg Thr Phe Gln Ala Ile Thr Val225 230 235 240Thr Lys Leu Ser Gln Lys Phe Thr Lys Val Asn Phe Thr Glu Ile Gln245 250 255Lys Leu Val Leu Asp Val Ala His Val His Glu His Cys Cys Arg Gly260 265 270Asp Val Leu Asp Cys Leu Gln Asp Gly Glu Lys Ile Met Ser Tyr Ile275 280 285Cys Ser Gln Gln Asp Thr Leu Ser Asn Lys Ile Thr Glu Cys Cys Lys290 295 300Leu Thr Thr Leu Glu Arg Gly Gln Cys Ile Ile His Ala Glu ASn Asp305 310 315 320Glu Lys Pro Glu Gly Leu Ser Pro Asn Leu Asn Arg Phe Leu 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權利要求
1.用於在哺乳動物中預防或治療癌症的方法，其中癌細胞在細胞表面表達甲胎蛋白分子的至少一部分，該方法包括在哺乳動物中引發針對甲胎蛋白分子的至少部分胺基酸序列的免疫應答的步驟，其中免疫應答包括激活針對癌細胞的甲胎蛋白肽特異性T淋巴細胞。
2.權利要求1的方法，其中甲胎蛋白肽特異性T淋巴細胞是細胞毒性T淋巴細胞。
3.權利要求1的方法，其中甲胎蛋白分子是SEQ ID NO2。
4.權利要求1的方法，其中所述甲胎蛋白分子的一部分選自下組SEQ ID NO2的第137-145位殘基、SEQ ID NO2的第158-166位殘基、SEQ ID NO2的第325-334位殘基、SEQ ID NO2的第542-550位殘基、及上述各項的聯合。
5.權利要求1的方法，其中癌症是肝細胞癌。
6.權利要求1的方法，其中哺乳動物是人。
7.權利要求1的方法，其中引發免疫應答的步驟包括對哺乳動物施用一種或多種組合物，其中所述組合物包含具有甲胎蛋白分子的至少部分胺基酸序列的肽。
8.權利要求7的方法，其中肽選自下組SEQ ID NO2的第137-145位殘基、SEQ ID NO2的第158-166位殘基、SEQ ID NO2的第325-334位殘基、SEQ ID NO2的第542-550位殘基、及上述各項的聯合。
9.權利要求7的方法，其中肽選自下組SEQ ID NO2的第1-9位殘基、SEQ ID NO2的第178-186位殘基、SEQ ID NO2的第218-226位殘基、SEQ ID NO2的第235-243位殘基、SEQ ID NO2的第306-315位殘基、SEQ ID NO2的第485-493位殘基、SEQ ID NO2的第492-500位殘基、SEQ ID NO2的第507-516位殘基、SEQ ID NO2的第547-556位殘基、SEQ ID NO2的第555-563位殘基、及上述各項的聯合。
10.權利要求1的方法，其中引發免疫應答的步驟包括對哺乳動物施用一種或多種組合物，其中所述組合物包含經過構成胺基酸序列SEQID NO2的至少一部分的一種或多種肽脈衝的樹突細胞。
11.權利要求1的方法，其中引發免疫應答的步驟包括對哺乳動物施用一種或多種組合物，其中所述組合物包含經過編碼甲胎蛋白的重組腺病毒載體轉導的樹突細胞。
12.用於在人中預防或治療肝細胞癌的方法，其中癌細胞在細胞表面表達甲胎蛋白分子的至少一部分，該方法包括通過對人施用選自下組的一種或多種肽從而針對胺基酸序列SEQ ID NO2的至少一部分激活針對癌細胞的甲胎蛋白細胞毒性T淋巴細胞的步驟SEQ ID NO2的第137-145位殘基、SEQ ID NO2的第325-334位殘基、及SEQ IDNO2的第137-145位殘基、SEQ ID NO2的第158-166位殘基、SEQID NO2的第325-334位殘基、和SEQ ID NO2的第542-550位殘基中至少兩項的聯合。
13.用於在人中預防或治療肝細胞癌的方法，其中癌細胞在細胞表面表達甲胎蛋白分子的至少一部分，該方法包括通過對人施用選自下組的一種或多種肽從而針對胺基酸序列SEQ ID NO2的至少一部分激活針對癌細胞的甲胎蛋白細胞毒性T淋巴細胞的步驟SEQ ID NO2的第158-166位殘基和SEQ ID NO2的第542-550位殘基。
14.用於在人中預防或治療肝細胞癌的方法，其中癌細胞在細胞表面表達甲胎蛋白分子的至少一部分，該方法包括通過對人施用選自下組的一種或多種肽從而針對胺基酸序列SEQ ID NO2的至少一部分激活針對癌細胞的甲胎蛋白細胞毒性T淋巴細胞的步驟SEQ ID NO2的第1-9位殘基、SEQ ID NO2的第178-186位殘基、SEQ ID NO2的第218-226位殘基、SEQ ID NO2的第235-243位殘基、SEQ ID NO2的第306-315位殘基、SEQ ID NO2的第485-493位殘基、SEQ ID NO2的第492-500位殘基、SEQ ID NO2的第507-516位殘基、SEQ ID NO2的第547-556位殘基、和SEQ ID NO2的第555-563位殘基。
15.用於在人中預防或治療肝細胞癌的方法，其中癌細胞在細胞表面表達甲胎蛋白分子的至少一部分，該方法包括通過對人施用一種或多種組合物從而針對胺基酸序列SEQ ID NO2的至少一部分激活針對癌細胞的甲胎蛋白細胞毒性T淋巴細胞的步驟，其中所述組合物包含經過構成胺基酸序列SEQ ID NO2的至少一部分的一種或多種肽脈衝的樹突細胞。
16.權利要求15的方法，其中用於脈衝樹突細胞的一種或多種肽選自下組SEQ ID NO2的第137-145位殘基、SEQ ID NO2的第158-166位殘基、SEQ ID NO2的第325-334位殘基、和SEQ ID NO2的第542-550位殘基。
17.用於在人中預防或治療肝細胞癌的方法，其中癌細胞在細胞表面表達甲胎蛋白分子的至少一部分，該方法包括通過對人施用一種或多種組合物從而針對胺基酸序列SEQ ID NO2的至少一部分激活針對癌細胞的甲胎蛋白細胞毒性T淋巴細胞的步驟，其中所述組合物包含經過編碼甲胎蛋白的重組腺病毒載體轉導的樹突細胞。
18.可用於預防或治療癌症的分離肽，其選自下組SEQ ID NO2的第137-145位殘基和SEQ ID NO2的第325-334位殘基。
19.用於預防或治療癌症的組合物，其包含權利要求18的一種或多種肽，它們的量足以在哺乳動物中引發針對甲胎蛋白的免疫應答。
20.權利要求19的組合物，其中還包含佐劑。
21.用於在人中預防或治療癌症的方法，包括對人施用權利要求18的肽的步驟。
22.用於在人中預防或治療癌症的方法，包括對人施用權利要求19的組合物的步驟。
23.用於在人中預防或治療癌症的方法，包括對人施用權利要求20的組合物的步驟。
24.用於預防或治療癌症的手段，其中包含選自下組的一種或多種肽SEQ ID NO2的第137-145位殘基、SEQ ID NO2的第158-166位殘基、SEQ ID NO2的第325-334位殘基、和SEQ ID NO2的第542-550位殘基。
25.可用於預防或治療癌症的分離肽，其中具有依照SEQ ID NO2的第158-166位殘基或SEQ ID NO2的第542-550位殘基的序列。
26.用於預防或治療癌症的組合物，其中包含權利要求25的一種或多種肽，它們的量足以在哺乳動物中引發針對甲胎蛋白的免疫應答。
27.權利要求26的組合物，其中還包含佐劑。
28.用於在人中預防或治療癌症的方法，包括對人施用權利要求25的肽的步驟。
29.用於在人中預防或治療癌症的方法，包括對人施用權利要求26的組合物的步驟。
30.用於在人中預防或治療癌症的方法，包括對人施用權利要求27的組合物的步驟。
31.用於預防或治療癌症的手段，其中包含權利要求19的組合物。
32.權利要求31的手段，其中還包含佐劑。
33.用於在人中預防或治療癌症的方法，包括對人施用權利要求31的手段的步驟。
34.用於在人中預防或治療癌症的方法，包括對人施用權利要求32的手段的步驟。
35.用於預防或治療癌症的手段，其中包含權利要求26的組合物。
36.權利要求35的手段，其中還包含佐劑。
37.用於在人中預防或治療癌症的方法，包括對人施用權利要求35的手段的步驟。
38.用於在人中預防或治療癌症的方法，包括對人施用權利要求36的手段的步驟。
全文摘要
用於在哺乳動物中預防或治療癌症的方法，其中癌細胞在細胞表面表達甲胎蛋白的至少一部分，該方法包括在哺乳動物中引發針對甲胎蛋白分子的至少部分胺基酸序列的免疫應答的步驟，其中免疫應答包括激活針對癌細胞的甲胎蛋白肽特異性T淋巴細胞。用於預防或治療癌症的組合物，該組合物包含具有甲胎蛋白的至少部分序列的肽。
文檔編號A61P35/00GK1398187SQ01804758
公開日2003年2月19日 申請日期2001年2月12日 優先權日2000年2月10日
發明者J·S·伊科諾默, L·H·巴特菲爾德, A·裡巴斯布魯格拉 申請人:加利福尼亞大學董事會