一種可活體成像監測肝臟中IFN-β或NF-κB活性的小鼠模型及其構建方法

2023-04-29 23:54:16 2

專利名稱：一種可活體成像監測肝臟中IFN-β或NF-κB活性的小鼠模型及其構建方法
技術領域：
本發明屬於生物學領域中的動物模型及其構建方法，特別是涉及一種可活體成像監測有IFN- β或NF- K B活性的小鼠模型及其構建方法。
背景技術：
I型幹擾素(Interferon，IFN)在天然免疫反應中有著重要作用，其主要成員是IFN-α和IFN-β，肝臟是蛋白合成和許多天然免疫成分活化的一個重要場所，許多免疫相關分子能夠被肝細胞來源的信號活化，肝臟的天然免疫系統在肝炎病毒感染及其免疫致病中發揮何種效應，已經成為學者們研究的熱點。IFN在細胞水平的研究無法反映出其在複雜完整免疫體系中的真實情況，目前尚無合適的動物模型，用來探討IFN在活體動物肝臟中的活性。核因子-κ B是1986年由Sen 和Baltimore在小鼠B淋巴細胞中發現的一種能與免疫球蛋白κ輕鏈基因增強子B位點特異結合的核蛋白因子，並將其命名為NuclearFactor-KB(NF-KB)。核因子_ κ B是一個具有廣泛生物活性的轉錄因子，調控多種信號傳導途徑。作為細胞內信號傳遞的一個樞紐，核因子-κ B在免疫、炎症、腫瘤等眾多疾病的發生發展過程中都起到重要作用，其表達的異常通常會導致機體的多種病理、生理學改變。然而，現今大多數關於NF-κ B的研究都是基於細胞水平進行的，真正動物整體水平的調控機制研究相對較少、較為困難，其主要原因就是缺乏實時、動態、易於建模、方便使用的動物模型。活體成像技術和生物發光技術由於其實用性，是近年來在生物醫學研究領域應用較為廣泛的報告基因監測手段。活體成像系統可以使研究人員直接實時的觀察活體動物體內的細胞生長和基因表達情況，大大提高了生物學實驗的可視性和可操作性，但成本相對較高，結合生物發光技術則可以有效控制由活體成像系統產生的高額成本。

發明內容
本發明的目的是提供一種可活體成像監測肝臟中IFN-β或NF-κ B活性的小鼠模型。本發明所提供的可活體成像監測肝臟中IFN-β或NF-κΒ活性的小鼠模型，是肝臟轉染有報告基因及IFN-β啟動子或NF-κ B基因的小鼠模型，所述IFN-β啟動子或NF-κ B基因調控報告基因的表達，所述報告基因用於指示IFN-β或NF-κ B的表達水平。在上述小鼠模型中，所述報告基因可為各種螢光素酶或鹼性磷酸酶報告基因，優選為螢火蟲螢光素酶(Fluc)基因。本發明的第二個目的是提供一種上述活體成像監測肝臟中IFN-β及NF-κ B活性的小鼠模型的構建方法。本發明所提供的上述活體成像監測肝臟中IFN-β及NF-κ B活性的小鼠模型的構建方法，可包括以下步驟:I)載體構建:構建攜帶噬菌體整合酶識別位點attB基因、IFN-β啟動子或NFk B基因以及螢火蟲螢光素酶(Fluc)報告基因的重組載體，所述噬菌體整合酶識別位點attB基因與IFN-β啟動子或NF κ B基因位於Fluc報告基因的上遊；2)將步驟I)構建的重組載體及噬菌體整合酶質粒用尾靜脈高壓注射的方法(水動力法)導入小鼠體內，得到受IFN-β啟動子或NF κ B基因調控表達的螢火蟲螢光素酶(Fluc)報告基因整合於小鼠肝臟的小鼠模型。在上述小鼠模型的構建方法中，所述步驟I)中用於構建攜帶噬菌體整合酶識別位點attB基因、IFN-β啟動子以及Fluc報告基因的重組載體的出發載體為pGL3-basic，以pGL3-basic為出發載體構建的攜帶噬菌體整合酶識別位點attB基因和IFN-β啟動子及螢火蟲螢光素酶(Fluc)報告基因的重組載體為pGL3-attB-1FNi3 ；所述步驟I)中用於構建攜帶噬菌體整合酶識別位點attB基因、NFkB基因以及Fluc報告基因的重組載體的出發載體為pNFK B-Luc，以PNF κ B-Luc為出發載體構建的攜帶噬菌體整合酶識別位點attB基因、NF-κ B基因以及螢火蟲螢光素酶(Fluc)報告基因的重組載體 pattB-NF κ B-Fluc。所述步驟2)中的噬菌體整合酶質粒為PhiC31o，所述將步驟I)構建的重組載體及噬菌體整合酶質粒用尾靜脈高壓注射的方法(水動力法)導入小鼠體內的方法具體為:取4-6周齡的雄性小鼠，稱重，將重組質粒10 μ g和噬菌體整合酶表達質粒PhiC31o20 μ g混合於相當於小鼠體重10%的生理鹽水，在3秒鐘以內通過尾靜脈快速轉染至小鼠肝臟。本發明提供了一種可活體成像監`測有IFN-β或NF-κ B活性的小鼠模型及其構建方法。本發明的小鼠模型是通過構建含有噬菌體整合酶識別位點attB基因、由IFN-β啟動子或NF κ B基因調控螢火蟲螢光素酶(Fluc)報告基因表達的重組載體，再通過水動力注射法將該重組載體轉染至小鼠肝臟，並可通過活體成像技術檢測IFN- β或NF- κ B活性。本發明的小鼠模型可用於評價poly (1: C)對IFN- β的活化，HCV NS3/4A對IFN- β的活化信號的抑制作用及MHV病毒感染後對小鼠肝臟IFN- β的活化過程，以及NF- κ B抑制劑TOTC抑制NF-κ B激活的藥效作用。用本發明的小鼠模型可以評價不同因素在體內對IFN-β啟動子或NF-κ B活性的調節作用，也可作為天然免疫中幹擾素或炎性因子調節藥物、分子和病毒的評價模型，可廣泛應用於各個門類的生物醫學動物實驗當中。下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。


圖1為載體pGL3_Basic的物理圖譜圖2A為可活體成像監測肝臟中IFN-β活性的小鼠模型肝臟中螢火蟲螢光素酶(Fluc)活性的活體成像檢測結果圖2B為可活體成像監測肝臟中IFN-β活性的小鼠模型肝臟中螢火蟲螢光素酶(Fluc)表達水平的Western blot檢測結果圖2C為可活體成像監測肝臟中IFN-β活性的小鼠模型穩定性的活體成像檢測結果圖2D為可活體成像監測肝臟中IFN-β活性的小鼠模型穩定性的巢式PCR檢測結果圖3A為可活體成像監測肝臟中IFN-β活性的小鼠模型其IFN-β啟動子活化的活體成像檢測結果圖3Β為可活體成像監測肝臟中IFN-β活性的小鼠模型其血清中IFN-β含量的檢測結果圖4Α為可活體成像監測肝臟中IFN-β活性的小鼠模型其IFN-β啟動子被HCVNS3/4A蛋白酶抑制的活體成像檢測結果圖4Β為可活體成像監測肝臟中IFN-β活性的小鼠模型其IFN-β啟動子被HCVNS3/4A蛋白酶抑制的血清中IFN-β ELISA檢測結果圖4C為可活體成像監測肝臟中IFN-β活性的小鼠模型其IFN-β啟動子被HCVNS3/4A蛋白酶抑制的Western blot檢測結果圖5為可活體成像監測肝臟中IFN-β活性的小鼠模型來評價真實病毒對IFN-β啟動子作用的活體成像檢測結果圖6Α為重組載體pattB-NF κ B-Fluc的結構示意6Β為可活體成像監測肝臟中NF κ B活性的小鼠模型肝臟Fluc表達情況的活體螢光成像監測結果圖7Α為pattB-NF κ B-Fluc質粒在小鼠肝臟長效整合激活再表達情況的檢測結果圖7Β為nest-PCR對可活體成像監測肝臟中NF κ B活性的小鼠模型整合位點的鑑 定結果圖8為利用可活體成像監測肝臟中NF κ B活性的小鼠模型對NF- κ B抑制劑TOTC的作用評價結果
具體實施例方式實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護範圍不限於下述的實施例。下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。實施例1、構建可活體成像監測肝臟中IFN-β活性的小鼠模型用本發明的方法構建可活體成像監測肝臟中IFN-β活性的小鼠模型，具體方法包括以下步驟:一、構建攜帶噬菌體整合酶識別位點attB基因、IFN-β啟動子以及螢火蟲螢光素酶(Fluc)報告基因的重組載體pGL3-attB-1FN3以!fepG2細胞基因組為模板，在上遊引物IFNBpf:AGATCTAATTCTCAGGTCGTTTGCTT 和下遊弓丨物 IFNBpr:AAGCTTAAAGGTTGCAGTTAGAATGT 的引導下，利用高保真 PrimeSTAR HSDNA 聚合酶，PCR擴增人的IFN-β啟動子序列(其核苷酸序列如序列表中序列I所示)，擴增結束後，對PCR擴增產物進行I %瓊脂糖凝膠電泳，回收並純化300bp的IFN-β啟動子序列，然後將IFN-β啟動子序列經BglII和HindIII雙酶切處理後，與經過相同酶(BglII和HindIII)酶切的載體pGL3-Basic (其物理圖譜如圖1所示)進行連接，得到攜帶螢火蟲螢光素酶(Fluc)報告基因和IFN-β啟動子的重組載體pGL3-1FN-0，再以pTA-attB(GR0THA C, OLIVARES E C, THYAGARAJAN B, CALOS M P.A phage integrase directs efficientsite-specific integration in human cells.Proc Natl Acad Sci USA 2000 ；97(11):5995-6000.由M.P.Calos博士提供)為模板，在上遊引物attBf: CTCGAGGCAGGTACCGTCGACGATG 和下遊引物 attfc:AGATCTGGCTGTCGACATGCCC的引導下，PCR擴增attB基因(其核苷酸序列如序列表中序列2所示)，擴增結束後，對PCR擴增產物進行I %瓊脂糖凝膠電泳，回收並純化297bp的attB基因，然後將attB基因經XhoI和BglII雙酶切處理後，與經過相同酶(XhoI和BglII)酶切的載體pGL3-Basic進行連接，將連接產物轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，篩選陽性克隆，提質粒，得到含有噬菌體整合酶識別位點attB基因、IFN-β啟動子引導螢火蟲螢光素酶(Fluc)報告基因表達的重組載體，命名為pGL3-attB-1FNi3。二、獲得活體成像監測肝臟中IFN-β活性的小鼠模型1、獲得活體成像監測肝臟中IFN-β活性的小鼠模型將步驟一構建的重組載體pGL3-attB-1FN0及噬菌體整合酶質粒PhiC31o利用尾靜脈高壓注射的方法(水動力法)導入小鼠體內，得到受IFN-β啟動子調控表達的螢火蟲螢光素酶(Fluc)報告基因整合於小鼠肝臟的活體成像監測IFN-β活性的小鼠模型，具體方法為:先將步驟一得到的重組質粒pGL3-attB-1FNP用無內毒素質粒大量純化試劑盒進行質粒純化(按照 QIA, GEN 公司、Protocol for EndoFree Plasmid Maxi Kit 進行)，然後選4-6周齡的雄性BALB/c小鼠(購於軍事醫學科學院實驗動物中心)20隻，將pGL3-attB-1FN^ 10 μ g和噬菌體整合酶表達質粒PhiC31o (購自Addgene公司)20 μ g混合於相當於小鼠體重10%的生理鹽水，在3秒鐘以內通過尾靜脈快速轉染至小鼠肝臟。三、活體螢光成像儀監測小鼠模型肝臟中螢火蟲螢光素酶(Fluc)的活性分別在轉染後的不同時間點(0、8、36、60小時)注射Fluc的作用底物-D-Luciferin至步驟二中的小鼠腹腔，5min後麻醉小鼠，置於IVIS活體螢光成像儀進行檢測。結果如圖2A所示，螢光素酶活性在第8個小時就已經達到了高峰，隨著時間延長，螢光素酶活性逐漸降低，到了 60小時基本上檢測不到。四、Western blot驗證小鼠模型肝臟中螢火蟲突光素酶(Fluc)的表達水平在相應時間點(8、36、60小時)處死步驟二獲得的模型小鼠，取肝臟蛋白用Western blot法檢測肝臟中螢火蟲突光素酶(Fluc)的表達水平,一抗為anti_luciferasemAb (購自Promega公司),二抗為辣根酶標記的羊抗鼠抗體(購自北京中杉金橋生物技術有限公司)，以β -actin為內參。結果如圖2B所示，可以看出，小鼠模型肝臟中螢火蟲螢光素酶(Fluc)的表達水平隨著時間的延長，發光減弱，蛋白表達量也減少。五、小鼠模型的穩定性評價為了驗證噬菌體整合酶的整合效率，構建了兩組小鼠模型，一組是只轉染pGL3-attB-1FN^質粒，第二組是共轉染pGL3_attB_IFN β和PhiC31o質粒，轉染後第5天和第30天分別用水動力方法注射10 μ g poly (1:C)(聚肌胞苷酸，聚肌苷酸-聚胞苷酸)，8小時後活體成像檢測螢光素酶的表達水平。結果如圖2C所示，可以看出，在第5天螢光素酶都能夠被poly (1:C)激活，兩組之間沒有明顯差別，而在第30天，第一組已經不能被poly (1: C)激活，而第二組由於同時轉染了噬菌體整合酶，仍然能夠被poly(1:C)激活。再取兩組小鼠的肝臟基因組DNA作為模板，進行巢式PCR擴增，引物序列如下:mspL I (forward):5/ -GTGGCACATTCCTTAATCCC-3'，mspL I (reverse):5/ -TGAGGAGGAGCCTTAGCAAC-3'；attB-1:5/ -GTAGGTCACGGTCTCGAAGC-3'，attB-2:5/ -CGAAGCCGCGGTGCGGGTGCCA-3'。擴增結束後，對PCR擴增產物進行I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖2D所示，可以看出，第二組3隻小鼠attL和attR都能見到250bp左右特異性的條帶。將PCR擴增產物回收連接到T載體上進行克隆測序，測序結果如下:測序序列attL arm sequence report:attB armcorempsLlarmMouse-1:CGCGGTGCGGGTGCCAGG**GT*CCCTT*ac*cccaaaggccctattaatttagggagcctMouse-2:CGCGGTGCGGGTGCCAG*G*GT**CCTTgac*cccaaaggccctattaatttagggagcctMouse-3:CGCGGTGCGGGTGCCAGGGC*T*C*CTT**c**ccaaaggccctattaatttagggagcctattR arm sequence report:attB arm corempsLlarmMouse-1:CGCGGTGCGGGTGCCAGGGCG*GCCCTTg**ccccaaaggccctattaatttagggagcctMouse-2:CGCGGTGCGGGTGCCAGGGC*TGC*CTTgaca*ccaaaggccctattaatttagggagcctMouse-3:CGCGGTGCGGGTGCCAGGGC***C*CTTgacacccaaaggccctattaatttagggagcct對測序結果進行BLAST比對分析，結果發現，表達載體attB位點和小鼠第2號染色體的mpsLl位點發生整合，整合鉸鏈區(core area)為TTG，有3_7個鹼基丟失。實施例2、用可活體成像監測IFN-β活性的小鼠模型評價IFN-β啟動子的活化為了驗證實施例1構建的活體成像監測肝臟中IFN-β活性的小鼠模型能否用來評價IFN-β在小鼠肝臟的活化，選用IFN-β產生的信號途徑中一種病原相關分子模式poly (1:C)來作為誘導劑。將poly(1:C)加至相當於小鼠體重10%的生理鹽水，利用水動力轉染方法快速注射(5-Ssec)入小鼠體內，分別檢測小鼠肝臟螢光素酶的表達及血清中IFN-β的水平，具體為:將poly (1:C) IOyg靶向送入3隻小鼠肝臟(實驗組)，並在4、8、
12、24、48、60小時活體成像監測小鼠肝臟的螢光活性，同時設3隻對照組小鼠水動力注射生理鹽水。活體成像檢測結果如圖3A所示，僅僅注射生理鹽水的小鼠沒有檢測到光子，而注射poly (1:C)的小鼠4小時就能夠看到明顯的發光，在8小時發光值達到頂峰，然後隨著時間延長，發光越來越弱，60小時就完全檢測不到。在上述時間點活體成像完成後，隨即通過眼眶後靜脈叢採血，取血清測量血清中IFN-β的含量。結果如圖3Β所示，實驗組血清IFN-β在4_8小時達到高峰，然後逐漸下降，24小時後基本達到基礎水平，而對照組血清中的IFN-β並沒有明顯變化。實施例3、用可活體成像監測肝臟中IFN-β活性的小鼠模型評價IFN-β啟動子的抑制HCV NS3/4A蛋白酶是已知的IFN-β活化信號通路中的抑制劑，在細胞水平的研究已經證明HCV NS3/4A蛋白酶能夠通過剪切人類的細胞中MAVS來阻斷IFN-β活化信號的傳導。用實施例1構建的活體成像監測IFN-β活性的小鼠模型來評價HCVNS3/4A蛋白酶對IFN- β抑制作用。將pC1-neo (對照組，購自Promega公司)和pCI_HCVNS3/4A (實驗組，將HCVNS3/4A插入pC1-neo載體中構建)兩組質粒分別用水動力的方法轉染至實施例1構建的活體成像監測IFN- β活性的小鼠模型的肝臟中，24小時後用poly (1: C) 10 μ g (或生理鹽水)刺激IFN-β活化，8小時後通過活體螢光成像監測螢光素酶的表達，在活體成像後隨即採血收集血清，然後處死部分小鼠取肝臟凍存。通過ELISA檢測血清中IFN-β的表達水平(Mouse Interferon beta ELISA kit,購自 PBL 公司)，用 Western blot 檢測肝臟中HCV NS3/4A蛋白的表達水平，一抗為ant1-NS3mAb (購自Santa Cruz公司)，二抗為辣根酶標記的鼠抗羊抗體(購自北京中杉金橋生物技術有限公司)。活體螢光成像監測螢光素酶表達水平的檢測結果如圖4A所示，用poly (1:C)刺激後，對照組對比實驗組的螢光素酶表達水平有顯著性差異(P = 0.018)，對照組螢光值比實驗組高約6倍；血清中IFN-β表達水平的ELISA檢測結果如圖4Β所示，對照組血清中IFN-β的表達水平平均為實驗組的4倍；血清中IFN-β表達水平的Western blot檢測結果如圖4C所示(Intact MAVS表示完整的MAVS，Cleaved MAVS表示切割的MAVS)，能夠檢測到實驗組小鼠肝臟中的HCV NS3/4A的表達及MAVS的切割，從而證實IFN-β活化信號能夠被HCV NS3/4A蛋白酶阻斷。實施例4、用可活體成像監測肝臟中IFN-β活性的小鼠模型來評價真實病毒對IFN-β啟動子的作用病毒為鼠肝炎病毒MHV-3，病毒滴度為100PFU，將100 μ I的該病毒通過腹腔注射來感染實施例1構建的可活體成像監測有IFN-β活性的模型小鼠，分別在4、8、12、24、28小時進行活體成像觀察小鼠肝臟的螢光素酶表達。觀察結果如圖5所示，在病毒接種後4小時就能夠見到肝臟螢光素酶的表達，在8小時達到峰值，表明本發明的小鼠模型可以用來評價病毒感染引起的天然免疫中IFN-β活化。`實施例5、構建可活體成像監測肝臟中NF-κ B活性的小鼠模型用本發明的方法構建可活體成像監測肝臟中NF-κ B活性的小鼠模型，具體方法包括以下步驟:一、構建攜帶噬菌體整合酶識別位點attB基因、NF-K B基因以及螢火蟲螢光素酶(Fluc)報告基因的重組載體pattB-NF κ B-Fluc使用KpnI單酶切,對pNF κ B-Fluc (購自Promega)進行單酶切,其單酶切體系如下:PNFk B-Fluc 7 μ UKpnI 5 μ IUOXBuffer 5 μ UddH2O 33 μ 1，總體積 50 μ I。37°C酶切8h，酶切產物用1%瓊脂糖凝膠電泳後切取5kb大小片段的條帶進行產物回收(按試劑盒說明書操作)將回收穫得的PNF κ B-Fluc載體與attB片段(297bp)進行連接，構建目的質粒pattB-NF κ B-Fluc,酶切產物連接反應體系:pattB_NF κ B-Fluc載體質粒I μ 1、attB片段5μ 1、10XT4DNA Ligase Buffer I μ 1.T4DNA Ligase I μ UddH2O 2 μ 1，共 10 μ 1，4°C過夜連接。載體的結構示意圖如圖6Α所示。二、獲得可活體成像監測肝臟中NF-K B活性的小鼠模型水動力轉染法將步驟一構建的重組載體pattB-NF κ B-Fluc分別轉染小鼠，具體方法為:取6-8周齡的雄性BALB/c小鼠(H-2d)(購於軍事醫學科學院實驗動物中心)10隻，將 ο μ g重組質粒pattB-NF κ B-Fluc和20 μ g噬菌體整合酶表達質粒PhiC31o (購自Addgene公司)混合於相當於小鼠體重10%的生理鹽水，在五秒鐘以內通過尾靜脈快速轉染至小鼠肝臟。三、活體螢光成像監測模型小鼠肝臟Fluc的表達分別在轉染後的第1、3、6天，通過小動物活體成像系統監測NF-κ B的激活過程，方法為:首先，注射D-Luciferin (Fluc作用底物)至轉染pattB-NF κ B-Fluc小鼠腹腔，5min後麻醉小鼠，置於IVIS活體螢光成像儀進行檢測。結果如圖6B所示,可以看出，轉染pattB-NF κ B-Fluc的小鼠肝臟中Fluc表達時間約為5-6天，且第一天的表達最為強烈，與水動力造成的肝損傷的過程相近。實施例6、pattB-NF κ B-Fluc質粒在小鼠肝臟中長效整合激活再表達及藥效評價一、pattB-NF κ B-Fluc質粒長效整合激活再表達分別於水動力轉染pattB-NF κ B-Fluc後的11天、30天、60天、80天通過10 μ g/只的脂多糖(LPS)腹腔注射造成小鼠(實施例5構建的小鼠模型)急性肝損傷，激發小鼠肝臟NF- κ B的表達，LPS注射後12小時進行活體成像。結果如圖7A所示，可以看出，每次激活NF κ B後，肝臟均有106-107的螢光光子數可以被檢出，而LPS注射前螢光光子數為零，說明本發明的小鼠模型可以靈敏的反應肝臟組織中NF- κ B的活性情況。二、nest-PCR對小鼠模型整合位點的鑑定使用Invitrogen公司的DNA Zol提取實施例5構建的轉染pattB-NF κ B-Fluc質粒的模型小鼠的肝臟基因組DNA，進行巢式PCR擴增，引物序列如下:mspL I (forward):5/ -GTGGCACATTCCTTAATCCC-3'，mspL I (reverse):5/ -TGAGGAGGAGCCTTAGCAAC-3'；attB-Ι:5/ -GTAGGTCACGGTCTCGAAGC-3'，attB-2:5/ -CGAAGCCGCGGTGCGGGTGCCA-3'。擴增結束後，對PCR擴增產物進行I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖7B所示，可以看出，3隻小鼠attL和attR都能見到250bp左右特異性的條帶。將PCR擴增產物回收連接到T載體上進行克隆測序，測序結果如下:測序序列attL arm sequence report:attB armcorempsLlarmMouse-1:CGCGGTGCGGGTGCCAGG**GT*CCCTT*ac*cccaaaggccctattaatttagggagcctMouse-2:CGCGGTGCGGGTGCCAG*G*GT**CCTTgac*cccaaaggccctattaatttagggagcct
Mouse-3:CGCGGTGCGGGTGCCAGGGC T*C*CTT**c**ccaaaggccctattaatttagggagcctattR arm sequence report:attB armcorempsLlarmMouse-1:CGCGGTGCGGGTGCCAGGGCG*GCCCTTg**ccccaaaggccctattaatttagggagcctMouse-2:CGCGGTGCGGGTGCCAGGGC*TGC*CTTgaca*ccaaaggccctattaatttagggagcctMouse-3:CGCGGTGCGGGTGCCAGGGC***C*CTTgacacccaaaggccctattaatttagggagcct對測序結果進行BLAST比對分析，結果發現，表達載體attB位點和小鼠第2號染色體的mpsLl位點發生整合，整合鉸鏈區(core area)為TTG，有3_7個鹼基丟失。
三、利用可活體成像監測肝臟中NF κ B活性的小鼠模型對NF- κ B抑制劑TOTC的作用評價首先向小鼠腹腔注射120mg/kg的roTC(NF_K B抑制劑/抗氧化劑)，半小時後在腹腔注射 ο μ g/只的LPS，在腹腔注射LPS之後開始計時，分別於2、4、12運用活體成像技術檢測NF- κ B的激活情況和被I3DTC 的抑制情況。利用可活體成像監測肝臟中NF κ B活性的小鼠模型活體成像結果如圖8所示，LPS激活兩小時後I3DTC對NF- κ B有明顯的抑制作用。
權利要求
1.一種可活體成像監測肝臟中IFN-β及NF-K B活性的小鼠模型的構建方法，包括以下步驟: 1)載體構建:構建攜帶噬菌體整合酶識別位點attB基因、IFN-β啟動子或NFkB基因以及螢火蟲螢光素酶(Fluc)報告基因的重組載體，所述噬菌體整合酶識別位點attB基因與IFN-β啟動子或NF K B基因位於Fluc報告基因的上遊； 2)將步驟I)構建的重組載體及噬菌體整合酶質粒利用尾靜脈高壓注射的方法(水動力法)導入小鼠體內，得到受IFN-β啟動子或NFk B基因調控表達的螢火蟲螢光素酶(Fluc)報告基因整合於小鼠肝臟的小鼠模型。
2.根據權利要求1所述的小鼠模型構建方法，其特徵在於:所述步驟I)中用於構建攜帶噬菌體整合酶識別位點attB基因、IFN-β啟動子以及Fluc報告基因的重組載體的出發載體為pGL3-basic，以pGL3-basic為出發載體構建的攜帶噬菌體整合酶識別位點attB基因和IFN-β啟動子及螢火蟲螢光素酶(Fluc)報告基因的重組載體為pGL3-attB-1FNi3 ；所述步驟I)中用於構建攜帶噬菌體整合酶識別位點attB基因、NF K B基因以及Fluc報告基因的重組載體的出發載體為pNFk B-Luc，以PNF κ B-Luc為出發載體構建的攜帶噬菌體整合酶識別位點attB基因、NF-K B基因以及螢火蟲螢光素酶(Fluc)報告基因的重組載體pattB-NFK B-Fluc。
3.根據權利要求1或2所述的小鼠模型構建方法，其特徵在於:所述步驟2)中的噬菌體整合酶質粒為PhiC31o，所述將步驟I)構建的重組載體及噬菌體整合酶質粒利用尾靜脈高壓注射的方法(水動力法)導入小鼠體內的方法具體為:取4-6周齡的雄性小鼠，稱重，將重組質粒10μ g和噬菌體整合酶表達質粒PhiC31o 20 μ g混合於相當於小鼠體重10%的生理鹽水，在3秒鐘以內通過尾靜脈快速轉染至小鼠肝臟。
4.用權利要求1-3任一項所述方法構建的可活體成像監測肝臟中IFN-β或NF-κB活性的小鼠模型。
5.根據權利要求4所述的小鼠模型，其特徵在於:所述小鼠模型是肝臟轉染有報告基因及IFN-β啟動子或NF-K B基因的小鼠模型，所述IFN-β啟動子或NF-κ B基因調控報告基因的表達，所述報告基因用於指示IFN-β基因或NF-κ B基因的表達水平。
6.根據權利要求4所述的小鼠模型，其特徵在於:所述報告基因為各種螢光素酶或鹼性磷酸酶報告基因，優選為螢火蟲螢光素酶(Fluc)基因。
全文摘要
本發明公開了一種可活體成像監測肝臟中IFN-β或NF-κB活性的小鼠模型及其構建方法。本發明通過構建攜帶噬菌體整合酶識別位點attB基因、IFN-β啟動子或NFκB基因以及螢火蟲螢光素酶(Fluc)報告基因的重組載體，用水動力法將其導入小鼠體內，得到受IFN-β啟動子或NFκB基因調控表達的螢火蟲螢光素酶(Fluc)報告基因整合於小鼠肝臟的小鼠模型。用本發明的小鼠模型可以評價不同因素在體內對IFN-β啟動子或NF-κB活性的調節作用，也可作為天然免疫中幹擾素或炎性因子調節藥物、分子和病毒的評價模型，可廣泛應用於各個門類的生物醫學動物實驗當中。
文檔編號A01K67/027GK103173479SQ201110441969
公開日2013年6月26日 申請日期2011年12月26日 優先權日2011年12月26日
發明者詹林盛, 周勇, 閻少多, 賈帥爭 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院野戰輸血研究所